專利名稱：：用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制藥工業(yè)，特別涉及含有低含量(堿性)唾液酸的rhEPO鼻內(nèi)藥物的制備，其通過遺傳工程開始于中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞，用于治療腦血管、神經(jīng)變性和精神病學(xué)疾病。
背景技術(shù)：
：促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，其分子量在34kDa范圍內(nèi)；該蛋白質(zhì)部分由大約166個(gè)氨基酸組成；它產(chǎn)生于腎、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中，并且它參與紅細(xì)胞和其它造血細(xì)胞的增殖、分4匕和成熟。1998年，Sakanaka和合作者報(bào)告了在沙土鼠的頸總動(dòng)脈阻塞(一個(gè)全球性的缺血才莫型)，接著將rhEPO注入側(cè)腦室后，rhEPO對(duì)抗體內(nèi)缺血損傷的神經(jīng)元保護(hù)特性。那些作者觀察到對(duì)CA1海馬神經(jīng)元的缺血性損傷的減少。rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)作用可能歸于不同的因素，包括拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、增加抗氧化性酶的表達(dá)、減少自由基介導(dǎo)的一氧化氮(NO)的形成、使腦血流正常化、影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、促進(jìn)新血管發(fā)生、抑制興奮性毒素或一氧化氮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、增加抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用、降低神經(jīng)元興奮性、腦抗炎作用、抑制kainato誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、血管原性和神經(jīng)原性作用。此外，rhEPO有助于缺血預(yù)調(diào)節(jié)。整體而言，這些原因可以證明rhEPO在治療腦血管、神經(jīng)變性、精神病學(xué)疾病中的應(yīng)用。rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)特性能預(yù)防神經(jīng)元死亡或使神經(jīng)元死亡復(fù)原，神經(jīng)元死亡成為許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如缺血、神經(jīng)性創(chuàng)傷和神經(jīng)變性和神經(jīng)元炎性疾病的特征性事件。還描述了神經(jīng)變性過程促使觸發(fā)精神分裂癥的生理病理學(xué)。這就是為什么神經(jīng)元保護(hù)性藥物可以是治療該疾病的有效替代治療。一旦將生物暴露于某些病理學(xué)條件，例如低血糖癥或強(qiáng)烈的神經(jīng)元去極化，或由于線粒體產(chǎn)生氧-反應(yīng)性物種，rhEPO的表達(dá)顯著增加。另一方面，炎癥過程通過不同的機(jī)理增加腦損傷，并且它們甚至直接局部抑制EPO的產(chǎn)生。事實(shí)上，即使在腦缺血后內(nèi)源性產(chǎn)生rhEPO，其表達(dá)也顯著地受到炎性細(xì)胞因子的抑制。該抑制降低了rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)能力并證明了rhEPO的外源性施用對(duì)腦血管、神經(jīng)變性或精神病學(xué)疾病特別有益。此外，眾所周知，rhEPO分子對(duì)其受體(receiver)的親和力(并且，因此，對(duì)該分子的生理學(xué)反應(yīng)的有效性)與和它結(jié)合的唾液酸百分比反相關(guān)。通過靜脈內(nèi)途徑對(duì)腦缺血的鼠模型施用，rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)作用|LMBrinesandcols，PNAS97(19):10526-10531,20001減少了由缺血引起的損傷50%到75%，并且在人類中產(chǎn)生類似的效果(WO0354475)。然而，使用酸性重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的臨床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果還沒有評(píng)估使用該分子對(duì)誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成的潛在負(fù)性中期影響，因?yàn)橐阎X屏障(BBB)的低滲透性和CNS中rhEPO受體的低親和性，為了相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間獲得有效的藥理學(xué)效果，需要相對(duì)大量的rhEPO。在這些條件下，人們冒增加血液粘度和增加溶血栓事件(其導(dǎo)致大腦缺血)的可能性的風(fēng)險(xiǎn)。已經(jīng)報(bào)道了應(yīng)用酸性rhEPO的這些負(fù)性結(jié)果是用該分子治療的腎炎患者中的并發(fā)癥。為了開發(fā)出增加BBB滲透性(其被認(rèn)為是將物質(zhì)結(jié)合至腦組織中的關(guān)鍵步驟)的方法，已經(jīng)進(jìn)行了研究(US5260308;WO8901343;US4801575;US5442043;JP57146710和JP01149718)。這些方法中的許多方法包括形成肽的綴合物的所謂的栽體(US5442043),或它們使用嵌合肽(US48015575)來將物質(zhì)結(jié)合到腦。已經(jīng)報(bào)道過包含促紅細(xì)胞生成素的脂質(zhì)體的制劑(JP08231417)。已報(bào)道了關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂的使用鼻內(nèi)途徑使分子達(dá)到CNS(US4639437)，以及關(guān)于神經(jīng)元治療藥通過鼻粘膜對(duì)它們的吸收并隨后通過神經(jīng)嗅覺途徑將它們輸送到達(dá)腦(EP504263)。存在幾個(gè)涉及rhEPO液體制劑保護(hù)的專利，下面列出其中最具有代表性的專利液體制劑，其中使用的有效成分是rhEPO并且其中在任何情況下，蛋白質(zhì)以可注射的形式提供(例如CIPO-2041989;CIPO-2353553)。這種給藥方式表明使用的rhEPO為酸類型，就是說，超過40%的分子為唾液酸所覆蓋，否則它將被肝臟酶滅活，并且它在臨床上不會(huì)有效。專利CIPO-2074820使用鼻內(nèi)途徑來施用蛋白質(zhì)。在該情況下，環(huán)糊精用作制劑的成分，并且同樣追求rhEPO的全身性吸收，以至于蛋白質(zhì)也是酸性的。存在涉及使用生物粘附劑增加蛋白質(zhì)在鼻腔內(nèi)的停留時(shí)間的科學(xué)出版物PolireddyD和cols，[InternationalJournalofPharmaceutics(127):115-133，1996；然而，沒有關(guān)于在含有rhEPO的制劑中使用生物粘附劑的報(bào)道。專利CIPO-2353553證明了外源性施用rhEPO用于治療大腦缺血，但與以前的情況完全一樣，該研究是蛋白質(zhì)直接或者間有效地進(jìn)入血流以便有效，以至于我們同樣地在存在含有高含量唾液酸的rhEPO。專利CIPO-2408685覆蓋了rhEPO的不同制劑，但在這種情況下，打算讓它們用于治療貧血，所以它是酸性rhEPO,因?yàn)閴A性rhEPO不能促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖、分化和成熟。專利CIPO-2437333詳細(xì)說明了保護(hù)的制劑是起源于a促紅細(xì)胞生成素，也就是起源于酸性rhEPO。在以前披露和文獻(xiàn)中修訂的所有情況中，提到的是酸性rhEPO,而我們正在申請(qǐng)的專利打算保護(hù)起源于堿性rhEPO的液體制劑。
發(fā)明內(nèi)容在rhEPO的生產(chǎn)過程中，獲得有不同含量唾液酸的糖蛋白。小于40%的其分子被(堿性)唾液酸保護(hù)的蛋白質(zhì)正常被清除，因?yàn)樗ㄟ^全身途徑而不具有生物學(xué)活性。含有低含量唾液酸的這種堿性rhEPO代表了全部產(chǎn)生的rhEPO的70%。令人意外地是，我們已發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)施用堿性rhEPO能夠比酸性rhEPO具有更高的治療價(jià)值；本發(fā)明的結(jié)果使得能利用rhEPO的堿性同工型，其當(dāng)時(shí)沒有被回收而且容易獲得。這代表了很大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗试S回收在當(dāng)時(shí)組成rhEPO生產(chǎn)的廢物。在初級(jí)衛(wèi)生保健系統(tǒng)水平，在能走的基礎(chǔ)上，該制劑可以用來治療和/或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦血管，神經(jīng)變性和精神疾病。建議的溶液的優(yōu)勢(shì)包括使用具有低含量唾液酸的rhEPO用于允許在較小劑量下有更大保護(hù)作用的治療目標(biāo)。實(shí)現(xiàn)了治療藥快速到達(dá)作用部位，而這對(duì)在存在腦缺氧的情況下，獲得滿意的治療效果是關(guān)鍵的。在腦血管疾病的特殊情況下，在級(jí)聯(lián)缺血的一些過程發(fā)生之前，在急性期從治療干預(yù)開始是必要的。這稱為治療窗口期。鼻內(nèi)施用堿性rhEPO消除了誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成的危險(xiǎn)。紅細(xì)胞濃度的增加將增加血液粘度，從而使阻塞或出血事件后再灌注危險(xiǎn)，以至于腦血流將減少并因此將阻礙氧和養(yǎng)分到達(dá)腦組織。鼻內(nèi)途徑比其它施用形式有更大的優(yōu)勢(shì)，允許快速到達(dá)腦；它比靜脈內(nèi)或腦室內(nèi)途徑的侵入性更小，并且一定百分比的rhEPO能到達(dá)腦脊液而不必首先傳到血流，這避免首過肝臟步驟代謝，從而防止了它隨后失活。鼻內(nèi)應(yīng)用不是創(chuàng)傷性的并且消除了外科手術(shù)危險(xiǎn)和其它由創(chuàng)傷性途徑產(chǎn)生的可能并發(fā)癥。它構(gòu)成了在不損害BBB的條件下到達(dá)腦的可替代性途徑。使用血管途徑的可替代性的施用途徑保證了分子經(jīng)通過組織液的擴(kuò)散，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的很少或無血液灌注的區(qū)域?？紤]到鼻內(nèi)施用的主要限制之一是快速纖毛-誘導(dǎo)的粘液清除，本發(fā)明采取了使用生物粘附性聚合物的策略，該生物粘附性聚合物增加了rhEPO在鼻腔內(nèi)的停留時(shí)間。在制劑的開發(fā)過程中，為了獲得具有物理、化學(xué)和微生物學(xué)穩(wěn)定性(該穩(wěn)定性自始至終保持其治療特性)的制劑，也混合了其它的輔助性物質(zhì)或賦形劑，例如防腐劑、張力活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，所述自始至終保持其治療特性。使用的rhEPO在其分子中包含小于40%的唾液酸(就是堿性rhEPO)，其濃度在0.5到2mg/mL的范圍內(nèi)。因此，提供的制劑為液體、無色、透明制劑，無機(jī)械雜質(zhì)，表觀粘度在10到250mPas的范圍內(nèi)。使用了濃度0.4到0.9。/。的羥丙基甲基纖維素(HPMC)，0.2到0.8。/。的羥丙基纖維素(HPC)，0.25到0.5%的甲基纖維素(MC)作為生物粘附性聚合物。主要使用濃度從20到100mM/L的磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液將pH值調(diào)節(jié)到6.0到7.5的范圍。滲透壓可以用不同的等滲劑，除了其它的以外，例如氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖調(diào)節(jié)，濃度范圍為0.05到10g/L。使用的防腐劑是濃度從0.01到0.02%的苯扎氯銨聯(lián)合濃度為0.01%的乙二胺四乙酸二鈉、0.3到0.5%的三氯叔丁醇、0.02到0.035%的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和從0.01到0.02%的對(duì)羥苯曱酸丙酯。為了避免蛋白質(zhì)粘附到容器壁上，使用了非離子型表面活性劑，例如濃度范圍從0.01到1g/L的月桂酸聚乙烯山梨坦(吐溫20到80)、cremophorRH40、三油酸山梨坦(司盤35到80)。使用不同的氨基酸作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，尤其是L-色氨酸、L-亮氨酸、鹽酸L-精氨酸和鹽酸L-組氨酸，濃度在0.1和10mg/mL的范圍之間。在所有情況下使用的溶劑是注射用水。在大鼠中進(jìn)行鼻粘膜的刺激性試驗(yàn)，并且在該水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)刺激的指征。這與該產(chǎn)物的優(yōu)良耐受性一起為在人類中使用堿性rhEPO提供了毒理學(xué)的驗(yàn)證。穩(wěn)定性研究顯示，蛋白質(zhì)濃度與時(shí)間的適當(dāng)行為。應(yīng)用羅氏(Lowry)蛋白質(zhì)含量測(cè)定法(±10%)時(shí)，建立了位于限度內(nèi)的pH。圖1.酸性和堿性促紅細(xì)胞生成素對(duì)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)物中GST的酶活性的作用。該圖顯示神經(jīng)起源的細(xì)胞如何通過改變GST酶的活性而對(duì)存在的rhEPO起反應(yīng)。該圖中的值代表了各自三個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值。圖2.蒙古沙土鼠的腦缺血模型中，對(duì)兩性死亡率的作用。圖3.在圓筒中蒙古沙土鼠的運(yùn)動(dòng)-功能性活動(dòng)。圖4.損傷后24小時(shí)，動(dòng)物的神經(jīng)學(xué)狀態(tài)。圖5.在單側(cè)腦缺血后5周期間，鼻內(nèi)施用rhEPO對(duì)治療動(dòng)物體重的作用。圖6.a和b.rhEPO對(duì)腦7JC腫的作用。圖7.在沙土鼠的海馬CA1扇形面中損傷的組織病理學(xué)得分。圖8.缺血損傷后沙土鼠海馬的顯微照片，未治療(A)和通過鼻內(nèi)施用rhEPO治療(B)。觀察在治療的動(dòng)物中CA1扇形面的完整性。圖9.酸性和堿性促紅細(xì)胞生成素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中脂質(zhì)(lipodic)過氧化的保護(hù)作用。該圖顯示具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素如何減少了研究的大鼠腦中三個(gè)區(qū)域的勻漿中MDA+4HDA的產(chǎn)生13%(0-23%)。該減少依賴于^f吏用的劑量。在海馬和小腦中觀察到保護(hù)的最高水平，其中已經(jīng)檢測(cè)到相當(dāng)水平的rhEPO受體。圖10.對(duì)用rhEPO治療組三個(gè)樣品分析的血液學(xué)變量平均值行為，與第一次抽樣的正常范圍X士2SD有關(guān)。圖11.具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素從鼻腔傳遞到嗅球和小腦。圖中每一條代表了六只動(dòng)物的平均值。該圖顯示具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素如何在至少5分鐘內(nèi)到達(dá)腦區(qū)域，并隨時(shí)間從腦的前面到尾側(cè)區(qū)域逐漸減少。從應(yīng)用起60分鐘，仍有一些rhEPO在嗅球和小腦區(qū)域。從應(yīng)用5分鐘，80到85°/。之間的到達(dá)腦的rhEPO在嗅球被檢測(cè)到，而接近20%的在小腦被檢測(cè)到。大約30分鐘后，這些濃度幾乎相等，并且60分鐘后小腦有30%放射活性，并且嗅球只有10%。具體實(shí)施例方式工作實(shí)施例實(shí)施例1具有低含量唾液酸的rhEPO的純化為了獲得唾液酸含量小于40%的堿性促紅細(xì)胞生成素，進(jìn)行了三個(gè)基本色譜法步驟，從非常復(fù)雜和有大量污染蛋白質(zhì)的材料開始，因?yàn)樵摬牧虾?%胎牛血清。然后進(jìn)行附加步驟以獲得目標(biāo)同工型。為了堿性rhEPO的滲濾和濃縮，使用了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的超濾系統(tǒng)(SARTOFLOWSLICE200)，其與蠕動(dòng)泵(IP55Watson-Marlow)連接。使用10kDa的Hydrosart膜。該工作以1.9±0.25mL/min流速、推進(jìn)壓力(P1)2.9±0.25bar、保留級(jí)分壓力(P2)0.65±0.1bar和跨膜(TM)壓力1.8±0.2bar進(jìn)行。為了測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，在X=280nnH吏用UltrospecTM3100分光光度計(jì)。對(duì)滲濾過程，使用pH6.0和電導(dǎo)率3.25ms/cm的NaH2P04和Na2HP04的鼻內(nèi)緩沖溶液。pH值通過使用SartoriuspH計(jì)和Omega電導(dǎo)儀進(jìn)行控制。發(fā)現(xiàn)該過程的收率在75-95%的范圍內(nèi)。表l顯示該過程的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2含有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其使用HPMC作為生物粘附性聚合物、鹽酸組氨酸作為穩(wěn)定劑、吐溫80作為非離子型表面活性劑和苯扎氯銨作為防腐劑。制備方法該溶液的制備從體積占制劑總體積30%的注射用水開始。該體積用于溶解防腐劑、緩沖劑和等滲劑。除此之外，在適當(dāng)容量的容器中，放入體積等于制劑總體積的15%的注射用水，并加溫至溫度為85到95°C，并且在劇烈的不斷的攪拌下分散聚合物。一旦聚合物被濕潤(rùn)，將先前制備的溶液摻入其中，同時(shí)劇烈搖動(dòng)直到全部勻化。然后為了摻入相應(yīng)量的堿性rhEPO、非離子型表面活性劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，減少搖動(dòng)。最后，用注射用水將體積加到制劑最終體積的100%。隨后通過0.2微米的乙酸纖維素膜將該制劑過濾，并且測(cè)試pH以驗(yàn)證其保持在確定的范圍內(nèi)。制成的制劑的組成如下組分比例堿性rhEPO0.8mg/mL羥丙基曱基纖維素5.0mg/mL鹽酸組氨酸1.0mg/mL磷酸二氬鈉2mg/mL碌酸氫二鈉0.7mg/mL吐溫800.25mg/mL氯化鈉7.4mg/mL乙二胺四乙酸二鈉0.1mg/mL苯扎氯銨0.2mg/mL注射用水足量1ml實(shí)施例3具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但使用甲基纖維素作為生物粘附性聚合物制備方法與實(shí)施例2相似。制成的制劑的組成如下組分堿性rhEPO曱基纖維素鹽酸組氨酸磷酸二氬鈉磷酸氫二鈉吐溫80氯化鈉乙二胺四乙酸二鈉苯扎氯銨注射用水比例0.8mg/mL3.0mg/mL1.0mg/mL2mg/mL0.7mg/mL0.25mg/mL7.4mg/mL0.1mg/mL0.2mg/mL足量1ml實(shí)施例4具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例2相似，但使用吐溫20作為非離子型表面活性劑。制備方法與實(shí)施例2相似。制成的制劑的組成如下纟且分比例堿性rhEPO0.8mg/mL羥丙基曱基纖維素5.0mg/mL鹽酸組氨酸1.0mg/mL碼酸二氫鈉2mg/ml」磷酸氬二鈉0.7mg/mL吐溫200.20mg/mL氯化鈉7.4mg/mL乙二胺四乙酸二鈉0.1mg/mL苯扎氯銨0.2mg/mL注射用水足量lml實(shí)施例5具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但有1.2mg/ml的有效成分并且不含鹽酸組氨酸作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。制備方法與實(shí)施例2相似，但不使用鹽酸組氨酸。制成的制劑的組成如下組分比例堿性rhEPO1.2mg/mL羥丙基甲基纖維素5.0mg/mL磷酸二氫鈉2mg/mL磷酸氫二鈉0.7mg/mL吐溫200.20mg/mL氯化鈉7.7mg/mL乙二胺四乙酸二4內(nèi)0.1mg/mL苯扎氯銨0.2mg/mL注射用水csp1ml實(shí)施例6具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例2相似，但有1.2mg/ml的有效成分并且不含鹽酸組氨酸作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。制備方法與實(shí)施例2相似，但是沒有使用鹽酸組氨酸。制成的制劑的組成如下比例1.2mg/mL5.0mg/mL2mg/mL0，7mg/mL0.25mg/mL7.7mg/mL0.1mg/mL0.2mg/mL足量1ml實(shí)施例7用于鼻內(nèi)施用的基于具有低含量唾液酸的rhEPO的制劑，其與實(shí)施例2相似但含有對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯作為抗微生物防腐劑。制備方法該溶液的制備從體積占該制劑總體積30%的注射用水開始。該體積用于溶解緩沖劑和等滲劑。除此之外，在適當(dāng)容量的容器中，放入體積等于制劑總體積15。/。的注射用水，并加溫至溫度為90到95。C。溶解對(duì)羥基苯甲酸酯類，然后在劇烈的不斷的搖動(dòng)下?lián)饺刖酆衔铩Ｒ坏┚酆衔锉粷駶?rùn)，將先前制備的溶液摻入其中，同時(shí)劇烈搖動(dòng)直到全部勻化。然后為了摻入相應(yīng)量的堿性rhEPO、非離子型表面活性劑和鹽酸組氨酸，減少搖動(dòng)。最后，用注射用水將體積加到制劑最終體積的100%。隨后通過0.2微米乙酸纖維素膜將該制劑過濾，并且測(cè)試pH以驗(yàn)證其保持在確定的范圍內(nèi)。制成的制劑的組成如下組分堿性rhEPO羥丙基曱基纖維素磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉吐溫80氯化鈉乙二胺四乙酸二鈉苯扎氯銨注射用水組分比例堿性rhEPO0.8mg/mL羥丙基甲基纖維素5.0mg/mL鹽酸組氨酸1.0mg/mL磷酸二氫鈉2mg/mL磷酸氬二鈉0.7mg/mL吐溫800.25mg/mL氯化鈉7.5mg/mL對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.33mg/mL對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.17mg/mL注射用水足量1ml實(shí)施例8具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但使用甲基纖維素作為生物粘附性聚合物。制備方法與實(shí)施例6相似。制成的形式的組成如下組分堿性rhEPO甲基纖維素鹽酸組氨酸磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉吐溫80氯化鈉對(duì)羥基苯甲酸甲酯對(duì)羥基苯甲酸丙酯注射用水比例0.8mg/mL3.0mg/mL1.0mg/mL2mg/mL0.7mg/mL0.25mg/mL7.5mg/mL0.33mg/mL0.17mg/mL足量1ml實(shí)施例9具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例7相似，但使用吐溫20作為非離子型表面活性劑制備方法與實(shí)施例7相似。比例0.8mg/mL5.0mg/mL1.0mg/mL2mg/mL0.7mg/mL0.20mg/mL7.5mg/mL0.33mg/mL0.17mg/mL足量1ml實(shí)施例10基于具有低含量唾液酸的rhEPO的制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但不含鹽酸組氨酸作為穩(wěn)定劑而且使用葡萄糖作為等滲劑制備方法與實(shí)施例7相似。制成的制劑的組成如下組分比例堿性rhEPO1.2mg/mL羥丙基甲基纖維素5.0mg/mL磷酸二氬鈉2mg/mL磷酸氬二鈉0.7mg/mL制成的制劑的組成如下:組分堿性rhEPO羥丙基甲基纖維素鹽酸組氨酸磷酸二氯鈉磷酸氫二鈉吐溫20氯化鈉對(duì)羥基苯甲酸甲酯對(duì)幾基苯甲酸丙酯注射用水吐溫200.20mg/mL葡萄糖48.0mg/mL對(duì)羥基苯曱酸甲酯0.33mg/mL對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.17mg/mL注射用水足量1ml實(shí)施例11基于具有低含量唾液酸的rhEPO的制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但用吐溫80作為非離子型表面活性劑。制備方法與實(shí)施例7相似。制成的制劑的組成如下組分堿性rhEPO幾丙基甲基纖維素磷酸二氫鈉磷酸氬二鈉吐溫80葡萄糖對(duì)羥基苯曱酸甲酯對(duì)羥基苯甲酸丙酯注射用水比例1.2mg/mL5.0mg/mL2mg/mL0.7mg/mL0.25mg/ml/48.0mg/mL0.33mg/mL0.17mg/mL足量1ml實(shí)施例12具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例7相似，但使用三氯叔丁醇作為抗微生物的防腐劑。制備方法與實(shí)施例7相似。制成的制劑的組成如下組分堿性rhEPO羥丙基甲基纖維素鹽酸組氨酸磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉吐溫80氯化鈉三氯叔丁醇注射用水比例0.8mg/mL5.0mg/mL1.0mg/mL2mg/mL0.7mg/mL0.25mg/mL6.2mg/mL5.0mg/mL足量1ml實(shí)施例13基于具有低含量唾液酸的rhEPO的制劑，其與前面的實(shí)施例相似,但用曱基纖維素作為生物粘附性聚合物。制備方法與實(shí)施例2相似。制成的制劑的組成如下組分比例堿性rhEPO0.8mg/mL甲基纖維素3.0mg/mL鹽酸組氨酸1.0mg/mL磷酸二氬鈉2mg/mL磷酸氫二鈉0.7mg/mL吐溫800.25mg/mL氯化鈉6.2mg/mL三氯叔丁醇5.0mg/mL注射用水足量1ml實(shí)施例14具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例12相似，但使用吐溫20作為非離子型表面活性劑。制備方法與實(shí)施例2相似。制成的制劑的組成如下組分堿性rhEPO羥丙基甲基纖維素鹽酸組氨酸磷酸二氫鈉磷酸氬二鈉吐溫20氯化鈉三氯叔丁醇注射用水比例0.8mg/mL5.0mg/mL1.0mg/mL2mg/mL0.7mg/mL0.20mg/mL6.2mg/mL5.0mg/mL足量1ml實(shí)施例15具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例5相似，但有三氯叔丁醇作為抗微生物的防腐劑。制備方法與實(shí)施例2相似。制成的制劑的組成如下組分堿性rhEPO羥丙基甲基纖維素磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉吐溫20比例1.2mg/mL5mg/mL2mg/mL0,7mg/mL0.20mg/mL氯化鈉三氯叔丁醇注射用水6.5mg/mL5.0mg/mL足量1ml實(shí)施例16"體外"評(píng)價(jià)具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素鼻用制劑對(duì)神經(jīng)起源細(xì)胞的刺激作用為了證明rhEPO對(duì)神經(jīng)起源細(xì)胞上的酶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)比活性的誘導(dǎo)作用，以及證明酸性和堿性重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)神經(jīng)起源的細(xì)胞具有相似的作用，用PC12細(xì)胞進(jìn)行了體外研究。在補(bǔ)充了2mML-谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素G、100微克/毫升鏈霉素(GIBCO)、含有10%(v/v)10mMHepes緩沖液的DMEM培養(yǎng)基中，使細(xì)胞保持未分化。培養(yǎng)基用10%的全馬血清制備。將細(xì)胞加入0,6和15毫微摩爾重組人促紅細(xì)胞生成素中，其具有低含量的唾液酸(實(shí)施例5和6)或是酸性(完全糖唾液酸化的(glycosilated))促紅細(xì)胞生成素。作為對(duì)照，將細(xì)胞加到相似數(shù)量的先前通過加熱滅活的rhEPO中。將在這些培養(yǎng)基中獲得的GST的比活性值看作100%。為了測(cè)定GST的比活性，使用了用酸性或堿性rhEPO培養(yǎng)的細(xì)胞勻漿；這是在4。C、用0.1M磷酸鹽緩沖液，pH=6.95,在完全用玻璃制造的勻化系統(tǒng)中進(jìn)行的。該不含細(xì)胞的勻漿是通過在冷卻的高速離心機(jī)中，在4°C、以16000Xg離心獲得的。將如此獲得的勻漿保持于冰水浴中并根據(jù)Habig的方法(Habig，W.H.，Pabst，J.J.，andJakoby，W.B.1974;Biol.Chem.249(22):7130-7139)，用于測(cè)定GST的比活性。蛋白質(zhì)的測(cè)定是通過Bradford的方法進(jìn)4亍的(BradfordAnalMM.Biochem，72，(176)158)。獲得的主要結(jié)果是神經(jīng)起源的細(xì)胞通過改變GST酶的活性而對(duì)存在的rhEPO起反應(yīng)。圖(圖1)中的值代表三個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值。對(duì)具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的反應(yīng)與對(duì)酸性rhEPO的反應(yīng)相似u實(shí)施例17鼻內(nèi)施用具有低含量唾液酸的rhEPO的治療有效性使用體重在60和70克之間的兩性蒙古沙土鼠。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間它們隨意飲水和攝食，并保持12小時(shí)明亮與12小時(shí)黑暗交替的周期。在用地西泮(5.0mg/kg)作為前驅(qū)麻醉劑，通過腹膜內(nèi)途徑深度麻醉下，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行永久性右頸動(dòng)脈單側(cè)阻塞。^使用氯胺酮(47mg/kg)和阿托品(0.02mg/kg)作為麻醉劑。在立體鏡下暴露右頸動(dòng)脈，雙重結(jié)扎并剪斷。假手術(shù)動(dòng)物用相同的操作制備，但沒有結(jié)扎或剪斷頸動(dòng)脈。對(duì)于臨床和組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)組是對(duì)照組:分離頸動(dòng)脈，沒有任何其它操作(假手術(shù))(n=10)。沒有治療的損傷動(dòng)物組:損傷的動(dòng)物，沒有經(jīng)受其它任何操作(n=20)。有治療的損傷動(dòng)物組:分離頸動(dòng)脈，雙重結(jié)扎并剪斷，鼻內(nèi)施用具有低含量唾液酸的rhEPO(實(shí)施例10)(n=20)。治療包括l(HUrhEPO或其賦形劑，每日每8小時(shí)應(yīng)用于鼻腔，從手術(shù)后1小時(shí)直到手術(shù)之后的第4天。根據(jù)從2到5等級(jí)，檢查每一動(dòng)物以確定其神經(jīng)學(xué)狀態(tài)，包括身體狀況(corporaltone)、抓握力和姿勢(shì)與行走的改變。沒有病理學(xué)體征的存活動(dòng)物在該等級(jí)中的值是5。該功能評(píng)價(jià)是通過觀察動(dòng)物的自發(fā)性探查活動(dòng)進(jìn)行的，即通過計(jì)數(shù)當(dāng)嚙齒類探查新容器時(shí)做出的身體用后腿站立動(dòng)作(即，站在后爪腳尖上的情況)的數(shù)量。使用的容器是垂直圓筒狀盒子，直徑30厘米并且高25厘米。每一沙土鼠放于該盒子中央，并且計(jì)數(shù)3分鐘間隔期間完成的用后腿站立的動(dòng)作。手術(shù)后7天，用在pH-7.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的4%甲醛溶液，通過左腦室灌注動(dòng)物。取出腦并放于該溶液中數(shù)天。然后將腦包于石蠟中，切為4微米厚的薄片，并用蘇木精和伊紅染色。這些切片沒有以前它們同一性的知識(shí)，以10x和^x進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于腦水腫的評(píng)價(jià)，4吏用了體重60到70g之間，90只雌性動(dòng)物，包含于3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中假手術(shù)的動(dòng)物(n=20)。損傷未治療的動(dòng)物(n=35)。損傷并治療的動(dòng)物(n-35)。在損傷后3、12或24小時(shí)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉并用鹽水溶液灌注。從顱腔取出腦并彼此分離大腦半球。根據(jù)Calapai和cols.2000描述的重量分析法，根據(jù)方程式水％=[(大腦半球濕重-大腦半球干重)X100X濕重"j進(jìn)行水含量的測(cè)定。為了分析該數(shù)據(jù)，通過Student檢驗(yàn)、方差分析(單因素檢測(cè))和多重比較的鄧奈特(Dunnett)檢驗(yàn)，對(duì)每一變量確定組和樣品之間的差異。為了評(píng)價(jià)動(dòng)物體重，將雄性動(dòng)物隨機(jī)分入三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中(每組IO只動(dòng)物)，繼之按照前面試驗(yàn)中使用的相同處理要點(diǎn)。在手術(shù)當(dāng)日和之后連續(xù)5周(每周一次)，使用Sartorius分級(jí)對(duì)動(dòng)物稱重。在用經(jīng)鼻施用rhEPO描述的實(shí)驗(yàn)期間，觀察到在手術(shù)之后的數(shù)天期間，在治療的兩性動(dòng)物中死亡率較低，如通過分析比例所證明(圖2)。單側(cè)結(jié)扎后24小時(shí)，部分動(dòng)物在神經(jīng)學(xué)狀態(tài)上顯示裝模作樣，其通過描述的檢測(cè)顯示并通過得分表示(圖3)。如可被觀察到的，在損傷的未治療動(dòng)物中，出現(xiàn)了明顯的功能性損傷。運(yùn)動(dòng)-功能性探查活動(dòng)在未治療的缺血?jiǎng)游镏谐霈F(xiàn)抑制(圖4)，而在用rhEPO治療的動(dòng)物中，該活動(dòng)與對(duì)照保持類似。在永久性單側(cè)缺血^=莫型中，損傷并鼻內(nèi)施用rhEPO對(duì)動(dòng)物體重的作用顯示于圖5。損傷并治療組的損傷動(dòng)物組和假手術(shù)組之間的比較顯示了不同行為的重量曲線。與損傷、未治療動(dòng)物體重減輕對(duì)比，對(duì)照組和損傷治療組有相似的曲線。在數(shù)周的過程中，該組不能超過實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的平均重量。在于腦水腫減少的該結(jié)果是由于鼻內(nèi)施用rhEPO，其在全部治療的動(dòng)物中防止形成腦水腫提供了明顯的保護(hù)(圖6，a和b)。事實(shí)上，沒有發(fā)現(xiàn)在用rhEPO治療的動(dòng)物和對(duì)照之間水含量的不同。在損傷的未治療的動(dòng)物組中，發(fā)現(xiàn)了正相反的對(duì)立的情況，其中在損傷的(右)大腦半球中水含量在研究的所有時(shí)間內(nèi)(3，12和24小時(shí))增加，并且發(fā)現(xiàn)在損傷后24小時(shí)高度顯著性(p<0.001)。在組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)方面，有完整腦的動(dòng)物的頻率在對(duì)照動(dòng)物中大于未治療的動(dòng)物(p-0.002),并且在用rhEPO治療的動(dòng)物中也比在未治療的動(dòng)物中大(p-O.(B),(圖7)。未治療的動(dòng)物受全身性水肺和整個(gè)右半球核固縮，以及右側(cè)海馬傘和右半球頂葉皮層、右半球中水腫性區(qū)域和密度、彌散性染色質(zhì)、海馬中固縮神經(jīng)元出血的影響(圖8)。實(shí)施例18在大鼠的海馬、腦皮質(zhì)和小腦的解剖區(qū)域的勻漿中，具有低含量唾液酸的堿性重組人促紅細(xì)胞生成素(實(shí)施例IO)的抗氧化能力的體外評(píng)價(jià)。為了證明酸性和堿性rhEPO二者能對(duì)抗大鼠腦勻漿中的丙二醛(MDA)和4-羥基烯磺(hydroxyalkenals)(4HDA)的產(chǎn)生，進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。為此目的，使用了體重在180到200g之間的雄性Wistar大鼠(n=15)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物隨意攝取水和食物并生活于12小時(shí)明亮與12小時(shí)黑暗交替方案下。應(yīng)用以獲得解剖區(qū)域的方法學(xué)如下通過頸脫位法和斷頭術(shù)處死動(dòng)物，快速將腦從顱腔中取出并且將該組織立即冷凍至-70。C。在立體定位圖的幫助下，解剖每只動(dòng)物的海馬、腦皮質(zhì)和小腦(Paxinos，G.，和Watson，C.，1986.AcademicPress,NewYork,pp230-259)。將這些區(qū)域的每一個(gè)都形成一個(gè)池并且制備每一區(qū)域的勻漿，其中每份磷酸鹽緩沖液0.1MpH=7.0中含有l(wèi):8份的組織。無細(xì)胞的液體是通過在4-C，lOOOOg離心30分鐘獲得的。勻漿保持于水水浴中，直到4吏用LaboMed，Inc.的SpectroUV-VISRS數(shù)字分光光度計(jì)測(cè)定酶活性。獲得的主要結(jié)果是具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素減少了研究的大鼠腦中三個(gè)區(qū)域的勻漿中MDA+4HDA的產(chǎn)生13%(0-23%)。該減少依賴于<吏用的劑量。在海馬和小腦中觀察到保護(hù)的最高水平，其中已經(jīng)檢測(cè)到相當(dāng)水平的rhEPO受體。酸性和堿性rhEPO的反應(yīng)是相似的(圖9)。實(shí)施例19應(yīng)用90000IU具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素(根據(jù)實(shí)施例6中的制劑)不誘導(dǎo)顯著的紅細(xì)胞生成反應(yīng)。為了證明在試驗(yàn)中使用的具有低含量唾液酸的堿性重組人促紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)沒有任何明顯的紅細(xì)胞生成活性，在用10只動(dòng)物(5只施用rhEPO和5只對(duì)照)的對(duì)比研究中，使用90000IU劑量評(píng)估了其對(duì)蒙古沙土鼠的紅細(xì)胞生成的作用。監(jiān)測(cè)所有動(dòng)物(施用前、施用后7天和施用后14天)，使用Af/c77w爿5X自動(dòng)計(jì)數(shù)器來處理樣品，在全血(10pLEDTA,占10。/。/mL血液)中進(jìn)行完全的血象。使用基于Windows的統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS,設(shè)置p=0.05作為置信水平，來處理變量。獲得下面的結(jié)果(表l)。表l.獲得的不同組的血液學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>通過抽樣p，0.05和11=10，每一血液學(xué)參數(shù)的群體分布顯示為正態(tài)分布。在方差均一性分析中觀察到，一般來說，方差有均勻的行為，抽樣I中的HB和HTC除外，也就是LEUC。在比較不同抽樣中組的血液學(xué)變量的方差時(shí)，觀察到在抽樣II的HB，ETO，HTC和CHCM中的差異，其中對(duì)照組和治療組之間的差異得到證明。在比較每一組的抽樣之間的方差時(shí)，觀察到對(duì)照組的CHCM中的差異(抽樣I對(duì)抽樣II),而治療組顯示在HB和HTC(抽樣II對(duì)抽樣I和III)和CHCM(抽樣II對(duì)抽樣I)中的差異。為了評(píng)價(jià)抽樣引起的上述變量的組間差異，抽樣I作為比較的參比抽樣。考慮到在組間和抽樣間顯示了一些統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p=0.05，決定對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行更整合的評(píng)價(jià)；為此目的，將抽樣I的值歸類，計(jì)算在動(dòng)物還沒有治療的時(shí)刻11=10，和該群體的范圍X士2SD，然后對(duì)每一變量的平均值的行為作圖(圖10)。這些變量的平均值同樣與對(duì)于該物種其他作者報(bào)道的那些比較，然后確定在所有組和抽樣中，獲得的值與文獻(xiàn)中報(bào)道的那些相似(表2)。即使統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示變量HB、ETO和HTC在抽樣II中顯著增力口,在根據(jù)在文獻(xiàn)(HandbookofCareandUseofExperimentalAnimals,CanadianCouncilforAnimalProtection.Volume1,第2版.1998)中報(bào)道的正常范圍X土2SD和平均值分析該行為時(shí)，人們能夠注意到該行為缺少生物學(xué)顯著性，以至于人們能夠得出結(jié)論具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素在研究的物種中不誘導(dǎo)任何顯著的紅細(xì)胞生成反應(yīng)。表2.沙土鼠的正常血液學(xué)值。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例20具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的1125標(biāo)記為了確定通過鼻內(nèi)施用具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素(實(shí)施例3和5)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域的傳遞，根據(jù)來自美國(guó)伊利諾州61105Pierce,Rockford的商業(yè)方法(YODOGEN)，用碟125標(biāo)記rhEPO。從該放射性標(biāo)記開始，制備鼻內(nèi)制劑。使用了總共18只體重180和200g之間的雄性Wistar大鼠。動(dòng)物通過鼻內(nèi)施用該標(biāo)記有I125的具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素制劑進(jìn)行治療。每一動(dòng)物接受鼻內(nèi)施用5到100微升該制劑。以5、30或60分鐘間隔，動(dòng)物在麻醉下通過斷頭術(shù)處死。將腦快速取出(在少于70秒內(nèi))。提取嗅球和小腦區(qū)域。用y計(jì)數(shù)器進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。獲得下面的結(jié)果應(yīng)用具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素，在至少5分鐘內(nèi)到達(dá)腦部區(qū)域，并且它從腦的前面到尾側(cè)區(qū)域逐漸隨時(shí)間減弱。從應(yīng)用起60分鐘時(shí)，在嗅球和小腦區(qū)域仍然有一些rhEPO。這些結(jié)果表明大約1-5%之間的鼻應(yīng)用的rhEPO到達(dá)腦。在嗅球中檢測(cè)到80和85%之間的到達(dá)腦的rhEPO，而從應(yīng)用起5分鐘時(shí)，在小腦中檢測(cè)到接近20%。在30分鐘之后，這些濃度幾乎相等，并且60分鐘后小腦有30%的放射活性，而嗅球只有10%。在小腦區(qū)域存在標(biāo)記的分子表明通過了BBB;另一方面，在與嗅覺途徑(小腦)不相關(guān)區(qū)域水平的分子檢測(cè)表明不僅嗅覺途徑參與了分子到腦的傳遞，而且更為普遍、更快的機(jī)制，可能通過粘液擴(kuò)散并隨后透過特別地存在于斑點(diǎn)篩板(WflC/fl區(qū)域中嗅覺上皮區(qū)域中的間斷，其允許具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素到達(dá)遠(yuǎn)離嗅覺途徑的區(qū)域。圖11中的每一條代表了六只動(dòng)物的平均值。實(shí)施例21堿性rhEPO對(duì)兔妹網(wǎng)膜下腔出血的作用對(duì)重量在3到4kg的雄性新西蘭兔進(jìn)行試驗(yàn)，用肌肉內(nèi)注射氯胺酮40mg/kg進(jìn)行麻醉。稍后，從耳的中央動(dòng)脈抽取5ml血液，并通過經(jīng)皮途徑注射進(jìn)小腦延髓池。監(jiān)測(cè)動(dòng)物72小時(shí)。將兔分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組8只動(dòng)物I組對(duì)照動(dòng)物。II組損傷動(dòng)物。III組損傷動(dòng)物+堿性rhEPO20jig(實(shí)施例5)。在誘導(dǎo)蛛網(wǎng)膜下腔出血后5分鐘進(jìn)行施用堿性rhEPO，并在72小時(shí)期間每8小時(shí)進(jìn)行重復(fù)。為神經(jīng)學(xué)評(píng)價(jià)，才艮據(jù)GrassoG,2002，在試驗(yàn)期間跟蹤動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)-功能性行為。結(jié)果顯示于表I中。觀察到在對(duì)照動(dòng)物(未損傷)和用堿性rhEPO治療的動(dòng)物中，比損傷的未治療動(dòng)物更好的運(yùn)動(dòng)-功能性行為。誘導(dǎo)出血后72小時(shí)觀察的神經(jīng)學(xué)評(píng)價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>神經(jīng)學(xué)損傷程度分類為1:無損傷指征。2:最小損傷。3:無異常運(yùn)動(dòng)的中度損傷。4:存在異常運(yùn)動(dòng)的重度損傷。*:在損傷并用堿性rhEPO治療動(dòng)物和損傷動(dòng)物之間存在顯著性差異p<0.05。實(shí)施例22堿性rhEPO對(duì)癡呆治療的作用在36只蒙古沙土鼠中，在麻醉下扎緊右側(cè)頸動(dòng)脈。在手術(shù)后1小時(shí)時(shí)間間隔內(nèi)開始，在7天期間動(dòng)物每日接受鼻內(nèi)施用40IU的rhEPO(實(shí)施例10和11)。其它進(jìn)行相似的處理的24只動(dòng)物接受等量的賦形劑。進(jìn)行頸動(dòng)脈分離未結(jié)扎的9只沙土鼠組成對(duì)照組。手術(shù)后8天，在進(jìn)行單側(cè)缺血并用rhEPO治療的組和只用賦形劑處理的組中，分別有27和13只動(dòng)物存活。對(duì)照組無死亡數(shù)。在頸動(dòng)脈單側(cè)結(jié)扎之前1天和之后1周，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行習(xí)慣形成測(cè)試。該測(cè)試基于在圓筒狀盒子中，在分為三個(gè)三分之一的9分鐘間隔期間，計(jì)數(shù)用后腿站立動(dòng)作。在每個(gè)三分之一中用后腿站立動(dòng)作的比例決定該三點(diǎn)之間的最佳擬合直線。通過Mann和Whitney'sU檢驗(yàn)，使用斜率建立組之間的比較。通過存活動(dòng)物的Wilcoxon，s范圍比較檢驗(yàn)進(jìn)行前后比較。結(jié)果如下組<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>a_與對(duì)照不同；b-與rhEPO不同；p<0.05。該結(jié)果顯示對(duì)患有缺血的動(dòng)物，較小的斜率(接近于0)，缺血之后1周，并與用rhEPO治療的那些和對(duì)照比較。較小的斜率證明了在9分鐘間隔的后三分之二中，動(dòng)物探查其環(huán)境的持久性，顯示了習(xí)慣形成的喪失，其可以表征為缺血誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。用堿性rhEPO的治療預(yù)防了該功能障礙的出現(xiàn)。動(dòng)物的行為顯示了缺血誘導(dǎo)的大腦退化，其可以表示為在它們關(guān)在圃柱內(nèi)期間，該物種雄性有代表性的筑巢能力的喪失；也可表示為進(jìn)攻性增強(qiáng)和自梳理行為的喪失。通過卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較并在表中以百分比表示<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>a—與對(duì)照不同；b-與rhEPO不同；p〈0.05明顯的是該治療完全預(yù)防水腫并減少一半固縮、神經(jīng)膠質(zhì)增生和神經(jīng)元損失的發(fā)生率。行為的退化可以適于作為在未治療組觀察到的神經(jīng)元損失和其它組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的反映。在蒙古沙土鼠中，用rhEPO治療至少部分地預(yù)防腦血流減少誘導(dǎo)的行為退化。提示rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)作用，其能對(duì)抗表現(xiàn)為于人類血管起因的癡呆的功能性退化，在此意義上該結(jié)果是優(yōu)異的。權(quán)利要求1.包含具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑，其特征在于制成的形式通過鼻途徑給藥。2.根據(jù)權(quán)利要求1的包含具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑，其特征在于制成的形式是滴鼻劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1的包含具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑，其特征在于制成的形式是鼻噴霧劑。4.根據(jù)權(quán)利要求l、2和3的包含具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑，其特征在于使用生物粘附性聚合物，例如羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)和曱基纖維素(MC)。5.根據(jù)權(quán)利要求l、2和3的包含具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑，其特征在于使用抗微生物的防腐劑，例如苯扎氯銨、三氯叔丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯。6.根據(jù)權(quán)利要求3、4和5的包含具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑，其特征在于使用蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如L-色氨酸、L-亮氨酸、鹽酸L-精氨酸和/或鹽酸L-組氨酸和/或它們的鹽。7.根據(jù)權(quán)利要求l的鼻用制劑，其用于治療急性或慢性腦血管、精神病學(xué)或神經(jīng)變性性疾病、新生兒缺氧、心血管原因引起的缺氧、事故、創(chuàng)傷、中毒、癡呆、記憶喪失、精神能力降低、精神退化、由疾病引起的神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)、生理系統(tǒng)的損傷或改變、疾病引起的精神病學(xué)表現(xiàn)、生理系統(tǒng)的損傷或改變、外周性疾病產(chǎn)生的神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)、外周性疾病產(chǎn)生的精神病學(xué)表現(xiàn)、癲癇產(chǎn)生的神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)。全文摘要本發(fā)明涉及生物制藥工業(yè)，特別涉及藥物的開發(fā)，該藥物擬用于治療腦血管、神經(jīng)變性和精神病學(xué)疾病，并含有效成分重組人促紅細(xì)胞生成素(rh-Epo)和低濃度的唾液酸。在rh-Epo生產(chǎn)過程中，當(dāng)用(堿性)唾液酸保護(hù)小于40％的該糖蛋白分子時(shí)，獲得的該糖蛋白有不同濃度的唾液酸，再這種情況下，以全身性途徑給藥它是無生物活性的并且被肝酶失活。令人意外地的是，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻施用的堿性rh-Epo比酸性rh-Epo具有更大的治療益處。本發(fā)明的堿性rh-Epo鼻用制劑包括生物粘附性聚合物，其增加在鼻腔內(nèi)的停留時(shí)間，從而提高其治療效果。所述制劑也包括其它輔助性物質(zhì)，例如防腐劑物質(zhì)、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。文檔編號(hào)A61P9/00GK101296692SQ200680034781公開日2008年10月29日申請(qǐng)日期2006年7月27日優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日發(fā)明者A·馬諾茲塞爾納達(dá),D·庫爾貝羅羅德里古茲,I·索薩特斯特,J·C·加西亞羅德里古茲,J·D·加西亞塞爾曼,J·克魯茲羅德里古茲,N·蘇比洛斯瑪提內(nèi)茲,Y·納恩茲費(fèi)古爾利多,Z·帕爾多盧茲申請(qǐng)人:藥物研發(fā)中心