專利名稱：：采用降低的溫度產(chǎn)生樹突細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)抗惡性腫瘤和感染疾病的免疫反應(yīng)的方法和裝置。更具體地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生抗原呈遞細胞的改良方法。
背景技術(shù)：
：利用抗原呈遞自然機制的基于樹突細胞的免疫療法代表了最有前景的非毒性癌癥治療方法。其可以作為單獨治療，或者作為其他類型療法(例如外科手術(shù)、放射和化療)的輔助。該策略基于細胞產(chǎn)物的體外操縱和再導(dǎo)入來繞過免疫功能，目的是誘導(dǎo)腫瘤特異性的免疫反應(yīng)。因此，這種基于樹突細胞的免疫療法的終極終極目標是體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性效應(yīng)細胞，近期進展集中于能夠識別并殺傷腫瘤細胞的CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)。另外，感染疾病例如HIV的治療可以受益于基于樹突細胞的接種策略?？乖蔬f腫瘤特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，需要表達主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子以及膜結(jié)合并分泌的共刺激分子的專業(yè)抗原呈遞細胞(APC)的參與。而且，這種APC必須能夠吸收、加工并呈遞與MHC結(jié)合的抗原。樹突細胞(DC)是免疫系統(tǒng)的專業(yè)APC，其具有剌激幼稚T細胞和記憶T細胞的能力。導(dǎo)致DC成熟的階段與細胞的某些性質(zhì)有關(guān)。未成熟DC特別善于通過吞噬或胞飲作用吸收細胞外抗原，并在細胞內(nèi)區(qū)室例如內(nèi)體和吞噬體中將抗原加工成肽。這里，肽與II類MHC分子結(jié)合。未成熟的DC還具有將肽從外源蛋白質(zhì)負載至I類MHC分子呈遞途徑的獨特能力，一種被稱為交叉呈遞的過程。通過激活1型CD4+輔助性T細胞(Thl細胞)和CD8+細胞毒性T細胞(CTL)而有效剌激免疫反應(yīng)的能力關(guān)鍵依賴于成熟DC。只有具有一系列膜結(jié)合共刺激分子和輔助分子(例如CD40,CD80,CD83,CD86和II類MHC)的完全成熟的DC才可能有效誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細胞的繁殖和分化1。DC的共刺激活性的重要作用由分泌的細胞因子、特別是IL-12p70來提供。Heufler等(1996)i清楚證明了其在T細胞活化中的作用以及其偏向Thl型反應(yīng)。而且，Inoue等(2005)報道了腫瘤中表達IL-12的成熟DC的存在與患者存活之間的良好相關(guān)性。用于接種的成熟DC應(yīng)該產(chǎn)生有限量的Thl細胞抑制性細胞因子IL-IO。CCR7是淋巴結(jié)中基底細胞產(chǎn)生的趨化因子CCL19和CCL21的受體。表達足夠水平的活化CCR7的DC響應(yīng)CCL19或CCL2尸而遷移至淋巴結(jié)。這里，它們遇到T淋巴細胞并可以引發(fā)免疫反應(yīng)。產(chǎn)生成熟DC的方案已經(jīng)描述了用于產(chǎn)生成熟DC的許多方案。目前用于誘導(dǎo)DC的最普遍使用的"標準"方案采用由IL-ip,IL-6,TNF-a和前列腺素E2組成的成熟雞尾酒。盡管有歸因于CCR7的遷移活性和體內(nèi)免疫刺激活性，但是由該雞尾酒成熟的DC產(chǎn)生了IL12p7()S生成能力降低的DC。另一組DC成熟方案包括聚肌苷:聚胞苷酸，聚-(I:C)。其通常與細胞因子例如TNFa、IL-ip、IFN-y和IFN-a結(jié)合使用。該方法產(chǎn)生的DC生成IL-12p70，但是它們通常表達低水平的CCR7。聚-(I:C)存在下獲得的DC的低水平CCR7表達特征，限制了它們在體內(nèi)遷移至淋巴結(jié)。近來，公布的專利申請US2005/0003533A1公開了表達CCR7的樹突細胞的成熟方法，所述樹突細胞在CD40L剌激后能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12p70。因此，依然存在對開發(fā)用于產(chǎn)生如下成熟樹突細胞的標準化方法的未滿足的要求表達高水平的活化CCR7，并同時產(chǎn)生足量的IL隱12p70。而且，盡管許多研究者的努力，但是用于癌癥療法的基于樹突細胞的疫苗一般提供了最溫和臨床效力的免疫反應(yīng)。這些疫苗主要通過自體DC的體外操縱和抗原負載來產(chǎn)生。日益增加的對患者安全性的需求，要求高水平的重復(fù)性和符合管理內(nèi)容的順應(yīng)性。因此，強烈需要正確產(chǎn)生裝配DC的方法，所述DC有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并特別提供改良的臨床反應(yīng)。另外，體外產(chǎn)生的DC還可以作為治療疫苗應(yīng)用于治療一些慢性感染疾病，例如HIV以及乙型和丙型肝炎，其中傳統(tǒng)疫苗方法不能有效地起作用。臨床前和首次臨床4—s研究結(jié)果表明，基于DC的免疫療法可能是治療HIV以及乙型和丙型肝炎的慢性感染患者的有前景的策略。對于癌癥免疫療法，抵抗這些胞內(nèi)感染劑的有效臨床反應(yīng)與產(chǎn)生CD8+效應(yīng)細胞所需的Thl輔助反應(yīng)的誘導(dǎo)有關(guān)5。因此，可以預(yù)期，體外產(chǎn)生的樹突細胞應(yīng)該具有相同的用于治療癌癥和慢性感染疾病的特征。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一方面涉及通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來產(chǎn)生樹突細胞的方法。本發(fā)明的第二方面涉及樹突細胞群，其中所述細胞通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第三方面涉及包含樹突細胞群的藥物組合物，其中所述細胞通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第四方面涉及細胞群用于刺激和/或擴增T細胞的用途，其中所述細胞通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第五方面涉及細胞群用于誘導(dǎo)受體中免疫反應(yīng)的用途，其中所述細胞通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第六方面涉及細胞群生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途，其中所述細胞通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細胞的方法而產(chǎn)生。下面參考附圖詳細說明本發(fā)明，其中圖1描述了溫度對DC的重要共剌激和輔助表面分子的影響。圖IB描述了低溫對CCR7表達的影響。圖2描述了溫度對由培養(yǎng)初期DC(A)產(chǎn)生的IL-IO、以及由未成熟DC(B)和成熟DC(C)產(chǎn)生的IL-IO的影響。圖3描述了溫度3TC、34。C和37。C對由新方法和標準方法生成的未成熟DC(A)和成熟DC(B)產(chǎn)生的IL-12p70的影響。圖4描述了低溫對CCR7表達的效果。圖5描述了根據(jù)本發(fā)明(A)方法生成的未成熟和成熟DC的表型和"標準"方法(B)的對比。圖6描述了成熟DC隨時間的表型穩(wěn)定性。圖7描述了DC在第7天和第10天的表型和異種刺激(MLR)活性。圖8描述了根據(jù)本發(fā)明方法和"標準"方法產(chǎn)生的DC的異種刺激活性。圖9描述了通過IFN-y誘導(dǎo)測量的CMV-抗原的功能展示(ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點)測定)。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明。為了解釋的目的，采用下述定義，并且適當時，單數(shù)使用的術(shù)語也包括復(fù)數(shù)，反之亦然。定義本文使用的"分化步驟"是指其中允許細胞相應(yīng)確定的分化因子而分化的步驟。本文使用的"成熟步驟"是指其中允許細胞相應(yīng)成熟因子的存在而成熟的步驟。本文使用的"減小的溫度"或"降低的溫度"是指溫度低于37°C。用于產(chǎn)生樹突細胞的方法是公知的J.H.Peters的方法，J.H.Peters首次描述了單核細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化成DC樣細胞的能力，首先是自發(fā)，然后是在GM-CSF和IL-46存在下。Romani等(1994)7和Sallusto&Lanzavecchia(1994)8公布后，在這兩種細胞因子存在下培養(yǎng)的單核細胞廣泛用于制備DC。該過程開始于從外周血液分離單核細胞，并在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)5-7天。獲得的細胞具有未成熟DC的性質(zhì)，特征為低水平的共剌激分子和高胞吞活性。在LPS、TNF-oc或其他成熟劑誘導(dǎo)的成熟過程中，細胞顯著上調(diào)共刺激和輔助分子例如CD40、CD80、CD83和CD86，并下調(diào)胞吞活性。體內(nèi)組織培養(yǎng)一般在37°C進行。已知朗氏細胞在29-31°C的皮膚環(huán)境溫度下是功能上活性的，并且?guī)讉€研究己經(jīng)記錄了細胞系統(tǒng)中降低的培養(yǎng)溫度的體外生物學作用，所述細胞系統(tǒng)例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和豬肺泡巨噬細胞。與Basil等(2003)9考察發(fā)熱樣溫度對DC活化和成熟的影響的研究相反，在幾個案例中測試了減小的溫度對哺乳動物細胞生長的影響。Dexter等(1977)建議使用33°C用于培養(yǎng)造血干細胞9。Athanasas-Platsis等(1995)發(fā)現(xiàn)，與在37°C相比較，朗氏細胞標志物CDla在單核細胞上的表達在34°C培養(yǎng)24小時過程中被上調(diào)1Q。據(jù)我們了解，還沒有人公開如何使用減小的溫度來產(chǎn)生未成熟或成熟的樹突細胞。本發(fā)明一個實施方案涉及在祖細胞發(fā)展為未成熟樹突細胞過程中采用低于37°C的溫度來產(chǎn)生樹突細胞的方法。IL-10是DC發(fā)展的負調(diào)節(jié)劑，并且在GM-CSF存在下的單核細胞系活化過程中產(chǎn)生11。Kirkley等(2003)報道，對應(yīng)于培養(yǎng)溫度從37°C至31°C的下降，LPS刺激的巨噬細胞系產(chǎn)生IL-10顯著減少12。因此，本發(fā)明方法中涉及的降低的溫度可以借助例如低IL-10濃度來為DC產(chǎn)生提供改良的條件。已經(jīng)測試了在GM-CSF和IL-4存在下于不同溫度(3TC、34°C和37T)培養(yǎng)單核細胞對未成熟DC的CDla表達水平的影響，CDla是對IL-10的抑制性作用極度敏感的分子。我們發(fā)現(xiàn)，更低溫下產(chǎn)生的DC具有更高的表達水平。所有進一步實驗在34。C下進行。下一個原理發(fā)現(xiàn)是，在更低溫度培養(yǎng)后，培養(yǎng)物上清液中檢測到的IL-10水平實際上明顯更低。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種方法，其中生成的樹突細胞為成熟的樹突細胞。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種方法，其中祖細胞和成熟的樹突細胞的發(fā)展包括所述細胞的分化。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種方法，其中分化步驟溫度低于37°C的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種方法，其中溫度為3TC至37°C的方法。該溫度可以是31°C、32°C、33°C、34°C、35°C或36°C中的任何溫度。本發(fā)明的一個實施方案涉及其中溫度為34°C的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及其中袓細胞是自體祖細胞的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及其中祖細胞選自髓樣祖細胞或干細胞的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及其中髓樣祖細胞是單核細胞的方法。本發(fā)明的另一個實施方案涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的樹突細胞群。本發(fā)明的一個實施方案涉及樹突細胞群，其中所述細胞表達CCR7禾口/或IL-12p70。本發(fā)明的一個實施方案涉及樹突細胞群，其中所述細胞表達CDla、CD14低、CD83、CD86和IL-10低。本發(fā)明的一個實施方案涉及樹突細胞群，進一步包括與細胞表面的MHC分子結(jié)合呈遞的至少一種抗原。本發(fā)明的一個實施方案涉及樹突細胞群，其中所述至少一種抗原是腫瘤抗原。本發(fā)明的一個實施方案涉及樹突細胞群，其中所述腫瘤抗原選自癌癥/睪丸抗原、家族特異性分化抗原、腫瘤過表達抗原、突變或異常表達抗原以及病毒抗原。本發(fā)明另一實施方案涉及上述樹突細胞群用于刺激和/或擴增T細胞的用途。本發(fā)明另一實施方案涉及樹突細胞群用于刺激和/或擴增T細胞的用途，其中所述T細胞是自體T細胞。本發(fā)明另一實施方案涉及樹突細胞群用于刺激和/或擴增T細胞的用途，其中所述用途是體外用途。本發(fā)明另一實施方案涉及樹突細胞群用于誘導(dǎo)受體中免疫反應(yīng)的用途。本發(fā)明另一實施方案涉及包含樹突細胞群的藥物組合物，其中所述群如上所定義。本發(fā)明一個實施方案涉及藥物組合物作為藥劑的用途。本發(fā)明另一實施方案涉及包含樹突細胞群的藥物組合物，進一步包含常規(guī)的佐劑和賦形劑。本發(fā)明替代實施方案涉及樹突細胞生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途。本發(fā)明替代實施方案涉及樹突細胞生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途，其中所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌，或者可以是任何類型的癌癥。本發(fā)明替代實施方案涉及樹突細胞生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途，其中所述感染疾病選自HIV和肝炎或者其他慢性感染疾病。現(xiàn)在通過下述并非以任何方式限制的實施例描述本發(fā)明。實施例l:降低溫度下樹突細胞的生成樹突細胞通常從血庫獲得的暗黃覆蓋層生成。60mL暗黃覆蓋層用60mL無鈣且無鎂的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS，產(chǎn)品號BE17-512F,Cambrex,Belgium)稀釋，并應(yīng)用至四個50-mL管，每個管含有15mL淋巴細胞分離齊U(產(chǎn)品號1053980,AXIS-SHIELDPoCAS，Norway)。離心(460g，30min,20。C)后，將10-20mL上部血漿層轉(zhuǎn)移至單獨的管。估計這是大約40%的血漿(稀釋的血漿)。血槳的最終制備包括添加肝素(25IU/mL)并離心(1500g，15min,4°C)。從界面收集單核細胞，用含有EDTA的DPBS稀釋兩倍，并通過4-5次離心來洗滌，第一次以250g、第二次以200g，接下來以150g離心，所有離心在4°C,12min。最后一次離心之前，使用Coulter計數(shù)儀(BeckmanCoulter,modelZ2)計數(shù)細胞，單核細胞的量估計為平均尺寸約9m的細胞數(shù)目)。細胞保存在-80。C(于10%DMSO稀釋的血漿中，每管107個單核細胞)，或者立即用于實驗。細胞以2xl06單核細胞/mL的濃度重懸于吸附介質(zhì)(添加了2mML-谷氨酰胺和2%血漿的RPMI1640(Cambrex))。5mL的細胞混懸液置于T25非TC處理的Falcon瓶中。37°C吸附1小時后，除去非粘附細胞，粘附細胞用溫的RPMI1640沖洗兩次，然后每個瓶中添加7mL的培養(yǎng)介質(zhì)(添加了2mML-谷氨酰胺和1%血漿的RPMI1640)。所述瓶置于不同的溫度的單獨CCV培養(yǎng)箱中31°C、34°C和37°C。在第1、3和5天添加終濃度分別為100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。在第6天添加終濃度為10ng/mL的TNF-a以誘導(dǎo)成熟，溫度升至37。C持續(xù)培養(yǎng)最后24小時。在第7天，收集細胞，并通過FACS分析來確定它們的表型。使用直接軛合的抗體CDla-藻紅蛋白(PE)、CD14-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD83畫PE、CD86-PE、HLA隱DR、-P,-Q曙FITC(全部來自Pharmingen,BecktonDickinson,Brandby,Denmark)禾口CCR7-FITC(R&DSystemsEurope,Abington,UK)對細胞染色。使用適當?shù)耐N型對照。使用FACSCalibur流式細胞儀(BecktonDickinson)和CELLQuest軟件(BecktonDickinson)分析樣品。代表性實驗的結(jié)果示于圖1。與37。C培養(yǎng)的細胞相比，降低溫度下培養(yǎng)的細胞更多表達CDla，而在更低溫度下培養(yǎng)的細胞群中觀察到更少的CD83和CD86陽性細胞。31°C和34°C培養(yǎng)后的CDla的平均熒光指數(shù)(MFI)兩倍于37°C培養(yǎng)。通過表達CD83和CD86的DC的百分比判斷的成熟度在31-34。C更低。這反映了對降低溫度下培養(yǎng)的細胞對成熟因子更低的敏感度，或者成熟過程本身需要37°C的溫度。實施例2:降低的溫度對IL-10生成的影響。在單核細胞分化為樹突細胞過程中考察了作為DC負調(diào)節(jié)劑的IL-10的產(chǎn)生。測量了其在第1、3和5天于培養(yǎng)上清液中的濃度。通過包括捕獲抗體(Ab)、標準品或樣品、生物素化的檢測Ab和HRP-鏈霉抗生物素的夾心ELISA測量IL-10的產(chǎn)生，使用了eBioscience的"Ready-Set-Go"試劑盒，基本根據(jù)生產(chǎn)商推薦并做了一些調(diào)整。捕獲Ab與Nuncmaxisorp96孔板結(jié)合過夜并洗滌后，室溫下延長封閉步驟至少3小時。通過開始于200pg/mLIL-10的七個連續(xù)的標準品稀釋液來產(chǎn)生標準曲線。標準品和樣品在室溫下保持2小時，隨后在4°C保持過夜。接下來的步驟根據(jù)生產(chǎn)商方案進行。來自相同試劑盒的四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)溶液用于HRP的酶反應(yīng)，終止反應(yīng)后，測量光密度，由于490nm和620nm讀數(shù)之間的差異而進行波長校正。這類實驗的一個的結(jié)果示于圖2A。單核細胞在第一天自發(fā)產(chǎn)生的IL-10是低的，而在第一天添加了GM-CSF和IL-4之后顯著上調(diào)。34°C培養(yǎng)至5天的細胞一般產(chǎn)生比37°C培養(yǎng)的細胞顯著更低量的IL-IO。在第5天對幾種DC培養(yǎng)物的測試顯示相似的模式(圖2B)。甚至在第5天洗滌細胞、將它們置于37°C、第6天添加成熟劑并在第8天收集上清液之后，34°C與37°C相比降低的IL-10產(chǎn)生依然持續(xù)(圖2C)。這些結(jié)果表明，在低于37°C的溫度下培養(yǎng)的細胞需要低IL-10產(chǎn)生的穩(wěn)定表型。實施例3:降低的溫度對IL-12p70生成的影響。我們還考察了溫度對IL-12p70產(chǎn)生的影響。通過包括捕獲抗體(Ab)、標準品或樣品、生物素化的檢測Ab和HRP-鏈霉抗生物素的夾心ELISA測量IL-12p70的產(chǎn)生。使用了針對IL-12p70的試劑盒"DuoSetELISA生成系統(tǒng)"(R&DSystems),基本根據(jù)生產(chǎn)商推薦并做了一些調(diào)整。捕獲Ab與Nuncmaxisorp96孔板結(jié)合過夜并洗滌后，室溫下延長封閉步驟至少3小時。通過開始于500pg/mLIL-12p70的七個連續(xù)的標準品稀釋液來產(chǎn)生標準曲線。標準品和樣品在室溫下保持2小時，隨后在4°C保持過夜。接下來的步驟根據(jù)生產(chǎn)商方案進行。使用過氧化氫-四甲基聯(lián)苯胺混合物作為HRP的基質(zhì)溶液，在終止反應(yīng)后測量光密度，由于490nm和620nm讀數(shù)之間的差異而進行波長校正。表l.在培養(yǎng)開始的5天里，溫度對MCM模擬物誘導(dǎo)的成熟過程中產(chǎn)生IL-12p70的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>可以看到(表l)，34'C產(chǎn)生的細胞產(chǎn)生明顯更高水平的IL-12p70。實施例4:組織培養(yǎng)塑料的選擇我們比較了兩種組織培養(yǎng)塑料非組織培養(yǎng)聚苯乙烯(PS)(產(chǎn)品號353813,T25BD-Bioscience,USA)和PrimariaTM塑料(產(chǎn)品號353813,T25BD-Bioscience,USA)。實驗設(shè)計與實施例1中描述的過程類似，使用2%自體血漿預(yù)處理15-45min的塑料表面作為組分來源，例如額外細胞組分，象纖維蛋白素原和纖維結(jié)合素，再不含血清的AIM-V介質(zhì)中34"C直至第5天，隨后將培養(yǎng)物置于37°C。在第6天添加成熟劑TNFa,IL-1卩，1L-6和前列腺素E2，在第8天收集培養(yǎng)物。根據(jù)培養(yǎng)條件，袓細胞選擇發(fā)展成巨噬細胞或DC。培養(yǎng)幾天后，本該發(fā)展成巨噬細胞的細胞形成附著細胞培養(yǎng)物，而本該發(fā)展成DC的細胞形成松散附著的細胞培養(yǎng)物。最初，相等數(shù)目的細胞被接種并附著至不同的組織培養(yǎng)塑料。從第6天對DC培養(yǎng)物光學顯微鏡檢査，顯示PrimariaTM塑料上附著的細胞數(shù)目明顯少于另一種塑料上生長的細胞。通常，PrimariaTM塑料上生長的細胞還表現(xiàn)為更"清潔"，即更少碎屑，反映了在成熟過程中更小程度的細胞死亡。我們測試了使用不同濃度的血漿來預(yù)處理塑料。2%，10%，20%或40%血漿預(yù)處理PrimariaTM塑料后沒有發(fā)現(xiàn)DC性質(zhì)上的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，我們發(fā)現(xiàn)，污染淋巴細胞的量隨著血漿濃度增加至10%而減少。因此，我們在隨后實驗中在實施例1中所述方法中加入了使用10%血漿處理PrimariaTM塑料的步驟。在隨后實驗中，我們比較了本發(fā)明方法與"標準方法"，除非另有說明，其如下所述進行。樹突細胞通常從獲自血庫的暗黃覆蓋層產(chǎn)生。60ml暗黃覆蓋層用60mL無Ca和無Mg的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS,產(chǎn)品號BE17-512F，Cambrex，Belgium)稀釋，并應(yīng)用至4個50-mL管，每個管含有15mL淋巴細胞分離劑(產(chǎn)品號1053980,AXIS-SHIELDPoCAS,Norway)。離心后(460g,30min，20°C)，10-20mL上部血漿層轉(zhuǎn)移至單獨的管。從界面收集單核細胞，用無鈣和鎂的PBSEDTA稀釋兩次，3次離心洗滌，首次250g，第二次175g，最后一次110g，所有離心在《C,12min。最后一次離心之前，使用Coulter計數(shù)儀(BeckmanCoulter,modelZ2)計數(shù)細胞，單核細胞的量估計為平均大小約9pm的細胞數(shù)目。細胞以2x106單核細胞/mL的濃度重懸于吸附介質(zhì)(RPMI1640(Cambrex)，添加有2mML-谷氨酰胺和1%熱失活自體血漿)。5mL的細胞混懸液置于T25無處理的Primaria瓶中。37。C吸附1小時后，除去非吸附的細胞，向每個瓶添加5mL培養(yǎng)介質(zhì)(RPMI1640，添加有2mML-谷氨酰胺和1%血漿)。第1天，培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。第3天，添加2ml培養(yǎng)基。第5天，收集所有非吸附細胞并置于含有新鮮培養(yǎng)基的T25PrimariaTM瓶中。所述瓶置于37。C的C02-培養(yǎng)箱中。在第1、3和5天添加濃度分別為100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。在第6天添加TNF-a或細胞因子雞尾酒(IL-1，IL-6,TNF-a和PGE-2)以誘導(dǎo)成熟。在第7天，收集細胞，并通過FACS分析確定其表型。實施例5:IL-12p70的產(chǎn)生。圖3顯示了IL-12p70產(chǎn)生經(jīng)過兩天后(第7天和第8天)的測量，我們能夠顯示，新方法產(chǎn)生的樹突細胞比標準方法產(chǎn)生的樹突細胞產(chǎn)生了更高量的IL-12p70。實施例6:CCR7的表達。為考察低溫對CCR7表達的影響，我們采用了由IL-1(3、IL-6、TNF-a和前列腺素E2組成的成熟雞尾酒來替代僅使用TNF-a。圖1B中所示實驗結(jié)果比較了新方法和標準方法的3個不同溫度。可以看到，新方法的CCR7表達高于標準方法。我們還在標準遷移實驗中測試了新方法產(chǎn)生的樹突細胞的CCR7受體表達的功能性(ChemotxDisposableChemotaxisSystem(116-5型)，來自NeuroProbe,Gakhersburg,MD,USA)。這里，我們看到樹突細胞向趨化因子CCL19遷移，且新方法產(chǎn)生的DC(數(shù)據(jù)未顯示)證實了功能性CCR7受體的表達。實施例7:細胞產(chǎn)量。本文描述的新方法還顯示了比標準方法提高的細胞產(chǎn)量。在三個不同運行中，我們發(fā)現(xiàn)在所有測試溫度(31。C、34°C和37。C)下，新方法具有比標準方法更高的細胞產(chǎn)量，參見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例8:根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的DC的批間標志物變化為符合對生產(chǎn)醫(yī)療目的的樹突細胞的GMP要求，樹突細胞性質(zhì)的批間差異應(yīng)該小。為此目的，我們從8個不同供體的血液在3周時段內(nèi)進行樹突細胞的制備，使用了相同批次的所有采用的試劑和0.5%自體血槳添加至AIM-V介質(zhì)。為了比較，使用"標準"方法(37。C)進行DC生產(chǎn)。實驗在融化的PBMC上進行。表3概括了這些實驗中產(chǎn)生的DC的性質(zhì)。與通過"標準"方法產(chǎn)生的DC性質(zhì)的高差異相反，發(fā)現(xiàn)通過新方法獲得的DC性質(zhì)差異度非常低。表3.通過標準方法或新方法產(chǎn)生的樹突細胞的不同標志物表達百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>S:標準方法，N:本發(fā)明方法，ND:未測定，X:平均值最后，圖4A表示了通過新方法產(chǎn)生的未成熟(第5天)和成熟(第8天)樹突細胞的表型。這里，我們還測量了CD80、甘露糖受體(MR)和兩種朗氏細胞標志物-CD207(langerin)和E-鈣黏著蛋白的表達。可以看到，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞不是朗氏細胞。圖5B表示通過新方法和標準方法產(chǎn)生的未成熟(第5天)和成熟(第8天)樹突細胞的表型。這里，我們針對標準DC標志物的表達而對細胞進行染色。對于未成熟(第5天)，我們具有更清潔的CDla群。成熟群(第8天)顯示了與標準方法相比，新方法產(chǎn)生的細胞中的高且均一的HLAD、CD83和CD86表達。而且，通過新方法，CCR7表達更均一表達。實施例9.通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的樹突細胞的穩(wěn)定性。在注射入有機體后，樹突細胞應(yīng)該遷移并達到淋巴結(jié)，以刺激T細胞。因此，DC保持其表型幾天是非常重要的。進行穩(wěn)定性測試的普遍方式是收集第8天的細胞，洗出細胞因子后繼續(xù)在缺乏刺激性細胞因子下培養(yǎng)細胞。我們已經(jīng)通過不用細胞因子培養(yǎng)細胞兩天而進行了這種實驗。圖5表示了第8天和額外兩天培養(yǎng)后收集的DC的FACS分析結(jié)果。顯然，測量參數(shù)CDla、CD14、CD83、HLA-D和CCR7的表達很大程度上保持不變，因此表型保持穩(wěn)定。在類似實驗中，在第8天沒有洗出細胞因子，我們測試了第7天和第10天的樹突細胞的表型和異種刺激活性。圖6A和6B分別顯示了表型和異種刺激活性。結(jié)果顯示，異種刺激作用在培養(yǎng)10天后依然高，第10天的表型特征類似于第7天測量的特征，證實了所產(chǎn)生的樹突細胞的高穩(wěn)定性。實施例10.由新方法生成的樹突細胞的異種刺激。我們比較了通過"標準"方法和本發(fā)明方法獲得的DC的異種刺激能力。細胞在含有5%AB人血清的RPMI1640介質(zhì)中培養(yǎng)。響應(yīng)細胞是通過外周血液暗黃覆蓋層密度分離從健康供體獲得的單核細胞。刺激細胞是暴露于成熟細胞因子雞尾酒2天后獲得的經(jīng)輻射的成熟樹突細胞，如實施例4所述。剌激細胞，0.1xl(f個細胞/10(^1，與圖7所示滴定數(shù)目的剌激細胞(10(V1)混合，并在U底96孔微滴定板中培養(yǎng)5天。最后18個小時添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.1ji居里/mL)。隨后，收集細胞用于閃爍計數(shù)。數(shù)據(jù)給出為四個平行培養(yǎng)的平均cpm值。使用Wilcoxon測試來估計用于產(chǎn)生DC的兩種方法之間的差異?？梢钥吹?，通過本發(fā)明方法獲得的樹突細胞具有3-10倍的異種刺激活性。實施例11.由新方法生成的樹突細胞的抗原呈遞為了說明DC呈遞抗原至T細胞的潛力，對通過裸露的或CMV肽脈沖的DC刺激的T細胞進行INFyELISPOT測定。選擇INFyELISPOT測定是因為該測定提供了單細胞水平上的清晰結(jié)果，并且T細胞遇到APC呈遞的抗原之后釋放INF。使用的CMV肽限于HLA-A2，并且供體材料已知為HLA-A2陽性，因為該群的80%具有CMV反應(yīng)，所以選擇該病毒模型。圖9描述了ELISPOT測定結(jié)果，顯示了用載有CMV肽的DC刺激的T細胞存在強反應(yīng)，表明這些DC能夠?qū)⒖乖蔬f至T細胞。參考文獻1.Heufler，C,Koch，F(xiàn).，Stanzl，U.，Topar,G.，Wysocka,M.'Trinchieri，G.，Enk，A.，Steinman，R.M.,Romani,N.，andSchuler，G.lnterleukin-12isproducedbydendriticcellsandmediatesThelper1developmentaswellasinterferon-gammaproductionbyThelper1cells.Eur.丄lmm,l.，26:659-668，1996.2.Scandella，E.，Men,Y.,Gillessen，S.，F(xiàn)orster，R.，andGroettmp，M.ProstaglandinE2isakeyfactorforCCR7surfaceexpressionandmigrationofmonocyte-deriveddendriticcells.Blood,100:1354-1361，2002.3.Jonuleit，H.，Kuhn，U.，Muller，G.，Steinbrink，K.,Paragnik，L.，Schmitt，E,，Knop，丄，andEnk，A.H.Pro-inflammatorycytokinesandprostaglandinsinducematurationofpotentimmunostimulatorydendriticcellsunderfetalcalfsemm-什eeconditions.Eur.丄lmmunol"27:3135-3142，1997.4.Chen,M.，Li，Y.G.，Zhang，D.Z.，Wang,Z.Y.，Zeng,W.Q.!Shi，X.F.，Guo，Y.，Guo，S.H.，andRen,H.TherapeuticeffectofautologousdendriticcellvaccineonpatientswithchronichepatitisB:aclinicalstudy.World丄Gastroenterol.，11:1806-1808，2005.5.Lu，W.，Arraes，L.C，F(xiàn)erreira，W.T.，andAndrieu,丄M.Therapeuticdendritic-cellvaccineforchronicHIV-1infection.Nat.Med.，10:1359-1365，2004.6.Peters,丄H.,Xu，H.，Ruppert，丄，Ostermeier，D.，F(xiàn)riedrichs，D.，andGieseler，R.K.Signalsrequiredfordifferentiatingdendriticcellsfromhumanmonocytesinvitro,Adv.Exp,Med.Biol.,329:275-280,1993.7.Romani，N.，Gruner，S.，Brang，D.,Kampgen,E.，Lenz，A.，Trockenbacher，B.，Konwalinka，G.，F(xiàn)ritsch，P.O.，Steinman，R.M.,andSchuler,G.Proliferatingdendriticcellprogenitorsinhumanblood.丄Exp.Med.，180:83-93，1994.8.Sallusto,F.andLanzavecchia,A.Efficientpresentationofsolubleantigenbyculturedhumandendriticcellsismaintainedbygranulocyte7macrophagecolony-stimulatingfactorplusinterleukin4anddownregulatedbytumornecrosisfactora.丄Exp.Med.，179:1109-1118，1994.9.Dexter，T.M.，Allen,T.D.，andLajtha,L.G.Conditionscontrollingtheproliferationofhaemopoieticstemcellsinvitro.J.CellPhysiol,91:335-344，1977.10.Athanasas-Platsis，S.，Savage,N.W,'Winning,T.A.，andWalsh,匕.丄InductionoftheCD1aLangerhanscellmarkeronhumanmonocytes.Arch.OralBiol.,40:157-160，1995.11.I_ehmann，M.H.Recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactortriggersinterleukin-10expressioninthemonocyticcelllineU937.Mol.lmm,l"35:479-485，1998.12.Kirkley，丄E.，Thompson,B.丄，andCoon，丄S,Temperaturealterslipopolysaccharide-jnducedcytokinesecretionbyRAW264,7cells.Scand.丄Immunol"58:51-58，2003.20權(quán)利要求1.一種通過在祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展過程中采用低于37℃的溫度生成樹突細胞的方法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生成的樹突細胞為成熟的樹突細胞。3.根據(jù)權(quán)利要求l-2所述的方法，其中祖細胞和未成熟樹突細胞的發(fā)展包括所述細胞的分化。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述溫度在分化過程中低于37。C。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述溫度是31°C至37°C。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述溫度是34°C。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述祖細胞是自體祖細胞。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述祖細胞選自髓樣祖細胞或干細胞。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述髓樣祖細胞是單核細胞。10.—種樹突細胞群，其中所述細胞根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的方法生成。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細胞群，其中所述細胞表達CCR7和/或IL-12p70。12.根據(jù)權(quán)利要求10-11中任一權(quán)利要求所述的細胞群，其中所述細胞表達CDla、CDlV氏、CD83、CD86和IL-10低。13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一權(quán)利要求所述的細胞群，其進一步包括至少一種抗原與所述細胞表面的MHC分子結(jié)合呈遞。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細胞群，其中所述至少一種抗原是腫瘤抗原。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細胞群，其中所述腫瘤抗原選自癌癥/睪丸抗原、家族特異性分化抗原、腫瘤過表達抗原、突變或異常表達抗原以及病毒抗原。16.權(quán)利要求10-15中任一權(quán)利要求所述的細胞群用于剌激和/或擴增T細胞的用途。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述T細胞是自體T細胞。18.根據(jù)權(quán)利要求16-17所述的用途，其中所述用途是體外用途。19.權(quán)利要求10-15中任一權(quán)利要求所述的細胞群在誘導(dǎo)受體免疫反應(yīng)中的用途。20.—種包含權(quán)利要求10-15中任一權(quán)利要求所述的樹突細胞群的藥物組合物。21.權(quán)利要求10-15中任一權(quán)利要求所述的細胞群在治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述感染疾病選自HIV和肝炎。全文摘要本發(fā)明在具體實施方案中涉及通過在祖細胞和未成熟樹突細胞發(fā)展過程中采用低于37℃的溫度來產(chǎn)生樹突細胞的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及樹突細胞群及其用途。文檔編號A61P31/12GK101321861SQ200680045697公開日2008年12月10日申請日期2006年12月7日優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日發(fā)明者A·柯金,J·祖森,K·丹久嘎贊申請人:丹竺特生技有限公司