專利名稱：：9-氯-15-脫氧前列腺素衍生物、其制備方法及其作為藥物的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及9-氯前列腺素衍生物、其制備方法及其作為藥物的應用。
背景技術：
：長期以來已知前列腺素是女性生殖生物學過程如控制排卵、受精、著床、脫膜(例如胎盤形成)和月經(jīng)中的關鍵分子。前列腺素也在生殖道中的病理學變化包括月經(jīng)過多、痛經(jīng)、子宮內膜異位和癌癥中具有重要作用。尚未完全闡明前列腺素引起這些變化的機理。近期的結果顯示前列腺素、它們的受體及其信號轉導途徑涉及如血管生成、細胞凋亡和增殖的過程。前列腺素的作用由位于細胞表面的它們的G蛋白-偶聯(lián)受體介導。前列腺素E2(PGE2)特別受關注，它通過結合至不同功能的受體亞型，即EPj、EP2、EP3和EP4受體而具有廣泛的細胞作用。因此，可能顯示EP2-剔除(EP2-knockout)小鼠(EP2"'")的生殖功能受損，這些動物具有更小的"窩產(chǎn)仔數(shù)(littersize)"(Matsumoto等，2001,BiologyofReproduction64,1557-1565)。還可能顯示這些EPr剔除小鼠(Hizaki等，ProcNatlAcadSciU.S.A.1999Aug31;96(18):10501-10506)顯示出明顯減小的卵丘擴展(cumulusexpansion)和嚴重的生育能力低下(subfertility)，這證明前列腺素EP2受體對于該過程的重要性。因此EP2受體為開發(fā)用于控制女性生育的藥物提出了重要的目標。EP2受體的4種子類為選擇性活性PGE2化合物的耙向開發(fā)提供了可能性。然而，到目前為止，幾乎沒有已知的選擇性EP2受體配體，大多數(shù)已知化合物也結合至其它EP2受體亞型，如EP4受體。歐洲專利EP1306087描述了用于治療勃起功能障礙的EP2受體激動劑。歐洲專利EP860430描述了相同的結構類型，并要求保護它們在制備用于治療免疫學障礙、哮喘和流產(chǎn)的藥物中的應用。申請WO04/32965描述了用于治療和預防由缺血引起的器官功能障礙所致的疾病的EP2受體激動劑。WO04/009117描述了用于治療由子宮收縮引起的疾病(如痛經(jīng))的EP2和EP4受體激動劑。申請WO03/74483和WO03/09872描述了相等地結合至EP2和EP4受體的激動齊廿(OnoPharmaceuticals)。EP2和EP4受體激動劑常常被描述與治療骨質疏松(WO99/19300、US2003/0166631、WO03〃7910、WO03/45371、WO03/74483和WO03/09872)和治療青光眼(WO04/37813、WO04/37786、WO04/19938、WO03/103772、WO03/103664、US6747037、US6410591、WO03/40123、WO03/47513、WO03/47417)相關。專利申請WO04/12656要求保護與炎癥有關的EP2受體激動劑。專利申請WO03/77919要求保護用于治療生育疾病的EP4受體激動劑。到目前為止未描述控制最終引起著床和脫膜并因此促進生育的過程的選擇性EP2受體激動劑。因此產(chǎn)生了提供用于開發(fā)新型藥物的可結合至EP2受體的穩(wěn)定、選擇性和有效的化合物這一目標。OnoPharmaceuticals的上述歐洲專利(EP0030377和EP1306087)公開了在9位具有氯原子的前列腺素衍生物。然而，這些專利中要求保護的化合物在低級側鏈中，例如在15或16位包含羥基等。
發(fā)明內容目前已出人意料地發(fā)現(xiàn)通式I的化合物及其鹽和其與生理學可耐受的堿的環(huán)糊精包合物克服了已知的缺點，并且通過略去羥基，可以獲得對EP2受體的更好的選擇性、更好的活性和更長的作用持續(xù)時間，其中Ri為CH20H、-COOR2、《01^11112或-(:0>^服3基團，R2為氫，CrCnr烷基，所述垸基為線性或支鏈垸基，任選為單不飽和至多不飽和烷基，并任選地被鹵素、d-C4-烷氧基、取代的C3-d。-芳基或任選取代的C3-do-芳酰基、二-d-C5-垸基氨基或三-CrC5-垸基氨基單取代至多取代，任選地被Q-Cr烷基取代的C3-d(r環(huán)垸基，任選地被苯基、l-萘基、2-萘基取代的C3-Cnr芳基，所述苯基、1-萘基、2-萘基又可以在3位和4位被氟、氯、垸氧基或三氯甲基取代，或在4位被羥基、鹵素、苯基、一個或多個Q-Cr垸基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、羧基、羥基或CVCr烷氧基取代，或C3-CV雜環(huán)烷基，R3為Q-d5-羧酸或d-d5-磺酸，A為順式-CHNCH-或-CH2-CH2-基團，B為反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，W為C2-C6-亞垸基，W為羥基、基團0-W或0-R7，其中RS為四氫吡喃基、四氫呋喃基、三甲基甲硅垸基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三芐基甲硅垸基，W為Q-d5-羧酸，R5為氫、CrCnr烷基或d-Cur烯基，n為1-4的數(shù)字。烷基為線性或支鏈烷基基團，具有1-10個碳原子的飽和和不飽和烷基。可以提及的實例為甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、癸基、丁烯基、異丁烯基、丙烯基、戊烯基、芐基、間氯芐基和對氯芐基。烷基可以任選地被鹵素原子如氟、氯或溴單取代或多取代，被烷氧基如甲氧基、乙氧基單取代或多取代，任選地被取代的芳基或芳酰基如苯基，或被二烷基氨基如二甲基氨基、二乙基氨基、二甲基氨基丙基和三烷基銨單取代或多取代，其中優(yōu)選單取代。合適的芳基是取代和未取代的芳基，如苯基、1-萘基和2-萘基，它們分別可以被1-3個鹵素原子、苯基、分別具有1-4個碳原子的1-3個烷基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、羧基、羥基或具有1-4個碳原子的垸氧基取代。環(huán)烷基的環(huán)中可以包含3-10個碳原子。環(huán)可以被具有1-4個碳原子的垸基取代?？梢蕴峒暗膶嵗秊榄h(huán)戊基、環(huán)己基、甲基環(huán)己基和金剛烷基。合適的雜環(huán)基團是包含至少一個雜原子的5-元和6-元雜環(huán)，所述雜原子優(yōu)選氮、氧或硫?？梢蕴峒暗膶嵗秊?-呋喃基、2-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、噁唑基、噻唑基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、3-呋喃基、3-噻吩基、2-四唑基。生理學可耐受的酸殘基(acidresidue)適合作為酸殘基。優(yōu)選的酸是具有1-15個碳原子的有機羧酸和磺酸，它們屬于脂肪族、脂環(huán)族、芳香族和雜環(huán)系列。可以提及的取代基的實例為CVd5-烷基、羥基、d-d5-垸氧基、氧代和氨基或鹵素原子?？梢蕴峒暗聂人岬膶嵗缦录姿?、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、三甲基乙酸、二乙基乙酸、叔丁基乙酸、環(huán)丙基乙酸、環(huán)戊基乙酸、環(huán)己基乙酸、環(huán)丙垸羧酸、環(huán)己烷羧酸、苯基乙酸、苯氧基乙酸、甲氧基乙酸、乙氧基乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸和三氯乙酸、氨基乙酸、二乙基氨基乙酸、哌啶子基乙酸(piperidinoaceticacid)、嗎啉代乙酸(morpholinoaceticacid)、乳酸、琥珀酸、己二酸、苯甲酸、被鹵素、三氟甲基、羥基、垸氧基或羧基取代的苯甲酸、煙酸、異煙酸、呋喃-2-羧酸、環(huán)戊基丙酸。合適的磺酸的實例是甲磺酸、乙磺酸、異丙磺酸、P-氯乙磺酸、丁磺酸、環(huán)戊磺酸、環(huán)己磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、對氯苯磺酸、N，N-二甲基氨基磺酸、N，N-二乙基氨基磺酸、N,N-雙(p-氯乙基)氨基磺酸、N，N-二異丁基氨基磺酸、N，N-二丁基氨基磺酸、吡咯垸基磺酸、哌啶子基磺酸、哌嗪基磺酸、N-甲基哌嗪基磺酸和嗎啉代磺酸。羥基可以例如通過醚化或酯化進行官能修飾。合適的醚殘基是技術人員已知的殘基。優(yōu)選易于除去的醚殘基，例如四氫吡喃基、四氫呋喃基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅垸基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三芐基甲硅垸基。合適的?；荝"所述的羧酸?？梢园疵Q提及的實例是乙?；⒈；⒍□；捅郊柞；?。適合形成鹽的是技術人員已知可用于形成生理學可耐受的鹽的無機堿和有機堿。可以提及的實例是堿金屬氫氧化物如氫氧化鈉和氫氧化鉀，堿土金屬氫氧化物如氫氧化鈣，氨，胺如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、嗎啉、三(羥基甲基)甲基胺等。已證明特別有效的通式I的化合物是下列化合物，其中R^為CH20H、-COOR2、-(:0,112或-(:0,113基團，w為氫或d-do-烷基，所述烷基為線性或支鏈烷基，任選為單不飽和至多不飽和垸基，并任選地被氟、氯或溴單取代，被CVC4-垸氧基、取代的C3-Cnr芳基或任選地取代的C3-do-芳?；?、二-CrCV烷基氨基或三-d-C5-烷基氨基單取代，任選地被CrCr烷基取代的C5-C6-環(huán)烷基，任選地被苯基取代的C3-Cht芳基，所述苯基可以在3位或4位被氟、氯、烷氧基或三氟甲基取代，或在4位被羥基取代，可以被氮、氧或硫阻斷一次或多次的C5-CV雜環(huán)垸基，R3為Crd。-羧酸或d-do-磺酸，A為順式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，B為反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，W為C2-Q-亞垸基，W為羥基，W為氫、C廣CV垸基或CrCur烯基，且n為1-4的數(shù)字。已證明特別有效的通式I的化合物是下列化合物，其中Ri為CH20H、-COOR2、-(:01^112或-(:0,113基團，W為氫或任選被苯基取代的d-Q-烷基，Cs-C6-環(huán)垸基，任選被苯基取代的Q-CV芳基，R3為CrC6-羧酸或d-CV磺酸，A為順式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，B為反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，W為CV亞烷基，W為羥基，W為氫、飽和的d-Cr垸基或CrCr烯基，且n為1-4的數(shù)字。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明通式I的前列腺烷(prostane)衍生物的方法，所述方法的特征在于使通式II的醛<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R1為基團-COOR2、-CONHR3，A和R4的含義如上所述，其中R'中的游離OH基團受到保護，與通式III的砜的碳負離子反應<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>將所得羥基砜乙?；?，然后還原消除得到烯烴，任選地，隨后以任何順序將受到保護的羥基脫保護，任選地，將雙鍵酯化、醚化和/或氫化，和/或將酯化的羧基(R^COOie)和/或游離羧基(COOR2，其中112=印酯化，和/或將游離羧基(COOR2，其中R2=H)轉化為酰胺(R1=CONie)和/或將游離或酯化的羧基(R1=CONHR"還原。使用惰性溶劑如四氫呋喃或乙醚，在-10(TC至24°C，優(yōu)選-10(TC至-70°。的溫度下，以本身已知的方法進行通式II的醛與由砜III產(chǎn)生的碳負離子的反應。以常規(guī)方法，用堿產(chǎn)生砜III的碳負離子，所述堿為例如丁基鋰、甲基鋰、叔丁醇鉀、氫化鈉、二異丙基酰胺鋰、優(yōu)選丁基鋰。碳負離子的形成在-78。C至25°C的溫度下進行，優(yōu)選在-78。C下進行。以已知的方法，任選地，在堿(如吡啶)的存在下，在-78。C至25°C的溫度下，用乙酸酐將所產(chǎn)生的羥基進行乙?；?。使用鎂粉的甲醇溶液并添加催化量的氯代三甲基硅垸，進行中間產(chǎn)物乙酰氧基砜(acetoxysulphone)的還原消除以得到通式I的反式烯烴。反應在(TC至6(TC的溫度下進行，優(yōu)選在15。C至25。C的溫度下進行?；蛘撸€原消除也可以用鈉汞齊進行。用適合還原酯或羧酸的還原劑如氫化鋁鋰、二異丁基氫化鋁等進行還原以得到其中W為-CH20H基團的通式I的化合物。合適的溶劑為乙醚、四氫呋喃、二甲氧基乙烷、甲苯等。還原在-30'C至所用溶劑的沸點下進行、優(yōu)選在(TC至3(TC下進行。通過已知方法釋放經(jīng)過官能修飾的羥基。例如，在有機酸如草酸、乙酸、丙酸等的水溶液中，或在無機酸如鹽酸的水溶液中消除羥基保護基團如四氫吡喃基團。添加與水混溶的惰性有機溶劑以改善溶解度是有利的。合適的有機溶劑的實例是醇如甲醇和乙醇，和醚如二甲氧基甲垸、二噁烷和四氫呋喃。優(yōu)選使用四氫呋喃。優(yōu)選在2(TC至8(TC的溫度下進行消除。在醇或醇的水溶液中，例如用堿金屬或堿土金屬碳酸鹽或氫氧化物將?；?。合適的醇是脂肪醇如甲醇、乙醇、丁醇等。優(yōu)選甲醇。可以提及的堿金屬碳酸鹽和氫氧化物是鉀鹽和鈉鹽。優(yōu)選鉀鹽。合適的堿土金屬碳酸鹽和氫氧化物的實例是碳酸鈣、氫氧化鈣和碳酸鋇。反應在-10。C至+70。C下進行、優(yōu)選在+25。C下進行。通過技術人員已知的方法引入I^的酯基團-COOR2，例如其中112為具有l(wèi)-10個碳原子的烷基。通過本身已知的方法使1-羧基化合物與例如重氮烴(diazohydrocarbon)反應。例如通過將重氮烴在惰性溶劑，優(yōu)選在乙醚中的溶液與1-羧基化合物在相同或不同的惰性溶劑如二氯甲烷中的溶液混合，而用重氮烴進行酯化。反應在1至30分鐘內完成，然后除去溶劑并通過常規(guī)方法純化所述酯。重氮烷是已知的，或者可以通過已知的方法(Org.ReactionsVol,8，第389-394頁(1954))制備。通過技術人員已知的方法引入R1的酯基團COOR2，其中W是取代或未取代的芳基。例如，在合適的堿如吡錠、DMAP、三乙胺的存在下，在惰性溶劑中，使1-羧基化合物與適當?shù)姆蓟u基化合物和二環(huán)己基碳二亞胺反應。合適的溶劑為二氯甲烷、氯化乙烯、氯仿、乙酸乙酯、四氫呋喃，優(yōu)選為氯仿。反應在-3(TC至+5(TC的溫度下進行、優(yōu)選在1(TC下進行。如果期望還原初始產(chǎn)物中存在的c=c雙鍵，則可以通過本身已知的方法進行氫化。以本身已知的方法，在低溫下，優(yōu)選在約-2(TC下，在氫氣氛中，在貴金屬催化劑的存在下，進行5,6雙鍵的氫化。合適的催化劑的實例是10%碳載鈀。如果將5，6雙鍵和13,14雙鍵兩者都氫化，則使用更高的溫度，優(yōu)選為約20°C。通過使用合適量的適當無機堿中和，可以將其中f為氫原子的通式I的前列腺素衍生物轉化為鹽。例如，將適當?shù)那傲邢偎厮崛苡诎瘜W計量量的堿的水中，在蒸發(fā)除去水或添加與水混溶的溶劑如醇或丙酮后，得到固體有機鹽。以常規(guī)的方法，通過將前列腺素酸溶于例如合適的溶劑如乙醇、丙酮、乙醚、乙腈或苯中，并向該溶液中添加至少化學計量量的胺，來制備胺鹽。這通常生成固體形式的鹽，或者在溶劑蒸發(fā)后以常規(guī)的方法將其分離。通過技術人員已知的方法引入R1的酰胺基團-CONHR3。最初在叔胺如三乙胺的存在下，以氯甲酸異丁酯將通式I的羧酸(R2=H)轉化為混合酐。在惰性溶劑或溶劑混合物如四氫呋喃、二甲氧基乙垸、二甲基甲酰胺、六甲基磷酰三胺(hexamethylphosphorictriamide)中，在-30。C至+60。C的溫度下、優(yōu)選在0'C至3(TC的溫度下，進行混合酐與適當?shù)陌返膲A金屬鹽或與氨(RS-H)的反應。用于引入R1的酰胺基團-CONHR3的另一種可能的方法包括使通式I的l-羧酸(R2=H)(其中任選地將游離羥基進行中間產(chǎn)物保護)與通式IV的化合物反應O=C=N-R3IV其中W的含義如上所述。，任選地，添加叔胺如三乙胺或吡啶，進行通式I的化合物(R2=H)與通式IV的異氰酸酯的反應。反應可以不用溶劑，或在惰性溶劑中，優(yōu)選在乙腈、四氫呋喃、丙酮、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、乙醚、甲苯中，在-8(TC至100°C，優(yōu)選在0°C至30°C的溫度下進行。如果起始物料在前列腺垸殘基中包含OH基團，則這些OH基團也參與反應。如果最后期望最終產(chǎn)物在前列腺烷殘基中包含游離羥基，則從被醚或?；虚g產(chǎn)物保護的起始物料開始是有利的，所述醚或?；Ｗo可以優(yōu)選是易于消除的。用作起始物料的通式II的醛是已知的，或者可以通過例如以本身已知的方法，在-20'C下，用叔丁基過氧化氫和異丙氧基鈦(IV)在二氯甲烷中將通式V的9-鹵代前列腺素的13,14雙鍵選擇性環(huán)氧化，通式V中優(yōu)選R1為-COOCH3基團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>然后在乙醚中用高碘酸裂解環(huán)氧化物，并且任選地，用例如二氫吡喃將11-羥基保護，從而提供通式II的醛?？梢酝ㄟ^用通式VIII的垸基鹵化物烷基化，由通式VII的環(huán)烷基羧酸制備用作起始物料的通式III的砜，通式VII中n的含義如上所述，通式VIII中RS的含義如上所述，鹵素可以是碘、氯或溴。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在丙酮中用甲基碘和碳酸鉀將IX酯化，然后在乙醚中用氫化鋁鋰將所得的甲酯還原成醇。在三乙胺的存在下，在二甲亞砜和二氯甲烷的混合物中，用S02-吡啶絡合物將醇氧化，得到通式X的醛。然后進行Wittig-Homer反應，并且任選地，將雙鍵氫化以得到XI，然后用二異丁基氫化鋁還原成通式XII的醇。然而，也可以在將酯XI還原成醇XII之后進行雙鍵的氫化，其中W指雙鍵。通過在甲苯中與苯硫酚反應將中間產(chǎn)物甲苯磺?；?，然后取代羥基。通過這種方法獲得的硫醚xm最后在甲醇水溶液中氧化成通式m的砜。與前列腺素E2相比，所述新EP2激動劑具有明顯更高的選擇性和穩(wěn)定性。所述EP2型新前列腺素類似物適合例如治療和預防如下疾病(disorders)，包括生育障礙、傳染病、癌癥、病毒性感染、心血管障礙、眼內壓升高、青光眼、骨骼系統(tǒng)障礙、血管生成障礙、子宮收縮異常、疼痛和腎障礙(nephrologicaldisorder)。生育障礙指導致不排卵、導致排卵的卵母細胞/卵丘細胞復合物不能受精、導致受精的卵母細胞不著床和不脫膜的障礙，傳染病指由單細胞寄生物(parasite)引起的疾病，癌癥指實體瘤和白血病，病毒性感染指巨細胞病毒感染、肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎以及HIV疾病，心血管障礙指缺血性再灌注損傷、狹窄(restenoses)、動脈粥樣硬化(arterioscleroses)和再狹窄(restenoses)，血管生成障礙指例如子宮內膜異位，眼內壓升高指青光眼，子宮收縮異常指例如痛經(jīng)，骨骼系統(tǒng)障礙指骨質疏松，腎障礙指腎小球腎炎。為將本發(fā)明的化合物用作藥物，將它們轉化為藥物產(chǎn)品的形式，除了活性成分外，所述藥物產(chǎn)品還包含適合腸道或非胃腸道給藥的藥用有機或無機惰性載體物質，如水、明膠、阿拉伯膠、乳酸鹽、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇等。所述藥物產(chǎn)品可以是固體形式例如為片劑、包衣片劑、栓劑、膠囊，或者是液體形式例如為溶液劑、混懸劑或乳劑。任選地，它們還包括賦形劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑；用于改變滲透壓的鹽或緩沖劑。本發(fā)明還涉及這些藥物產(chǎn)品。通過吸入方便地制備氣霧劑溶液。特別適合口服的是包含滑石和/或碳水化合物載體或粘合劑如乳糖、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉的片劑、包衣片劑或膠囊劑。也可以以液體形式使用，例如作為任選地向其中添加甜味劑的流體。無菌的可注射的水溶液或油溶液用于非胃腸道給藥。注射液或混懸劑是特別合適的，活性化合物在聚乙氧基化蓖麻油中的水溶液是特別合適的。例如栓劑適合并通常用于陰道給藥。還可以使用的載體系統(tǒng)是表面活性的賦形劑如膽酸鹽或動物或植物磷脂，但也可以是其混合物、及其脂質體或成分。本發(fā)明還涉及腸道、非胃腸道、陰道和口服給藥。以有效量將本發(fā)明的化合物施用至有需要的患者。"有效量"指治療或預防具體疾病所必需的量或劑量，通過本領域的已知方法，無需過度的試驗即可確定所述量或劑量。活性成分的劑量可以根據(jù)給藥途徑、患者的年齡和體重、待治療的障礙的性質和嚴重性以及類似因素而變化。每日劑量為0.5-1000mg，優(yōu)選50-200mg，所述劑量可以作為單次劑量一次給藥，或者分成2個或更多個每日劑量給藥。本發(fā)明還涉及用于治療上述疾病的藥物，所述藥物包含至少一種通式I的化合物，和包含合適的制劑物質和載體的藥物。本發(fā)明還涉及通式(I)的化合物在制備用于治療和預防以下疾病的藥物中的應用，包括生育障礙、傳染病、癌癥、病毒性感染、心血管障礙、眼內壓升高、青光眼、骨骼系統(tǒng)障礙、血管生成障礙、子宮收縮異常、疼痛和腎障礙。生育障礙指導致不排卵、導致排卵的卵母細胞/卵丘細胞復合物不能受精、導致受精的卵母細胞不著床和不脫膜的障礙，傳染病指由單細胞寄生物引起的疾病，癌癥指實體瘤和白血病，病毒性感染指巨細胞病毒感染、肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎以及HIV障礙，心血管障礙指缺血性再灌注損傷、狹窄、動脈粥樣硬化和再狹窄，血管生成障礙指例如子宮內膜異位，眼內壓升高指青光眼，子宮收縮異常指例如痛經(jīng)，骨骼系統(tǒng)障礙指骨質疏松，腎障礙指腎小球腎炎。本發(fā)明通式I的化合物與EP2受體結合并具有激動作用。PGE2結合至人PGE2受體的EP2亞型誘導與膜關聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶的激活并導致形成cAMP。圖1顯示在細胞激動(agonism)實驗中的極高活性(EC50<9.5xl0e-10M)，而在拮抗實驗中沒有任何抑制(IC5(^2xl0e-5M)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的物質作為EP2受體激動劑的應用。本發(fā)明通式I的化合物具有促進受精(profertile)的作用。在排卵前囊狀卵泡中，卵母細胞被卵丘細胞包圍，卵丘細胞形成了圍繞卵母細胞的稠密細胞環(huán)。在黃體生成素(lutenisinghormone)峰(LH峰)后，一系列過程被激活并導致包含卵丘細胞的細胞環(huán)的巨大形態(tài)學變化。在這種情況下，卵丘細胞形成胞外基質，其導致所謂的卵丘擴展(Vanderhyden等DevBiol.1990Aug;140(2):307-317)。這種卵丘擴展是排卵過程和隨后的受精可能性的重要組成部分。其合成由LH峰誘導的前列腺素(在本文指前列腺素E2)在卵丘擴展中是至關重要的。類前列腺素EP2剔除小鼠(Hizaki等，ProcNatlAcadSciUSA.1999Aug31;96(18):10501-6.)顯示顯著降低的卵丘擴展和嚴重的生育能力低下，證明類前列腺素EP2受體對該過程的重要性。EP2激動劑導致卵丘復合物濃度依賴性巨大擴展。由濃度為0.5^M和1pM的實驗物質誘導的卵丘擴展與由濃度為1的天然EP2受體激動劑PGE2誘導的卵丘擴展相等(n-16卵丘-卵母細胞復合物/組；參見圖1)。EP2激動劑導致排卵的卵母細胞濃度依賴性顯著增加。在每種情況下，只需給藥0.00015mg/動物即可發(fā)生排卵的卵母細胞的這種顯著增加，并顯示即使使用用于排卵的標準劑量的HCG也可能提高排卵的卵母細胞的數(shù)目(n=11隱12動物/組；**p<0.005，*p<0.05，圖2)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明化合物在治療生育障礙如排卵受損(impairedovulation)或排卵缺失(absentovulation)、卵母細胞/卵丘細胞復合物受精受損(impairedfertilization)、植入受損(impairedimplantation)禾口脫膜受損(impaireddecidualisation)中的應用。前列腺素在血管生成中具有重要作用(Sales,Jabbour，2003,Reproduction126，559-567)。子宮內膜異位是由血管受損引起的慢性障礙。由于子宮內膜血管的變化，約10%的婦女在經(jīng)期時經(jīng)常受到大量出血的困擾。此外，已經(jīng)觀察到血管的結構差異，例如平滑肌細胞層形成不完全(Abberton等，1999,Hum.Reprod.14,1072-1079)。由于經(jīng)期出血部分地受到血管收縮的控制，因此顯然平滑肌的缺陷對出血具有重要的作用。前列腺素和由EP2受體介導的作用還在子宮內膜損傷的激素調節(jié)中具有作用(Sun等，2003,Endocrinology144,3934-3942)。越來越多的證據(jù)顯示子宮內膜異位與顯著的炎癥響應有關，所述炎癥響應可能由激活的巨噬細胞和淋巴細胞以及細胞因子、趨化因子和生長因子的水平上升所介導。已假設這些炎癥過程介導某些與子宮內膜異位有關的臨床特征。已知患有子宮內膜異位的婦女的腹腔液包含更多的炎癥細胞及與其相關的細胞因子、趨化因子和生長因子(MurphyAA.Clinicalaspectsofendometriosis.AnnNYAcadSci.March2002;955:1-10)。其結果是可促進植入和增殖的環(huán)境。前列腺素(在本文指前列腺素E2)可減少炎癥細胞因子如TNFa自激活的巨噬細胞的表達。類前列腺素EP2剔除小鼠(ShinomiyaS等，RegulationofTNFaandIL-10productionbyprostaglandins12andE2:studieswithprostaglandinreceptor-deficientmiceandprostaglandinE-receptorsubtype-selectivesyntheticagonists.(BiochPhar2001;611153)不能響應EP2激動劑，證明類前列腺素EP2受體對于該過程的重要性。表1顯示EP2激動劑導致對在培養(yǎng)物上清液中測量的細胞因子水平的抑制。EP2激動劑還引起TNFa顯著減少，如圖3所示。本發(fā)明涉及通式I的化合物用于治療子宮內膜異位的應用。前列腺素在子宮收縮中具有重要作用，過度強烈的收縮會引起痛經(jīng)(Sales,Jabbour,2003，Reproduction126,559-567)。本發(fā)明涉及通式I的物質用于治療痛經(jīng)的應用。EP2受體激動劑還在控制眼內壓中具有重要作用?？赡茱@示眼的小梁網(wǎng)(TM)血管中存在高濃度的尤其是EP2受體。眼淚通過TM和鞏膜靜脈竇(Schlemm，scanal)離開眼睛，EP2受體激動劑通過刺激淚液流出而影響淚液的動力學，并因此導致眼內壓降低(W.Kamphuis等，CurrentEyeRes.2004,29,17-26)。本發(fā)明涉及本發(fā)明的物質用于治療與青光眼等有關的眼內壓升高的應用。前列腺素還在對抗骨質疏松的過程中具有重要作用。本發(fā)明因此涉及本發(fā)明的物質用于治療骨質疏松的應用。前列腺素還在控制血壓的過程中具有重要作用。本發(fā)明因此涉及本發(fā)明的物質用于治療高血壓的應用。前列腺素還影響細胞因子的產(chǎn)生。認為多發(fā)性硬化(MS)是全身T淋巴細胞介導的自身免疫疾病，其靶組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。T淋巴細胞細胞因子釋放曲線可以被傾斜到T輔助細胞1或T輔助細胞2(Th-l或Th-2)譜系(lineage)。Th-1細胞分泌細胞因子如干擾素y(INF-力并誘導細胞介導的免疫響應，而Th-2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-10并誘導體液或抗體介導的響應[Mossman等，1989,AnnualRevImmunol.7:145-173]。INF-y表達與MS有關，使用多因素失能測量，響應PLP肽和MBP肽的INF-y表達與失能顯著相關[Hirsch等，1985，J.ClinImmunolNov;5(6):386-389;Moldovan等，2003，J.Neuroimmunol.Aug;141(1-2):132-140]。重要的是，臨床研究顯示給藥IFN-y可引起MS患者惡化[Panitch等，Lancet,Apr18;(8538):893-895]。表2顯示在激活的T細胞試驗中，EP2激動劑導致抑制INF-y自激活的人供體T細胞表達。表3顯示在EP2激動劑的存在下，在源自激活的人供體單核細胞的樹突細胞試驗中，Th-l相關的細胞因子被下調。因此，通過直接抑制INF-Y表達并通過使樹突細胞介導的CD4+T細胞極化偏離表達INF-y的Th-l譜系，預期EP2激動劑可減少INF-y在MS患者中的表達。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物用于治療自身免疫疾病的應用，所述自身免疫疾病例如多發(fā)性硬化、繼發(fā)進展性多發(fā)性硬化、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、克羅恩病(Crohn，sdisease)和斑禿。在沒有描述起始化合物的制備時，它們是己知的或者可以按照與已知化合物類似的方法或本文所述的方法制備。還可以在平行反應器中或通過組合運行(combinatorialoperating)技術的方法進行本文所述的所有反應。可以通過常規(guī)方法如結晶、色譜法或形成鹽來將異構體的混合物拆分為對映異構體或E/Z異構體。以常規(guī)的方法通過將等量或過量的堿或酸(任選地為溶液)添加到式I化合物的溶液中并以常規(guī)的方法分離沉淀物或處理溶液而制備鹽。本發(fā)明因此還涉及基于通式I的化合物和常規(guī)的賦形劑或載體的藥物。下列實施例將詳細解釋本發(fā)明，而不限制本發(fā)明。實施例制備實施例實施例1(5Z，13E)-(9R，11R)-9-氯-ll-[(2H)-四氫吡喃-2-基氧基]-17，17-四亞甲基-20-去甲-5，13-前列腺二烯酸甲酯在-78'C下，在氮氣氛下，將0.68ml1.6M丁基鋰的己烷溶液滴加到290mg1-苯基磺?；?4,4-(三亞甲基)己垸的2.4ml四氫呋喃溶液中，將混合物在-78。C下攪拌1.5小時。然后在-10(TC下將該溶液滴加到315mg醛(實施例lc)的2.4ml四氫呋喃溶液中。然后將混合物在-100。C下攪拌30min，在-78°。下攪拌1h。然后向反應混合物中添加0.16ml乙酸酐，在1h內將混合物溫熱到室溫。將反應混合物與氯化銨溶液混合并用乙酸乙酯萃取3次，合并的有機相用水洗滌1次，用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。將中間產(chǎn)物溶于6ml甲醇，在氮氣氛下添加160mg鎂粉。然后將混合物在室溫下攪拌15min。然后向反應混合物中添加1滴氯代三甲基硅烷，將混合物在室溫下再攪拌3h。將反應混合物添加到5ml冰冷的氯化銨溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并的有機相用水洗滌1次，用飽和氯化鈉溶液洗滌l次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己垸/乙酸乙酯(8:2)硅膠色譜法純化，得到140mg酯。iH-NMR(CDC13):S=0.75(3H)，1.4-2.4(30H)，3.44(1H),3.66(3H)，3,8-4.15(3H),4.63(1H)，5.15-5.65(4H)如下制備起始的醛la)(5Z)-(9R,llR，13RS,14RS,15S)-9-氯-11,15-二羥基-16,16-二甲基-13,14-環(huán)氧-5-前列腺烯酸甲酯在-20'C下，在氮氣氛下，將4.7ml異丙氧基鈦(IV)滴加到6.52g(5Z,13E)-(9R，llR,15R)-9-氯-ll,15-二羥基-16，16-二甲基-5，13-前列腺二烯酸甲酯的33ml二氯甲烷溶液中，將混合物在-20'C下攪拌30min。然后將6ml叔丁基過氧化氫添加到反應混合物中。隨后添加10g硫酸鐵和20g檸檬酸的100ml水溶液，用二氯甲烷將混合物萃取3次。合并的有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用二氯甲烷/乙酸乙酯(0-40%)硅膠色譜法純化，得到3.55g作為無色油的環(huán)氧化物。!H-NMR(CDC13):5=0.75-1.05(9H)，1.1-2.4(18H),2.9-3.0(2H),3.2(1H),3.65(3H)，4.0-4.15(2H)，4.63(1H)，5.3-5.55(2H)1b)(5Z)-(9R，11R)-9-氯-ll-羥基-14，15,16,17，18,19,20-七去甲-12-氧代-5-前列腺烯酸甲酯在氮氣氛下，將5g高碘酸在360ml醚中劇烈攪拌1h。將125ml該溶液添加到2g環(huán)氧化物的5ml醚溶液中，將混合物在氮氣氛下在室溫下攪拌。在lh后，向反應混合物中再添加125ml高碘酸溶液，在2h后，添加剩余的高碘酸溶液。在過濾后，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌1次，用水洗滌1次，用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。收率:1.9g醛。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>lc)(5Z)-(9R,llR)-9-氯-11-[(2H)-四氫吡卩南-2-基氧基]-14，15,16,17，18,19,20-七去甲-12-氧代-5-前列腺烯酸甲酯將1.9g醛溶于20ml二氯甲垸并與1.6ml二氫吡喃和8.8mgpTsOH混合，攪拌30min。然后用醚稀釋混合物，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌1次，用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。在硅膠上經(jīng)色譜法純化兩次[第l柱二氯甲垸/乙酸乙酯(2-10%)，第2柱己烷/乙酸乙酯(0-20%)]，得到720mg四氫吡喃基醚。iH-R(CDC13):5=1.35-2.7(17H),3.65(3H),3.4-4.1(3H)，4.58(2H),5.3-5.55(2H)，9.75(1H)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>砜的制備ld)2,2-(三亞甲基)丁酸在-10。C下，在氮氣氛下，將61.6ml二異丙胺的180ml四氫呋喃溶液滴加到275ml丁基鋰(lM己烷溶液)中，將混合物在-10。C下攪拌30min。在-20。C下，向反應混合物中滴加19.1ml環(huán)丁垸羧酸，將反應混合物攪拌4小時，在此期間將其溫熱到室溫。將懸浮液傾入300ml冰水中，用2N鹽酸調節(jié)到pHl，用醚萃取4次，每次300ml，合并的有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。產(chǎn)生30.1g羧酸。iH畫畫R(CDC13):5=0.88(3H)，1.75-1.95(6H)，2.4(2H)。le)2,2-三亞甲基丁-l-醛在室溫下，在氮氣氛下，將62.2g碳酸鉀和28ml甲基碘添加到25.6gld的300ml丙酮溶液中，將混合物攪拌12小時。然后用抽吸濾除沉淀物，濾液在室溫下真空濃縮。將粗產(chǎn)物溶于500ml醚，用水洗滌1次，用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，有機相用硫酸鈉干燥并真空濃縮。殘余物在85mbar真空和110。C下(沸點85-90。C)蒸餾。產(chǎn)生24.5g酯。將20g酯溶于40ml醚，在0。C下，在氮氣氛下，將該溶液滴加到4.8g氫化鋁鋰的390ml醚懸浮液中，將混合物在Ot:攪拌l小時，在室溫下攪拌l小時。在O"C下，用11ml水、11ml15%濃度氫氧化鈉溶液，再用30ml水非常小心地分解過量的氫化鋁鋰。攪拌20分鐘，然后過濾，然后用醚充分洗滌，濾液用硫酸鈉干燥并真空濃縮。產(chǎn)生16.3g醇。在室溫下，在氮氣氛下，將481111三乙胺和22.27§803-吡啶絡合物添加到8g醇的450ml二氯甲垸和100ml二甲亞砜溶液中。將混合物攪拌1小時，然后與300ml飽和氯化銨溶液混合，再攪拌15min。然后用1.51醚稀釋，分離各相，有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌2次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。產(chǎn)生9.5g醛。1)CH3l,K2CO:2)LialH43)S03-PyDMSO1f)4，4-(三亞甲基)-2-己烯羧酸乙酯在0。C下，在氮氣氛下，將18.3ml膦?；宜崛阴?triethylphosphonoacetate)的20ml四氫呋喃溶液滴加到3.39g氫化鈉的60ml四氫呋喃懸浮液中，將混合物在室溫下攪拌30min。然后在(TC下將醛(在le中制備)滴加到反應混合物中，將混合物在室溫下攪拌3小時。然后用飽和氯化銨溶液使其驟冷，用醚萃取3次，合并的有機相用水洗滌1次，用飽和氯化鈉溶液洗滌l次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己烷/醚(0-10%)硅膠色譜法純化，得到9.81g酯。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>lg)4，4-(三亞甲基)己-l-醇在-70'C下，在氮氣氛下，將78.5mlDIBAH緩慢滴加到7.8glf)中制備的酯的65ml二氯甲烷溶液中。在30min后，向反應混合物中緩慢滴加20ml異丙醇，然后緩慢滴加36ml水。將混合物在室溫下攪拌2小時，用抽吸濾除沉淀物并用二氯甲烷徹底洗滌，將濾液真空濃縮。用己烷/乙酸乙酯(0-40%)硅膠色譜法純化，得到5.4g烯丙醇。將5g烯丙醇溶于與混合500mgPd/C的200ml乙酸乙酯中，然后通過Cdlite抽吸過濾并用乙酸乙酯徹底洗漆。將濾液真空濃縮，得到4.5g伯醇。iH-NMR(CDC13):S=0.8(3H)，1.2-1.9(12H)，3.6(2H)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>1h)l-苯硫基-4，4-(三亞甲基)己烷在O"C下，在氮氣氛下，將6.19g對甲苯磺酰氯的7.4ml甲苯溶液滴加到4.4g在lg)中制備的醇、25ml甲苯、997mg叔丁基溴化銨和46ml2NNaOH的混合物中，將混合物攪拌2小時。然后分離各相，有機相用水洗滌3次，用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己烷/醚(0-20%)硅膠色譜法純化，得到4.6g硫醚。化顧R(CDC13):S=0.75(3)，1.39(2H),1.45-1.88(10H),2.88(2H),7.15-7.53(5H)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>1i)l-苯基磺酰基-4,4-(三亞甲基)己烷在0-10'C下，在氮氣氛下，將18g臭氧的70ml水溶液滴加到4.6g在lh)中制備的產(chǎn)物的70ml甲醇溶液中，將混合物攪拌2小時。然后用100ml水將其稀釋，用乙酸乙酯萃取4次，合并的有機相用水洗滌1次，用飽和硫代硫酸鹽溶液洗滌2次，用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己烷/乙酸乙酯(0-20%)硅膠色譜法純化，得到2.55g砜。'H-畫R(CDC13):S=0.7(3H)，1.3-1.85(12H)，3.08(2H),7.5-7.7(3H)，7.9(2H)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>實施例2(5Z，13E)-(9R，llR)-9-氯-ll-羥基-17,17-四亞甲基-20-去甲-5,13-前列腺二烯酸甲酯在0t下，在氮氣氛下，將2.5mgpTsOH添加到140mg在實施例1制備的產(chǎn)物的1.5ml甲醇溶液中，將混合物攪拌3小時。然后將反應混合物傾入飽和碳酸鈉溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并的有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌l次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己垸/乙酸乙酯(0-50%)硅膠色譜法純化，得到105mg醇。'H-NMR(CDC13):5=0,75(3H)，1.38-2.4(24H),3.65(3H)，3.9-4.13(2H)，5.2-5.63,實施例3(5Z，13E)-(9R，llR)-9-氯-ll-羥基-17，17-四亞甲基-20-去甲-5,13-前列腺二烯酸在氮氣氛下，將0.2ml2N氫氧化鈉溶液添加到68mg在實施例2中制備的醇的1ml甲醇溶液中，將混合物攪拌5小時。然后用1ml水將其稀釋，用2N鹽酸調節(jié)到pH3，用乙酸乙酯萃取3次，合并的有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己烷/乙酸乙酯(50-80%)硅膠色譜法純化，得到50.3mg羧酸。^-畫R(CDC13):S=0.75(3H)，1.38-2.4(24H)，3.9-4.1(2H),5.2-5.62(4H)生物學實施例1.檢測對人前列腺素&(亞型EP2)受體信號的拮抗作用l丄檢測原理PGE2結合至人PGE2受體的EP2亞型誘導激活膜關聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶并導致形成cAMP。在磷酸二酯酶抑制劑IBMX的存在下，由于這種刺激(stimulation)而累積并通過細胞溶解而釋放的cAMP被用于競爭性檢測方法。在本試驗中，細胞溶解產(chǎn)物中的cAMP與cAMP-XL665競爭結合Eu穴狀化合物標記的抗-cAMP抗體。在沒有細胞cAMP的情況下，這導致該抗體偶聯(lián)至cAMP-XL665分子所致的最大的信號。在337nm下激發(fā)后，這導致在665nm(和620nm)的基于FRET(熒光共振能量轉移)的持久的發(fā)射信號。在合適的測量儀器中，以一定的時滯(timelag)，即在消除背景熒光后，測量這兩個信號。由加入前列腺素E2所致的低FRET信號的任何增力卩(測量孔變化比(wellratiochange)=發(fā)射665鵬/發(fā)射62Gnm*10OOO)都顯示拮抗劑的作用。1.2.檢測方法1.2丄拮抗作用試驗(384-孔板的每個孔的數(shù)據(jù))將物質的溶液(0.75pl)引入試驗板中，將30%DMSO溶于16plKRSB+IBMX刺激溶液(lXKrebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液；Sigma-Aldrich#K-4002;包括750pM3-異丁基-l-甲基黃嘌呤，Sigma-Aldrich#1-7018)中，然后將其中15|al轉移到不久前用KRSB洗滌過的無培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中。在室溫(RT)下預溫育30分鐘后，添加5(il4xPGE2溶液(11nM)，在激動劑的存在下，在RT下再溫育60min(體積~20pl)，然后通過添加5^溶胞緩沖液終止反應，在RT下再溫育20min(體積~25pl)。然后將細胞溶解產(chǎn)物轉移到測量板中，根據(jù)制造商的說明(環(huán)形AMP試劑盒，CisbioInternational#62AMPPEC)進行測量。1.2.2.激動作用測量(384-孔板的每個孔的數(shù)據(jù))將物質的溶液(0.75pl)引入試驗板中，將30%DMSO溶于16KRSB+IBMX刺激溶液(lXKrebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液；Sigma-Aldrich#K-4002;包括750pM3-異丁基-l-甲基黃嘌呤，Sigma-Aldrich#1-7018)中，然后將其中15|al轉移到不久前用KRSB洗滌過的無培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中。在室溫下(RT;體積~15)al)溫育60分鐘后，然后通過添加5jil溶胞緩沖液終止反應，在RT下再溫育20min(體積~20(al)。然后將細胞溶解產(chǎn)物轉移到測量板中，根據(jù)制造商的說明(環(huán)形AMP試劑盒，CisbioInternational弁62AMPPEC)進行測量。在細胞激動作用試驗中，試驗化合物顯示出極高的活性(EC50<9.5xl0e-10M)，在拮抗作用試驗中沒有任何抑制(IC50>2xl0e-5M)。2.PGE2受體的EP2亞型和排卵前卵丘擴展2丄背景在排卵前囊狀卵泡中，卵母細胞被卵丘細胞包圍，卵丘細胞形成了圍繞卵母細胞的稠密細胞環(huán)。在LH峰(黃體生成素)后，一系列過程被激活并導致包含卵丘細胞的該細胞環(huán)的巨大形態(tài)學變化。在這種情況下，卵丘細胞形成胞外基質，其導致所謂的卵丘擴展(Vanderhyden等DevBiol.1990Aug;140(2):307-317)。這種卵丘擴展是排卵過程和隨后的受精可能性的重要組成部分。其合成由LH峰誘導的前列腺素(在本文指前列腺素E2)在卵丘擴展中是至關重要的。類前列腺素EP2剔除小鼠(Hizaki等，ProcNatlAcadSciUSA.1999Aug31;96(18):10501-6.)顯示顯著降低的卵丘擴展和嚴重的生育能力低下，證明類前列腺素EP2受體對該過程的重要性。2.2.體外卵丘擴展試驗通過單劑量(腹腔內)7.5I.U.PMSG(懷孕母馬血清促性腺激素；SigmaG-4877，Lot68H0909)，在20-24日齡不成熟雌性小鼠(種類CD1(ICR),獲自CharlesRiver)體內誘導卵泡生成。在注射47-50小時后，取出卵巢并取出卵丘-卵母細胞復合物。卵丘復合物在該階段還沒有擴展。然后用前列腺素E2(PGE2)(1^M)、載體對照(乙醇)或實驗物質將卵丘-卵母細胞復合物溫育20-24小時。培養(yǎng)基a-MEM培養(yǎng)基，包含0.1mMIBMX，丙酮酸鹽(0.23mM)，谷氨酸鹽(2mM)，pen/strep100IU/mlpen.和100pg/mlstrep.)和HSA(8mg/ml))。然后通過分成四個階段來建立卵丘擴展(根據(jù)Vanderhyden等DevBiol.19卯Aug;140(2):307畫317)。實驗物質導致卵丘復合物濃度依賴性巨大擴展。由濃度為0.5pM和lpM的實驗物質誘導的卵丘擴展與濃度為1^M的天然EP2受體激動劑PGE2誘導的卵丘擴展相等(11=16卵丘-卵母細胞復合物/組；參見圖1)。2.3.體內排卵試驗通過單劑量(腹腔內)IOI.U.PMSG(懷孕母馬血清促性腺激素；SigmaG-4877,Lot68H0卯9)，在16-20日齡的不成熟雌性小鼠(種類(B6D2F1)，獲自CharlesRiver)體內誘導卵泡生成。在PMSG刺激47-50小時后，使用劑量為10IU的HCG(人絨毛膜促性腺激素)誘導最終卵泡成熟和排卵。在給藥HCG(s.c在苯甲酸芐酯/蓖麻油l+4(體積比)中)前10小時、5小時和0小時給藥實驗物質。在給藥HCG14小時后，進行尸體解剖，并測定輸卵管中排卵的卵母細胞的數(shù)目。EP2激動劑導致排卵的卵母細胞濃度依賴性顯著增加。在每種情況下，僅給藥0.00015mg/動物即可發(fā)生排卵的卵母細胞的這種顯著增加，顯示即使使用用于排卵的標準劑量的HCG也可能提高排卵的卵母細胞的數(shù)目(n二11-12動物/組；**p<0.005，*p<0.05))。3.PGE2受體的EP2亞型和細胞因子釋放試驗3.1.背景越來越多的證據(jù)顯示子宮內膜異位與顯著的炎癥響應有關，所述炎癥響應可能由激活的巨噬細胞和淋巴細胞以及細胞因子、趨化因子和生長因子的水平上升所介導。已假設這些炎癥過程介導某些與子宮內膜異位有關的臨床特征。已知患有子宮內膜異位的婦女的腹腔液包含更多的炎癥細胞及其相關的細胞因子、趨化因子和生長因子(MurphyAA.Clinicalaspectsofendometriosis.AnnNYAcadSci.March2002;955:1-10)。其結果是可促進植入和增殖的環(huán)境。前列腺素(在本文指前列腺素E2)可減少炎癥細胞因子如TNFa自激活的巨噬細胞表達。類前列腺素EP2剔除小鼠(ShinomiyaS等，BiochPhar2001;611153)不能響應EP2激動劑，證明類前列腺素EP2受體對于該過程的重要性。3.2.體外細胞因子釋放試驗在10ng/mlIL-4和200ng/mlGM-CSF的存在下，將源自人供體單核細胞的樹突細胞在包含10%胎牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)6天。在前列腺素E2(PGE2)(1pM)、載體對照(DMSO)或實驗物質(lpM)的存在下，用各種激活刺激物將細胞激活18小時10ng/mlLPS(Sigma),5(xg/ml重組人CD-40配體(R&DSystems),或5|iM人CpG-DNA(HyCultBiotechnology)。通過市售ELISA試劑盒測量個體供體的細胞培養(yǎng)物上清液的TNFa水平。實驗物質導致對在培養(yǎng)物上清液中測量的細胞因子水平的抑制，如表1所示。3.3.離體細胞因子釋放試驗給體重分別為30-35克的治療組CD-I小鼠(1!=5)腹腔內給藥實驗物質或載體對照。20分鐘后，對小鼠實行安樂死，取出脾臟，在RPMI+10。/。胎牛血清中培育脾細胞。在沒有實驗物質的情況下，用PHA和ConA激活細胞并培養(yǎng)18小時。通過市售ELISA試劑盒測量個體小鼠的細胞培養(yǎng)物上清液的TNFa水平。EP2激動劑引起TNFa的顯著降低，如圖3所示。4.證明對T淋巴細胞Th-l細胞因子釋放的抑制4丄原理在試驗條件下，用凝集素伴刀豆球蛋白A(lectinconcanavilinA)(ConA)模擬通過T細胞受體由抗原呈遞細胞(antigenpresentingcell)和抗原來激活人T淋巴細胞。已知ConA與T細胞受體結合并刺激細胞釋放各種細胞因子。Th-l釋放的細胞因子之一是INF-Y。已經(jīng)大量綜述了INF-Y的生物化學和生物學活性。4.2.檢測方法INF-Y是表達的143氨基酸蛋白質的二聚體?；贗NF-Y特異性抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(ELISA)是可商購的。將標準物和樣品吸移到微板的孔中。將人INF-Y特異性抗體添加到孔中。將底物添加到孔中，顏色的顯色與結合的INF-Y的量成比例。測量顏色的強度。4.3.步驟使用Ficoll密度梯度由人供體分離外周血淋巴細胞，并通過選擇性溶胞除去殘余的紅細胞。以大約106細胞/1111在包含另外10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)淋巴細胞。如上所述用2pg/mlConA激活細胞培養(yǎng)物。在ConA的激活過程中，以各種稀釋倍數(shù)添加實驗物質。在37"C下將細胞溫育大約18hr。通過ELISA測量激活過程中釋放的INF-Y。5.證明對源自人單核細胞的樹突細胞細胞因子釋放的抑制5丄原理樹突細胞(DC)是最有效的抗原呈遞細胞，并且在免疫響應中具有核心的作用。在通過toll-樣受體(TLR)刺激后，DC表達并釋放促炎細胞因子和趨化因子，并可以誘導幼稚T細胞的激活和增殖。EP2激動劑結合至DCEP受體可抑制TLR4配體(LPS)刺激的白細胞介素12(IL-12)釋放。EP2激動劑結合至DCEP受體不會抑制TLR4配體(LPS)刺激的白細胞介素10(IL-10)釋放。因此，EP2激動劑使CD4T細胞分化偏離Th-譜系。5.2.檢測方法IL-12是包含通過二硫鍵連接的兩種基因不相關的亞基的75kDa糖蛋白異二聚體(p70)。基于IL-12p70特異性抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(ELISA)是可商購的。將標準物和樣品吸移到微板的孔中。將人IL-12特異性抗體添加到孔中。將底物添加到孔中，顏色的顯色與結合的IL-12的量成比例。測量顏色的強度。IL-10最初被稱為細胞因子合成抑制因子(CSIF)，起初被認為是Th-2克隆的產(chǎn)物，在抗原呈遞細胞的存在下，通過抗原響應刺激的Th-l克隆抑制細胞因子的產(chǎn)生。IL-10是包含兩個相同的160氨基酸子單元的二聚體。基于IL-10特異性抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(ELISA)是可商購的。將標準物和樣品吸移到微板的孔中。將人IL-10特異性抗體添加到孔中。將底物添加到孔中，顏色的顯色與結合的IL-10的量成比例。測量顏色的強度。5.3.步驟使用Ficoll密度梯度由人供體分離源自人單核細胞的樹突細胞，并通過選擇性溶胞除去殘余的紅細胞?；贑D14抗原的表達，使用CD14MicroBead分離人細胞。以大約1.5x106細胞/ml在包含胎牛血清、200ng/mlGM-CSF(Leukine)和10ng/mlIL-4的RPMI1640中培養(yǎng)樹突細胞。細胞生長3天，然后改變培養(yǎng)基。用10ng/mlLPS激活細胞。在LPS刺激過程中，添加1^M物質(EP2激動劑)和1^MPGE2。在37t:下將細胞溫育大約18hr。通過ELISA測量激活過程中釋放的IL-12和IL-IO。表格表1顯示實驗物質對激活的單核細胞釋放的TNFa的體外作用。以18的濃度給藥實驗物質。將細胞激活18小時。實驗物質顯示出對T淋巴細胞Th-l細胞因子釋放呈劑量響應性地極高的抑制活性。表2證明實驗物質對T淋巴細胞Th-l細胞因子釋放抑制的作用。在細胞被ConA激活的過程中，向其中劑量依賴性地(0-20nM)添加實驗物質，將細胞溫育18小時。表3a)和b)證明實驗物質對源自人單核細胞的樹突細胞的細胞因子釋放的抑制的作用。在用LPS刺激細胞的過程中，以lpM的濃度添加實驗物質或PGE2。將細胞溫育18小時。在源自人單核細胞的樹突細胞(DC)的細胞因子釋放試驗中，實驗物質顯示出高度的免疫調節(jié)活性，并且在不抑制Th-2促進細胞因子IL-10(3b)的同時卻抑制Th-l促進細胞因子IL-12(3a)，實際上增加了Th-2促進細胞因子IL-IO。附圖圖1顯示由濃度為0.5^M和1pM的實驗物質誘導的卵丘擴展。該擴展與由濃度為1laM的天然EP2受體激動劑PGE2誘導的卵丘擴展相等(t^16卵丘-卵母細胞復合物/組)。圖2顯示由實驗物質誘導的體內排卵。在HCG之前IO、5和0小時以0.00015、0.0015和0.015mg/動物的濃度給藥實驗物質。圖3顯示實驗物質對離體小鼠脾細胞激活的作用。用PHA或ConA激活細胞。在處死前20min，以1和2嗎/動物的濃度腹腔內給藥實驗物質。表1:對由激活的單核細胞釋放的TNFoi的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2:對T淋巴細胞Th-l細胞因子釋放的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3b:對源自人單核細胞的樹突細胞細胞因子釋放的抑制，<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>權利要求1.通式I的化合物，及其鹽和其與生理學可耐受的堿的環(huán)糊精包合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R'為CH20H、畫COOR2、《0^^2或-(:0腿113基團，R2為氫，Q-Cur烷基，所述烷基為線性或支鏈垸基，任選為單不飽和至多不飽和烷基，并任選地被鹵素、d-Q-烷氧基、取代的C3-Cur芳基或任選取代的C3-d。-芳酰基、二-d-C5-垸基氨基或三-C,-C5-烷基氨基單取代至多取代，任選地被Q-Cr垸基取代的C3-do-環(huán)烷基，任選地被苯基、l-萘基、2-萘基取代的C3-d。-芳基，所述苯基、1-萘基、2-萘基又可以在3位和4位被氟、氯、烷氧基或三氯甲基取代，或在4位被羥基、鹵素、苯基、一個或多個C廣Cr烷基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、羧基、羥基或CVCr垸氧基取代，或C3-CV雜環(huán)烷基，R3為Q-d5-羧酸或d-d5-磺酸，A為順式-CH:CH-或-CH2-CH2-基團，B為反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，W為C2-C6-亞烷基，R"為羥基、基團0-RS或0-R7，其中W為四氫吡喃基、四氫呋喃基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三節(jié)基甲硅烷基，并且W為d-d5-羧酸，R5為氫、Crd(r垸基或d-do-烯基，n為1-4的數(shù)字。2.如權利要求1所述的化合物，其中R^為CH20H、-COOR2、-CONHR2或-CONHR3基團，W為氫或CrCur垸基，所述垸基為線性或支鏈垸基，任選為單不飽和至多不飽和烷基，并任選地被氟、氯或溴單取代，被C,-Cr烷氧基、取代的C3-do-芳基或任選地取代的C3-Cur芳酰基、二-d-C5-烷基氨基或三-d-C5-垸基氨基單取代，任選地被CrCV烷基取代的CVC6-環(huán)垸基，任選地被苯基取代的C3-d。-芳基，所述苯基可以在3位或4位被氟、氯、烷氧基或三氟甲基取代，或在4位被羥基取代，可以被氮、氧或硫阻斷一次或多次的C5-Q-雜環(huán)烷基，R3為Crd。-羧酸或d-d。-磺酸，A為順式-CHK^H-或-CH2-CH2-基團，B為反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基團，W為C2-C6-亞烷基，w為羥基，R5為氫、CrC6-烷基或d-Cnr烯基，且n為1-4的數(shù)字。3.如權利要求1或2所述的化合物其中F^為CH20H、-COOR2、-03順112或-(:0麗113基團，W為氫或任選被苯基取代的d-Cr垸基，C5-CV環(huán)垸基，任選被苯基取代的C3-CV芳基，R3為-d-Q-羧酸或d-Q-磺酸，A為順式-CHK:H-或-CH2-CH2-基團，B為反式-CHK:H-或-CHrCH2-基團，W為C2-亞烷基，W為羥基，W為氫、飽和的CrC4-烷基或d-Cr烯基，且n為1-4的數(shù)字。4.包含至少一種如權利要求1-3所述的式I化合物的藥物。5.如權利要求4所述的藥物，其特征在于通式I的前列腺素衍生物以有效量存在。6.如權利要求1-3所述的化合物和如權利要求4和5所述的藥物與合適的制劑物質和載體。7.如權利要求1-3所述的通式I的前列腺素衍生物作為藥物的應用。8.如權利要求7所述的藥物用于促進生育。9.如權利要求7所述的藥物用于體外受精。10.如權利要求7所述的藥物用于促進排卵。11.如權利要求7所述的藥物用于消除受損的卵丘擴展及其后遺癥。12.如權利要求7所述的藥物用于治療疾病。13.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括生育障礙。14.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括痛經(jīng)。15.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括子宮內膜異16.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括眼內壓升高。17.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括骨質疏松。18.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括血壓升高。19.如權利要求12所述的藥物，其特征在于所述疾病包括自身免疫疾病。20.如權利要求19所述的藥物，其中所述自身免疫疾病選自多發(fā)性硬化、繼發(fā)進展性多發(fā)性硬化、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、克羅恩病和斑禿。21.如權利要求19所述的藥物，其中所述自身免疫疾病是多發(fā)性硬化。22.如權利要求1-3所述的通式I的前列腺素衍生物，其為用于腸道、非胃腸道、陰道和口服給藥的藥物產(chǎn)品的形式。23.用于制備如權利要求l-3所述的化合物的方法，其特征在于使通式II的醛其中R1為基團-COOR2、-CONHR3，A和R4的意義如上所述，其中R"中的游離OH基團受到保護，與通式III的砜的碳負離子反應，并且將所得羥基砜乙?；?，然后還原消除得到烯烴，任選地，隨后以任何順序將受到保護的羥基脫保護，任選地，將雙鍵酯化、醚化和/或氫化，和/或將酯化的羧基(R、COOR2)和/或游離羧基(COOR2，其中R2-H)酯化，禾口/或將游離羧基(COOR2，其中R2=H)轉化為酰胺(R1=CONI^)和/或將游離或酯化的羧基(R1=CONHR"還原。全文摘要本發(fā)明涉及通式(I)的9-氯前列腺素衍生物，所述化合物可以有利地治療生育問題。文檔編號A61K31/557GK101312946SQ200680043508公開日2008年11月26日申請日期2006年11月20日優(yōu)先權日2005年11月21日發(fā)明者B·布赫曼,B·林登塔爾,D·福爾茲,G·郎格爾,J·李,L·托斯基,W·J·吉爾福德,W·斯庫巴拉申請人:拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司