專利名稱：用于預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的組合物，其包含瑞伐普拉贊(revaprazan)或其鹽。
技術(shù)背景瑞伐普拉贊，已知化學(xué)名為5,6-二甲基-2-(4-氟苯基氨基)-4-(1-甲基 -1，2，3，4-四氫異喹啉-2-基)嘧啶，為下式1表示的化合物，可以酸加成鹽 (例如鹽酸瑞伐普拉贊)的形式獲得[PCT公開號WO96/05177]。式1瑞伐普拉贊或其鹽與存在于胃壁細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子泵(H+/K+ ATP酶) 的H+ZK+交換位點(diǎn)可逆結(jié)合，從而競爭性地抑制H+分泌到胃腔中。瑞伐 普拉贊或其鹽結(jié)合到11+化+八??？酶的特定位點(diǎn)，從而阻止H+運(yùn)送以及酸 分泌到胃腔中，因此提高了胃內(nèi)pH。與不可逆質(zhì)子泵抑制劑例如奧美拉 唑不同，瑞伐普拉贊或其鹽不受藥物的胃酸激活或質(zhì)子泵的胃酸分泌的 影響。基于瑞伐普拉贊或其鹽的機(jī)理不同于不可逆質(zhì)子泵抑制劑例如奧 美拉唑的機(jī)理，將瑞伐普拉贊或其鹽歸類為酸泵拮抗劑(APA)。同時，當(dāng)攻擊因子(例如胃酸)增強(qiáng)或防御因子削弱時，會引起胃 腸紊亂。質(zhì)子泵抑制劑(例如奧美拉唑)和酸泵拮抗劑(例如瑞伐普拉 贊)都是抑制攻擊因子即胃酸分泌的化合物，細(xì)胞保護(hù)劑(例如硫糖鋁、 瑞巴派特)是增強(qiáng)防御因子的化合物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者已使用酸泵拮抗劑即瑞伐普拉贊或其鹽進(jìn)行了各種臨床試 驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)瑞伐普拉贊或其鹽在胃腸道中除了具有質(zhì)子泵抑制活性外，還 具有細(xì)胞保護(hù)活性。這種令人驚異的發(fā)現(xiàn)暗示瑞伐普拉贊或其鹽不僅有 抑制胃酸(攻擊因子)分泌的作用，還有增強(qiáng)防御因子的胃腸道細(xì)胞保 護(hù)作用。因此，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的組合物，其包 含瑞伐普拉贊或其鹽。本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的組合物，其包含瑞伐 普拉贊或其鹽及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種預(yù)防或治療胃粘膜損傷的方法， 其包括將藥物組合物給予需要上述預(yù)防或治療的人，所述藥物組合物包 含對于預(yù)防或治療胃粘膜損傷有效量的瑞伐普拉贊或其藥學(xué)上可接受的 鹽及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種預(yù)防或治療藥物誘發(fā)的胃粘膜 損傷的方法，其包括將藥物組合物給予需要上述預(yù)防或治療的人，所述 藥物組合物包含對于預(yù)防或治療藥物誘發(fā)的胃粘膜損傷有效量的瑞伐普 拉贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種預(yù)防或治療乙醇誘發(fā)的胃粘膜損傷的方法，其包括將藥物組合物給予需要上述預(yù)防或治療的人，所述藥物組合物包含對于預(yù)防或治療乙醇誘發(fā)的胃粘膜損傷有效量的瑞伐普 拉贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種為接受非甾體類抗炎藥(NSAID)的人提供胃粘膜細(xì)胞保護(hù)的方法，其包括在給予NSAID之前 或給予NSAID的同時，將藥物組合物給予所述的人，所述藥物組合物包 含對于細(xì)胞保護(hù)有效量的瑞伐普拉贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可 接受的載體。對于本發(fā)明的NSAID沒有特殊限制，包括廣泛使用的所有 NSAID，例如阿斯匹林、吲哚美辛、雙氯芬酸、布洛芬、萘普生、吡羅 昔康、甲芬那酸、氟芬那酸、夫洛非寧、乙水楊胺、水楊酸鈉、二氟尼柳、氯非宗、酮保泰松、保泰松、阿氯芬酸、阿明洛芬、酮洛芬、氟比 洛芬、普拉洛芬、洛索洛芬鈉、鹽酸噻拉米特、檸檬酸哌立索唑、依莫 法宗、阿西美辛、馬來酸丙谷美辛、布可隆等。


通過詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方式并參考其附圖，本發(fā)明上述的和其 它的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將更為清楚圖1顯示瑞伐普拉贊對由幽門螺桿菌(//./7_WonO誘發(fā)的胃腸道粘膜 損傷引起的細(xì)胞死亡的抑制作用的MTT分析結(jié)果；圖2顯示瑞伐普拉贊對由乙醇誘發(fā)的胃腸道粘膜損傷引起的細(xì)胞死 亡的抑制作用的MTT分析結(jié)果；圖3A和3B顯示瑞伐普拉贊對體內(nèi)胃腸道損傷的細(xì)胞保護(hù)作用的圖像；圖4顯示瑞伐普拉贊對幽門螺桿菌誘發(fā)的ERK (細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激 酶)激活的抑制作用的Western印跡圖像；圖5顯示瑞伐普拉贊對幽門螺桿菌誘發(fā)的NF-kB激活的抑制作用的 電泳遷移率變動分析(EMSA)結(jié)果；圖6顯示瑞伐普拉贊對促血管生長因子的活性影響的RT-PCR結(jié)果；圖7顯示瑞伐普拉贊對熱休克蛋白的活性影響的Western印跡圖像；圖8顯示給予吲哚美辛之前，用瑞巴派特、奧美拉唑和瑞伐普拉贊 處理對胃粘膜損傷預(yù)防作用的對比圖像；和圖9顯示給予吲哚美辛之后，瑞伐普拉贊對胃粘膜損傷治療作用的 對比圖像。
具體實(shí)施方式
可根據(jù)WO96/05177、 W097/42186禾口/或W098/18784公開的方法制 備瑞伐普拉贊。瑞伐普拉贊的鹽可以是無機(jī)酸鹽，例如鹽酸鹽、硫酸鹽、 磷酸鹽和硝酸鹽；或有機(jī)酸鹽，例如酒石酸鹽、延胡索酸鹽、檸檬酸鹽、 甲磺酸鹽和乙酸鹽。優(yōu)選鹽酸瑞伐普拉贊。本發(fā)明的組合物可包含添加劑(例如乳糖或玉米淀粉)、潤滑劑(例 如硬脂酸鎂)、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑和等張劑。如需要，可添加 甜味劑和/或調(diào)味劑。本發(fā)明的組合物可通過口服或腸胃外給予，包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、 皮下、直腸和局部給予途徑。因此，本發(fā)明的組合物可制成各種形式， 例如片劑、膠囊劑、水溶液劑或懸浮劑。對于口服用片劑，通常添加載 體(例如乳糖、玉米淀粉)和潤滑劑(例如硬脂酸鎂)。對于口服給予的 膠囊劑，可將乳糖和/或干玉米淀粉用作稀釋劑。當(dāng)需口服用的水懸浮劑 時，活性成分可與乳化劑和/或懸浮劑混合。如需要，可添加某些甜味劑 和/或調(diào)味劑。用于肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)時，通常制備活性成分的無菌溶液，并應(yīng)將溶液的pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)和緩沖。用于靜脈內(nèi)時，應(yīng)控制溶質(zhì)總濃度以使所述制劑具有等張性。本發(fā)明的組合物可以是含有藥學(xué)上可接受的載體(例如pH7.4的鹽溶液)的水溶液劑的形式。通過局部團(tuán)注可將溶液引入患者的肌內(nèi)血流中?？山o予需要預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的患者有效量的瑞伐普拉贊或其鹽，所述有效量為約50mg 400mg/天，優(yōu)選為約100mg 300mg/ 天，更優(yōu)選為約150mg 250mg/天，最優(yōu)選為約200mg/天。當(dāng)然，可根 據(jù)患者的年齡、體重、敏感性或癥狀改變劑量。在下文中，將通過以下實(shí)施例更為具體地描述本發(fā)明。然而，以下 實(shí)施例只為了說明本發(fā)明，因此本發(fā)明不限于此并且不受其限制。實(shí)施例1幽門螺桿菌(//. pv/oW)誘發(fā)的細(xì)胞死亡率的測量(MTT分析-l) 為測定瑞伐普拉贊對幽門螺桿菌感染的細(xì)胞保護(hù)性質(zhì)，在幽門螺桿 菌感染之前，使用瑞伐 普拉贊和瑞巴派特預(yù)處理胃粘膜細(xì)胞，測量細(xì)胞 死亡率。將已知具有細(xì)胞保護(hù)性質(zhì)的瑞巴派特用作對照藥物。將人胃上皮(AGS, KCLB 21739)細(xì)胞以5xl04個細(xì)胞/ml接種到 96孔板上，在補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100pg/mL的鏈霉素和 10%FBS (胎牛血清)的RPMI 1640 (Gibco BRL，格蘭德島，紐約，美 國)中培養(yǎng)。將溶解于無菌水的瑞伐普拉贊和瑞巴派特加入AGS細(xì)胞中， 使最終濃度達(dá)到50pM，在37'C下培養(yǎng)細(xì)胞16小時。為去除RPMI1640培養(yǎng)基，將上述96孔板在24°C 、3000rpm下離心5分鐘，并用PBS( 137mM NaCl、 2.7mM KC1、 10mM Na2HP04和2mM KH2P04)洗滌3次。為了 接種，將幽門螺桿菌(ATCC 43504)培養(yǎng)液重懸于PBS，并在最終濃度 為5xl08CFU/ml條件下，與AGS細(xì)胞共培養(yǎng)。在37"C下培養(yǎng)48小時后， 將培養(yǎng)液在24'C、 3000rpm下離心5分鐘，除去培養(yǎng)基即RPMI 1640, 然后通過MTT (3-[4,5-二甲基-2-噻唑]-2,5-二苯基溴化四唑)分析方法估 計活細(xì)胞總數(shù)。將MTT(Amresco，俄亥俄州，美國)溶解于PBS (137mM NaCl、 2.7mMKCl、 10mM Na2HP04和2mM KH2P04)中制備的lmg/ml 的MTT溶液加入每個孔(50pl/孔)中，接著在37'C下培養(yǎng)4小時。然 后在24r、 3000rpm下離心5分鐘，除去上清液，將活細(xì)胞形成的甲臘顆 粒(formazan grains)溶解于99.5%二甲亞砜(DMSO) (Kanto，東京， 日本)(50(jl/孔)，使用ELISA讀取儀(TECAN， Maennedorf，瑞士)在 540nm下測量光強(qiáng)度。MTT分析結(jié)果如圖l所示。參照圖1， 48小時的幽門螺桿菌感染引 起顯著的胃粘膜細(xì)胞毒性。然而，通過瑞巴派特和瑞伐普拉贊的預(yù)處理， 顯著減小了幽門螺桿菌感染引起的胃粘膜細(xì)胞毒性。這些結(jié)果顯示瑞伐 普拉贊對幽門螺桿菌誘發(fā)的細(xì)胞毒性具有等于或高于瑞巴派特的細(xì)胞保 護(hù)作用。實(shí)施例2乙醇誘發(fā)的細(xì)胞死亡率的測量(MTT分析-2)將大鼠胃粘膜(RGM-1， RIKEN細(xì)胞庫，日本)細(xì)胞以5"04個細(xì) 胞/ml接種到96孔板上，在補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100pg/mL的 鏈霉素和10%FBS (胎牛血清)的DMEM-F12 (GibcoBRL，格蘭德島， 紐約，美國)中培養(yǎng)。將溶解于無菌水的瑞伐普拉贊和瑞巴派特加入 RGM-1細(xì)胞，使最終濃度達(dá)到50pM，在37'C下培養(yǎng)細(xì)胞16小時。為 去除DMEM-F12培養(yǎng)基，將上述96孔板在24°C、 3000rpm下離心5分 鐘，并用PBS (137mM NaCl、 2.7mM KC1、 10mM Na2HP04禾n 2mM KH2P04)洗滌3次。然后，將含有乙醇的培養(yǎng)基(含有200mM乙醇的 DMEM-F12，其中補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100|ig/mL的鏈霉素和 10%FBS)加入細(xì)胞中，在37t下培養(yǎng)細(xì)胞16小時。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液 在24i:、 3000rpm下離心5分鐘，除去培養(yǎng)基，然后通過MTT (3-[4，5-二甲基-2-噻唑]-2，5-二苯基溴化四唑)分析方法估計活細(xì)胞總數(shù)。將MTT (Amresco，俄亥俄州，美國)溶解于PBS (137mMNaCl、 2.7mMKCl、 10mM Na2HP04和2mM KH2P04)中制備的lmg/ml的MTT溶液加入每 個孔(50m1/孔)中，接著在37"下培養(yǎng)4小時。然后在24t:、 3000rpm 下離心5分鐘，除去上清液，將活細(xì)胞形成的甲臘顆粒溶解于99.5%的二 甲亞砜(DMSO) (Kanto，東京，日本)(50pl/孔)，使用ELISA讀取儀 (TECAN， Maennedorf，瑞士)在540nm下測量光強(qiáng)度。MTT分析結(jié)果如圖2所示。參照圖2，在僅用乙醇處理組中，誘發(fā) 了顯著的胃粘膜細(xì)胞毒性。另一方面，在瑞巴派特/瑞伐普拉贊-乙醇處理 組中，胃粘膜細(xì)胞毒性顯著減小。這些結(jié)果顯示瑞伐普拉贊具有等于或 高于瑞巴派特的細(xì)胞保護(hù)作用。實(shí)施例3瑞伐普拉贊對體內(nèi)胃腸道損傷預(yù)防作用的評價實(shí)驗(yàn)使用六周齡的無特異病原(SPF)的Sprague-Dawley雄性大鼠 (Charles River，東京，日本)。向大鼠喂詞商購的滅菌顆粒飼料 (BiogenomicsCo.，首爾，韓國)，隨意給予無菌水，將其飼養(yǎng)在裝有空 調(diào)裝置的生物危害的房間中，光暗周期為12小時光亮期12小時光暗期。 將大鼠分成4組僅用吲哚美辛處理組、瑞伐普拉贊-吲哚美辛處理組、 僅用乙醇處理組和瑞伐普拉贊-乙醇處理組。使大鼠禁食24小時，然后 在接觸吲哚美辛(40mg/kg，接觸時間為12小時)或無水乙醇(6ml/kg， 接觸時間為l小時)之前，通過口胃管將懸浮于0.5%CMC (羧甲基纖維 素)中的瑞伐普拉贊以10mg/kg給予大鼠。切除屬于吲哚美辛處理組的大鼠的胃，觀察胃粘膜損傷程度(參見 圖3A)。參照圖3A，在僅用吲哚美辛處理組中，可目視觀察到加重的胃 粘膜出血性損傷。然而，在給予瑞伐普拉贊之后，使用吲哚美辛處理過 的瑞伐普拉贊-吲哚美辛處理組中，吲哚美辛誘發(fā)的胃粘膜損傷得到完全 抑制。此外，切除屬于乙醇處理組的大鼠的胃，觀察胃粘膜損傷程度(參 見圖3B)。參照圖3B,在僅用乙醇處理組中，也可目視觀察到顯著加重 的胃粘膜出血性損傷。然而，在給予瑞伐普拉贊之后，使用乙醇處理過 的瑞伐普拉贊-乙醇處理組中，乙醇誘發(fā)的胃粘膜損傷得到完全抑制。這 些結(jié)果顯示瑞伐普拉贊的預(yù)處理顯著減小了非甾體類抗炎藥(NSAID)(例如吲哚美辛)誘發(fā)的或乙醇誘發(fā)的胃粘膜損傷，因此獲得了極好的 胃腸道粘膜的細(xì)胞保護(hù)作用。
實(shí)施例4誘發(fā)幽門螺桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK) 活性的評價
幽門螺桿菌誘發(fā)的細(xì)胞毒性激活MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)， 因此導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，幽門螺桿菌感染造成MAPK的3個主要亞族 中ERK磷酸化的增加。
將人胃上皮(AGS, KCLB 21739)細(xì)胞以2xl()6個細(xì)胞/100mm2接 種于培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100pg/mL的鏈霉素和 10%FBS (胎牛血清)的RPMI 1640 (Gibco BRL，格蘭德島，紐約，美 國)中培養(yǎng)。將溶解于無菌水的瑞伐普拉贊加入AGS細(xì)胞中，使最終濃 度達(dá)到5pM和25nM，在37"C下培養(yǎng)細(xì)胞16小時。去除RPMI 1640培 養(yǎng)基，然后用PBS (137mMNaCl、 2.7mM KC1、 10mM Na2HP04和2mM KH2P04)洗滌細(xì)胞3次。為了接種，將幽門螺桿菌(ATCC 43504)培養(yǎng) 液重懸于PBS，并在5xl08CFU/ml條件下，與AGS細(xì)胞共培養(yǎng)。在37 "下培養(yǎng)30分鐘后，將細(xì)胞重懸于裂解緩沖液(20mMTris-Cl (pH7.5)、 150mM NaCl、 l%Triton X-IOO、 lmM EDTA和蛋白酶抑制劑混合物 (Roche，曼海姆，德國))中。使用BIORUPTOR (Cosmo Bio，江東區(qū) (Koto-ku)，東京)將懸浮液超聲約IO秒鐘，共4次，在4。C、 12000rpm 下離心30分鐘。將上清液用作蛋白提取物，在10。/。SDS-PAGE凝膠上進(jìn) 行電泳，使用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Hoeffer Pharmacia Biotech,舊金山，力口州， 美國)將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore,馬薩諸塞州，美國)上。為了 防止一抗與該蛋白之間的非特異性結(jié)合，用含有5%脫脂乳(Difco，利 沃里亞(Livonia)，密西根州，美國)的封閉液(TBST: 10mMTris-Cl， pH8.0; 150mM NaCl禾B 0.1%吐溫20 (v/v))在23。C下封閉PVDF膜1 小時。在4T下，用p-ERK或ERK的一抗的1:1000稀釋液(200ng/ml) 培養(yǎng)PVDF膜15小時。在23'C下，用HRP (辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的 二抗(Santa Cruz Biotech,加州，美國)的1:2000稀釋液(100ng/ml) 培養(yǎng)PVDF膜1小時。使用ECL (增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)檢測試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotec，白金漢郡，英國)使免疫復(fù)合物得以顯 示。
幽門螺桿菌感染細(xì)胞的未處理組和瑞伐普拉贊處理組的p-ERK的 Western印跡結(jié)果如圖4所示。參照圖4，瑞伐普拉贊對ERK的激活顯示 出顯著的、濃度依賴性的抑制作用。
實(shí)施例5與幽門螺桿菌感染有關(guān)的NF-kB轉(zhuǎn)錄因子活性的評價(電泳遷 移率變動分析，EMSA)
使用EMSA評價已知與幽門螺桿菌感染有關(guān)的對氧化還原敏感的轉(zhuǎn) 錄因子NF-kB (核因子-kB)的DNA結(jié)合活性。將已知具有細(xì)胞保護(hù)性 質(zhì)的瑞巴派特(50nM)用作對照藥物，瑞伐普拉贊(25pM)用作試驗(yàn) 藥物。
將人胃上皮(AGS, KCLB 21739)細(xì)胞以2xl()6個細(xì)胞/100mm2接 種于培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100pg/mL的鏈霉素和 10%FBS (胎牛血清)的RPMI 1640 (GibcoBRL,格蘭德島，紐約，美 國)中培養(yǎng)。將溶解于無菌水的瑞伐普拉贊和瑞巴派特加入AGS細(xì)胞中， 使最終濃度分別達(dá)到25nM和50pM，在37'C下培養(yǎng)細(xì)胞16小時。除去 培養(yǎng)基，用PBS (137mM NaCl、 2.7mM KC1、 10mM Na2HPCX^d 2mM KH2P04)洗滌細(xì)胞2次。為了接種，將幽門螺桿菌(ATCC 43504)培養(yǎng) 液重懸于PBS，并在37'C、最終濃度為5xl08CFU/ml條件下，與AGS 細(xì)胞共培養(yǎng)1小時。使用NE-PER核和胞質(zhì)提取試劑盒(Pierce，羅克福 德(Rockford)，伊利諾斯州，美國)制備用于EMSA的核組分。用于 NF-kB的EMSA的雙鏈寡核苷酸序列如下5'-AGTTGAGGG GAC TTT CCCAGGC-3'，用生物素3'端DNA標(biāo)記試劑盒(Pierce，羅克福德，伊 利諾斯州，美國)標(biāo)記寡核苷酸。用光位移化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒(Pierce， 羅克福德，伊利諾斯州，美國)進(jìn)行EMSA。
使用EMSA對NF-kB的DNA結(jié)合活性的評價結(jié)果如圖5所示。這 些結(jié)果表明通過瑞伐普拉贊預(yù)處理，NF-kB的活性得到顯著抑制，因此 獲得了等于或高于瑞巴派特的細(xì)胞保護(hù)作用。
實(shí)施例6參與細(xì)胞保護(hù)的蛋白表達(dá)水平的測量(RT-PCR)為評價瑞伐普拉贊的細(xì)胞保護(hù)作用，將屬于NSAID的舒林酸lOOpM 加入大鼠細(xì)胞中，測量促血管生長因子、VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)、 白介素-8 (IL-8)和COX-2 (環(huán)氧化酶-2)的表達(dá)水平。將已知具有細(xì)胞 保護(hù)性質(zhì)的瑞巴派特(50nM)用作對照藥物，瑞伐普拉贊(25|iM)用 作試驗(yàn)藥物。
將大鼠胃粘膜(RGM-l, RIKEN細(xì)胞庫，日本)細(xì)胞以2xl()6個細(xì) 胞/100mm2接種于培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100Mg/mL 的鏈霉素和10%FBS (胎牛血清)的RPMI 1640 (GibcoBRL，格蘭德島， 紐約，美國)中培養(yǎng)。將溶解于無菌水的瑞伐普拉贊和瑞巴派特加入 RGM-1細(xì)胞中，使最終濃度分別達(dá)到25^M和50pM，在37。C下培養(yǎng)細(xì) 胞16小時。除去培養(yǎng)基，用PBS (137mM NaCl、 2.7mM KC1、 10mM Na2HP04和2mMKH2P04)洗滌細(xì)胞3次。將舒林酸的DMSO溶液加入 細(xì)胞中，使最終濃度達(dá)到100pM，在37"C下培養(yǎng)細(xì)胞8小時。在23T、 3000rpm下離心3分鐘，收集培養(yǎng)的細(xì)胞，使用TRIzol試劑(Life technologies,米蘭，意大利)從細(xì)胞中分離總RNA。將滅菌的無核糖核 酸酶(RNase)的水加入2pg總RNA和lpl 10pmol從寡聚dT中，以獲 得體積為34pl的反應(yīng)溶液。在65'C下培養(yǎng)反應(yīng)溶液5分鐘，向其加入 10^1 5X的反轉(zhuǎn)錄緩沖溶液、5pl 10mM的dNTP和lpl的M-MLV反轉(zhuǎn)錄 酶。在37"C下培養(yǎng)所得溶液1小時，獲得cDNA (Promega，麥迪遜分校， 威斯康星大學(xué))，通過PCR擴(kuò)增所述cDNA。使用Premix Ex T 《試劑盒 (Takara，千葉縣(Chiba)，日本)和如下的特定引物進(jìn)行PCR:
5'-TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3'禾口
5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT隱3'(用于VEGF);
5'-GAAGATAGATTGCCCGA-3'禾口
5'-CATAGCCTCTCACACATTTC-3'(用于IL-8);
5'-ATCTGTGTGGGTACAAATTTG-3鄰
5'-GTCTCTCATCTGCAATAATGTG-3'(用于COX-2);
5'-TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGTC-3'和
5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC國3'(用于GAPDH)。如上所述，GAPDH用作陽性對照。PCR進(jìn)行如下94"C下進(jìn)行1 分鐘，60°C (VEGF)、 45°C (IL-8)、 48°C (C0X-2)和55°C (GAPDH) 下各自進(jìn)行1分鐘，72'C下進(jìn)行1分鐘，如此進(jìn)行35個循環(huán)(VEGF、 IL-8和COX-2)或28個循環(huán)(GAPDE)。在1%瓊脂糖凝膠上分離PCR 產(chǎn)物，用10mg/ml溴化乙錠染色。
瑞巴派特-舒林酸處理組和瑞伐普拉贊-舒林酸處理組中的IL-8、 VEGF和COX-2的表達(dá)水平如圖6所示。參照圖6，瑞伐普拉贊-舒林酸 處理組中，IL-8、 VEGF和COX-2的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于瑞巴派特-舒林酸處 理組中的表達(dá)水平。己知用于解釋NSAID誘發(fā)的胃粘膜損傷的機(jī)理之一 與引起胃粘膜再生和局部缺血的VEGF、 IL-8和COX-2的減少有關(guān)。在 此方面，圖6顯示的瑞伐普拉贊-舒林酸處理組中IL-8、 VEGF和COX-2 表達(dá)水平增加的結(jié)果揭示出瑞伐普拉贊對胃腸道粘膜具有良好的細(xì)胞保 護(hù)作用。
實(shí)施例7熱休克蛋白活性的評價(Western印跡)
為測量熱休克蛋白HO-l、 HSP27和HSP70的表達(dá)，用濃度為5pM、 10pM和25pM的瑞伐普拉贊預(yù)處理細(xì)胞，然后用吲哚美辛(NSAID， 0.5pM)處理。
將大鼠胃粘膜(RGM-l, RIKEN細(xì)胞庫，日本)細(xì)胞以2xl()6個細(xì) 胞/100mrr^接種到培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充有100單位/mL的青霉素、100pg/mL 的鏈霉素和10。/。FBS(胎牛血清)的DMEM-F12 (GibcoBRL，格蘭德島， 紐約，美國)中培養(yǎng)。用瑞伐普拉贊(5pM、 10pM和25pM)預(yù)處理RGM-l 細(xì)胞，在37。C下培養(yǎng)16小時。除去培養(yǎng)基，用PBS(137mMNaCl、2.7mM KC1、 10mMNa2HPO4和2mMKH2P04)洗滌細(xì)胞3次。將B引哚美辛的無 菌水溶液加入細(xì)胞中，使最終濃度達(dá)到0.5pM，在37"C下培養(yǎng)細(xì)胞16 小時。培養(yǎng)后，將細(xì)胞重懸于裂解緩沖液(20mMTris-CKpH7.5)、 150mM NaCl、 1% Triton X-100、 lmM EDTA和蛋白酶抑制劑混合物(Roche，曼 海姆，德國))中。使用BIORUPTOR (Cosmo Bio，江東區(qū)，東京)將 懸浮液超聲約10秒鐘，共4次，在4。C、 12000rpm下離心30分鐘。將 上清液用作蛋白提取物，將提取的蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電 泳，使用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Hoeffer Pharmacia Biotech,舊金山，加州，美國)將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore，馬薩諸塞州，美國)上。為了防 止一抗與該蛋白之間的非特異性結(jié)合，用含有5%脫脂乳(Difco，利沃 里亞，密西根州，美國)的封閉液(TBST: lOmMTris-Cl, pH8.0; 150mM NaCl和0.1%吐溫20 (v/v))在23。C下封閉PVDF膜1小時。在4匸下， 用HO-l、 HSP27、 HSP70或a-微管蛋白(TU-02)的一抗的1:1000稀釋 液(200ng/ml)培養(yǎng)PVDF膜15小時。在23'C下，用HRP (辣根過氧 化物酶)偶聯(lián)的二抗(Santa Cruz Biotech,加州，美國)的1:2000稀釋 液(100ng/ml)培養(yǎng)PVDF膜1小時。使用ECL (增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)檢測 試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotec，白金漢郡，英國)使免疫復(fù)合物 得以顯示(參見圖7)。
由圖7可看出瑞伐普拉贊通過刺激熱休克蛋白的表達(dá)顯示出細(xì)胞保 護(hù)作用。
實(shí)施例8瑞伐普拉贊對NSAID誘發(fā)的胃病預(yù)防作用的評價
實(shí)驗(yàn)使用六周齡的無特異病原(SPF)的Sprague-Dawley雄性大鼠 (Charles River，東京，日本)。向大鼠喂飼商購的滅菌顆粒飼料 (BiogenomicsCo.，首爾，韓國)，隨意給予無菌水，將其飼養(yǎng)在裝有空 調(diào)裝置的生物危害的房間中，光暗周期為12小時光亮期12小時光暗期。 使大鼠禁食24小時，然后在接觸吲哚美辛(40mg/kg，接觸時間為12小 時)之前，通過口胃管將懸浮于0.5o/。CMC (羧甲基纖維素)中的瑞伐普 拉贊以5mg/kg、 10mg/kg、瑞巴派特以30mg/kg以及奧美拉唑以5mg/kg 給予大鼠。將磷酸鹽緩沖鹽水灌注到大鼠胃腔中使胃膨脹。然后，沿較 大曲度切割打開胃，計算胃粘膜損傷的總面積以獲得損傷的平均尺寸。
對照組和試驗(yàn)組中對胃粘膜損傷預(yù)防作用的對比結(jié)果如圖8所示。 參照圖8，在對照組、奧美拉唑預(yù)處理組和瑞巴派特預(yù)處理組中，可觀察 到出血性損傷，而在瑞伐普拉贊預(yù)處理組中幾乎觀察不到出血性損傷。 這些結(jié)果顯示瑞伐普拉贊對胃粘膜損傷具有極好的預(yù)防作用。
實(shí)施例9瑞伐普拉贊對NSAID誘發(fā)的胃病治療作用的評價
實(shí)驗(yàn)使用六周齡的無特異病原(SPF)的Sprague-Dawley雄性大鼠 (Charles River ，東京，日本)。向大鼠喂飼商購的滅菌顆粒飼料 (BiogenomicsCo.，首爾，韓國)，隨意給予無菌水，將其飼養(yǎng)在裝有空
14調(diào)裝置的生物危害的房間中，光暗周期為12小時光亮期12小時光暗期。
使大鼠禁食24小時，然后通過口胃管用lml卩引哚美辛的0.5%CMC (羧 甲基纖維素)溶液(40mg/kg)處理大鼠。用吲哚美辛處理8小時后，用 lml瑞伐普拉贊的0.5%CMC溶液(5mg/kg和10mg/kg)處理大鼠1小 時，以與實(shí)施例8相同的方式確定胃病程度。
僅用吲哚美辛處理組和吲哚美辛-瑞伐普拉贊處理組中的胃粘膜損 傷治療作用的對比結(jié)果如圖9所示。參照圖9，在吲哚美辛-瑞伐普拉贊 處理組中，胃粘膜出血性損傷得到顯著改善，糜爛和潰瘍的數(shù)量也減少 了。這些結(jié)果顯示瑞伐普拉贊對胃粘膜損傷有極好的治療作用。
工業(yè)實(shí)用性
如上所述，通過增強(qiáng)胃腸道粘膜中的防御因子，同時作為酸泵拮抗 劑，瑞伐普拉贊或其鹽對胃腸道粘膜損傷有極好的預(yù)防或治療作用。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的組合物，其包含瑞伐普拉贊或其鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述瑞伐普拉贊的鹽是鹽酸瑞伐普拉贊。
3. —種預(yù)防或治療胃粘膜損傷的方法，其包括將藥物組合物給予需 要上述預(yù)防或治療的人，所述藥物組合物包含對于預(yù)防或治療胃粘膜損 傷有效量的瑞伐普拉贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
4. 一種預(yù)防或治療藥物誘發(fā)的胃粘膜損傷的方法，其包括將藥物組 合物給予需要上述預(yù)防或治療的人，所述藥物組合物包含對于預(yù)防或治 療藥物誘發(fā)的胃粘膜損傷有效量的瑞伐普拉贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及 藥學(xué)上可接受的載體。
5. —種預(yù)防或治療乙醇誘發(fā)的胃粘膜損傷的方法，其包括將藥物組 合物給予需要上述預(yù)防或治療的人，所述藥物組合物包含對于預(yù)防或治 療乙醇誘發(fā)的胃粘膜損傷有效量的瑞伐普拉贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及 藥學(xué)上可接受的載體。
6. —種為接受非甾體類抗炎藥(NSAID)的人提供胃粘膜細(xì)胞保護(hù)的方法，其包括在給予NSAID之前或給予NSAID的同時，將藥物組合物給予所述的人，所述藥物組合物包含對于細(xì)胞保護(hù)有效量的瑞伐普拉 贊或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥學(xué)上可接 受的鹽是鹽酸瑞伐普拉贊。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效量為約 100mg 300mg/天。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效量為約 150mg 250mg/天。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效量為約 200mg/天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療胃腸道粘膜損傷的組合物，其包含瑞伐普拉贊或其鹽及藥學(xué)上可接受的載體。通過增強(qiáng)胃腸道粘膜中的防御因子，同時作為酸泵拮抗劑，瑞伐普拉贊或其鹽對胃腸道粘膜損傷有極好的預(yù)防或治療作用。
文檔編號A61K31/506GK101316594SQ200680044428
公開日2008年12月3日 申請日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者咸基白, 宋根石, 文炳錫, 朱相彥, 郭美善, 金東奎 申請人:株式會社柳韓洋行