專(zhuān)利名稱(chēng)：：胰高血糖素受體表達(dá)的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文公開(kāi)了用于調(diào)節(jié)胰高血糖素受體在細(xì)胞、組織或動(dòng)物中的表達(dá)的4t合物、纟且合物禾口方法。
背景技術(shù)：
：正常高血糖的保持是一種精細(xì)調(diào)節(jié)的代謝事件。胰高血糖素是一種29個(gè)氨基酸的肽，其負(fù)責(zé)保持血糖水平，通過(guò)激活肝臟糖酵解和糖異生而增加葡萄糖從肝臟釋放，并且也刺激脂肪組織中的脂解。在餐后狀態(tài)，當(dāng)消耗外源葡萄糖，導(dǎo)致高血糖水平時(shí)，胰島素逆轉(zhuǎn)胰高血糖素介導(dǎo)的糖酵解和糖異生增強(qiáng)。在糖尿病患者中，胰島素不能利用或不完全有效。盡管糖尿病的治療常規(guī)致力于增加胰島素水平，已經(jīng)將胰高血糖素功能的拮抗考慮為替代療法。由于胰高血糖素通過(guò)經(jīng)由胰高血糖素受體(也稱(chēng)作GCGR或GR)的信號(hào)傳遞而施加其生理作用，已經(jīng)提出將胰高血糖素受體作為糖尿病的潛在治療輩巴(Madsenetal.,Cwr.Z)".，1999,5,683-691)。胰高血糖素受體屬于G-蛋白偶聯(lián)的受體超家族，其具有7次跨膜的結(jié)構(gòu)域。它也是結(jié)合于結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于胰高血糖素的肽的同源受體的更小亞家族。在1994年克隆了編碼人胰高血糖素受體的基因，基因組序列分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)內(nèi)含子和與大鼠胰高血糖素受體基因的82%同一性(Lok等人，1994,"0,203-209.;MacNeiletal.,^ocAem.Ao;^:^.Coww朋.，1994,/卵，328-334)。大鼠胰高血糖素受體基因的克隆也導(dǎo)致多種可變剪接變體的描述(Maget等人，/^萬(wàn)S丄ert.，1994,35/,271-275)。美國(guó)專(zhuān)利5，776，725公開(kāi)了一種編碼人或大鼠胰高血糖素受體的分離的核酸序列(Kmdsvogel等人，1998)。人胰高血糖素受體基因位于染色體17q25(Menzel等人，Ge"ds，1994，，，327-328)。胰高血糖素受體基因中密碼子40的Gly錯(cuò)義突變?yōu)镾er,導(dǎo)致對(duì)胰高血糖素的親和力降4氐3倍(Fujisawa等人，D,W"o/og叫1995,3S,983-985)，并且該突變與一些疾病狀態(tài)相關(guān)，包括非胰島素依賴(lài)性糖尿病(Fujisawa等人，Z)zWeto/og叫1995,3S,983-985)、高血壓(ChambersandMoms,Ato.Gew".,1996,",122)和中樞性肥胖(Siam等人，(9&&Wm.，2001,9,722-726)。小鼠中胰高血糖素受體基因的靶向破壞顯示，盡管完全不存在胰高血糖素受體和升高的血漿胰高血糖素水平，小鼠仍然保持幾乎正常的高血糖和高脂血癥(Parker等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,2002,290，839-843)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及靶向編碼GCGR的核酸分子且可與編碼GCGR的核酸分子雜交的寡聚化合物，所述寡聚化合物調(diào)節(jié)GCGR的表達(dá)并且與靶向GCGR的、包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的缺口區(qū)域的寡核苷酸相比，具有改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)。本文提供了被稱(chēng)為"缺口聚體(gapmers)"的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含在5，和3，末端中的每一個(gè)上與"翼"側(cè)接的脫氧核苷酸區(qū)域或"缺口，，，所述"翼，，包含l-4個(gè)2，-〇-(2-甲氧乙基)核苦酸。本發(fā)明的寡核普酸的脫氧核苦酸區(qū)域包含超過(guò)10個(gè)脫氧核苦酸，因此與包含10個(gè)脫氧核苦酸的缺口區(qū)域的嵌合化合物，例如美國(guó)公開(kāi)US2005-0014713(所述專(zhuān)利整體引入本文作為參考)中例示的化合物比較，本發(fā)明的缺口聚體是"缺口加寬的"。發(fā)現(xiàn)靶向GCGR的缺口加寬的寡核苷酸的腎濃度相對(duì)于具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苦酸的區(qū)域的寡核苷酸降低，同時(shí)維持寡核苷酸肝中的良好到優(yōu)越的效力。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括靶向GCGR的缺口加寬的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的腎濃度相對(duì)于具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域的寡核苷酸降低。本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括耙向GCGR的缺口加寬的寡核苦酸，其中所述寡核苷酸的腎濃度相對(duì)于具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苦酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域的寡核苷酸相似或降低，同時(shí)維持或改善在靶組織例如肝中的效力。在某些實(shí)施方案中，與具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2'-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸區(qū)域的寡核苷酸比較，缺口加寬的寡核苷酸具有相似或改善的效力，而沒(méi)有寡核苷酸在肝中的積聚增加。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括靶向GCGR的缺口加寬的寡核苷酸，其中效力與具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域的寡核苷酸相似或更佳，而沒(méi)有寡核苷酸在靶組織中的積聚增加。進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織或動(dòng)物中的GCGR表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞、組織或動(dòng)物與本發(fā)明的一種或多種化合物或組合物接觸。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物或組合物可以用于減少細(xì)胞、組織或動(dòng)物中的GCGR表達(dá)。本發(fā)明包括藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的反義寡核苷酸并任選包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或增強(qiáng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用本文描述的寡聚化合物降低血糖的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用本文描述的寡聚化合物增加GLP-1水平的方法。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改善或減輕動(dòng)物中狀況的嚴(yán)重程度的方法，包括使動(dòng)物與有效量的本發(fā)明的寡聚化合物或藥物組合物接觸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改善或減輕動(dòng)物中狀況的嚴(yán)重程度的方法，包括使動(dòng)物與有效量的本發(fā)明的寡聚化合物或藥物組合物接觸，從而減少GCGR的表達(dá)，并且所述狀況的一種或多種身體指征的測(cè)量表明所述狀況的嚴(yán)重程度減輕。在一些實(shí)施方案中，所述疾病或狀況是代謝疾病或狀況。在一些實(shí)施方案中，所述狀況包括但不限于糖尿病、肥胖、胰島素抵抗和胰島素缺乏。在一些實(shí)施方案中，所述糖尿病是2型糖尿病。在另一實(shí)施方案中，所述狀況是代謝綜合征。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肥胖是飲食誘導(dǎo)的。也提供了預(yù)防或延遲動(dòng)物中的血糖水平開(kāi)始升高的方法，包括給所述動(dòng)物施用本發(fā)明的化合物或藥物組合物。也提供了保持P-細(xì)胞功能的方法。本申請(qǐng)還與整體引入作為參考的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/718,685相關(guān)。本申請(qǐng)還與各自整體？I入本文作為參考的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/231,243和PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2005/033837相關(guān)。詳述概述本文公開(kāi)了用于在編碼GCGR的核酸分子表達(dá)調(diào)節(jié)中使用的寡聚化合物，包括反義寡核苷酸和其他反義化合物。這通過(guò)提供與一種或多種編碼GCGR的靶核酸分子雜交的寡聚化合物來(lái)完成。依照本發(fā)明的是用于調(diào)節(jié)GCGR(也稱(chēng)為胰高血糖素受體或GR)表達(dá)的組合物和方法。表1中列舉了可以用于設(shè)計(jì)靶向GCGR的寡聚化合物的序列的GENBANK⑧登記號(hào)。本發(fā)明的寡聚化合物包括與表1中所示的一種或多種靶核酸分子雜交的寡聚化合物，以及與編碼GCGR的其他核酸分子雜交的寡聚化合物。寡聚化合物可以靼向編碼GCGR的核酸分子的任何區(qū)域、片段或位點(diǎn)。合適的革巴區(qū)域、片段和位點(diǎn)包括但不限于，5，UTR、起始密碼子、終止密碼子、編碼區(qū)、3，UTR、5，帽區(qū)、內(nèi)含子、外顯子、內(nèi)含子-外顯子連接處、外顯子-內(nèi)含子連接處、和外顯子-外顯子連接處。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>活性寡聚化合物將與之雜交的輩巴核酸上的位置在下文中被稱(chēng)為"驗(yàn)證的耙片段"。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"驗(yàn)證的耙片段"被定義為活性寡聚化合物所耙向的耙區(qū)域的至少8個(gè)核堿基的部分。盡管不希望被理論束縛，但目前認(rèn)為這些靶片段代表容易進(jìn)行雜交的靶核酸的部分。本發(fā)明包括是嵌合化合物的寡聚化合物。嵌合化合物的例子是具有由非脫氧核苷酸區(qū)域或"翼"側(cè)接的2，個(gè)脫氧核苷酸區(qū)域或"缺口"的缺口聚體。盡管不希望被理論束縛，但缺口聚體的缺口提供了當(dāng)與RNA耙結(jié)合時(shí)可由RNA酶H識(shí)別的底物，而翼不是最佳底物4旦可以賦予其他性質(zhì)，例如促成雙鏈體穩(wěn)定性或有利的藥代動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。每個(gè)翼可以是一種或多種非脫氧寡核苷酸單體。在一個(gè)實(shí)施方案中，缺口聚體包含在5，和3，末端中的每一個(gè)上由2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸的翼側(cè)接的16個(gè)2'個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。這被稱(chēng)為2-16-2缺口聚體。因此，這種嵌合寡聚化合物或缺口聚體的"基序"是2-16-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所有核苷間鍵都是硫代磷酸酯鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，缺口聚體的胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。本發(fā)明的實(shí)施方案包括包含長(zhǎng)度為13-26個(gè)核苷酸的序列并且包含在5，和3，末端的每一個(gè)上與至少一個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接，長(zhǎng)度超過(guò)10個(gè)核堿基的脫氧核苷酸區(qū)域的寡聚化合物。優(yōu)選的"缺口加寬的，，寡核苷酸在寡核苷酸的缺口部分中包含11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)或18個(gè)脫氧核苷酸。長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基的反義寡核苷酸也是優(yōu)選的。優(yōu)選的5'和3'側(cè)翼區(qū)包含l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸。優(yōu)選的缺口加寬的寡核苦酸具有包括1-18-1、1-17-2、2-17-1、2-16-2、3-14-3和4-12-4的基序。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡聚4匕合物耙向GCGRRNA或與GCGRRNA雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚化合物減少GCGRRNA的表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，寡聚化合物減少GCGR的表達(dá)，其中GCGR的表達(dá)減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%。本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選包括其中所述寡核苷酸的腎濃度相對(duì)于具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域的寡核苷酸降低的那些。本發(fā)明的寡核苷酸包含其中所述寡核苷酸的腎濃度相對(duì)于具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域的寡核苷酸的那些相似或降低的那些。本發(fā)明的寡核普酸包括其中關(guān)于肝中的靶減少的效力或療效與具有相同序列但包含在5，和3，末端上都與5個(gè)2，-O-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的10個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域的寡核苷酸的那種相似或更佳，而沒(méi)有寡核苷酸在組織中的增加積聚的那些。本發(fā)明提供了靶向編碼GCGR的核酸分子、長(zhǎng)度為13-26個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含第一個(gè)區(qū)域、第二個(gè)區(qū)域和第三個(gè)區(qū)域，其中所述第一個(gè)區(qū)域包含至少11個(gè)脫氧核苷酸并且其中所述第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域包含1-4個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸，所述第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域在所述第一個(gè)區(qū)域的5，和3，末端上側(cè)接第一個(gè)區(qū)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，"缺口"區(qū)域包含ll個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)或18個(gè)核堿基。在某些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基。寡聚化合物可以包含約8-約80個(gè)核堿基(即約8-約80個(gè)連接的核普)，優(yōu)選地約13-約26個(gè)核堿基。本領(lǐng)域普通沖支術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解預(yù)期的優(yōu)選的寡聚化合物包括長(zhǎng)度為13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)或26個(gè)核堿基的化合物。本發(fā)明的化合物包括這樣的寡核苷酸序列，其包含來(lái)自舉例說(shuō)明性反義化合物之一的5'末端的至少8個(gè)連續(xù)核堿基(剩余核堿基是相同寡核苷酸的連續(xù)段，其在可與靶核酸特異性雜交的反義化合物的5，末端緊鄰的上游開(kāi)始，且持續(xù)直至寡核苷酸包含約13-約26個(gè)核堿基)。其他化合物可以由這樣的寡核苷酸序列表示，其包含來(lái)自舉例說(shuō)明性反義化合物之一的3'末端的至少8個(gè)連續(xù)核堿基(剩余核堿基是相同寡核苷酸的連續(xù)段，其在可與靶核酸特異性雜交的反義化合物的3，末端緊鄰的下游開(kāi)始，且持續(xù)直至寡核苷酸包含約13_約26個(gè)核堿基)。還應(yīng)當(dāng)理解化合物可以由這樣的寡核苷酸序列表示，其包含來(lái)自舉例說(shuō)明性化合物的序列內(nèi)部部分的至少8個(gè)連續(xù)核堿基，并且可以在2個(gè)方向的任一方向或2個(gè)方向上延伸直至寡核苷酸包含約13-約26個(gè)核堿基。本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的核堿基序列的反義寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的核堿基序列的至少8個(gè)核堿基的部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，所述寡核苷酸輩巴向編碼GCGR的核酸分子，并且包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的至少8個(gè)核石咸基的部分，其中所述寡核苷酸包含長(zhǎng)度為12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)或18個(gè)核石威基的脫氧核苷酸區(qū)域，所述脫氧核普酸區(qū)域在其5，和3，末端上與1-4個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接，并且其中所述寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)是對(duì)稱(chēng)的(在5，側(cè)翼區(qū)中具有與3，側(cè)翼區(qū)中相同數(shù)目的核香酸)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)是不對(duì)稱(chēng)的(與3，側(cè)翼區(qū)比較，在5，側(cè)翼區(qū)中具有不同數(shù)目的核苷酸)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有SEQIDNO:4或SEQIDN0:2的核堿基序列的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸的特征在于在5，和3，末端上與4個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的12個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域，在5，和3，末端上與2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域，在5，和3，末端上與1個(gè)或2個(gè)2，_0一(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的17個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域，或在5，和3，末端上與1個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的18個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷間鍵。經(jīng)修飾的核苷間鍵包括硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸中的所有核苷間鍵都是硫代磷酸酯鍵。本發(fā)明的反義寡核苷酸還可以包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在另一實(shí)施方案中，所有的胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，其具有SEQIDNO:2的序列，特征在于在5，和3，末端上與2個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域，其中每個(gè)鍵都是硫代磷酸酯鍵，并且每個(gè)胞嘧啶都是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:2的核石成基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與4個(gè)2'-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的12個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苦酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核普酸具有SEQIDNO:2的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與3個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的14個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:2的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有其5，和3，末端上與2個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:2的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與l個(gè)或2個(gè)2，-O-(2-曱氧乙基)核苦酸側(cè)接的17個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:2的核石咸基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與1個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的18個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苦酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核香間鍵是^L代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:4的核石咸基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與4個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的12個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNCh4的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與3個(gè)2'-O-(2-曱氧乙基)核普酸側(cè)接的14個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:4的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與2個(gè)2，-O-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:4的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3，末端上與1個(gè)或2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的17個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有SEQIDNO:4的核堿基序列，其中所述反義寡核苷酸具有在5，和3'末端上與1個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的18個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。本文還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的反義寡核苷酸并任選包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增強(qiáng)劑或賦形劑。本發(fā)明的化合物還可以在用于治療與由GCGR介導(dǎo)的胰高血糖素作用相關(guān)的疾病和病癥的藥物制備中〗吏用。述方法包括使所述細(xì)胞或組織與本發(fā)明的反義寡核苷酸或藥物組合物接觸，降低動(dòng)物中的血糖水平、血甘油三酯水平或血膽固醇水平的方法，所述方法包括給所述動(dòng)物施用本發(fā)明的反義寡核苷酸或藥物組合物。血液水平可以是血漿或血清水平。還涉及改善胰島素壽丈感性的方法，增加GLP-1水平的方法，和抑制動(dòng)物中的肝葡萄糖排出的方法，所述方法包括給所述動(dòng)物施用本發(fā)明的反義寡核苷酸或藥物組合物。增加的胰島素敏感性可以由循環(huán)胰島素水平中的降低來(lái)指示。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括治療具有與經(jīng)由GCGR的胰高血糖素活性相關(guān)的疾病或狀況的動(dòng)物的方法，所述方法包括給所述動(dòng)物施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的反義寡核苷酸或藥物組合物。疾病或狀況可以是代謝疾病或狀況。在某些實(shí)施方案中，代謝疾病或狀況是糖尿病、高血糖癥、高脂血癥、代謝綜合征X、肥胖、原發(fā)性高胰高血糖素血癥(hyperglucagonemia)、胰島素缺乏或胰島素抵抗。在某些實(shí)施方案中，所述糖尿病是2型糖尿病。在某些實(shí)施方案中，肥胖是飲食誘導(dǎo)的。在某些實(shí)施方案中，高脂血癥與升高的血脂水平相關(guān)。脂質(zhì)包括膽固醇和甘油三酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，狀況是肝脂肪變性。在某些實(shí)施方案中，脂肪變性是脂肪肝或非酒精性脂肪肝。還提供了用本文描述的寡聚化合物預(yù)防或延遲動(dòng)物中血糖或血脂水平開(kāi)始升高的方法，以及保持P-細(xì)胞功能的方法。本發(fā)明的化合物可以用于調(diào)節(jié)有需要的動(dòng)物例如人中的GCGR表達(dá)。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，該方法包括給所述動(dòng)物施用有效量的反義化合物的步驟，所述反義化合物減少GCGR的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物有效減少GCGRRNA的水平或功能。因?yàn)镚CGRmRNA水平的減少也可以導(dǎo)致表達(dá)的GCGR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變，使用此類(lèi)所得到的改變也可以進(jìn)行測(cè)量。有效減少GCGRRNA或表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平或功能的本發(fā)明反義化合物被視為活性反義化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，如通過(guò)本文例示的測(cè)定法測(cè)量的，本發(fā)明的反義化合物減少GCGR的表達(dá)，引起RNA減少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。過(guò)多實(shí)驗(yàn)的條件下鑒定其它反義化合物。"反義機(jī)制"是涉及化合物與靶核酸雜交的所有那些，其中雜交的結(jié)果或效應(yīng)是耙降解或耙占據(jù)，伴隨涉及例如轉(zhuǎn)錄或剪接的細(xì)胞機(jī)制停止。乾如本文所使用的，為了方便起見(jiàn)，術(shù)語(yǔ)"靶核酸"和"編碼GCGR的核酸分子，，已用于包含編碼GCGR的DNA,由此類(lèi)DNA轉(zhuǎn)錄的RNA(包括前-mRNA和mRNA或其部分)，以及由此類(lèi)RNA衍生的cDNA。區(qū)域、片段和位點(diǎn)少一個(gè)J巴區(qū)域、片段、或位點(diǎn)，從而使得將導(dǎo)致所需效應(yīng)，、例如表達(dá)的調(diào)節(jié)。"區(qū)域"被定義為具有至少一種可鑒定的結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的區(qū)域內(nèi)是片段。"片段"^f皮定義為靶核酸內(nèi)的區(qū)域的較小或亞部分。如本發(fā)明所使用的，"位點(diǎn)"被定義為靶核酸內(nèi)的獨(dú)特核堿基位置。一旦鑒定一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域、片段或位點(diǎn)，就設(shè)計(jì)與靶充分互補(bǔ)的寡聚化合物，即充分良好地雜交并且具有足夠的特異性，以產(chǎn)生所需效應(yīng)。變體本領(lǐng)域還已知的是由DNA的相同基因組區(qū)域可以產(chǎn)生可變RNA轉(zhuǎn)錄物。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱(chēng)為"變體"。更具體而言，"前mRNA變體"是由相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物在其起始或終止位置方面不同于由相同基因組DNA產(chǎn)生的其他轉(zhuǎn)錄物，并且包含內(nèi)含子和外顯子序列。在剪接過(guò)程中一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或其部分切除后，前mRNA變體產(chǎn)生較小的"mRNA變體"。因此，mRNA變體由前mRNA變體進(jìn)行加工，并且由于剪接，每個(gè)獨(dú)特的前mRNA變體必須始終產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱(chēng)為"可變剪接變體"。如果不存在前mRNA的剪接，那么前mRNA變體等同于mRNA變體。本領(lǐng)域還已知的是變體可以通過(guò)使用可變信號(hào)以起始或終止轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生，并且前mRNAs和mRNAs可以具有超過(guò)一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。源于4吏用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體一皮稱(chēng)為那種前mRNA或mRNA的"可變起始變體"。^f吏用可變終止密碼子的那些轉(zhuǎn)錄物一皮稱(chēng)為那種前mRNA或mRNA的"可變終止變體"?？勺兘K止變體的一種具體類(lèi)型是"聚腺苷酸變體"，其中產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物來(lái)源于通過(guò)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的"聚腺苷酸終止信號(hào)，，之一的可變選擇，從而產(chǎn)生在獨(dú)特的聚腺苷酸位點(diǎn)處終止的轉(zhuǎn)錄物。因此，本文描述的變體類(lèi)型也是合適的靶核酸。乾《i^^源，"調(diào)節(jié)"意指功能干擾，例如，表達(dá)中的增加(刺激或誘導(dǎo))或降低(抑制或減少)。作為另一個(gè)例子，表達(dá)的調(diào)節(jié)可以包括干擾前mRNA加工的剪接位點(diǎn)選擇。"表達(dá)"包括基因的編碼信息通過(guò)其轉(zhuǎn)變成細(xì)胞中存在和運(yùn)作的結(jié)構(gòu)的所有功能。這些結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物。"表達(dá)的調(diào)節(jié)"意指此類(lèi)功能的干擾。"調(diào)節(jié)劑"是調(diào)節(jié)GCGR表達(dá)并且包含與有效耙片段互補(bǔ)的至少8核堿基部分的那些化合物。耙核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過(guò)改變?nèi)魏螖?shù)目的核酸(DNA或RNA)功能來(lái)達(dá)到。待調(diào)節(jié)的DNA功能可以包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。復(fù)制和轉(zhuǎn)錄例如可以來(lái)自?xún)?nèi)源性細(xì)胞^t板、載體、質(zhì)粒構(gòu)建體或其他。待調(diào)節(jié)的RNA功能可以包括易位功能，這包括但不限于，RNA易位至蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)，RNA易位至細(xì)月包內(nèi)遠(yuǎn)離RNA合成位點(diǎn)的《立點(diǎn)，和來(lái)自RNA的蛋白質(zhì)翻譯。可以進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA加工功能包括但不限于，RNA剪接以產(chǎn)生一種或多種RNA種類(lèi)、RNA加帽、RNA的3，成熟和可以由RNA參與或由RNA促進(jìn)的涉及RNA的催化活性或復(fù)合物形成。表達(dá)的調(diào)節(jié)可以暫時(shí)地或通過(guò)凈穩(wěn)態(tài)水平導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)核酸種類(lèi)的水平增加，或一個(gè)或多個(gè)核酸種類(lèi)的水平降低。對(duì)于靶核酸功能的此類(lèi)干擾的一種結(jié)果是GCGR表達(dá)的調(diào)節(jié)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的調(diào)節(jié)可以意指靶RNA或蛋白質(zhì)水平的增加或降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的調(diào)節(jié)可以意指一種或多種RNA剪接產(chǎn)物的增加或降低，或2種或更多剪接產(chǎn)物比率的改變。染x/口i辦嫂"雜交，，意指寡聚化合物的互補(bǔ)鏈配對(duì)。盡管不限制于具體機(jī)制，但最常見(jiàn)的配對(duì)機(jī)制涉及在寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核堿基)之間的氫鍵結(jié)合，所述氫鍵結(jié)合可以是沃森-克里克、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵結(jié)合。例如，腺。票呤和胸腺嘧啶是通過(guò)形成氫鍵配對(duì)的互補(bǔ)核堿基。雜交可以在不同環(huán)境下發(fā)生。當(dāng)在希望特異性結(jié)合在體外測(cè)定法的情況下進(jìn)行測(cè)定的條件下，存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免寡聚化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合時(shí)，寡聚化合物是可特異性雜交的。"嚴(yán)格雜交條件"或"嚴(yán)格條件"指寡聚化合物將與其靶序列雜交，但與最少數(shù)目的其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴(lài)性的，并且在不同環(huán)境下將是不同的，并且寡聚化合物與靶序列雜交的"嚴(yán)格條件""^:本文所使用的，"互補(bǔ)性"指i;或2條寡聚化合物鏈上的2個(gè)核堿基之間精確配對(duì)的能力。例如，如果反義化合物的某個(gè)位置上的核堿基能夠與靶核酸的某個(gè)位置上的核堿基氳鍵鍵合，那么寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵鍵合位置被視為互補(bǔ)位置。當(dāng)每個(gè)分子中足夠數(shù)目的互補(bǔ)位置由可以與彼此氪鍵鍵合的核堿基占據(jù)時(shí)，寡聚化合物和進(jìn)一步的DNA或RNA彼此互補(bǔ)。因此，"可特異性雜交的，，和"互補(bǔ)的"是用于指示在足夠數(shù)目的核堿基上足夠程度的精確配對(duì)或互補(bǔ)性，從而使得穩(wěn)定和特異性結(jié)合在寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生的術(shù)語(yǔ)。本領(lǐng)域中理解，寡聚化合物的序列無(wú)需與其可特異性雜交的靶核酸的序列100%互補(bǔ)。此外，寡核苷酸可以在一個(gè)或多個(gè)片段上雜交，從而使得插入或鄰近片段不參與雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物與其靶向的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域包含至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少92%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的序列互補(bǔ)性。例如，其中反義化合物的20個(gè)核石咸基中的18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)并且因此是可特異性雜交的寡聚化合物，將表示90%的互補(bǔ)性。在這個(gè)例子中，剩余的非互補(bǔ)核堿基可以成簇或散布在互補(bǔ)核堿基內(nèi)并且無(wú)需彼此鄰接或與互補(bǔ)核堿基鄰接。因此，長(zhǎng)度為18個(gè)核堿基，具有由與輩巴核酸完全互補(bǔ)的2個(gè)區(qū)域側(cè)接的4個(gè)(四個(gè))非互補(bǔ)核堿基的寡聚化合物將與耙核酸具有77.8%的總互補(bǔ)性，并且因此將包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。寡聚化合物與輩巴核酸區(qū)域的互補(bǔ)性百分比可以使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對(duì)檢索工具)和PowerBLAST程序進(jìn)行常規(guī)測(cè)定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410;Zhang和Madden,GenomeRes.，1997,7,649-656)。同源性百分比、序列同一性或互補(bǔ)性可以通過(guò)例如Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,MadisonWI),使用缺省i殳置進(jìn)行測(cè)定，所述Gap程序4吏用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)的算法。術(shù)語(yǔ)"寡聚化合物，，指能夠與核酸分子區(qū)域雜交的聚合結(jié)構(gòu)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸類(lèi)似物、寡核苷酸模擬物和這些他:式制備成:;l的。此外，分支結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已二的、。"反義:合物:，或"反義寡聚化合物，，指與核酸分子區(qū)域至少部分互補(bǔ)的寡聚化合物，所述核酸分子與之雜交并且調(diào)節(jié)(增加或降低)其表達(dá)。因此，盡管所有反義化合物都可以說(shuō)成寡聚化合物，但并非所有寡聚化合物都是反義化合物。"反義寡核苷酸"是這樣的反義化合物，其是基于核酸的寡聚物。反義寡核苷酸可以進(jìn)行化學(xué)修飾。寡聚化合物的非限制性例子包括引物、探針、反義化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接子和siRNAs。因此，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、環(huán)狀、分支或發(fā)夾的形式引入，并且包含結(jié)構(gòu)元件例如內(nèi)部或末端突起或環(huán)。寡聚雙鏈化合物可以是雜交的2條鏈以形成雙鏈化合物，或具有足夠的自我互補(bǔ)性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。在本發(fā)明上下文中的"嵌合，，寡聚化合物或"嵌合體"是單或雙鏈寡聚化合物，例如寡核苷酸，其包含2個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同的區(qū)域，各自包含至少一個(gè)單體單位，即，在寡聚化合物的情況下是核苷酸。"缺口聚體"被定義為具有由非脫氧寡核苷酸片段側(cè)接的2'-脫氧寡核苷酸區(qū)域的寡聚化合物，一般是寡核苷酸。中央?yún)^(qū)被稱(chēng)為"缺口"。側(cè)接片段被稱(chēng)為"翼"。如果翼之一具有0個(gè)非脫氧寡核苷酸單體，那么描述了"半聚體，，。術(shù)語(yǔ)"非酒精性脂肪性肝病"(NAFLD)包含從肝細(xì)胞中的簡(jiǎn)單甘油三酯積聚(肝脂肪變性)到具有炎癥(脂肪肝)、纖維化和硬化的肝脂肪變性的疾病i普。非酒精性脂肪肝(NASH)由NAFLD超過(guò)甘油三酯沉積的進(jìn)展而發(fā)生。能夠誘導(dǎo)壞死、炎癥和纖維化的第二擊是NASH發(fā)展所需的。關(guān)于第二擊的候選物可以分成廣泛的種類(lèi)引起氧化應(yīng)激增加的因子和促進(jìn)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的因子。已提出增加的肝臟甘油三酯導(dǎo)致動(dòng)物和人肝細(xì)胞中增加的氧化應(yīng)激，表明肝臟甘油三酯積聚、氧化應(yīng)激和肝脂肪變性進(jìn)展至NASH之間潛在的原因和效應(yīng)關(guān)系(Browning和Horton,J.C//"./"veW.,2004,"么147-152)。高甘油三酯血癥和高脂肪酸血癥(hyperfattyacidemia)可以引起周?chē)M織中的甘油三酯積聚(Shimamura等人,B/oc/zew.6z'o//zj^.CV9淤otw".,2004,322,1080-1085)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)施用預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的寡聚化合物減少動(dòng)物肝中的脂質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)施用預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的寡聚化合物治療動(dòng)物中的肝脂肪變性的方法。在某些實(shí)施方案中，脂肪變性是脂肪肝。在某些實(shí)施方案中，脂肪變性是NASH。必夢(mèng)滲謬經(jīng)修飾和可替代的核堿基本發(fā)明的寡聚化合物還包括不同的堿基存在于化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上的變體。例如，如果第一種核苷酸是腺苷，那么可以產(chǎn)生在那個(gè)位置上包含胸普、鳥(niǎo)苦或胞苦的變體。這可以在寡聚化合物的任何位置上進(jìn)行。這些化合物隨后使用本文描述的方法進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)以確定其使GCGRmRNA表達(dá)減少的能力。寡聚化合物還可以包括核堿基(在本文中通常稱(chēng)為雜環(huán)堿基或簡(jiǎn)單地"堿基，，)修飾或取代。如本文所使用的，"未修飾的"或"天然的"核堿基包括。票呤堿基腺噤呤(A)和鳥(niǎo)。票呤(G),以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。"取代"是用另一種未修飾的或天然的堿基替換未修飾的或天然的堿基。"經(jīng)修飾的"核堿基意指其他合成的和天然的核堿基例如5-曱基胞嘧啶(5-me-C),5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物，腺噤呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-CeC-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧咬、胞嘧咬和胸腺嘧咬，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-石危尿嘧啶，8-鹵素、8-氨基、8-巰基、8-烷硫基、8-羥基及其他8-取代腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，5-卣代特別是5-溴、5-三氟曱基及其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶，7-曱基鳥(niǎo)噤呤和7-曱基腺嘌呤，2-F-腺。票呤，2-氨基-腺噤呤，8-氮鳥(niǎo)噤呤和8-氮腺噤呤，7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤，7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。進(jìn)一步修飾的核堿基包括三環(huán)嘧咬例如吩嗜嗪胞苷UH-嘧。定并(5，4-b)(1,4)苯并嚙。秦-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(lH-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并p塞溱-2(3H)-酮)，G-夾(clamps)例如取代的吩嘈秦胞苦(例如9-(2陽(yáng)氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并喁嗪-2(3H)-酮)，。卡唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮),吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3',2':4,5)吡咯并(2,3-d)嘧咬-2-酮)。經(jīng)4f飾的核石成基還可以包括噤呤或嘧啶堿基替換為其他雜環(huán)的那些，例如7-脫氮-腺嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。更多的核堿基包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,687,808中公開(kāi)的那些，T7zeC露we五wqyc/，力"(9/尸—膨rSc柳ceJwc/5Vgz"een'"g,第858-859頁(yè)，Kroschwitz,J丄，編輯JohnWiley&Sons,1990中7>開(kāi)的那些,由Englisch等人，爿"geH^wc//^C7ze/m'e,InternationalEdition,1991,30,613描述的那些,和由Sanghvi,Y.S.,第15章，j/7"《eraei^earc/z朋J卻/^'ca"'ora,第289-302頁(yè),Crooke，S.T.和Lebleu,B.,編輯，CRCPress,1993公開(kāi)的那些。這些核石咸基中的某些是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為適合于增加本發(fā)明的化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代嘧啶，6-氮嘧咬和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺噪呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取4義已顯示4吏核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0.6-1.2°C,并且是目前合適的堿基取代，甚至更特別是當(dāng)與2'-〇-甲氧乙基糖修飾組合時(shí)。本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解堿基修飾不會(huì)使得此類(lèi)化學(xué)修飾能夠在核酸序列中產(chǎn)生取代。教導(dǎo)了上述經(jīng)修飾的核堿基中的某些以及其他經(jīng)修飾的核堿基的制備的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，上文描述的U.S.3,687,808，以及U.S.:4,845,205;5，130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5，525，711;5,552,540;5,587,469;5,594,121,5,596,091;5,614,617;5,645,985;5,830,653;5,763,588;6,005,096;5,681,941;和5，750,692。本發(fā)明的寡聚化合物還可以包括多環(huán)雜環(huán)化合物代替一個(gè)或多個(gè)天然存在的雜環(huán)堿基部分。許多三環(huán)雜環(huán)化合物先前已得到報(bào)道。這些化合物常規(guī)地用于反義應(yīng)用中以增加經(jīng)修飾的鏈與靶鏈的結(jié)合性質(zhì)。研究最多的修飾靶向鳥(niǎo)苷，因此它們已命名為G-夾或胞苷類(lèi)似物。在第二條鏈中與鳥(niǎo)苷形成3個(gè)氫鍵的代表性胞嘧啶類(lèi)似物包括1,3-二氮雜吩哺秦隱2-酉同(Kurchavov,等人,TVwc/eow'tsfesA/wc/eC<afey,1997,16，1837-1846),1,3-二氮雜吩噻漆-2-酮,(Lm,K,Y.;Jones,R.J.;Matteucci,M.J.Am.Chem.Soc.1995,117，3873-3874)和6,7,8,9隱四氟-l,3-二氮雜p分伊惡口秦-2陽(yáng)酉同(Wang,丄；Lin，K,Y.,Matteucci,M.TetrahedronLett.1998,39,8385-8388)。摻入寡核苷酸內(nèi)的這些堿基修飾顯示與互補(bǔ)鳥(niǎo)噤呤雜交，并且后者也顯示與腺嘌呤雜交并且通過(guò)延伸的疊加相互作用增強(qiáng)螺旋的熱穩(wěn)定性(還參見(jiàn)美國(guó)授權(quán)前公開(kāi)20030207804和20030175卯6)。當(dāng)胞嘧啶類(lèi)似物/取代物具有與剛性1,3-二氮雜吩嗜嗪-2-酮支架附著的氨基乙氧基部分時(shí)，已觀察到進(jìn)一步的螺旋穩(wěn)定性質(zhì)(Lin,K.-Y.;Matteucci,M.J.Am.Chem.Soc.1998,120，8531-8532)。結(jié)合研究證實(shí)單個(gè)摻入可以增強(qiáng)模型寡核苷酸與其互補(bǔ)革巴DNA或RNA的結(jié)合親和力，其中相對(duì)于5-曱基胞嘧啶(dC5me)，ATm最高達(dá)18。C,這是關(guān)于單個(gè)修飾的高親和力增加。另一方面，螺旋穩(wěn)定性中的增加不會(huì)破壞寡核苷酸的特異性。適于在本發(fā)明中使用的更多的三環(huán)雜環(huán)化合物和使用其的方法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利6,028,183和6,007,992中。吩噹嗪衍生物增強(qiáng)的結(jié)合親和力連同其不受破壞的序列特異性使得它們成為有價(jià)值的核堿基類(lèi)似物用于開(kāi)發(fā)更有效的基于反義的藥物。事實(shí)上，有希望的數(shù)據(jù)已從體外實(shí)驗(yàn)獲得，證實(shí)包含吩哺嗪取代的七核苷酸能夠活化RNA酶H、增強(qiáng)細(xì)胞纟聶取并且顯示增加的反義活性(Lin,K-Y;Matteucci,M.J.Am.Chem.Soc.1998,120,8531-8532)?；钚栽黾釉贕-夾的情況下甚至更顯著，因?yàn)閱蝹€(gè)取代顯示明顯改善20聚體2,-脫氧硫代磷酸酯寡核香酸的體外效力(Flanagan,W.M.;Wolf，J丄；Olson,P.;Grant,D.;Lin,K,Y.;Wagner，R.W.;Matteucci,M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999，96，3513-3518)。作為雜環(huán)堿基有用的更多的經(jīng)修飾的多環(huán)雜環(huán)化合物公開(kāi)于下述專(zhuān)利中，但不限于下述專(zhuān)利上文描述的美國(guó)專(zhuān)利3,687,808，以及美國(guó)專(zhuān)利4,845,205;5,130，302;5，134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,434,257;5，457,187;5,459,255;5,484,908;5,502，177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121,5,596,091;5,614,617;5,645,985;5,646,269;5,750,692;5,830,653;5,763,588;6,005,096;和5,681,941,以及美國(guó)4受^又前^〉開(kāi)20030158403。逸合本發(fā)明的組合物可以包含2種或更多寡聚化合物。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含靶向第一種核酸的一種或多種反義化合物，特別是寡核苷酸，和耙向第二種核酸革巴的一種或多種另外的反義化合物?？商娲?，本發(fā)明的組合物可以包含靶向相同核酸靶的不同區(qū)域的2種或更多反義化合物。2種或更多組合的化合物可以一起或順次使用。本發(fā)明的化合物可以在組合療法中使用，其中通過(guò)施用本發(fā)明的一種或多種化合物和一種或多種其他合適的治療/預(yù)防化合物以治療狀況來(lái)達(dá)到附加效應(yīng)。合適的一種或多種治療/預(yù)防化合物包括但不限于，降糖劑、減肥藥、和降脂劑。降糖劑包括但不限于，激素，激素模擬物或腸降血糖素沖莫擬物(例如，胰島素，包括吸入胰島素，GLP-1或GLP-1類(lèi)似物例如liraglutide、或依西奈肽)，DPP(IV)抑制劑，磺酰脲(例如，乙酸己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、曱磺吖庚脲、格列美脲、格列吡。秦、格列本脲或格列齊特)，雙胍(二曱雙胍)，氯茴苯酸(例如，那格列奈或瑞格列奈)，遙唑烷二酮或其他PPAR-y激動(dòng)劑(例如，吡格列酮或羅格列酮)，oc-葡糖苦酶抑制劑(例如，阿卡波糖或米才各列醇)，或不耙向GCGR的反義化合物。還包括了雙PPAR-激動(dòng)劑(例如，由Bristol-MyersSquibb開(kāi)發(fā)的莫格列他，或由Astra-Zeneca開(kāi)發(fā)的替格列扎)。還包括了在開(kāi)發(fā)中的其他糖尿病治療(例如，由Novartis開(kāi)發(fā)的LAF237;由Merck開(kāi)發(fā)的MK-0431;或由Sanofi-Aventis開(kāi)發(fā)的利莫那班)。減肥藥包括但不限于，食欲抑制劑(例如苯丁胺或MendiaTM)，脂肪吸收抑制劑例如奧利司他(例如XenicalTM)，和抑制剌激食欲的饑餓信號(hào)的改良形式的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。降脂劑包括但不限于，膽鹽掩蔽樹(shù)脂(例如考來(lái)烯胺、考來(lái)替泊和鹽酸考來(lái)維侖)，HMGCoA-還原酶抑制劑(例如，洛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀和氟伐他汀)，煙酸，纖維酸衍生物(例如，氯貝丁酯、吉非貝齊、非i若貝特、苯扎貝特和環(huán)丙貝特)，普羅布可，新霉素，右曱狀腺素，植物stanol酯，膽固醇吸收抑制劑(例如，依澤替米貝)，CETP抑制劑(例如，拖徹普和JTT-705),MTP抑制劑(例如，英普他派)，膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(頂端鈉依賴(lài)性膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，肝CYP7a調(diào)節(jié)劑，ACAT抑制劑(例如Avasimibe),雌激素^,4戈療法(例如，它莫西芬)，合成HDL(例如，ETC-216),抗炎劑(例如，糖皮質(zhì)激素)，或不靶向GCGR的反義化合物。這些藥物中的一種或多種可以與GCGR的一種或多種反義抑制劑組合以達(dá)到附加療。寡聚物合成經(jīng)修飾的和未修飾的核苦的寡聚化可以根據(jù)關(guān)于DNA(ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,編輯Agrawal(1993),HumanaPress)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001),23,206-217.Gait等人，ApplicationsofChemicallysynthesizedRNAinRNA:ProteinInteractions,編輯Smith(1998),1-36.Gallo等人，Tetrahedron(2001),57,5707-5713)的文獻(xiàn)操作和美國(guó)公開(kāi)號(hào)US2005-0014713常規(guī)地進(jìn)行，所述專(zhuān)利引入本文作為參考。本發(fā)明的寡聚化合物可以通過(guò)眾所周知的固相合成技術(shù)來(lái)方便地和常規(guī)地制備。用于此類(lèi)合成的設(shè)備由幾個(gè)廠商出售，包括，例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。可以另外地或可替4戈地4吏用本領(lǐng)域已知的用于此類(lèi)合成的任何其他方法。眾所周知的是使用相似技術(shù)以制備寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。寡聚物純化和分析寡核苷酸純化和分析的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。分析方法包括毛細(xì)管電泳法(CE)和電霧化質(zhì)"i普法。此類(lèi)合成和分析方法可以在多孔板中進(jìn)行。#艱封#^矛^容^^7入#為參孝盡管已依照某些實(shí)施方案具體地描述了本發(fā)明的某些化合物、組合物和方法，<旦本文的實(shí)施例4又用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的化合物并且不意欲對(duì)其進(jìn)行限制。本申請(qǐng)中引用的參考文獻(xiàn)、GENBANK⑧登記號(hào)等各自整體引入本文作為參考。實(shí)施例1測(cè)定表達(dá)的調(diào)節(jié)GCGR表達(dá)的調(diào)節(jié)可以以本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行測(cè)定。GCGRmRNA水平可以通過(guò)例如RNA印跡分析、竟?fàn)幘酆厦浮哆B式反應(yīng)(PCR)或?qū)崟r(shí)PCR來(lái)定量。RNA分一斤可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法對(duì)總細(xì)胞RNA或poly(A)+mRNA來(lái)進(jìn)行。RNA分離的方法在例如Ausubel,F.M.等人,CwreW/VWoc(9/《z"A/o/ecw/w5w/ogy,第1巻,第4.1.1-4.2.9和4.5.1-4.5.3頁(yè)，JohnWiley&Sons，Inc.,1993中教導(dǎo)。RNA印跡分析是本領(lǐng)域常規(guī)的，并且在例如Ausubel,F.M.等人，Cwre"f尸rotoco/sz'打Afo/ecw/arS/o/ogy,第1巻,第4.2.1-4.2.9頁(yè),JohnWiley&Sons,Inc.,1996中教導(dǎo)。實(shí)時(shí)定量(PCR)可以使用商購(gòu)可得的ABIPRISM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)方便地完成，其可從PE-AppliedBiosystems,FosterCity，CA獲得并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)4吏用。由GCGR編碼的蛋白質(zhì)水平可以以本領(lǐng)域眾所周知的各種方法進(jìn)行定量，例如免疫沉淀、蛋白質(zhì)印跡分析(免疫印跡)、ELISA或熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)。針對(duì)由GCGR編碼的蛋白質(zhì)的抗體可以從各種來(lái)源進(jìn)4亍鑒定且獲得，例如MSRS抗體目錄(AerieCorporation,Birmingham,MI)，或可以經(jīng)由常^L抗體產(chǎn)生方法進(jìn)行制備。用于制備多克隆抗血清的方法在例如Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.12.1-11.12.9頁(yè)，JohnWiley&Sons,Inc.,1997中教導(dǎo)。用于制備單克隆抗體的方法在例如Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11.11.5頁(yè)，JohnWiley&Sons,Inc.,1997中教導(dǎo)。免疫沉淀法是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的，并且可以在例如Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.16.11頁(yè)，JohnWiley&Sons,Inc.,1998找到。蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)分析是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的，并且可以在例如Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsmMolecularBiology,第2巻，第10.8.1-10.8.21頁(yè)，JohnWiley&Sons,Inc.,1997找到。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的，并且可以在1列》口Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.2.1-11.2.22頁(yè)，JohnWiley&Sons,Inc.,1991找到。本發(fā)明的寡聚化合物對(duì)靶核酸表達(dá)的影響可以在各種細(xì)胞類(lèi)型中的任何一種中進(jìn)行測(cè)試，條件是耙核酸以可測(cè)量的水平存在。本發(fā)明的寡聚化合物對(duì)靼核酸表達(dá)的影響可以使用例如PCR或RNA印跡分析常規(guī)地測(cè)定。細(xì)胞系衍生自正常組織和細(xì)胞類(lèi)型并且衍生自與各種病癥(例如過(guò)度增殖性病癥)相關(guān)的細(xì)胞。衍生自多種組織和種類(lèi)的細(xì)胞系可以得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)、日本癌癥研究資源庫(kù)(JapaneseCancerResearchResourcesBank)(Tokyo,Japan)、或英國(guó)應(yīng)用樣t生物與研究中心(CentreforAppliedMicrobiologyandResearch)(Wiltshire,UnitedKingdom)。原代細(xì)胞或從動(dòng)物中分離且不實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)的那些細(xì)胞可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備，或從各種商業(yè)供應(yīng)者獲得。此外，原代細(xì)胞包括從臨床情況中的人受試者(即供血者，手術(shù)患者)獲得的那些。細(xì)胞類(lèi)型寡聚化合物對(duì)靶核酸表達(dá)的影響在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)試。HepG2細(xì)胞人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA)。HepG2細(xì)胞在Eagle'sMEM中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，所述Eagle'sMEM補(bǔ)充有10%胎牛血清、1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸鈉(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)。當(dāng)它們達(dá)到約90%匯合時(shí)，細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶消化和稀釋進(jìn)行常規(guī)傳代。通過(guò)用在磷酸鹽緩沖鹽水中1:100稀釋的l型大鼠尾部膠原(BDBiosciences,Bedford,MA)包被，制備多孔培養(yǎng)板用于細(xì)胞培養(yǎng)。包含膠原的板于37。C溫育約1小時(shí)，這之后去除膠原并且用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌孔2次。以約8,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞種植到96孔板(Falcon-Pnmaria#353872，BDBiosciences,Bedford,MA)內(nèi)用于在寡聚化合物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用。用寡聚化合物處理當(dāng)細(xì)胞達(dá)到合適的匯合時(shí)，如所述的使用轉(zhuǎn)染方法將它們用寡核苷酸進(jìn)行處理。本領(lǐng)域已知的其他合適的轉(zhuǎn)染試劑包括但不限于，LIPOFECTAMINE、OLIGOFECTAMINE和FUGENETM。本領(lǐng)域已LIPOFECTIN1M當(dāng)細(xì)胞達(dá)到65-75%匯合時(shí)，將它們用寡核苦酸進(jìn)行處理。使寡核苦酸在Opti-MEMTM-l減少的血清培養(yǎng)基(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中與LIPOFECTIN(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)進(jìn)行混合，以達(dá)到寡核苷酸的所需濃度和2.5或3pg/mL/100nM寡核普酸的LIPOFECTINTM濃度。使這種轉(zhuǎn)染混合物在室溫下溫育約0.5小時(shí)。對(duì)于在96孔^1中生長(zhǎng)的細(xì)^0細(xì)^<用100jiLOPTI-MEMTM-l洗滌1次，并隨后用130^L轉(zhuǎn)染混合物進(jìn)行處理。在24孔板或其他標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的細(xì)胞使用合適體積的培養(yǎng)基和寡核苦酸進(jìn)行類(lèi)似地處理。一式兩份或一式三份地處理細(xì)胞且獲得數(shù)據(jù)。于37。C處理約4-7小時(shí)后，將包含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基。在寡核苷酸處理后16-24小時(shí)收獲細(xì)胞。CYTOFECTIN1M當(dāng)細(xì)胞達(dá)到65-75%匯合時(shí)，將它們用寡核苷酸進(jìn)行處理。使寡核苷酸在〇pti-MEMTM-l減少的血清培養(yǎng)基(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中與CYTOFECTINTM(GeneTherapySystems,SanDiego,CA)進(jìn)行混合，以達(dá)到寡核苷酸的所需濃度和2或4yg/mL/100nM寡核苷酸的CYTOFECTINTM濃度。使這種轉(zhuǎn)染混合物在室溫下溫育約0.5小時(shí)。對(duì)于在96孔板中生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞用100JULOPTI-MEMTM-l洗滌1次，并隨后用130(aL轉(zhuǎn)染混合物進(jìn)行處理。在24孔板或其他標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的細(xì)胞使用合適體積的培養(yǎng)基和寡核苦酸進(jìn)行類(lèi)似地處理。一式兩份或一式三份地處理細(xì)胞且獲得數(shù)據(jù)。于37。C處理約4-7小時(shí)后，將包含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基。在寡核苷酸處理后16-24小時(shí)收獲細(xì)i包。對(duì)照寡核苷酸對(duì)照寡核苷酸用于測(cè)定關(guān)于特定細(xì)胞系的最佳寡聚化合物濃度。此外，當(dāng)本發(fā)明的寡聚化合物在寡聚化合物篩選實(shí)驗(yàn)或表型分析中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，對(duì)照寡核苷酸與本發(fā)明的化合物平行地進(jìn)行測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，對(duì)照寡核苷酸用作陰性對(duì)照寡核苷酸，即作為用于測(cè)量對(duì)基因表達(dá)或表型的影響不存在的手段。在可替代的實(shí)施方案中，對(duì)照寡核苷酸用作陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸，即作為已知影響基因表達(dá)或表型的寡核苦酸。對(duì)照寡核苷酸顯示于表2中。"靶名稱(chēng)"指寡核苷酸靶向的基因。"靶種類(lèi)"指其中寡核苷酸與靶mRNA完全互補(bǔ)的種類(lèi)。"基序"是包含寡核苷酸的化學(xué)上獨(dú)特區(qū)域的指示。表2中的某些化合物是嵌合寡核苷酸，包含由2，-脫氧核菩酸組成的中央"缺口"區(qū)，所述中央"缺口"區(qū)在兩側(cè)(5'和3，)上由"翼，，側(cè)接。翼由2，-O-(2-甲氧乙基)核苦酸，也稱(chēng)為2，-MOE核苦酸組成。每個(gè)缺口聚體寡核苷酸的"基序"在表2中舉例說(shuō)明，并且指出了每個(gè)缺口區(qū)和翼中的核苷酸數(shù)目，例如"5-10-5"指具有由5個(gè)核苷酸的翼側(cè)接的10個(gè)核苷酸的缺口區(qū)的缺口聚體。ISIS29848是隨機(jī)化的寡聚化合物的混合物；其序列顯示于表2中，其中N可以是A、T、C或G。表2中的寡核苷酸自始至終核苷間(主鏈)鍵是硫代磷酸酯。未修飾的胞嘧啶由核苷酸序列中的"UC"指出；所有其他胞嘧咬都是5-曱基胞嘧啶。表2用于細(xì)胞系測(cè)試、寡聚化合物篩選和表型測(cè)定法的對(duì)照寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>使用的寡核苷酸濃度從細(xì)胞系到細(xì)胞系不同。為了測(cè)定關(guān)于特定細(xì)胞系的最佳寡核苷酸濃度，細(xì)胞用一系列濃度的陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸進(jìn)行處理。陽(yáng)性對(duì)照顯示于表2中。例如，對(duì)于人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸可以選自ISIS336806或ISIS18078。對(duì)于小鼠或大鼠細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照寡核普酸可以是例如ISIS15770。導(dǎo)致靶mRNA減少80%的陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸的濃度，隨后用作對(duì)于那種細(xì)胞系的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中關(guān)于新寡核苷酸的篩選濃度，所述靶mRNA例如對(duì)于ISIS15770是大鼠Raf激酶C。如果未達(dá)到80%減少，那么導(dǎo)致靶mRNA減少60%的陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸的最低濃度，隨后用作對(duì)于那種細(xì)胞系的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的寡核苷酸篩選濃度。如果未達(dá)到減少60%,那么那種特定細(xì)胞系#皮一見(jiàn)為不適合于寡核苷酸轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。當(dāng)反義寡核苷酸使用脂質(zhì)體試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，本文使用的反義寡核普酸濃度為50nM-300nM,當(dāng)反義寡核苷酸通過(guò)電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，濃度為1juM-40juM。實(shí)施例2GCGRmRNA水平的實(shí)時(shí)定量PCR分析GCGRmRNA水平的定量通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR使用ABIPRISM7600、7700或7900序列檢測(cè)系統(tǒng)(PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)完成。通過(guò)RT、實(shí)時(shí)PCR獲得的基因耙量使用表達(dá)恒定的基因-GAPDH的表達(dá)？K平，或通過(guò)4吏用RiboGreenTM(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)定量總RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。總RNA使用RiboGreenRNA定量試劑(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)進(jìn)4亍定量。將170|uLRiboGreenTM工作試劑(在10mMTris-HCl,ImMEDTA,pH7.5中l(wèi):350稀釋的RiboGreenTM試劑)移液到包含30juL純化的細(xì)胞RNA的96孔板內(nèi)。板在CytoFl麗4000(PEAppliedBiosystems)中進(jìn)行讀數(shù)，其中在485nm處激發(fā)和在530nm處發(fā)射。GAPDH表達(dá)通過(guò)RT、實(shí)時(shí)PCR與靼的定量同時(shí)或分開(kāi)進(jìn)行定量。對(duì)于與耙水平的測(cè)量同時(shí)的測(cè)量，就其在定量PCR分析前與GAPDH擴(kuò)增反應(yīng)"多路進(jìn)行(multiplexed)"的能力評(píng)估對(duì)測(cè)量的靶基因特異的引物-探針組。多路進(jìn)行指在單管中進(jìn)行多個(gè)DNA種類(lèi)(在這種情況下是靶和內(nèi)源性GAPDH對(duì)照)的檢測(cè)，這要求GAPDH的引物-探針組不干擾靶的擴(kuò)增。用于在實(shí)時(shí)PCR中使用的探針和引物被設(shè)計(jì)成與靶特異性序列雜交。引物和探針設(shè)計(jì)的方法是本領(lǐng)域已知的。用于在實(shí)時(shí)PCR中使用的引物和探針的設(shè)計(jì)可以4吏用商購(gòu)可得的4t件來(lái)進(jìn)行，例如PrimerExpress,PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA。引物和才果4十及與之雜交的靶核酸序列呈現(xiàn)于表4中。靶特異性PCR探針具有與5'末端共價(jià)連接的FAM和與3'末端共價(jià)連接的TAMRA或MGB,其中FAM是熒光染料，TAMRA或MGB是摔滅染料。分離后，對(duì)RNA實(shí)施順次的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)和實(shí)時(shí)PCR,這兩者都在同一孔中進(jìn)4亍。RT和PCR試劑得自InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad,CA)。RT、實(shí)時(shí)PCR通過(guò)向包含30juL總RNA溶液(20-200ng)的96孔板中加入20juLPCR混合物(cocktail)(2.5xPCR緩沖液減MgCl2，6.6mMMgCl2，dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375^iM,正向引物和反向引物各375nM,125nM探針，4單位RNA酶抑制劑，1.25單位PLATINUMTaq,5單位MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和2.5xROX染料)同樣進(jìn)行。通過(guò)于48。C溫育30分鐘來(lái)進(jìn)行RT反應(yīng)。于95。C溫育10分鐘以激活PLATINUMTaq后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的2步PCR方案95°C15秒(變性)，隨后為60°C1.5分鐘(復(fù)性/延伸)。通過(guò)如本文其他實(shí)施例中所述的定量實(shí)時(shí)PCR,評(píng)估本發(fā)明的化合物對(duì)人耙mRNA水平的影響，其中使用設(shè)計(jì)為與人GCGR雜交的引物-才冢針組。例如正向引物TGCGGTTCCCCGTCTTC(作為SEQIDNO:21引入本文)反向引物CTTGTAGTCTGTGTGGTGCATCTG(作為SEQIDNO:22引入本文)和PCRJ采針FAM-CATCTTCGTCCGCATCG畫(huà)MGB(作為SEQIDNO:23引入本文)，其中FAM是熒光染料，MGB是非熒光猝滅染料。通過(guò)如本文其他實(shí)施例中所述的定量實(shí)時(shí)PCR,評(píng)估本發(fā)明的化合物對(duì)大鼠靶mRNA水平的影響，其中使用設(shè)計(jì)為與大鼠GCGR雜交的引物-探針組。例如正向引物CAGTGCCACCACAACCTAAGC(作為SEQIDNO:24引入本文)反向引物AGTACTTGTCGAAAGTTCTGTTGCA(作為SEQIDNO:25引入本文)和PCR探針FAM-TGCTGCCCCCACCTACTGAGCTG誦TAMRA(作為SEQIDNO:26引入本文)，其中FAM是萸光染料，TAMRA是猝滅染料。通過(guò)如本文其他實(shí)施例中所述的定量實(shí)時(shí)PCR，評(píng)估本發(fā)明的化合物對(duì)猴靶mRNA水平的影響，其中使用設(shè)計(jì)為與猴GCGR雜交的引物-探針組。例如正向引物ACTGCACCCGCAACGC(作為SEQIDNO:27引入本文)反向引物CACGGAGCTGGCCTTCAG(作為SEQIDNO:28引入本文)和PCR探針FAM-ATCCACGCGAACCTGTTTGTGTCCTT畫(huà)TAMRA(作為SEQIDNO:29引入本文)，其中FAM是焚光染料，TAMRA是猝滅染料。設(shè)計(jì)用于與猴GCGR雜交的引物-探針組的另一個(gè)實(shí)例是正向引物GAACCTTCGACAAGTATTCCTGCT(作為SEQIDNO:30引入本文)反向引物GGGCAGGAGATGTTGGCC(作為SEQIDNO:31引入本文)和PCR探針FAM陽(yáng)CCAGACACCCCCGCCAATAACA畫(huà)TAMRA(作為SEQIDNO:32引入本文)，其中FAM是萸光染料，TAMRA是猝滅染料。實(shí)施例3設(shè)計(jì)靶向人GCGR的"缺口加寬的，，反義寡核苷酸設(shè)計(jì)一系列寡聚化合物以靶向具有各種大小的脫氧核苷酸缺口和2，-MOE翼的人GCGR(Genbank登錄號(hào)NM—000160.1,作為SEQIDNO:1引入本文)。每種寡核苷酸長(zhǎng)度是20個(gè)核堿基，并且具有相同的核石咸基序列(GCACTTTGTGGTGCCAAGGC,作為SEQIDNO:2引入本文)，且因此靶向SEQIDNO:1的相同片段(核堿基532-551)?；衔镲@示于表3中。文本指脫氧核苷酸，用粗體、加下劃線的文本指定的核苦酸是2，-O-(2-曱氧乙基)核苷酸。自始至終，核苷間鍵是硫代磷酸酯，所有胞嘧啶都是5-曱基胞嘧啶。表3中指出的是每種化合物指示包含寡核苷酸的化學(xué)上獨(dú)特區(qū)域的"基序"。表3輩巴向人GCGR的反義化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>測(cè)試了5-10-5缺口聚體，即ISIS310457體外減少靶mRNA水平的能力。用本文描述的方法用ISIS310457處理HepG2細(xì)胞。通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR分析ISIS310457對(duì)人胰高血糖素受體mRNA水平的影響，發(fā)現(xiàn)其使GCGR表達(dá)減少約96%。實(shí)施例4設(shè)計(jì)耙向大鼠GCGR的"缺口加寬的"反義寡核苷酸設(shè)計(jì)一系列寡聚化合物以靶向具有各種大小的脫氧核苷酸缺口和2'-MOE翼的大鼠GCGR(Genbank登錄號(hào)M96674.1,作為SEQIDNO:3引入本文)。測(cè)試的每種寡核苷酸具有相同的核堿基序列(GCACTTTGTGGTACCAAGGT,作為SEQIDNO:4引入本文)，且因此耙向SEQIDNO:3的相同片段(核堿基402-421)?；衔镲@示于表4中。文本指脫氧核苷酸，用粗體、加下劃線的文本指定的核苷酸是2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸。自始至終，核苷間鍵是硫代磷酸酯，所有胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。表4中指出的是每種化合物指示包含寡核苷酸的化學(xué)上獨(dú)特區(qū)域的"基序"。表4耙向大鼠GCGR的反義化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)施例5靶向GCGR的反義寡核苦酸的作用-大鼠體內(nèi)研究根據(jù)本發(fā)明，體內(nèi)測(cè)試了設(shè)計(jì)用于靶向大鼠GCGR的寡核苷酸。給8周齡的雄性SpragueDawley大鼠注射50、25、12.5或6.25mg/kg的ISIS356171、ISIS357368、ISIS357369、ISIS357370、ISIS357371、ISIS357372或ISIS357373,每周注射兩次，注射3周，總共六劑。注射鹽水的動(dòng)物作為對(duì)照。測(cè)試的每種寡核苷酸具有相同的核堿基序列(GCACTTTGTGGTACCAAGGT,作為SEQIDNO:4引入本文)，上文描述了每種化合物的化學(xué)和基序。處理后，處死大鼠，評(píng)估肝中的耙核酸水平。采用RIBOGREENTM,按照本文其它實(shí)施例的描述進(jìn)行RNA分離和靶mRNA表達(dá)水平定量。測(cè)定來(lái)自每個(gè)處理組的RNA以及來(lái)自用ISIS356171處理的組的RNA。結(jié)果在表5a,5b,5c,5d,5e,和5f中表示為鹽水處理的對(duì)照水平的百分比。表5a<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表5c用耙向GCGR的4-12-4反義寡核苷酸處理的大鼠肝中的靶水平減少<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表5e用耙向GCGR的1-18-1反義寡核苷酸處理的大鼠肝中的靶水平減少<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表5f用耙向GCGR的統(tǒng)一的脫氧寡核苷酸處理的大鼠肝中的靶水平減少<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如表5a，5b,5c,5d和5e所示，缺口加寬的反義寡核苷酸以劑量依賴(lài)性方式在體內(nèi)有效減少GCGR水平。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是減少動(dòng)物中GCGR的表達(dá)水平的方法，包4舌施用靶向GCGR的反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接2個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸的16個(gè)脫氧核苷酸的缺口。此外，測(cè)定了腎和肝中的寡核苷酸濃度。測(cè)定組織中的寡核苷酸濃度的方法是本領(lǐng)域已知的(Geary等人，^oc/ze附.，1999，W,241-248)。表6中示出了用25mg/kg指出的寡核苦酸處理的動(dòng)物腎或肝中總寡核苷酸濃度和全長(zhǎng)寡核苷酸濃度(以Mg/g表示)。總寡核苷酸是組織中檢測(cè)到的所有寡核香酸代謝產(chǎn)物的總和。表6肝和腎中的寡核苷酸濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>如表6所示，腎中的缺口加寬的寡核苷酸濃度相對(duì)于這些組織中的ISIS356171通常是減少的?？紤]表5顯示的靶減少數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于ISIS356171,用ISIS356371、ISIS356372和ISIS356373保持了效力,這些數(shù)據(jù)表明缺口加寬的寡核苦酸，特別是ISIS356371、ISIS356372和ISIS356373,在本質(zhì)上在減少肝中的靼水平方面比ISIS356171更有效。實(shí)施例6輩巴向GCGR的反義寡核苷酸的生理作用_大鼠體內(nèi)研究為了評(píng)估用本發(fā)明的反義化合物減少GCGR的生理作用，對(duì)于前面實(shí)施例描述的每個(gè)處理組，在研究過(guò)程中監(jiān)測(cè)血漿葡萄糖水平。在開(kāi)始處理前("取血前")和在處理階段的每周，用常規(guī)臨床方法(例如YSI葡萄糖分析儀，YSIScientific,YellowSprings,OH)測(cè)量葡萄糖水平。對(duì)于每個(gè)處理組，結(jié)果在表7中以mg/dL表示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表7所示，用靶向GCGR的反義化合物處理的動(dòng)物在研究過(guò)程中顯示出葡萄糖降低的趨勢(shì)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是降低動(dòng)物中的葡萄糖水平的方法，包括給所述動(dòng)物施用減少GCGR表達(dá)水平的反義寡核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是缺口加寬的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3'末端都側(cè)接2個(gè)2'-0-(2-甲氧乙基)核苦酸的16個(gè)脫氧核苷酸的缺口。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接3個(gè)2，-O-(2-曱氧乙基)核苦酸的14個(gè)脫氧核苷酸的缺口或在5'和3，末端都側(cè)接4個(gè)2'-0-(2-甲氧乙基)核苦酸的12個(gè)脫氧核苷酸的缺口。為了檢-瞼GCGR的減少對(duì)胰高血糖素途徑中其它元件的影響，在處胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)水平。用商購(gòu)試劑盒、儀器或服務(wù)(例如通過(guò)》文射免疫測(cè)定、ELISA和/或Luminex免疫測(cè)定，和/或LincoResearchInc.生物分析服務(wù)，St.Louis,MO)測(cè)定胰高血糖素和活性GLP-1的血漿水平。表8顯示了每個(gè)處理組的平均胰高血糖素水平(以ng/mL表示)和GLP-1水平(pM)。表8GCGR的反義抑制對(duì)胰高血糖素和GLP-1水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>如表8所示，GCGR的反義減少，增加了循環(huán)胰高血糖素水平和循環(huán)GLP-1水平。盡管表7注意到了血漿葡萄糖水平減少的趨勢(shì)，沒(méi)有觀察到低血糖癥。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)施用靶向GCGR的反義寡核苷酸而增加GLP-1水平的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸的16個(gè)脫氧核苷酸的缺口。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接3個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核普酸的14個(gè)脫氧核苷酸的缺口或在5，和3，末端都側(cè)接4個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸的12個(gè)脫氧核苦酸的缺口。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是缺口加寬的寡核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包括ISIS357371、ISIS357372或ISIS357373。實(shí)施例7輩巴向GCGR的反義寡核苷酸的作用-獼猴體內(nèi)研究為了評(píng)估通過(guò)修飾靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物獼猴中反義寡核苷酸基序?qū)е碌慕M織分布、效力或治療指數(shù)，以每周3、10或20mg/kg的劑量給獼猴注射ISIS310457(5-10-5基序)或ISIS325568(2隱16-2基序)。這些反義化合物顯示與猴GCGR靶序列的100%互補(bǔ)性。單獨(dú)注射鹽水的動(dòng)物作為對(duì)照。研究的持續(xù)時(shí)間是7周，第一周給動(dòng)物注射3次，然后每周一次，共6周。每個(gè)處理組包含5只動(dòng)物。一組用20mg/kgISIS310457處理，一組用20mg/kglSIS325568處理，在停止給藥后恢復(fù)3周，然后處死("20mg/kg恢復(fù)")。研究結(jié)束時(shí)處死其它處理組。收集肝組織評(píng)估靶減少。采用RIBOGREEN,按照本文其它實(shí)施例的描述進(jìn)行RNA分離和粑mRNA表達(dá)水平定量。結(jié)果在表9中表示為鹽水處理的對(duì)照水平的百分比。表9用耙向GCGR的反義寡核苷酸處理的猴的肝中的靶水平減少<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>如表9所示，用ISIS310457和325568處理，在所有測(cè)試的劑量下導(dǎo)致了GCGR水平的減少，并且在20mg/kg恢復(fù)組中仍然觀察到了靶水平的減少。ISIS325568比3mg/kg劑量的ISIS310457導(dǎo)致了更大的減少。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是減少動(dòng)物中的GCGR表達(dá)水平的方法，包括施用靶向GCGR的反義寡核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是缺口加寬的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸的16個(gè)脫氧核普酸的缺口。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5'和3，末端都側(cè)接3個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸的14個(gè)脫氧核苷酸的缺口或在5，和3，末端都側(cè)接4個(gè)2，-O-(2-曱氧乙基)核苷酸的12個(gè)脫氧核苦酸的缺口。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包括ISIS325568。此外，測(cè)定了腎和肝中的寡核苷酸濃度。測(cè)定組織中的寡核苷酸濃度的方法是本領(lǐng)域已知的(Geary等人，X""/.Swc/^m,，1999，274,241-248)。表10中示出了用指出的寡核苷酸處理的動(dòng)物腎或肝中總濃度和全長(zhǎng)寡核苷酸濃度(以Pg/g表示)。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>如表10所示，5-10-5基序寡核苦酸ISIS310457的腎濃度在所有測(cè)試的濃度下高于對(duì)2-16-2基序寡核苷酸ISIS325568所測(cè)量的腎濃度?？紤]表9中2-16-2基序寡核苷酸的靶減少數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明缺口加寬的寡核苷酸比相應(yīng)的5-10-5基序寡核苷酸的效力更高，在肝中提供了更強(qiáng)的耙mRNA水平降低，而沒(méi)有增強(qiáng)寡核苷酸積聚。實(shí)施例8靶向GCGR的反義寡核苷酸的生理作用-獼猴體內(nèi)研究為了4企-驗(yàn)GCGR的減少對(duì)胰高血糖素途徑中其它元件的影響，在處理的每周中也纟姿照實(shí)施例7的描述評(píng)估了用反義化合物處理的動(dòng)物的胰高血糖素水平和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)水平。停止給藥后對(duì)恢復(fù)組進(jìn)行了額外三周測(cè)試。麻醉猴，然后采血，以避免由于應(yīng)激導(dǎo)致的偽跡。用商購(gòu)試劑盒、儀器或服務(wù)(例如通過(guò)放射免疫測(cè)定、ELISA和/或Lummex免疫測(cè)定，和/或LmcoResearchInc.生物分牙斤月良務(wù)，St.Louis:MO)測(cè)定胰高血糖素和活性GLP-l的血漿水平。表11顯示了每個(gè)處理組的平均胰高血糖素水平(以ng/mL表示)和GLP-l水平(pM)。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)施用靶向GCGR的反義寡核苷酸增加動(dòng)物中的GLP-1水平的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是缺口加寬的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸的16個(gè)脫氧核苷酸的缺口。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含在5，和3，末端都側(cè)接3個(gè)2，-〇-(2-甲氧乙基)核苷酸的14個(gè)脫氧核苷酸的缺口或在5，和3'末端都側(cè)接4個(gè)2，-〇-(2-甲氧乙基)核苷酸的12個(gè)脫氧核苷酸的缺口。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是ISIS325568。在另一實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包括ISIS325568。權(quán)利要求1.一種長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，所述寡核苷酸靶向編碼GCGR的核酸分子，并且包含SEQIDNO2或4的至少8個(gè)核堿基的部分，其中所述寡核苷酸包含長(zhǎng)度為12個(gè)、13個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)或18個(gè)核堿基的脫氧核苷酸區(qū)域，所述脫氧核苷酸區(qū)域在其5’和3’末端上與1-4個(gè)2’-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接，并且其中所述寡核苷酸與GCGR特異性雜交且減少GCGR的表達(dá)。2.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。3.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧咬。4.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其具有SEQIDNO:4的核堿基序列。5.權(quán)利要求4的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。6.權(quán)利要求5的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。7.權(quán)利要求5的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。8.權(quán)利要求4的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與1個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的18個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。9.權(quán)利要求8的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。10.權(quán)利要求8的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。11.權(quán)利要求4的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與1個(gè)或2個(gè)2，-〇-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的n個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。12.權(quán)利要求11的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。13.權(quán)利要求11的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。14.權(quán)利要求4的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與4個(gè)2'-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的12個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。15.權(quán)利要求14的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。16.權(quán)利要求14的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。17.權(quán)利要求4的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與3個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的14個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。18.權(quán)利要求17的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。19.權(quán)利要求17的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。20.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其具有SEQIDNO:2的核堿基序列。21.權(quán)利要求20的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與2個(gè)2，-O-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核普酸的區(qū)域。22.權(quán)利要求21的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。23.權(quán)利要求21的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。24.權(quán)利要求20的反義寡核苷酸，其特征在于在5'和3，末端上與1個(gè)2'-O-(2-甲氧乙基)核苦酸側(cè)接的18個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。25.權(quán)利要求24的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。26.權(quán)利要求24的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。27.權(quán)利要求20的反義寡核苷酸，其特征在于在5'和3'末端上與1個(gè)或2個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核普酸側(cè)接的17個(gè)脫氧核普酸的區(qū)域。28.權(quán)利要求27的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苦間鍵是硫代磷酸酯鍵。29.權(quán)利要求27的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-曱基胞嘧啶。30.權(quán)利要求20的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與4個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核苷酸側(cè)接的12個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。31.權(quán)利要求30的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。32.權(quán)利要求30的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。33.權(quán)利要求20的反義寡核苷酸，其特征在于在5，和3，末端上與3個(gè)2，-0-(2-甲氧乙基)核普酸側(cè)接的14個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域。34.權(quán)利要求33的反義寡核苷酸，其中至少一個(gè)核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。35.權(quán)利要求33的反義寡核普酸，其中至少一個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧咬。36.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的反義寡核苷酸并任選包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增強(qiáng)劑或賦形劑。37.—種減少組織或細(xì)胞中的GCGR表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求36的藥物組合物接觸。38.—種降低動(dòng)物中的血糖水平的方法，其包括給所述動(dòng)物施用斗又利要求36的藥物組合物。39.—種增加動(dòng)物中的GLP-1水平的方法，其包括給所述動(dòng)物施用4又利要求36的藥物組合物。40.—種改進(jìn)動(dòng)物中的胰島素敏感性的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求36的藥物組合物。41.一種降低動(dòng)物中的血甘油三酯的方法，其包括給所述動(dòng)物施用4又利要求36的藥物組合物。42.—種降低動(dòng)物中的血膽固醇水平的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求36的藥物組合物。43.—種治療具有與胰高血糖素受體表達(dá)相關(guān)的疾病或狀況的動(dòng)物的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求36的藥物組合物。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病或狀況是^^射疾病或狀況。45.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病或狀況是糖尿病、高血糖癥、肥胖、原發(fā)性高胰高血糖素血癥、胰島素缺乏或胰島素抵抗。46.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病或狀況是2型糖尿病。47.—種預(yù)防或延遲動(dòng)物中的血糖水平開(kāi)始升高的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求36的藥物組合物。48.—種保持動(dòng)物中的P-細(xì)胞功能的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求36的藥物組合物。49.一種長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，具有SEQIDNO:2的序列，并且特征在于在5，和3，末端上與2個(gè)2，-0-(2-曱氧乙基)核苷酸側(cè)接的16個(gè)脫氧核苷酸的區(qū)域，其中每個(gè)核苷間鍵都是硫代磷酸酯鍵，并且每個(gè)胞嘧啶都是5-曱基胞嘧啶。50.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求49的反義寡核苷酸并任選包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增強(qiáng)劑或賦形劑。51.—種減少組織或細(xì)胞中的GCGR表達(dá)的方法，其包4舌使所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求50的藥物組合物接觸。52.—種降低動(dòng)物中的血糖水平的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求50的藥物組合物。53.—種增加動(dòng)物中的GLP-1水平的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求50的藥物組合物。54.—種改進(jìn)動(dòng)物中的胰島素敏感性的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求50的藥物組合物。55.—種降低動(dòng)物中的血甘油三酯的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求50的藥物組合物。56.—種降低動(dòng)物中的血膽固醇水平的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求50的藥物組合物。57.—種治療具有與胰高血糖素受體表達(dá)相關(guān)的疾病或狀況的動(dòng)物的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求50的藥物纟且合物。58.^f又利要求57的方法，其中所述疾病或狀況是4戈i射疾病或狀況。59.斥又利要求57的方法，其中所述疾病或狀況是^唐尿病、高血糖癥、肥胖、原發(fā)性高胰高血糖素血癥、胰島素缺乏或胰島素抵抗。60.權(quán)利要求57的方法，其中所述疾病或狀況是2型糖尿病。61.—種預(yù)防或延遲動(dòng)物中的血糖水平開(kāi)始升高的方法，其包括給所述動(dòng)物施用4又利要求50的藥物組合物。62.—種保持動(dòng)物中的P-細(xì)胞功能的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求50的藥物組合物。63.—種治療具有代謝疾病或狀況的動(dòng)物的方法，其包括給所述動(dòng)物施用與選自下述的抗糖尿病劑組合的權(quán)利要求1的化合物ppar激動(dòng)劑，包括ppar-y、雙ppar或全ppar激動(dòng)劑、二肽基肽酶(iv)抑制劑、glp-1類(lèi)似物、胰島素和胰島素類(lèi)似物、胰島素促分泌素、sglt2抑制劑、人胰淀素類(lèi)似物，包括普蘭林肽、葡萄糖激酶活化劑、雙胍和oc-葡萄糖苷酶抑制劑，以達(dá)到附加的療效。全文摘要提供了用于調(diào)節(jié)胰高血糖素受體表達(dá)的化合物、組合物和方法。組合物包括具有特別的體內(nèi)性質(zhì)，靶向編碼胰高血糖素受體的核酸的反義化合物，特別是反義寡核苷酸。提供了使用這些化合物用于調(diào)節(jié)胰高血糖素受體表達(dá)和用于治療疾病的方法。文檔編號(hào)A61K31/712GK101321869SQ200680043077公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2006年9月19日優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日發(fā)明者B·P·莫尼亞,S·M·弗雷爾,S·巴諾特申請(qǐng)人:強(qiáng)生醫(yī)藥研究及開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司