專利名稱：胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有IL-6抑制劑作為有效成分的胰島移植中的移植胰島 障礙(移植膝島障害)抑制劑及其應用。
背景技術：
已知胰島素依賴性糖尿病的成因是由于降血糖激素一胰島素生成 細胞(胰島卩細胞)由于免疫學機理而被選擇性破壞，結果，發(fā)病后產生高 血糖，引起各種障礙。以往的治療方法是給予(注射)不足的胰島素制劑， 矯正高血糖。但是，胰島素治療難以進行嚴密的血糖控制，時常過量給 予，造成對生命有危險的低血糖。另外，糖尿病發(fā)病后，糖尿病血管并 發(fā)癥(視網膜病、腎癥、神經癥等)得以發(fā)展，胰島素注射等以往的治療 方法無法阻止該發(fā)展，在治療上成為重要的問題。在生理上主要是通過 胰島P細胞的調節(jié)機理來控制血糖，但是胰島素依賴型糖尿病中，由于 該缺失導致血糖值升降混亂，成為上述臨床癥狀的原因。近年來在歐美，作為糖尿病治療的方法，開始了移植langerhans島(胰 島)的胰島移植的臨床應用。不采用給予胰島素的治療，而嘗試移植胰島 素生成細胞。臨床胰島移植的實際操作手法是在局部麻痹下、在超聲波 引導下經皮經肺穿刺門靜脈，留置導管，由該部位向肝內移植供體胰島。 胰島移植物在門靜脈末端存活，分泌胰島素，調節(jié)血糖值。胰島移植成 功時，糖尿病受體恢復正常血糖，無需胰島素治療。但是，目前為止臨 床胰島移植的成功例子有限，并且對于一名受體需要移植由2 3人的胰 臟分離的胰島。即，移植后立即產生胰島功能障礙，移植物存活率降低， 因此，由l人對l人的移植并不足夠，需要有2至3人的供體向1人移植。 有些學說認為，移植物只能存活20 30%。該功能障礙的詳細情況尚未了 解，對于臨床胰島移植的成績提高來說是極為重要的課題。并且，除了以往的從腦死亡供體或心臟停止供體的胰臟中分離的胰 島的移植之外，最近，關于切除健康活體供體的胰臟的一部分，分離純 化胰島，移植給糖尿病患者的活體胰島移植也有成功例子的報道?；铙w 胰島移植中，對供體產生了侵襲或負擔，因此，人們希望能夠抑制移植使用更少的供體胰島即可進行治療。IL-6是B細胞刺激因子2 (BSF2)或被稱為干擾素P2的細胞因子。IL-6 作為與P淋巴細胞系的細胞活化有關的分化因子被發(fā)現(非專利文獻1)， 之后還了解到它是對各種細胞功能具有影響的多功能細胞因子(非專利 文獻2)。已報道IL-6可誘導T淋巴細胞系細胞的成熟(非專利文獻3)。IL-6在細胞上經由兩種蛋白質傳導其生物學活性。 一種是IL-6所結 合的分子量為約80kD的配體結合性蛋白的IL-6受體(非專利文獻4、 5)。 IL-6受體除了貫通細胞膜、在細胞膜上表達的膜結合型之外，主要還以 含有胞外域的可溶性IL-6受體的形式存在。另一個是與非配體結合性信號傳導有關的、分子量為約130kD的膜 蛋白gpl30。 IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復合物，接著與gpl30結合， 由此，IL-6的生物學活性在細胞內傳導(非專利文獻6)。IL-6抑制劑是抑制IL-6的生物學活性傳導的物質。目前已知有IL-6 的抗體(抗IL-6抗體)、IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、gpl30的抗體(抗 gpl30抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體部分肽等。關于抗IL-6受體抗體，已有一些報道(非專利文獻7、 8、專利文獻 1~3)。已知其中之一是將小鼠抗體PM-1(非專利文獻9)的互補決定區(qū) (CDR,complementarity determining region)移植到人抗體中得到的人源化 PM-1抗體(專利文獻4)。本申請的發(fā)明中相關的現有技術文獻信息如下。 非專利文獻l: Hirano,T.等人.，Nature (1986) 324, 73-76 非專利文獻2: Akira，S.等人.，Adv. in Immunology (1993) 54, 1畫78 非專利文獻3: Lotz,M.等人.，J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258 非專利文獻4: Taga,T.等人.，J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 非專利文獻5: Yamasaki,K.等人.，Science (1988) 241, 825-828 非專利文獻6: Taga,T.等人.，Cell (1989) 58, 573-581 非專利文獻7: Novick,D.等人.，Hybridoma(1991) 10, 137-146 非專利文獻8: Huang,Y.W.等人.，Hybridoma (1993) 12， 621-630 非專利文獻9: Hirata,Y.等人.，J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 專利文獻l:國際專利申請爿^開號WO 95-09873 專利文獻2:法國專利申請公開號FR2694767 專利文獻3:美國專利號US 5216128專利文獻4:國際專利申i青乂^開號WO 92-19759 發(fā)明內容糖尿病治療的胰島移植中，在移植時抑制移植胰島障礙、提高胰島 的存活是很重要的，目前尚未有顯示顯著效果的方法。另外，作為IL-6 抑制劑之一的抗IL-6受體抗體在胰島移植中是否顯示抑制移植胰島障礙 的效果，目前尚未進行過研究。本發(fā)明是針對上述狀況而進行的，其目的在于提供含有IL-6抑制劑 作為有效成分的胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑。還提供抑制對象移 植胰島障礙的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予進行胰島移植的對象 的步驟。本發(fā)明人為解決上述課題，對于抗IL-6受體抗體抑制胰島移植中的 移植胰島障礙的效果進行了研究。首先，本發(fā)明人對雄性C57BL/6小鼠靜脈內給予鏈脲菌素，制作糖 尿病受體小鼠。接著，將兩只量(400個)或一只量(200個)的由小鼠胰臟分離的胰島移 植到該糖尿病受體小鼠中。結果，移植兩只量的胰島時，血糖值正常， 表現了糖尿病的治療效果，而移植一只量的胰島時，則血糖值不正常， 持續(xù)高血糖(圖2、 3)。移植一只量(200個)的小鼠的胰島，移植后將500嗎抗IL-6受體抗體 (MR16-1)腹腔內給予三次，則所有受體的血糖值在移植后均恢復正常(圖 4)。而將同等量的抗IL-6受體抗體給予一次時，3/4恢復正常血糖(圖5)。 將200 ng抗IL-6受體抗體給予一次時，1/3恢復正常血糖(圖6)。并且可知，通過給予本發(fā)明的抗IL-6受體抗體，可以抑制移植后浸 潤細胞的炎癥性細胞因子的生成。由以上結果表明，抗IL-6受體抗體可以減輕移植胰島障礙，改善胰 島的存活，糾正受體的高血糖。即，本發(fā)明人通過本發(fā)明首次發(fā)現通過抗IL-6受體抗體，可以抑 制胰島移植時的移植胰島障礙，由此完成了本發(fā)明。本明更具體地提供以下的[1 ]~[23]。[1]胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑，該抑制劑含有IL-6抑制劑 作為有效成分。[2] [l]的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。[3] [l]的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。[4] [2]或[3]的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，抗體是單克隆抗體。[5〗[2] [4]中任一項的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，抗體是人 IL-6的抗體或人IL-6受體的抗體。[6] [2] [5]中任一項的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，抗體是重 組型抗體。[7] [6]的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，抗體是嵌合抗體、人 源化抗體或人抗體。[8] [1卜[7]中任一項的移植胰島障礙抑制劑，該抑制劑用于糖尿病的 治療。[9]抑制對象的移植胰島障礙的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給 予進行胰島移植的對象的步驟。[10]使對象中胰島的存活提高的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給 予進行胰島移植的對象的步驟。[11] [9]或[10]的方法，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。[12] [9]或[10]的方法，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。[13] [11]或[12]的方法，其特征在于，抗體是單克隆抗體。[14] [11] [13]中任一項的方法，其特征在于，抗體是人IL-6的抗體或人IL-6受體的抗體。[15] [11] [14]中任一項的方法，其特征在于，抗體是重組型抗體。 [16] [15]的方法，其特征在于，抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[17] IL-6抑制劑在制備胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑中的應用。[18][17]的應用，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。 [19][17]的應用，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。 [20] [18]或[19]的應用，其特征在于，抗體是單克隆抗體。[21] [18] [20]中任一項的應用， 或人IL-6受體的抗體。[22] [18] [21]中任一項的應用， [23] [22]的應用，其特征在于，抗體。說明書第5/25頁其特征在于，抗體是人IL-6的抗體其特征在于，抗體是重組型抗體。 抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人


圖l是未進行胰島移植的糖尿病受體小鼠的血糖值變化圖。 圖2是同種同體移植兩只量的小鼠胰島(400個)的糖尿病受體小鼠的 血糖值變化圖。圖3是表示同種同體移植一只量的小鼠胰島(200個)的糖尿病受體小 鼠的血糖值變化圖。圖4是表示同種同體移植一只量的小鼠胰島(200個)，移植后將500 嗎抗IL-6受體抗體腹腔內給予三次的糖尿病受體小鼠的血糖值變化的 圖。圖5是表示同種同體移植一只量的小鼠胰島(200個)，移植后將500 pg抗IL-6受體抗體腹腔內給予 一次的糖尿病受體小鼠的血糖值變化的圖。圖6是表示同種同體移植一只量的小鼠胰島(200個)，移植后將200 1ig抗IL-6受體抗體腹腔內給予 一次的糖尿病受體小鼠的血糖值變化的圖。圖7是表示給予抗IL - 6受體抗體抑制移植后浸潤細胞炎癥性細胞因 子產生的圖。圖8是表示同種異體移植一只量的小鼠胰島(200個)，移植后將200 嗎大鼠IgG腹腔內給予三次的糖尿病受體小鼠的血糖值變化的圖。圖9是表示同種異體移植一 只量的小鼠胰島(200個)，移植后將200 嗎抗CD4抗體腹腔內給予一次的糖尿病受體小鼠的血糖值變化的圖。圖10是表示同種異體移植一只量的小鼠胰島(200個)，移植后將500 嗎抗IL-6受體抗體腹腔內給予三次、將200嗎抗CD4抗體腹腔內給予一次 的糖尿病受體小鼠的血糖值變化的圖。
具體實施方式
本發(fā)明人發(fā)現抗IL-6受體抗體可抑制胰島移植后的移植胰島障礙。 本發(fā)明是基于這些認識而完成的。本發(fā)明涉及胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑，該抑制劑含有IL-6 抑制劑作為有效成分。本發(fā)明中，"IL-6抑制劑"是指阻斷利用IL-6的信號傳導、抑制IL-6的 生物學活性的物質。IL-6抑制劑優(yōu)選為對IL-6、 IL-6受體和gpl30的結合 具有抑制作用的物質。本發(fā)明的IL-6抑制劑例如有抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gpl30 抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6受體變異體或者IL-6或IL-6受體的部分肽、 以及與它們顯示同樣活性的低分子物質，但并不限于此。本發(fā)明的IL-6 抑制劑可優(yōu)選列舉識別IL-6受體的抗體。對本發(fā)明的抗體的來源沒有特別限定，但優(yōu)選來自哺乳動物，更優(yōu) 選來自人的抗體。本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體可采用公知的方法，以多克隆或單克隆 抗體的形式獲得。本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的 單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體有在雜交瘤中生成的抗體、 以及通過遺傳工程方法、在用含有抗體基因的表達載體轉化的宿主中生 成的抗體。該抗體與IL-6結合，可以抑制IL-6與IL-6受體的結合，阻斷IL-6 的生物學活性向細胞內的傳導。作為這樣的抗體，可列舉MH166 (Matsuda,T.等人.，Eur丄Immunol. (1988) 18,951-956)、 SK2抗體(Sato,K等人.，第21回日本免疫學會總會、 學術記錄(1991)21, 166)等。生成抗IL-6抗體的雜交瘤基本上可釆用公知技術如下制備。即，使 用IL-6作為致敏抗原(感作杭原)，將其按照通常的免疫方法進行免疫， 將所得免疫細胞通過通常的細胞融合法與公知的母細胞(親細胞)融合， 通過通常的篩選方法篩選單克隆抗體產生細胞。具體來說，制備抗IL-6抗體可如下進行。例如，作為取得抗體的致 敏抗原使用的人IL-6可通過使用Eur丄Biochem (1987) 168, 543-550、 J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541 、或Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列得到。將IL-6的基因序列插入到公知的表達載體體系中，轉化適當的宿主 細胞，然后通過公知的方法，從該宿主細胞中或者培養(yǎng)上清中純化目標IL-6蛋白質，可使用該純化IL-6蛋白質作為致敏抗原。也可以^使用IL-6 蛋白質與其它蛋白質的融合蛋白作為致敏抗原。本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體可使用公知的方法，以多克隆抗體 或單克隆的形式獲得。本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體特別優(yōu)選來自哺 乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體有在雜交瘤中 生成的抗體，以及通過基因工程方法、在用含有抗體基因的表達載體轉 化的宿主中生成的抗體。該抗體與IL-6受體結合，可以抑制IL-6與IL-6 受體的結合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內的傳導。作為這樣的抗體，可列舉MR16-l抗體(Tamura, T.等人.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928)、 PM-1抗體(Hirata,Y.等人.,J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)、 AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或 AUK146-15抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)等。其中，作為人 IL-6受體的優(yōu)選的單克隆抗體可列舉PM-1抗體，另外作為小鼠IL-6受體 的優(yōu)選的單克隆抗體可列舉MR16-1抗體。生成抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤基本上可采用公知技術如下制 備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原，將其按照通常的免疫方法進行免通常的篩選法篩選單克隆的抗體生成細胞來制備。具體來說，制備抗IL-6受體抗體可如下進行。例如，作為取得抗體 的致敏抗原使用的人IL-6受體可使用歐洲專利申請公開號EP 325474、小 鼠IL-6受體可使用日本特許出愿公開號特開平3-155795中公開的IL-6受 體基因/氨基酸序列獲得。IL-6受體蛋白有在細胞膜上表達的和與細胞膜脫離的(可溶性IL-6受 體)(Yasukawa,K.等人.,J. Biochem. (19卯)108, 673-676)兩種?？扇苄?IL-6受體由與細胞膜結合的IL-6受體的實質上的胞外域構成，貫通細胞 膜區(qū)域或者貫通細胞膜區(qū)域和胞內域缺損，在該點上與膜結合型IL-6受 體不同。IL-6受體蛋白只要在本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的制備中 可用作致敏抗原即可，可以-使用任何IL-6受體。將IL-6受體的基因序列插入到公知的表達載體體系中，轉化適當的 宿主細胞，然后按照公知的方法，從該宿主細胞中或者培養(yǎng)上清中純化 目標IL-6受體蛋白，將該純化IL-6受體蛋白用作致敏抗原即可。還可以 使用表達IL-6受體的細胞、IL-6受體蛋白與其它蛋白的融合蛋白作為致敏抗原。本發(fā)明中使用的抗gpl30抗體可以使用公知的方法，以多克隆或單 克隆抗體的形式獲得。本發(fā)明中使用的抗gpl30抗體特別優(yōu)選來自哺乳 動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體有在雜交瘤中生 成的抗體，和通過基因工程方法、在用含有抗體基因的表達栽體轉化的 宿主細胞中生成的抗體。該抗體通過與gpl30結合，可以抑制IL-6/IL-6 受體復合物與gpl30的結合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內傳導。作為這樣的抗體，可列舉AM64抗體(日本特開平3-219894)、 4B11 抗體和2H4抗體(US 5571513)B-S12抗體和B-P8抗體(日本特開平 8-291199)等。生成抗gpl30單克隆抗體的雜交瘤基本上可使用公知的技術如下制 備。即，使用gpl30作為致敏抗原，將其按照通常的免疫方法免疫，按 照通常的細胞融合法將所得免疫細胞與公知的母細胞融合，通過通常的 篩選方法篩選產生單克隆抗體的細胞。具體來說，制備單克隆抗體可以如下進行。例如，用作取得抗體的 致敏抗原的gpl30可使用歐洲專利申請公開號EP 41W4G中公開的gp130 基因/氨基酸序列獲得。將gpl30的基因序列插入到公知的表達載體體系中，轉化適當的宿 主細胞，然后通過公知的方法，從該宿主細胞中或者培養(yǎng)上清中純化目 標gpl30蛋白，可使用該純化gpl30蛋白作為致敏抗原。還可以使用表達 gpl30的細胞、gpl30蛋白與其它蛋白質的融合蛋白作為致敏抗原。作為用致敏抗原免疫的哺乳動物，沒有特別限定，但優(yōu)選考慮與在 細胞融合中所使用的母細胞的適合性選擇，通?？墒褂脟X類的動物， 例如小鼠、大鼠、倉鼠等。用致敏抗原免疫動物可按照公知的方法進行。例如常規(guī)的方法是將 致敏抗原向哺乳動物的腹腔內或皮下注射。具體來說，將致敏抗原用PBS (磷酸鹽緩沖液)、生理食鹽水等稀釋、懸浮成適量，根據需要，將其與 通常的佐劑例如弗氏完全佐劑適量混合，乳化后每隔4 21天多次給予哺 乳動物。另外，致敏抗原免疫時可使用適當的載體。通過上述免疫，確認血清中所需抗體水平升高，然后從哺乳動物中 獲得免疫細胞，進行細胞融合。進行細胞融合的優(yōu)選的免疫細胞特別例 舉脾細胞。融合的其它母細胞的哺乳動物的骨髓瘤細胞可以適當使用公知的各種細胞抹，例如P3X63Ag8.653 (Kearney,J.F.等人. J.Immunol. (1979) 123， 1548-1550)、 P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81， 1-7)、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519)、 MPC-11 (Margulies.D.H. 等人.，Cell (1976) 8, 405-415)、 SP2/0 (Shulman, M.等人.，Nature (1978) 276, 269-270)、 FO (de St. Groth, S.F.等人.，J. Immunol. Methods (1980) 35， 1-21)、 S194 (Trowbridge, I.S丄Exp. Med. (1978) 148， 313-323)、 R210 (Galfre, G.等人.，nature (1979) 277, 131-133)等。上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合基本上可按照公知的方法、 例如Milstein等人的方法(Kohler. G. and Milstein, C.、 Methods Enzymol. (1981) 73，3-46)等進行。更具體地說，上述細胞融合例如可在細胞融合促進劑存在下、在通 常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施。融合促進劑例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙臺 病毒(HVJ)等，為了提高融合效率，還可以進一步根據需要添加二甲基 亞砜等輔助劑。對于免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例，例如相對于骨髓瘤細胞， 優(yōu)選使免疫細胞為1 10倍。作為上述細胞融合中4吏用的培養(yǎng)液，例如可 以使用適合于上迷骨髓瘤細胞抹增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、 其它在該種細胞培養(yǎng)中使用的通常的培養(yǎng)液，還可以并用胎牛血清(FCS) 等血清補料(血清補液)。細胞融合是將規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液 中充分混合，將預先加溫至37。C左右的PEG溶液、例如平均分子量為 1000 6000左右的PEG溶液通常以30 60。/。(w/v)的濃度添加，混合，形成 目標融合細胞(雜交瘤)。接著，依次添加適當的培養(yǎng)液，離心除去上清， 將該操作反復進行，可以除去雜交瘤的生長發(fā)育中不優(yōu)選的細胞融合劑 等。該雜交瘤通過在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌 呤、氨基蝶呤、胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)而進行選擇。該HAT培養(yǎng)液中的培 養(yǎng)持續(xù)足以使目標雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的時間、通常持 續(xù)數天 數周。接著，實施通常的極限稀釋法，篩選和克隆產生目標抗 體的雜交瘤。另外，除了對人以外的動物免疫抗原，獲得上述雜交瘤之外，還可以將人淋巴細胞在體外用所需抗原蛋白或抗原表達細胞致敏，將致敏B 淋巴細胞與人骨髓瘤細胞例如U266融合，獲得具有與所需抗原或與抗原 表達細胞的結合活性的所需的人抗體(參照日本特公平1-59878)。并且，轉i因動物,'、i照上述方法獲得所需人抗體(參A國際專利申請公開號WO 93/12227、 WO 92/03918、 WO 94/02602、 WO 94/25585、 WO 96/34096、 WO 96/33735)。這樣制備的產生單克隆抗體的雜交瘤可在通常的培養(yǎng)液中繼代培 養(yǎng)。還可以在液氮中長期保存。要由該雜交瘤取得單克隆抗體，可以采用下述方法按照通常的方 法培養(yǎng)該雜交瘤，以其培養(yǎng)上清的形式獲得的方法；或者是將雜交瘤給 予與其具有適合性的哺乳動物，進行增殖，以腹水的形式獲得的方法等。前者的方法適合獲得高純度的抗體，而后者的方法適合于抗體的大量生產。例如，產生抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備可按照日本特開平 3-139293所公開的方法進行。可按照以下的方法進行將產生PM-1抗體 的雜交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔內，獲得腹水，由該腹水純化PM-1 抗體的方法；或者是將該雜交瘤在適當的培養(yǎng)基、例如含有10。/。胎牛血 清、5% BM國Condimed HI (Boehringer Mannheim制)的RPMI1640培養(yǎng)基、 雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)等中 培養(yǎng)，由該培養(yǎng)上清純化PM-1抗體的方法。本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用將抗體基因從雜交瘤中克隆， 整合到適當的載體中，將其導入宿主，使用基因重組技術生產的重組型 抗體(例如參照Borrebaeck C.A.K. and larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBOD正S, Published in the United kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具體來說，從生產目標抗體的細胞、例如從雜交瘤中分離編碼抗體 的可變(V)區(qū)的mRNA。 mRNA的分離可采用公知的方法、例如胍超離心 法(Chirgwin, J.M.等人.，Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、 AGPC法 (Chomczynski,P.等人.，Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等制備總 RNA，使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)等制備mRNA。還可使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)直接制備mRNA。使用反轉錄酶由所得mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。 cDNA的合成可 使用AMV反轉錄酶第 一 鏈cDNA合成試劑盒(AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)等進行。進行cDNA的合成 和擴增可采用使用5，-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制)和使用 PCR的5，陽RACE法(Frohman,M,A.等人.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A.等人.，Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932 )。由所得PCR產物純化目標DNA片段，與載體DNA連接。再 由此制備重組載體，導入到大腸桿菌等中，選擇集落，制備所需重組載 體。目標DNA堿基序列可按照公知的方法例如脫氧法(，才年少法)確認。得到編碼目標抗體的V區(qū)的DNA,將其與編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū)) 的DNA連接，將其整合到表達載體中。或者將編碼抗體V區(qū)的DNA整合 到含有抗體C區(qū)的DNA的表達載體中。為了制備本發(fā)明中使用的抗體，如后所述，可以將抗體基因整合到 表達載體中，使其在表達控制區(qū)、例如增強子、啟動子的控制下表達。 接著，可通過該表達載體轉化宿主細胞，使抗體表達。本發(fā)明中，為了降低對人的異種抗原性等，可以使用人工變異的基 因重組型抗體，例如嵌合(chimeric )抗體、人源化(humanized)抗體、 人(human)抗體。這些變異抗體可采用已知的方法制備。嵌合抗體可如下獲得將上述得到的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人 抗體C區(qū)的DNA連接，將其整合到表達載體中，導入宿主，使其生成(參 照歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO 92-19759)。 使用這些已知的方法可以獲得本發(fā)明中有用的嵌合抗體。人源化抗體也稱作重構人抗體或人型化抗體，是將人以外的哺乳動其通常的基因重組方法也已知(參照歐洲專利申請公開號EP 1^023、"國 際專利申請公開號WO 92-19759)。具體來說，設計成小鼠抗體的CDR與人抗體的構架區(qū)(FR; framework region)連接的DNA序列，通過PCR法由制成末端部具有重疊 部分的多個寡核苷酸合成。將所得DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接， 接著整合到表達載體中，將其導入到宿主中生成(參照歐洲專利申請公開 號EP 239400、國際專利申請公開號WO 92-19759)。部位的FR。還可根據需要置換抗體可變區(qū)構架區(qū)的氨基酸，以使重構人抗體的互補決定區(qū)形成合適的抗原結合部位(Sato,K.等人.，Cancer Res. (1993) 53， 851-856)。嵌合抗體、人源化抗體中使用人抗體C區(qū)。作為人抗體C區(qū)，可列舉 Cy,例如可使用Cyl、 Cy2、 Cy3或C/4。為了改善抗體或其生產穩(wěn)定性， 可以對人抗體C區(qū)進行修飾。來自人抗體-的構架區(qū)和c區(qū)，兩者在人體內的抗原性低，、因此可用作在本發(fā)明中使用的抗體。作為本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選具體例子，可列舉人源化 PM-1抗體(參照國際專利申請公開號WO 92-19759)。作為人抗體的取得方法，除了之前所述的方法之外，還已知使用人 抗體文庫、通過淘選得到人抗體的技術。例如，可將人抗體的可變區(qū)作 為單鏈抗體(scFv),通過噬菌體展示法在噬菌體的表面表達，選擇與抗 原結合的噬菌體。對被選擇的噬菌體的基因進行分析，可以確定編碼與 抗原結合的人抗體可變區(qū)的DNA序列。如果與抗原結合的scFv的DNA序 列得到明確，則可以制備含有該序列的適當的表達載體，獲得人抗體。 這些方法是公知的，可以以WO 92/01047、 WO 92/20791、 WO 93/06213、 WO 93/11236、 WO 93/19172、 WO 95/01438、 WO 95/15388作為參考。如上所迷構建的抗體基因可通過公知的方法表達。使用哺乳類細胞 時，可以通過常用的有用啟動子、要表達的抗體基因、在其3，側下游功 能性結合有polyA信號的DNA、或者含有該DNA的載體來表達。例如作 為啟動子/增強子，可列舉人巨細胞病毒即刻早期啟動子/增強子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。除此之外，本發(fā)明中使用的、可用于抗體表達的啟動子/增強子還可 以使用反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等的病毒啟 動子/增強子或人延伸因子la (HEFla)等來自哺乳類細胞的啟動子/增強 子。例如，使用SV40啟動子/增強子時，可按照Mulligan等人的方法 (Mulligan,R.C.等人.，nature (1979) 277， 108-114),使用HEFla啟動子/增強子時，可按照Mizushima等人的方法(Mizushima,S.和Nagata， S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)容易地實施。為大腸桿菌時，可以使常用的有用啟動子，用于抗體分泌的信號序 列、要表達的抗體基因功能性結合，使其表達。例如作為啟動子，可列 舉lacZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，可按照Ward等人的方 法(Ward，E.S.等人.Nature (1989) 341,544-546, Ward, E.S.等人FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)，使用araB啟動子時，可以按照Better等人的方法 (Better,M.等人.Science (1988) 240, 1041-1043)進行。作為用于抗體分泌的信號序列，在大腸桿菌的周質中生成時，可使 用pe舊信號序列(Lei,S.P.等人J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)。分離 在周質中生成的抗體后，可以將抗體的結構適當地重折疊(refold)使 用(例如參照WO 96/30394)。作為復制起源，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤 病毒(BPV)等的，進一步，為了在宿主細胞系內擴增基因拷貝數，表達 載體可以含有氨基糖普磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大 腸桿菌黃噪呤-鳥嘌呤;粦酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氬葉酸還原酶 (dhfr)基因等作為選擇標志。為了制備本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產體系。抗體制備的生產體系有體外和體內生產體系。作為體外生產體系，可列舉使用 真核細胞的生產體系、使用原核細胞的生產體系。使用真核細胞時，有使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞的生產體 系。動物細胞已知有(l)哺乳類細胞例如CHO、 COS、骨髓瘤、BHK(幼 倉鼠腎)、HeLa、 Vero等，(2)兩棲類細胞例如非洲爪蟾卵母細胞，或者 (3)昆蟲細胞，例如sf9、 sf21、 Tn5等。植物細胞已知有來自煙草(Nicotiana tabacum)的細胞，將其進行愈傷組織培養(yǎng)即可。真菌細胞已知有酵母 例^口酵母菌(Sacc/2"rowyces)屬,例^口酉良酒酵母(iS"cc/zorom少ce51 、 絲訝犬菌例^口曲霉屬(y^; ergz〃w力屬，例J(口黑曲霉(^^/ erg/〃W51m.ger)等。使用原核細胞時，有使用細菌細胞的生產體系。細菌細胞已知有大 腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。通過轉化，將目標抗體基因導入到這些細胞中，將轉化的細胞在體 外培養(yǎng)，由此可獲得抗體。培養(yǎng)可按照公知的方法進行。例如培養(yǎng)液可使用DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM,也可以并用胎牛血清(FCS)等 血清補料。將導入了抗體基因的細胞轉移到動物的腹腔內等，由此可以 在體內生成抗體。另一方面，作為體內生產體系，可列舉使用動物的生產體系、使用 植物的生產體系。使用動物時，有使用哺乳動物、昆蟲的生產體系等。哺乳類動物可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。昆蟲可以使用蠶。使用 植物時，例如可使用煙草。將抗體基因導入這些動物或植物，在動物或植物體內生成抗體并回 收。例如，將抗體基因插入到編碼如山羊p酪蛋白等在乳汁中特定產生 的蛋白質的基因中途，以融合基因的形式制備。將含有插入了抗體基因 的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎中，將該胚胎導入到雌山羊。由 接受了胚胎的山羊生的轉基因山羊、或其子孫所生產的乳汁中獲得所需 抗體。為了使由轉基因山羊產生的含所需抗體的乳汁量增加，可以對轉 基因山羊使用適當的激素(Ebert, K.M.等人.，Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。使用蠶時，將插入了目標抗體基因的桿狀病毒感染蠶，由該蠶的體 液獲得所需抗體(Maeda,S.等人.，Nature (1985) 315, 592-594)。使用煙草 時，將目標抗體基因插入到植物表達用載體例如pMON530，將該載體導 入到根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)等細菌中。將該細菌感染煙 草、例如煙草(Nicotiana tabacum)，可由該煙草的葉獲得所需抗體(Julian, K,C. Ma等人.，Eur,J.Immunol. (1994) 24， 131-138)。如上所述，在通過體外或體內生產體系生產抗體時，可以將編碼抗 體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合到表達載體中，同時轉化宿主， 或者是將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到單一的表達載體中，轉化宿主(國 際專利申請公開號WO 94-11523)。本發(fā)明中使用的抗體只要在本發(fā)明中可適宜使用即可，可以是抗體 的片段或其修飾物。例如，抗體的片段有Fab、 F(ab')2、 Fv、或H鏈與L 鏈的Fv通過適當的接頭連接而成的信號鏈Fv (scFv)。具體來說，將抗體用酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等進行處理，生 成抗體片段，或者構建編碼這些抗體片段的基因，將其導入到表達載體 中，然后在適當的宿主細胞中表達(例如參照Co, M.S.等人.，J.Immunol.(1994) 152， 2968-2976、 Better, M.& Horwitz, A.H.Methods in Enzymology (1989) 178,476-496、 Plueckthun, A.& Skerra, A.Methods in Enzymology (1989) 178,497-515、 Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J.等人，Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、 Bird, R. E.等人.，TIBTECH (1991) 9, 132-137)。scFv可通過將抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)連接獲得。在該scFv中，H鏈 V區(qū)和L鏈V區(qū)經由接頭、優(yōu)選肽接頭連接(Huston,J.S.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (1988) 85, 5879-5883)。 scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以 來自上述所記載的任何抗體。連接V區(qū)的肽接頭例如可使用含有12 19 個氨基酸殘基的任意的單鏈肽。編碼scFv的DNA如下獲得以編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的 DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA作為模板，將這些序列中編碼所需 氨基酸序列的DNA部分用規(guī)定了其兩端的引物對、通過PCR法擴增，接 著，再將編碼肽接頭部分的DNA和規(guī)定其兩端分別與各H鏈、L鏈連接的 引物對組合進行擴增。如果制備了編碼scFv的DNA,則可以按照常規(guī)方法獲得含有它們的 表達載體、以及由該表達載體轉化的宿主，還可以使用該宿主按照常規(guī) 方法獲得scFv。對于上述抗體的片段，可以與上述同樣地取得其基因，并使其表達， 通過宿主進行生產。本發(fā)明中所述"抗體"也包含這些抗體的片段。抗體的修飾物例如可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗 體。本發(fā)明中所述的"抗體"也包括這些抗體修飾物。為了獲得上述抗體 修飾物，可通過對所得抗體實施化學修飾獲得。這些方法在本領域中已 經得到確立。如上所述，生成并表達的抗體從細胞內外、宿主分離，純化至均勻。 本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可通過親和柱層析進行。親和柱層析 中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的載體例如有 HyperB、 POROS、 Sepharose F.F.等。除此之外還可以采用通常的蛋白質 所使用的分離、純化方法，沒有任何限定。例如將上述親和柱層析以外的色譜、過濾、超濾、鹽析、透析等適 當選擇、組合，分離并純化本發(fā)明中使用的抗體。色譜例如有離子交換 色譜、疏水色譜、凝膠過濾等。這些色譜可采用HPLC(高效液相色譜)。還可以4吏用反相HPLC ( reverse phase HPLC)。上述得到的抗體的濃度測定可通過吸光度測定或ELISA等進行。即， 通過吸光度測定時，用PBS(-)適當稀釋，然后測定280 nm下的吸光度， 以l mg/ml作為1.35 OD計算。通過ELISA進行時，可如下測定。即，將 100 jil用O.l M碳酸氬鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋為1 pg/ml的山羊抗人IgG (TAG制)加入到M孔板(Nunc制)中，在^C下溫育過夜，使抗體固定。封 閉后添加適當稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或者IOO pl作為標準品的人IgG (CAPPEL制)，在室溫下溫育1小時。洗滌后，添加IOO nL稀釋5000倍的堿性^疇酸酶標記抗人IgG (BIO SOURCE制)，在室溫下溫育l小時。洗滌后加入底物溶液，溫育后使用 讀板儀3550型(MICROPLATE READER Model 3550， Bio-Rad制)，測定 405 nm的吸光度，計算目標抗體的濃度。本發(fā)明中使用的IL-6變異體是具有與IL-6受體的結合活性、且不傳 導IL-6的生物學活性的物質。即，IL-6變異體與IL-6竟爭性地與IL-6受體 結合，但并不傳導IL-6的生物學活性，因此阻斷IL-6的信號傳導。IL-6變異體是通過置換IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基導入變異而 制備的。作為IL-6變異體基礎的IL-6，其來源可以是任何來源，但考慮 到抗原性等，優(yōu)選使用人IL-6。具體來說，采用公知的分子建才莫程序(molecular modeling programs ) 例如WHATIF (Vriend等人.,J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56)，預測IL-6氨 基酸序列的二級結構，通過評價置換的氨基酸殘基對整體的影響而進 行。確定了適當的取代氨基酸殘基后，以含有編碼人IL-6基因的堿基序 列的載體作為模板，按照通常進行的PCR法，通過導入使氨基酸被置換 的變異，由此可獲得編碼IL-6變異體的基因。可以將其根據需要整合到 適當的表達載體中，按照上述重組型抗體的表達、生產和純化方法獲得 IL-6變異體。IL-6變異體的具體例子在Brakenhoff等人.，J.Biol.Chem. (1994) 269， 86國93以及Savino等人,，EMBO J. (1994) 13， 1357-1367、 WO 96-18648、 WO 96-17869中有公開。本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是分別具有與IL-6受 體或IL-6的結合活性、且不傳導IL-6的生物學活性的物質。即，IL-6部分 肽或IL-6受體部分肽與IL-6受體或IL-6結合，通過捕獲它們，可以特異性200680047109.4說明書第17/25頁抑制IL-6與IL-6受體的結合。結果，由于不傳導IL-6的生物學活性，因此 可以阻斷IL-6介導的信號傳導。IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是含有IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中 的IL-6和IL-6受體的與結合有關的區(qū)域的一部分或全部氨基酸序列的 肽。上述肽通常含有10 80、優(yōu)選20 50、更優(yōu)選20 40個氨基酸殘基。IL-6部分肽或IL-6受體部分肽可如下制備在IL-6或IL-6受體的氨基 酸序列中，確定IL-6和IL-6受體的與結合有關的區(qū)域，根據該確定的區(qū) 域的 一 部分或全部氨基酸序列、按照通常已知的方法例如基因工程方法 或肽合成法制備。通過基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以將編 碼所需肽的DNA序列整合到表達載體中，按照上述重組型抗體的表達、 生產和純化方法得到。通過肽合成法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以采用肽合 成中通常^f吏用的方法、例如固相合成法或液相合成法。具體來說，可按照續(xù)醫(yī)藥品的開發(fā)第14巻肽合成監(jiān)修矢島治明 廣川書店1991年記載的方法進行。固相合成法例如可采用以下方法將 與要合成的肽的C末端對應的氨基酸與在有機溶劑中為不溶性的支持體 結合，交替反復進行將a-氨基和支鏈官能團用適當的保護基保護的氨基 酸由C末端向N末端方向依次一個氨基酸一個氨基酸地縮合的反應，和使 結合在樹脂上的氨基酸或肽的a-氨基的該保護基離去的反應，使肽鏈延 伸。固相肽合成法根據所使用的保護基團的種類而大致分為Boc法和 Fmoc法。如此合成目標肽后，進行脫保護反應和將肽鏈從支持體上切斷的反 應。肽鏈的切斷反應中，如果采用Boc法則通?？墒褂梅瘹浠蛉鷷?磺酸，如采用Fmoc法則通常使用TFA。 Boc法中，例如在茴香醚存在下、 在氟化氬中對上述保護肽樹脂進行處理。接著脫保護基團和從支持體上 切斷，回收肽。將其冷凍干燥，由此可得到粗制肽。另一方面，在Fmoc 法中，例如可通過在TFA中、按照與上述同樣的操作進行脫保護反應和 將肽鏈從支持體上切斷的反應。所得粗制肽可通過HPLC進行分離、純化。在其洗脫時，可使用蛋 白質純化中通常使用的水-乙腈系溶劑在最佳條件下進行。分離所得色譜 峰所對應的組分，將其冷凍干燥。對于上述純化的肽組分，通過質譜分析進行分子量分析、氨基酸組成分析、或氨基酸序列分析等，由此進行 鑒定。IL-6部分肽或IL-6受體部分肽的具體例子在日本特開平2-188600、日 本特開平7-324097、日本特開平8-311098和美國專利公報US5210075中 有公開。本發(fā)明中使用的抗體可以是與聚乙二醇(PEG)、放射性物質、毒素 等各種分子結合的結合抗體(conjugated antibody)。上述結合抗體可通 過對所得抗體實施化學修飾獲得?？贵w的修飾方法在本領域已經得到確 立。本發(fā)明中"抗體"也包含這些結合抗體。本發(fā)明的胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑可以在糖尿病治療中 使用。糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病、胰腺性糖尿病(隊性糖尿病)、 妊娠糖尿病等。另外，胰腺炎或使用類固醇藥等而二次發(fā)生時、或者是 由于特定基因有異常時等的特定原因的糖尿病也包含在上述糖尿病中。本發(fā)明的移植胰島障礙抑制劑可在胰島移植中使用。胰島移植包括 腦死亡供體胰島移植、心臟停止供體胰島移植和活體胰島移植等。本發(fā)明的胰島移植可以是同種同體移植(isograft),也可以是同種異 體移植(allograft)。同種同體移植是指在相同的均一體系的動物之間進行 的移植，對于人來說，是在同卵雙生兒之間進行的移植。同種異體移植 是指在基因原來組成不同的2個個體間進行的移植，例如對于人來說， 有雙卵雙生兒之間的移植或完全沒有血緣關系的個體間的移植。本發(fā)明中使用的IL-6抑制劑的IL-6信號傳導抑制活性可通過通常所 使用的方法評價。具體來說，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤細胞抹(S6B45, KPMM2)、人LennertT淋巴瘤細胞抹KT3、或IL-6依賴性細胞MH60.BSF2， 向其中添加IL-6，同時使IL-6抑制劑共存，由此測定IL-6依賴性細胞對3H-胸苷的攝取。還可以培養(yǎng)IL-6受體表達細胞U266，添加125I標記IL-6， 同時加入IL-6抑制劑，由此測定與IL-6受體表達細胞結合的125I標記 IL-6。上述測定體系中，除使IL-6抑制劑存在的組之外，也可以設置不 含有IL-6抑制劑的陰性對照組，將兩者所得結果進行比較，則可以評價 IL-6抑制劑對IL-6的抑制活性。如后述實施例所示，確認通過給予抗IL-6受體抗體，可抑制胰島移 植中的移植胰島障礙，由此顯示抗IL-6受體抗體等IL-6抑制劑可用作 胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑。21200680047109.4說明書第19/25頁本發(fā)明的移植胰島障礙抑制劑所給予的對象是哺乳動物。哺乳動物 優(yōu)選人。本發(fā)明的移植胰島障礙抑制劑可以以藥物的形式給予，可以是口服 或非口服地全身或局部給予。例如可選擇輸液等靜脈內注射、肌內注射、 腹腔內注射、皮下注射、栓劑、灌腸劑、口服性腸溶劑等，可根據患者 的年齡、癥狀等選擇適當的給予方法。有效給予量可以是每次l公斤體重在O.Ol mg~100 mg的范圍選擇?；蛘呖蛇x擇每位患者1 1000 mg、優(yōu)選 5 50mg的給予量。對于優(yōu)選的給予量、給予方法，例如為抗IL-6受體抗 體時，使血液中存在游離抗體程度的量為有效給予量，其具體例子是l kg 體重l個月(4周)為0.5mg 40mg,優(yōu)選lmg 20mg，分1次或多次、例如 2次/周、l次/周、l次/2周、l次/4周等給予方案通過輸液等靜脈內注射、 皮下注射等方法給予的方法等。給予方案可以在觀察移植后狀態(tài)以及觀 察血液檢查值的動向的同時，以2次/周或l次/周至l次/2周、l次/3周、1 次/4周這樣逐漸延長給予間隔等的方式進行調節(jié)，。本發(fā)明中，移植胰島障礙抑制劑中可以添加保存劑或穩(wěn)定劑等制劑 上可接受的載體。制劑上可接受的載體可以是其本身具有上述移植胰島 障礙抑制效果的材料，也可以是不具有移植胰島障礙抑制效果的材料， 是可以與上述抑制劑 一起給予的材料。還可以是雖然不具有移植胰島障 礙抑制效果，但是通過與IL-6抑制劑并用、具有協同性或相疊加性的穩(wěn) 定效果的材料。作為制劑上可接受的材料，可列舉例如滅菌水、生理食鹽水、穩(wěn)定 劑、賦型劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑(EDTA等)、粘合劑等。本發(fā)明中，作為表面活性劑，可列舉非離子表面活性劑，例如作為 典型的例子，可列舉失水山梨醇單辛酸酯、失水山梨醇單月桂酸酯、失 水山梨醇單椋櫚酸酯等失水山梨醇脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油單肉 豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油基單硬脂酸酯、十 甘油基二硬脂酸酯、十甘油單亞油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯失 水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯失水山 梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯失水山梨 醇三油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂 肪酸酯；聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸 酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚 氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚 氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯 基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚 氧乙烯氫化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨醇蜂蠟等聚氧 乙烯蜂蠟衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯 硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等具有HLB 6 18等的物質。表面活性劑還可以是陰離子表面活性劑，例如作為典型例子，可列 舉鯨蠟基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具有碳原子數為10 18 的烷基的烷基硫酸鹽；聚氧乙烯月桂基硫酸鈉等氧化乙烯平均加成摩爾 數為2 4、烷基的碳原子數為10 18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基磺 基琥珀酸酯鈉等烷基的碳原子數為8 18的烷基磺基琥珀酸酯鹽；天然系 表面活性劑，例如卵磷脂、甘油磷脂(力七口!^脂質)；神經鞘磷脂等鞘 磷脂；碳原子數為12 18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。本發(fā)明的制劑中使用的優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨醇酯20、 40、 60或80 等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，特別優(yōu)選聚山梨醇酯20和80。還優(yōu)選 以泊洛沙姆C7W口二、乂夕F-68 (注冊商標)等)為代表的聚氧乙烯聚氧丙烯 二醇。表面活性劑的添加量根據所使用的表面活性劑的種類而不同，為聚 山梨醇酯20或聚山梨醇酯80時，通常為0.001 100 mg/ml，優(yōu)選為 0.003~50 mg/ml，進一步優(yōu)選為0.005 2 mg/ml。本發(fā)明中，緩沖劑有磷酸、檸檬酸緩沖液、乙酸、蘋果酸、酒石酸、 琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、葡糖酸、辛酸、脫氧膽酸、水楊酸、三乙醇胺、 富馬酸等其它有機酸等，或者是碳酸緩沖液、Tris緩沖液、組氨酸緩沖 液、咪唑緩沖液等。在溶液制劑領域中，可以通過溶解于公知的水性緩沖液中制備溶液 制劑。緩沖液的濃度通常為1 500mM，優(yōu)選5~100 mM,進一步優(yōu)選10 20 mM。本發(fā)明的抑制劑可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠、 免疫球蛋白等蛋白質、氨基酸、多糖和單糖等糖類或烴、糖醇。本發(fā)明中，作為氨基酸，可列舉堿性氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、 組氨酸、鳥氨酸等，或者是它們這些氨基酸的無機鹽(優(yōu)選鹽酸鹽、磷酸鹽的形式，即磷酸氨基酸)。使用游離氨基酸時，優(yōu)選的pH值可通過添 加適當的生理可接受的緩沖物質例如無機酸、特別是鹽酸、磷酸、硫酸、 乙酸、曱酸或它們的鹽來調節(jié)。這種情況下，應用磷酸鹽可以獲得穩(wěn)定 的凍干物，因此特別有利。制備物實質上不含有機酸例如蘋果酸、酒石 酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等時、或者是不存在對應的陰離子(蘋果酸 離子、酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等)時，特別 有利。優(yōu)選的氨基酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸。并且也可以 使用酸性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸、及其鹽的形式(優(yōu)選鈉鹽)或 中性氨基酸，例如異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、繩氨 酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、或丙氨酸，或者是芳族氨基酸例如苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸或^f汙生物N-乙酰色氨酸。本發(fā)明中，作為多糖和單糖等的糖類、烴，可列舉例如葡聚糖、葡 萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等。本發(fā)明中，糖醇例如有甘露醇、山梨醇、肌醇等。將本發(fā)明的藥物制成注射用的水溶液時，例如可以與含有生理食鹽 水、葡萄糖或其它輔助藥物(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯 化鈉)的等滲液混合。該水溶液還可以與適當的溶解助劑(例如醇(乙醇 等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑(聚山梨醇酯80、 HCO-50)等)并用。根據所需，可以進一步含有稀釋劑、溶解助劑、pH調節(jié)劑、止痛劑 (無痛化剤)、含辟u還原劑、抗氧化劑等。本發(fā)明中，作為含硫還原劑，可列舉N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高 半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、 巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱苷肽、以及碳原子數為1 7的硫代 烷酸等具有巰基的物質等。本發(fā)明中，作為抗氧化劑，例如可列舉異抗壞血酸、二丁基羥基 甲苯、丁基羥基茴香醚、a-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、 L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞;危酸氫鈉、亞辟u酸鈉、 沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或乙二氨四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、 偏磷酸鈉等螯合劑。另外，可以根據需要封裝到微嚢(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基丙 烯酸曱酯]等微嚢)中，或者是制成膠態(tài)給藥系統(tǒng)(脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒以及納米嚢等)(參照"Remington's Pharmaceutical Science 16thedition", Oslo Ed.， 1980等)。并且，將藥物制成緩釋性的藥物 的方法也是公知的。也可應用于本發(fā)明(Langer等人.，J.Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer， Chem. Tech. 1982， 12: 98-105;美國專利 第3,773,919號；歐洲專利申請公開(EP)第58，481號；Sidman等人., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP第133,988號)。所使用的制劑上可接受的載體可根據劑型從上述中適當或者組合 選擇，但并不限于此。本發(fā)明涉及抑制對象的移植胰島障礙的方法，該方法包含將IL-6抑 制劑給予進行胰島移植的對象的步驟。本發(fā)明還涉及使對象中的胰島的 存活提高的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予進行胰島移植的對象的 步驟。本發(fā)明中，"對象"是指給予本發(fā)明的移植胰島障礙抑制劑的生物 體、該生物體的體內的一部分、或者由生物體摘除或排出的一部分。生 物體沒有特別限定，包括動物(例如人、家畜動物種類、野生動物)。對"生物體的體內的一部分"沒有特別限定，優(yōu)選可進行胰島移植的 器官、大網膜、腎包膜下、腸系膜。本發(fā)明中，作為移植胰島的器官， 例如可列舉肝臟，更具體地說是肝臟的血管。本發(fā)明中，"給予"包含口服或非口服給予?？诜o予可以是以口服 制劑的形式給予，口服制劑可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠嚢劑、溶 液劑、乳劑、或混懸劑等劑型。作為非口服給予，可列舉以注射劑的形式給予，注射劑可以是皮下 注射劑、肌肉注射劑或腹腔內注射劑等。另外，使用基因治療的方法， 將要給予的含有寡核苷酸的基因導入到生物體內，由此可實現本發(fā)明的 方法的效果。還可以將本發(fā)明的抑制劑局部給予要實施處置的區(qū)域。例 如，手術中的局部注入、導管的應用、或者編碼本發(fā)明的肽的DNA通過 靶基因傳遞而給予。對對象給予本發(fā)明的抑制劑，可以是在器官移植之前，也可以是器 官移植的同時，或者是器官移植之后。給予抑制劑可以是一次，也可以 是連續(xù)給予。對由生物體摘除或排出的生物體的 一部分給予時，可以使本發(fā)明的 抑制劑與生物體的 一部分"接觸"。本發(fā)明中，"接觸"按照生物體的狀態(tài)進行。例如，可以是將本抑制 劑散布到生物體的一部分上、或者將本抑制劑添加到生物體的一部分的 破碎物中，但并不限于這些方法。生物體的一部分為培養(yǎng)細胞時，通過 將本抑制劑添加到該細胞的培養(yǎng)液中、或者將含有本發(fā)明的寡核苷酸的DNA導入到構成生物體的一部分的細胞中，由此可進行上述"接觸"。 實踐本發(fā)明的方法時，本發(fā)明的抑制劑可以與至少 一 種已知的化學療法制劑一起，作為藥學組合物的一部分給予。或者是本發(fā)明的抑制劑與至少一種已知的免疫抑制劑同時給予。在一種方案中，可以將本發(fā)明的抑制劑和已知的化學療法制劑實質上同時給予。本發(fā)明的抑制劑還可以在胰島移植后對移植了胰島的部位進行給予，也可以與胰島同時對靶進行給予。還可以是對于移植前的胰島進行體外給予。本發(fā)明中，"抑制移植胰島障礙"是指抑制所移植的胰島的障礙、提 高存活率。另外，"抑制移植胰島障礙"也包含抑制與移植相伴隨的自然 免疫應答(自然免疫応答)。是否抑制了移植胰島障礙，這可按照實施例所述方法，通過測定生 物體中的血糖值來進行。例如，血糖值的測定可以由眶靜脈竇(orbital sinus)采血，分離血漿后通過貝克曼葡萄糖分析儀(Beckman Glucose Analyzer)進行。通過給予本發(fā)明的移植胰島障礙抑制劑而表現出血糖值持續(xù)降低 時，可以視為移植胰島障礙得到抑制。結果胰島的存活提高時，也可以 視為是在胰島移植中"移植胰島障礙得到抑制"。胰島的存活可通過糖尿 病受體的血糖值在移植后是否正常來判定。例如，在本發(fā)明的實施例的 對照組中，移植了可由一只供體分離的200個胰島時，持續(xù)維持高血糖， 可將這種情況下的存活率視為0%。另外，在本發(fā)明的實施例的IL-6受體 抗體給予組中，移植了與對照組同等數量的胰島，但所有受體的血糖正 常，這時的存活率可視為100%。本說明書中引用的所有現有技術文獻可作為參照引用到本說明書中。實施例以下，通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些 實施例。[實施例l]對于給予抗IL-6受體抗體的同種同體胰島移植中的移植 胰島障礙抑制效果的研究。將鏈脲菌素(180mg/kg)靜脈內給予雄性C57BL/6小鼠，制作糖尿 病受體小鼠。鏈脲菌素是選擇性破壞langerhans島的藥物，給予一次即可 以使大部分B細胞脫落，引發(fā)I型糖尿病。未移植胰島時，所有的小鼠均持續(xù)高血糖(圖1)。在給予鏈脲菌素3 5 天后，將小鼠分離胰島經門靜脈移植到同種同體糖尿病小鼠的肝內。胰 島是通過膠原酶法從供體胰島中分離的?？捎梢恢恍∈笠认俜蛛x的胰島數是200個。以2只量的胰島、即400 個作為供體時，移植后糖尿病受體的血糖正常，可以治療糖尿病(圖2)。本實施例中，血糖值的測定是由眶靜脈竇采血，血漿分離后通過貝 克曼葡萄糖分析儀進行。但是，移植一只量的胰島、即200個時，血糖值不正常，受體保持 高血糖(圖3)。移植200個胰島，在移植后將500嗎抗IL-6受體抗體(MR16-1)腹腔內 給予三次(第l天、2天后、4天后)，所有的受體的血糖值在移植后恢復正 常(圖4)。給予一次等量的抗IL-6受體抗體時，3/4恢復正常血糖(圖5)。給 予一次200 jxg抗IL-6受體抗體時，1/3恢復正常血糖(圖6)。由以上結果顯示，抗IL-6受體抗體減輕了移植胰島障礙，帶來胰島 存活的改善，可以糾正受體的高血糖。即，抗IL-6受體抗體可用作同種 同體胰島移植(isografts)的移植胰島障礙抑制劑。[實施例2]給予抗IL-6受體抗體的抑制炎癥性細胞因子生成的效果 的研究通過流式細胞儀評價法對通過給予本發(fā)明的抗IL-6受體抗體是否可 抑制移植后浸潤細胞的炎癥性細胞因子的生成進行了研究。向鏈脲菌素糖尿病小鼠肝內移植200個同種同體胰島，6小時后使動 物死亡，摘除肝臟，分離肝單核細胞，通過流式細胞儀進行分析(圖7)。未處置小鼠(naive)未見肝臟內單核細胞的IFN-y、 TNF-a的生成。在 未給予IL-6受體抗體的對照組中，肝臟內單核細胞的IFN-y和TNF-a的生 成增強。移植時給予一次IL-6受體抗體(ip， 200 pg/注射/小鼠)的小鼠中， 未見肝臟內單核細月包的IFN-y和TNF-a的生成。由此可知，通過給予IL-6 受體抗體，可抑制炎癥性細胞因子的生成，可防止移植胰島障礙。[實施例3]給予抗IL-6受體抗體的同種異體胰島移植中移植胰島障 礙抑制效果的研究。將鏈脲菌素(180mg/kg)靜脈內給予雄性C57BL/6小鼠，制作糖尿 病受體小鼠。在給予鏈脲菌素3 5天后，將小鼠分離胰島經門靜脈移植 到同種異體糖尿病小鼠(BALB/c)的肝內。胰島是通過膠原酶法由供體胰 臟分離的。血糖值的測定與實施例l同樣進行。移植200個胰島、將500 pg抗IL-6受體抗體(MR16-l)在移植后給予3 次(第1天、2天后、4天后)、以及在第l次給予抗IL-6受體抗體的同時腹 腔內給予1次200 pg抗CD4抗體，則所有受體的血糖值在移植后恢復正常 (圖IO)。另一方面，只將500 ng對照抗體(大鼠IgG)(圖8)、或200嗎抗CD4 抗體(圖9)給予同樣的次數時，所有'J、鼠均持續(xù)高血糖。由以上結果顯示，在同種異體移植中，抗IL-6受體抗體可以減徑移 植胰島障礙，改善胰島存活，糾正受體的高血糖。即，抗IL-6受體抗體 可用作同種異體胰島移植的移植胰島障礙抑制劑。產業(yè)實用性通過本發(fā)明的移植胰島障礙抑制劑和方法，可以使胰島移植中胰島 的存活提高，使用更少的供體胰島即可以有效地進行糖尿病治療。目前為止，對由腦死亡供體或心臟停止供體的胰臟中分離的胰島進 行移植時，發(fā)生胰島功能障礙，移植物存活率低，因此，對于l個受體 必須有從2 3人的供體的胰臟中分離的胰島。通過使用本發(fā)明的移植胰 島障礙抑制劑，可降低l個受體所需的胰島數，可以使更多的受體接受 胰島移植治療。最近，關于切除健康活體供體的胰臟的一部分、分離純化胰島、移 植到糖尿病患者中的活體胰島移植也有成功的例子報道，通過使用本發(fā) 明的移植胰島障礙抑制劑，可以建立對供體的更低侵襲的治療方法。
權利要求
1.胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑，該抑制劑含有IL-6抑制劑作為有效成分。
2. 權利要求l所述的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，IL-6抑制 劑是識別IL-6的抗體。
3. 權利要求l所述的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，IL-6抑制 劑是識別IL-6受體的抗體。
4. 權利要求2或3所述的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，抗體 是單克隆抗體。
5. 權利要求2 4中任一項所述的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于， 抗體是人IL-6的抗體或人IL-6受體的抗體。
6. 權利要求2 5中任一項所述的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于， 抗體是重組型抗體。
7. 權利要求6所述的移植胰島障礙抑制劑，其特征在于，抗體是嵌 合抗體、人源化抗體或人抗體。
8. 權利要求1 7中任一項所述的移植胰島障礙抑制劑，該抑制劑用 于沖唐尿病的治療。
9. 抑制對象中的移植胰島障礙的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給 予進行胰島移植的對象的步驟。
10. 使對象的胰島的存活提高的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給 予進行胰島移植的對象的步驟。
11. 權利要求9或10所述的方法，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6 的抗體。
12. 權利要求9或10所述的方法，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。
13. 權利要求11或12所述的方法，其特征在于，抗體是單克隆抗體。
14. 權利要求ll 13中任一項所述的方法，其特征在于，抗體是人IL-6 的抗體或人IL-6受體的抗體。
15. 權利要求11 14中任一項所述的方法，其特征在于，抗體是重 組型抗體。
16. 權利要求15所述的方法，其特征在于，抗體是嵌合抗體、人源 化抗體或人抗體。
17. IL-6抑制劑在制備胰島移植中的移植胰島障礙抑制劑中的應用。
18. 權利要求17所述的應用，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。
19. 權利要求17所述的應用，其特征在于，IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。
20. 權利要求18或19所述的應用，其特征在于，抗體是單克隆抗體。
21. 權利要求18 20中任一項所述的應用，其特征在于，抗體是人IL-6 的抗體或人IL-6受體的抗體。
22. 權利要求18 21中任一項所述的應用，其特征在于，抗體是重 組型抗體。
23. 權利要求22所述的應用，其特征在于，抗體是嵌合抗體、人 源化抗體或人抗體。
全文摘要
本發(fā)明人對于抗IL-6受體抗體在抑制胰島移植中的移植胰島障礙的效果進行了研究。結果，抗IL-6受體抗體減輕了移植胰島障礙，改善胰島存活，糾正受體的高血糖。另外，明確了通過給予本發(fā)明的抗IL-6受體抗體，移植后浸潤細胞的炎癥性細胞因子的生成受到抑制。即，本發(fā)明中，本發(fā)明人首次發(fā)現通過抗IL-6受體抗體可以抑制胰島移植時的移植胰島障礙。
文檔編號A61K39/395GK101330929SQ200680047109
公開日2008年12月24日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權日2005年10月14日
發(fā)明者安波洋一 申請人:學校法人福岡大學;中外制藥株式會社