專利名稱：：具有可調(diào)整性質(zhì)的人造生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于修復(fù)和/或替換個(gè)體中受損組織的人造生物材料和組織等效植入物的制造方法，以及由該方法生產(chǎn)的生物材料和植入物。
背景技術(shù)：
：多數(shù)連接組織的機(jī)械性質(zhì)(也就是功能性質(zhì))取決于纖維蛋白膠原及其三維結(jié)構(gòu)。因?yàn)楝F(xiàn)代西方人中多數(shù)慢性的，與年齡有關(guān)的運(yùn)動(dòng)外科和外傷損傷都跟這些連接組織有關(guān)，膠原功能的損壞據(jù)說(shuō)代表影響生活質(zhì)量和靈活性的重要臨床因素。因此，組織工程學(xué)和再生藥物的主要新發(fā)展中的大部分都集中在膠原結(jié)構(gòu)的重建或誘導(dǎo)再生(R.A.Brown,ini^wre^rafeg^7!wwe朋d(9rgawie//ace淤ewf(Eds:J.M.Polak,L.L.Hench，P.Kemp),WorldScientificPublishing,Singapore(2002)48;R.A.Brownetalffoz^"e/.(1997)5212)。限制治療進(jìn)展的關(guān)鍵因素是對(duì)細(xì)胞如何調(diào)節(jié)膠原原纖維結(jié)構(gòu)和特定的原纖維直徑缺乏了解。原纖維結(jié)構(gòu)(就任何纖維材料而言)對(duì)膠原結(jié)構(gòu)的材料性質(zhì)是重要的。目前，甚至連簡(jiǎn)單的、部分功能(復(fù)制)組織的重組的所有治療方法都使用細(xì)胞活性去改造膠原結(jié)構(gòu)(M.Eastwoodetal,Cel.Motil.Cytoskel.19984013;D.H,g，etalAnn.Biomed.Eng.1993W289)。這P艮制了移植組織在體內(nèi)修復(fù)期間和在體外生長(zhǎng)期間的組織工程。這種缺乏了解也限制了疾病的新的治療方法或病人體內(nèi)失敗的修復(fù)過(guò)程的發(fā)展。例子是關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)一肌肉損傷/退化、肌一鍵受損和老化、創(chuàng)傷后的低再生能力或組織壞死或外科切除(比如腫瘤手術(shù))。組織工程學(xué)的一個(gè)重要問(wèn)題仍是在不使用細(xì)胞的情況下，不能控制或影響組織材料的性質(zhì)以產(chǎn)生特定式樣的膠原原纖維結(jié)構(gòu)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)壓縮膠原凝膠施加多循環(huán)拉伸載荷會(huì)使膠原原纖維融合入壓縮凝膠。該融合在不涉及細(xì)胞的情況下導(dǎo)致材料性質(zhì)的改進(jìn)。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種生產(chǎn)生物材料的方法，包含(i)塑性壓縮膠原凝膠，(ii)對(duì)壓縮凝膠施加單軸拉伸載荷，(iii)移除所述的載荷，和；(iv)重復(fù)步驟(ii)和(iii)以產(chǎn)生所述的生物材料。重復(fù)循環(huán)載荷增加壓縮凝膠中膠原原纖維的融合，以產(chǎn)生具有改進(jìn)的材料強(qiáng)度(也就是增加的斷裂應(yīng)力、斷裂應(yīng)變和/或彈性系數(shù))的生物材料。得到的生物材料例如可以用來(lái)生產(chǎn)組織等效植入物。凝膠中原纖維的融合的增加可以導(dǎo)致原纖維直徑的增加或原纖維網(wǎng)狀物的數(shù)量、尺寸和/或交叉吻合的緊密性的增加。用于本發(fā)明的膠原凝膠包含膠原原纖維基質(zhì)，所述膠原原纖維在隙間液體周圍形成連續(xù)的網(wǎng)狀物。制備膠原凝膠的方法在本領(lǐng)域中是已知的。比如，先將三螺旋膠原單體溶解在稀酸中，然后誘導(dǎo)其聚合(聚集)成原纖維(比如在37。中性pH下)。當(dāng)原纖維聚合時(shí)，會(huì)發(fā)生相變且所述的原纖維固體網(wǎng)狀物"支撐"剩下的大約相同體積和形狀的隙間液體一也就是說(shuō)它成膠化。從可溶單體到固體聚合物的相轉(zhuǎn)移是凝膠的特性。這里描述的膠原凝膠不同于通過(guò)預(yù)聚合的原纖維或其他不溶膠原原纖維的聚合體形成的"海綿"，也不同于通過(guò)變性的膠原比如明膠制得的凝膠。膠原原纖維可以是任何天然原纖維形成的膠原類型，包括膠原類型I、n、in、v、vi、vn、ix和xi以及它們(比如i、ni、v或n、ix、XI等)的組合。優(yōu)選地，所述膠原原纖維是膠原類型I、II或III。比如，原纖維可以是膠原類型I原纖維。隙間液體通常是水溶液，雖然其他有機(jī)溶液可以被用于某些無(wú)生命的應(yīng)用中。比如，所述液體可以是有溶質(zhì)的水，所述溶質(zhì)比如是溶于其中的鹽和蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，所述隙間液體是適于細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在一些實(shí)施例中，膠原凝膠可以是非細(xì)胞的和不含活細(xì)胞的。在其他實(shí)施例中，凝膠可以包含活細(xì)胞，其可以，比如，使制得的生物材料具有組織功能性，且提供用于替換或促進(jìn)內(nèi)源性組織修復(fù)的結(jié)構(gòu)。比如，凝膠可以包含一種或多種肌細(xì)胞從而提供有收縮性的結(jié)構(gòu)，脈管和/或神經(jīng)細(xì)胞從而提供傳導(dǎo)元件，代謝活性的分泌細(xì)胞，比如肝細(xì)胞、激素合成細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰島細(xì)胞或腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞從而提供分泌結(jié)構(gòu)，干細(xì)胞，比如成熟組織源性(比如骨髓)或胚胎干細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、(和兩者的結(jié)合層)，許旺細(xì)胞(Schwanncell)或其他用于神經(jīng)植入物的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，用于脈管結(jié)構(gòu)的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，用于膀胱/尿道結(jié)構(gòu)的尿路和平滑肌細(xì)胞，及用于骨和腱結(jié)構(gòu)的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和腱細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，種入凝膠內(nèi)的細(xì)胞可以包含纖維原細(xì)胞。細(xì)胞可以以任何排列形式間隙地分布在凝膠內(nèi)。比如，細(xì)胞可以均勻地分布在整個(gè)凝膠中，或分布在凝膠內(nèi)規(guī)定的帶、區(qū)域或?qū)?。?yōu)選在壓縮前將細(xì)胞種入凝膠中，比如先將它們和液體膠原混合，比如在每ml中至少有1x105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度下，然后根據(jù)已知的技術(shù)讓膠原凝固成凝膠。優(yōu)選在合適的溫度、pH、離子強(qiáng)度和剪力的條件下種入膠原基質(zhì)，以使其在凝膠形成前保持生命力。細(xì)胞在凝膠中可以被孵化24小時(shí)或更少、12小時(shí)或更少、6小時(shí)或更少、3小時(shí)或更少、或l小時(shí)或更少，優(yōu)選壓縮前孵化0到2小時(shí)。如本發(fā)明所描述的塑性壓縮膠原凝膠，使凝膠原纖維緊密接近并促進(jìn)原纖維融合。凝膠的塑性壓縮包括使凝膠變形以減小其體積，這樣，即使在移除壓縮原因后，凝膠能保持或基本上保持它的新體積。膠原凝膠的塑性壓縮減小膠原原纖維之間的距離，且增加相鄰原纖維之間的接觸點(diǎn)數(shù)量。塑性壓縮是一個(gè)快速的細(xì)胞獨(dú)立過(guò)程，其是凝膠經(jīng)受物理處理，比如使隙間液體從凝膠中排出的外力或壓力的結(jié)果。塑性壓縮與細(xì)胞驅(qū)動(dòng)收縮的慢過(guò)程不同，細(xì)胞驅(qū)動(dòng)收縮是通過(guò)凝膠中細(xì)胞生長(zhǎng)的固有動(dòng)作而發(fā)生的，也就是說(shuō)塑性壓縮是非細(xì)胞介導(dǎo)的，且不是通過(guò)凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞動(dòng)作而發(fā)生的。凝膠的壓縮，比如通過(guò)擠壓，可以引起凝膠的一種或多種尺寸減少至少5倍，至少10倍或至少20倍。一種或多種尺寸可以被減少500倍或更少、300倍或更少、200倍或更少、150倍或更少、或100倍或更少。在優(yōu)選的實(shí)施例中，通過(guò)壓縮來(lái)減小凝膠的厚度。比如，通過(guò)塑性壓縮，凝膠的體積可以被減少50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、99%或更多、.或99.9%或更多。發(fā)生塑性壓縮的時(shí)間要比發(fā)生細(xì)胞驅(qū)動(dòng)收縮所需的時(shí)間短，且可以根據(jù)使用的壓縮方法和條件來(lái)改變。比如，壓縮可以發(fā)生在少于12小時(shí)內(nèi)、少于6小時(shí)內(nèi)、少于3小時(shí)內(nèi)、少于1小時(shí)內(nèi)、少于30分鐘內(nèi)或少于10分鐘內(nèi)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，凝膠可以被壓縮2分鐘或更少，或l分鐘或更少。凝膠的塑性壓縮可以跟間隙液體從凝膠中的損失或去除有關(guān)聯(lián)。比如，通過(guò)塑性壓縮從凝膠中損失或去除的液體量可以是凝膠原始液體量的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%、或至少99.9%。可以通過(guò)任何簡(jiǎn)便的方法或方法的結(jié)合來(lái)塑性壓縮凝膠。用于膠原凝膠塑性壓縮的合適技術(shù)和規(guī)約被記載在PCT/GB2005/002631中。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，可以對(duì)凝膠施加機(jī)械力，比如壓縮力。為了達(dá)到所需的壓縮作用而作用于凝膠的壓縮力的量取決于特定的環(huán)境，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定壓縮力的量。比如，合適的壓縮力可以是O.1到ION，比如1N。優(yōu)選地，凝膠在經(jīng)受壓縮力時(shí)是無(wú)限制的?？梢允褂萌魏卧谀z上作用壓縮力的適當(dāng)方法。比如，可以通過(guò)一種或多種以下方式對(duì)凝膠施加靜態(tài)載荷(比如靜重)，通過(guò)水力、凸輪或讓凝膠通過(guò)滾筒的方法來(lái)施加載荷。在一些實(shí)施例中，流體壓力水化膨脹可以被用于壓縮膠原凝膠。在一些實(shí)施例中，在循環(huán)載荷前，壓縮凝膠的原纖維可以是無(wú)序的，且處于隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)排列，并在任何一維上都沒(méi)有對(duì)準(zhǔn)。循環(huán)載荷通過(guò)增加交叉吻合的數(shù)量、尺寸和緊密性來(lái)增加原纖維網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)度，所述循環(huán)載荷可以被用來(lái)生產(chǎn)基本同向性的生物材料。在其他實(shí)施例中，在循環(huán)載荷前，壓縮的凝膠原纖維可以部分地或全部地對(duì)準(zhǔn)。比如，原纖維可以在一個(gè)維度內(nèi)對(duì)準(zhǔn)或取向(比如對(duì)準(zhǔn)或平行層、或在每個(gè)層中隨機(jī)定向的原纖維平面)或，更優(yōu)選地，在兩個(gè)維度中對(duì)準(zhǔn)(也就是對(duì)準(zhǔn)或平行層，或在每個(gè)層中對(duì)準(zhǔn)或平行的原纖維平面)。利用任何簡(jiǎn)便的技術(shù)使膠原原纖維對(duì)準(zhǔn)。許多合適的技術(shù)在本領(lǐng)域中已經(jīng)公知。比如，夾住凝膠的端部，并在夾住的端部之間施加單軸應(yīng)變(seeforexampleM.Eastwoodetal，Ce/.Afo"/.C;^osA:e/.(1998)4013;Muderaetal(ibid)2000;andMarenzanaetalExp.Cell.Res.(Inpress));凝膠可以受到剪切力并成角度膠化(Elstow&Bard.J.Biol.Chem.1976);或者膠原原纖維可以在超強(qiáng)磁場(chǎng)下膠化(KotaniH,etal(2000)J.App.Phys876191-3,TorbetJetalBiochemJ.(1984)219:1057,GuidoSetalJ.Cell,Sci.105:317(1993))。載荷循環(huán)期間施加的張力可以使原纖維充分對(duì)準(zhǔn)。作為選擇，張力可以在循環(huán)載荷(步驟ii)前作為單獨(dú)步驟作用于凝膠。比如，在循環(huán)載荷前將靜態(tài)單軸張力作用于凝膠，其可以使得壓縮凝膠受到5-50%單軸應(yīng)變，優(yōu)選10-30%或20-25%單軸應(yīng)變，這樣可以使膠原原纖維和種子細(xì)胞(如果存在)向著主應(yīng)變方向成平行取向排列。單個(gè)定位張力的載荷速度可以比循環(huán)載荷的速度快。在一些實(shí)施例中，單個(gè)定位張力的載荷速度足夠高以促使凝膠塑性形變?？梢栽谀z塑性壓縮之前或之后施加張力，但優(yōu)選在塑性壓縮之前施加?；蛘?，可以在塑性壓縮期間施加張力，比如在塑性壓縮過(guò)程的起始階段或在經(jīng)過(guò)部分壓縮過(guò)程后(比如20到60%壓縮過(guò)程)，然后所述張力回到塑性壓縮態(tài)，這樣由拉伸應(yīng)變引起的原纖維排列被固定在凝膠中，得到對(duì)準(zhǔn)的緊密的復(fù)合材料。膠原原纖維塑性壓縮和任選地排列或定向之后，膠原凝膠可以受到多次循環(huán)拉伸載荷。該循環(huán)載荷引起凝膠中的膠原原纖維相對(duì)于彼此移動(dòng)，并使相鄰原纖維的表面電荷基序?qū)R，從而使原纖維融合。膠原凝膠中相鄰原纖維的融合會(huì)導(dǎo)致形成凝膠直徑增加的原纖維。載荷方向(也就是載荷矢量)可以確定凝膠中的哪些原纖維直徑增加，因?yàn)榕c載荷軸平行的原纖維增加的直徑要比與載荷軸垂直的原纖維增加的直徑多。在凝膠原纖維被預(yù)先對(duì)準(zhǔn)的實(shí)施方式中，載荷方向優(yōu)選與原纖維排列方向相對(duì)應(yīng)。每個(gè)循環(huán)張力包含載荷階段和空載階段，在載荷階段中單軸拉伸載荷被施加于壓縮凝膠，在空載階段中拉伸載荷被移除。每個(gè)載荷循環(huán)的載荷階段可以包含變速載荷期，和任意的應(yīng)力松弛期。在變速載荷期，施加于凝膠的載荷逐漸地增加到預(yù)先確定的值。在應(yīng)力松弛期，施加于凝膠的載荷則可以維持在預(yù)先確定的值。施加于凝膠的載荷優(yōu)選以一定速度增加，這樣使得引起的形變是粘彈性的且臨時(shí)性的(也就是非塑性形變)。比如，該載荷可以在l分鐘或更長(zhǎng)、5分鐘或更長(zhǎng)、IO分鐘或更長(zhǎng)、15分鐘或更長(zhǎng)、或30分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)增加或增速。合適的載荷速度包括10%應(yīng)變/分鐘或更少、5%應(yīng)變/分鐘或更少、4%應(yīng)變/分鐘或更少、3%應(yīng)變/分鐘或更少、2%應(yīng)變/分鐘或更少、1%應(yīng)變/分鐘或更少。上述的對(duì)凝膠施加拉伸載荷的方法是本領(lǐng)域公知的(seeforexample,M.Eastwoodetal,Ce〃.Mo"/.Q;^^e/.(1998)4013)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，可以?shī)A住膠原凝膠的端部，并在夾住的端部之間施加單軸載荷。其他合適的方法包括磁拉力、滲透作用、壓縮、流體水化膨脹和流體剪切。當(dāng)對(duì)顆粒、泡囊、小球或粉末形式的膠原凝膠施加拉伸載荷時(shí)，流體剪切特別的有用。流體流動(dòng)也對(duì)壓縮膠原凝膠施加載荷時(shí)有用，比如包含壓縮膠原凝膠的管狀結(jié)構(gòu)，所述管狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞膨脹核成螺旋形或巻形。膨脹核可以包含一種在水合時(shí)膨脹或溶脹的組分，例如凝膠形成劑，具有大量膨脹壓力的帶電物質(zhì)，如透明質(zhì)酸、淀粉、葡聚糖、殼聚糖和糖胺多糖，所述糖胺多糖如軟骨素硫酸鹽、角蛋白硫酸鹽和肝素。水合所述的核(比如通過(guò)潤(rùn)濕)使其膨脹，從而對(duì)周圍膠原施加拉伸載荷。當(dāng)溶脹核材料分解或擴(kuò)散開(kāi)后，移除或驅(qū)散載荷，留下一個(gè)被壓縮膠原層環(huán)繞的中心通道。循環(huán)載荷可以被施加在上面描述的結(jié)構(gòu)上以促進(jìn)縱向原纖維融合或者，做為選擇，通過(guò)施加搏動(dòng)流體流過(guò)中心通道的方法促進(jìn)周圍原纖維融合。循環(huán)載荷的合適拉伸載荷可以使凝膠受到至少5%、10%、15%或20%應(yīng)力，及達(dá)到30%、40%或50%應(yīng)力。通常地，合適的拉伸載荷可以使凝膠受到20%應(yīng)力。在一些實(shí)施例中，可以使用低于凝膠斷裂應(yīng)變的5%的拉伸載荷。在一些實(shí)施例中，當(dāng)拉伸載荷達(dá)到預(yù)先確定值后，在載荷循環(huán)的空載階段中可以逐漸減少或移除拉伸載荷。在其他實(shí)施例中，載荷循環(huán)的載荷階段可以進(jìn)一步包含應(yīng)力松弛期，在該松弛期預(yù)先確定值的載荷被連續(xù)地作用于凝膠，其持續(xù)的時(shí)期為10秒或更多、30秒或更多、l分鐘或更多、5分鐘或更多、IO分鐘或更多、15分鐘或更多、或30分鐘或更多。載荷階段之后，可以將拉伸載荷從載荷循環(huán)的空載階段中的凝膠移除。載荷循環(huán)的空載階段可以包含變速空載期，在變速空載期，逐漸地移除作用于凝膠的拉伸載荷。拉伸載荷優(yōu)選以一定速度減少，所述速度足以使凝膠回到它的初始形狀，并且該速度在載荷期間可以根據(jù)材料密度和剛性來(lái)改變。比如，載荷可以在1分鐘或更多、5分鐘或更長(zhǎng)、10分鐘或更長(zhǎng)、或15分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)減少或減速。合適的空載速度包含10%應(yīng)力/分鐘或更少、5%應(yīng)力/分鐘或更少、4%應(yīng)力/分鐘或更少、3%應(yīng)力/分鐘或更少、2%應(yīng)力/分鐘或更少、1%應(yīng)力/分鐘或更少。可選地，在移除或減少拉伸載荷后，空載階段也可以包含松弛期，在松弛期所述凝膠被維持在空載或處在減少的載荷下。例如，凝膠可以被維持在松弛狀態(tài)(比如空載或基本上空載)下IO秒或更長(zhǎng)、30秒或更長(zhǎng)、1分鐘或更長(zhǎng)、5分鐘或更長(zhǎng)、IO分鐘或更長(zhǎng)、15分鐘或更長(zhǎng)、或30分鐘或更長(zhǎng)。在移除或減少壓縮凝膠的拉伸載荷和可選的松弛期后，可以在下一個(gè)載荷循環(huán)的載荷階段逐步地增加載荷。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，合適的載荷循環(huán)可以包括5分鐘內(nèi)變速載荷達(dá)到預(yù)先確定的值，如20%，例如在4%/分鐘的穩(wěn)定速度下，20%應(yīng)力的應(yīng)力松弛維持5分鐘，然后是5分鐘內(nèi)變速空載，例如在4%/分鐘的穩(wěn)定速度下達(dá)到空載狀態(tài)，在下一個(gè)循環(huán)載荷前維持所述空載狀態(tài)5分鐘。載荷循環(huán)(也就是步驟(ii)和(iii))可以重復(fù)2次或更多次、10次或更多次、50次或更多次、IOO次或更多次、或200次或更多次。_所述載荷和空載階段可以以一定的速度重復(fù)，所述速度可以是每小時(shí)0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，載荷循環(huán)可以以每小時(shí)少于IO次循環(huán)的速度重復(fù)?？梢哉J(rèn)為，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)任何給定的時(shí)間的膠原凝膠的剛性和所需精密生物材料的性質(zhì)來(lái)改變載荷循環(huán)的數(shù)量、循環(huán)的速度和每個(gè)循環(huán)的參數(shù)(比如，載荷的數(shù)量、載荷的速度、和載荷、空載階段的長(zhǎng)度)。在一些實(shí)施例中，例如，載荷和空載的參數(shù)可以在整個(gè)載荷循環(huán)中保持恒定。在其他實(shí)施例中，在載荷循環(huán)期間可以簡(jiǎn)便地改變載荷和空載的參數(shù)。例如，在載荷循環(huán)期間改變循環(huán)率，如增加或減少循環(huán)率；特別是當(dāng)壓縮凝膠的剛性增加時(shí)增加速度。同樣地，作用于凝膠的應(yīng)力可以逐漸地增加。例如，在一些實(shí)施例中，初始載荷循環(huán)可以在低速度高應(yīng)力下進(jìn)行(比如，20-30%,3-30次循環(huán)/小時(shí))，隨后是持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間的高速度低應(yīng)力的循環(huán)(比如，5%應(yīng)力，50-100次循環(huán)/小時(shí))。壓縮凝膠也可以經(jīng)受平緩的循環(huán)、慢壓縮或流體剪切以改進(jìn)或修飾表面性質(zhì)。在細(xì)胞實(shí)施例中，優(yōu)選地，在這里描述的整個(gè)方法中將壓縮凝膠維持在生理環(huán)境下(如溫度、pH、水合和離子強(qiáng)度)以保持細(xì)胞存活。為了減少與干燥有關(guān)的細(xì)胞死亡和/或損害，凝膠可以在水溶液中被壓縮和經(jīng)受循環(huán)載荷，比如在培養(yǎng)基中，如DMEM，Ham，s或Eagle's培養(yǎng)基或生理緩沖液，所述生理緩沖液比如是適當(dāng)溫度下的Ringer's或PBS，所述溫度比如是5'C到37°C。在非生命的或非細(xì)胞的實(shí)施例中，壓縮凝膠不需要保存在生理環(huán)境下，且可以使用任何塑性壓縮和循環(huán)載荷的方法及任何與框架基質(zhì)相容的溶劑，包括那些改變凝膠流體的離子性質(zhì)的溶劑，所述方法如滲透方法。通過(guò)改變膠原凝膠中單個(gè)成分的比率(比如是XV/V)、壓縮參數(shù)以及載荷循環(huán)的數(shù)量和參數(shù)來(lái)調(diào)整本發(fā)明方法制得的生物材料的性質(zhì)，以用于特定的用途或應(yīng)用。例如，通過(guò)改變膠原比例來(lái)改變生物材料的強(qiáng)度，通過(guò)改變循環(huán)載荷來(lái)改變膠原原纖維的直徑，通過(guò)改變細(xì)胞比例來(lái)改變生物材料的細(xì)胞活性，和/或通過(guò)改變微通道的存在與否或數(shù)量來(lái)改變生物材料的灌注性質(zhì)。經(jīng)過(guò)此處描述的循環(huán)載荷改進(jìn)了原纖維直徑和機(jī)械性質(zhì)的壓縮膠原可以用作生物材料，比如適合用于制造組織等效植入物的仿生材料和人造生物材料。通過(guò)本方法得到的生物材料可以是任何便利形式，例如，可以是片、環(huán)、螺旋管、毛細(xì)管、條帶、塊、管、顆粒、或巻形物。在一些實(shí)施例中，本方法制得的生物材料可以在無(wú)需額外加工的情況下用作組織等效植入物，所述組織等效植入物用于修復(fù)或替換受損組織。在其他實(shí)施例中，可以進(jìn)行生物材料的額外加工來(lái)生產(chǎn)用于修復(fù)或替換受損組織的組織等效植入物。例如，可以鑄模和/或塑造生物材料以生產(chǎn)組織等效植入物。生物材料可以被模制成預(yù)先確定的形狀和/或可以經(jīng)受進(jìn)一步的塑性壓縮。塑性壓縮可以是對(duì)稱的或不對(duì)成的。生物材料可以鑄模和/或塑造成任何便利的植入物形式，例如，小片、塊、管、帶、條帶、環(huán)、螺旋管、毛細(xì)管、巻形物、片或線。組織等效植入物的最終形狀取決于其將被使用的特定環(huán)境。在一些實(shí)施例中，組織等效植入物可以具有適于進(jìn)一步成形的易彎形式。本方法制得的生物材料片或條帶可以巻起來(lái)或折疊以形成多層結(jié)構(gòu)，比如巻形物。所述的巻形或折疊形的多層結(jié)構(gòu)可以被直接用作組織等效植入物，或根據(jù)需要被進(jìn)一步的切割、成形或模鑄。在一些實(shí)施例中，可以進(jìn)一步塑性壓縮所述結(jié)構(gòu)以使所述層粘在一起，以達(dá)到所需的尺寸規(guī)格、增加細(xì)胞密度或改進(jìn)其他性質(zhì)。對(duì)此，PCT/GB2005/002631中有更詳細(xì)的記載。所述塑性壓縮允許3-維的組織等效植入物快速安裝，比如可以是外科醫(yī)生從生物材料的一個(gè)或多個(gè)平坦2-維層開(kāi)始進(jìn)行簡(jiǎn)便地操作。本發(fā)明允許快速給予該組織等效物可調(diào)基質(zhì)結(jié)構(gòu)和機(jī)械性質(zhì)(納米/微米級(jí))，且基本上不損害其含有的細(xì)胞。組織等效植入物是一種植入人體以修復(fù)或替換內(nèi)源性組織的材料，所述內(nèi)源性組織比如是受損的或有病的。被組織等效植入物修復(fù)或替換的有病組織的例子包括神經(jīng)、腱、軟管、皮膚、骨、泌尿生殖器官、肝、心肺組織、腎、眼組織、血管、腸和腺。有病或受損的組織比如可以由關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)肌肉受損/退化、肌肉一腱受損和老化、創(chuàng)傷后的低再生能力、組織壞死或外科切除(如腫瘤手術(shù))所產(chǎn)生。如上描述的產(chǎn)生之后，組織等效植入物被迅速植入到個(gè)體、或儲(chǔ)存或經(jīng)受進(jìn)一步的處理以調(diào)節(jié)膠原的精細(xì)性質(zhì)，比如剛性、彈性系數(shù)等。為了減少和/或預(yù)防細(xì)胞死亡或損壞，包含活細(xì)胞的植入物或生物材料在使用前被儲(chǔ)存在可以維持生命力但不支持細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境中。例如，植入物或生物材料被儲(chǔ)存在低溫，如0'C到5"C之間，優(yōu)選4。C。在一些實(shí)施例中，塑性壓縮和循環(huán)載荷后生物材料不經(jīng)過(guò)干燥或脫水，比如加熱、凍干、氣流或真空干燥，因?yàn)槊撍畷?huì)殺死細(xì)胞和破壞生物材料的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供一種由本發(fā)明所述方法制得的生物材料。優(yōu)選，所述生物材料具有相對(duì)于通過(guò)其他方法制得的膠原凝膠或膠原基生物材料更改良的性質(zhì)。例如，生物材料的原纖維直徑增加，材料強(qiáng)度增加，孔徑減小，原纖維交叉點(diǎn)的數(shù)量增加和原纖維交叉點(diǎn)的穩(wěn)定性增加。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供一種組織等效植入物，所述植入物包含本發(fā)明所述方法制得的生物材料，或由本發(fā)明所述方法制得的生物材料組成。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供一種治療個(gè)體內(nèi)受損組織的方法，其包含在所述的受損組織處安裝一個(gè)這里描述的組織等效植入物，以修復(fù)和/或替換所述組織?？梢酝ㄟ^(guò)任何便利的技術(shù)來(lái)安裝植入物。例如，可以縫合或粘合在適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｓ蛇@里描述的生物材料制成的植入物將采用縫合術(shù)，且甚至在肌肉載荷的情況下也能通過(guò)外科手術(shù)縫合到身體部位。本發(fā)明的相關(guān)方面提供了一種用于治療個(gè)體內(nèi)受損組織的方法的組織等效植入物，以及該組織等效植入物在制備治療受損組織的藥物中的應(yīng)用。個(gè)體內(nèi)受損組織比如可以由關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)肌肉損傷或退化、，肌肉一腱受損和老化、創(chuàng)傷后的低再生能力、組織壞死或手術(shù)切除(如腫瘤手術(shù))所產(chǎn)生。本方法可以在不依賴細(xì)胞的情況下控制和操縱基于膠原的生物材料的組織、結(jié)構(gòu)和原纖維幾何形狀。本方法制得的生物材料可以用作天然組織的定義模型(比如用于研究、教學(xué)、臨床診斷、毒性試驗(yàn))，或作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或人體模型，例如在光學(xué)/光譜顯微鏡、x射線和核磁共振成像監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)定中。本方法可以控制和操縱孔徑，從而也可以控制和操縱生物材料的超濾性質(zhì)。因此由本發(fā)明方法制得的生物材料可以例如用作具有可調(diào)性質(zhì)的過(guò)濾器或用在控制藥物釋放的系統(tǒng)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容后可以容易地得到本發(fā)明的各種其他方面和實(shí)施方式。說(shuō)明書(shū)中提到的所有資料都以引用方式全部合并于此。本發(fā)明包含這里描述的特征的每個(gè)結(jié)合和亞結(jié)合形式。本發(fā)明的特定方面和實(shí)施形式將通過(guò)舉例和參考以下記載的附圖和表格的方式來(lái)說(shuō)明。圖1顯示頻率圖，表示增加循環(huán)次數(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)處理的材料中膠原原纖維直徑分布形式的影響。通過(guò)該處理范圍其平均粒徑增加了將近2倍，且存在于初始凝膠中的最小原纖維種類(15至40nm直徑)已經(jīng)完全消失。圖2顯示一盒子和原纖維直徑分布的晶須圖。盒子表示四分位數(shù)間距(25th到75th百分點(diǎn))，中間的線表示平均值。誤差條表示尺寸的總范圍。圖3顯示平均原纖維直徑隨著載荷循環(huán)數(shù)量的增加而增加的線條圖，表明是逐步地增加且SD在平均值周圍。圖4顯示循環(huán)載荷之后膠原凝膠的平均斷裂強(qiáng)度增加。*=P<0.001圖5顯示循環(huán)載荷后膠原凝膠的應(yīng)力/應(yīng)變關(guān)系，表明載荷樣品的斷裂應(yīng)力和剛性大幅提高(增加梯度)。圖6顯示經(jīng)過(guò)144次循環(huán)載荷的膠原凝膠的平均斷裂強(qiáng)度，空載對(duì)照的膠原凝膠平均斷裂強(qiáng)度和在靜態(tài)張力下孵化跟144次循環(huán)所需時(shí)間一樣長(zhǎng)的時(shí)間的膠原凝膠的平均斷裂強(qiáng)度。如同144次循環(huán)序列，孵化所述的"僅孵化"對(duì)照48小時(shí)，但是沒(méi)有循環(huán)載荷，以測(cè)試自發(fā)的與時(shí)間有關(guān)的穩(wěn)定性(如果有的話)，所述穩(wěn)定性可能以自發(fā)的交聯(lián)的形式發(fā)生于膠原中。該對(duì)照中沒(méi)有觀察到強(qiáng)度的增加，因此也沒(méi)有交聯(lián)的增加，顯示需要循環(huán)載荷。圖7顯示機(jī)械介導(dǎo)膠原原纖維吻合的可能機(jī)制。首先，通過(guò)壓縮[i]使稀疏的原纖維(由自發(fā)單體聚集成凝膠而形成)緊密接觸。該步驟提供了許多原纖維側(cè)面接觸的點(diǎn)，但是相鄰原纖維[ii]在對(duì)齊的"表面電荷"(這里指如EM水平中的原纖維帶型)中接觸點(diǎn)很少。但是，循環(huán)單軸拉伸應(yīng)變的施加使對(duì)齊的相鄰原纖維數(shù)量增加[iii]。彼此接觸且對(duì)齊的原纖維形成穩(wěn)定的吻合，導(dǎo)致接合[iv]和較厚原纖維數(shù)量[v]逐步聚集。重要的是，原纖維直徑以離散原纖維直徑倍數(shù)的方式增加。超微結(jié)構(gòu)分析顯示原纖維融合的所有階段都能在l)啞鈴形2)三葉草形3)喪失(隨著多次循環(huán)逐漸地減少)小原纖維(20-30nm)的較大圓形截面這三類橫截面中找到。在縱剖面中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)原纖維2、3、或4通過(guò)單帶方式并入到大原纖維中的例子。圖8顯示粘附在用于循環(huán)載荷的2個(gè)聚乙烯篩孔浮選桿所附的膠原凝膠。表1說(shuō)明循環(huán)載荷對(duì)壓縮膠原凝膠的機(jī)械性質(zhì)的影響。144次循環(huán)后，斷裂應(yīng)力增加了4.5倍。表2表示凝膠中的膠原原纖維的取向分布。原纖維分成以下幾類(i)橫截面(也就是與施加的主應(yīng)變平行)，(ii)斜截面(也就是成一個(gè)角度)和(iii)縱截面(也就是垂直于應(yīng)變)。具體實(shí)施方式非細(xì)胞膠原凝膠的形成通過(guò)I型膠原的pH滴定法來(lái)制備非細(xì)胞膠原凝膠。為了制備膠原凝膠，將0.3ml的10XEaglesMEM溶液(Gibco,Paisley,UK)和0.3ml的Dulbeccos改良的eagles培養(yǎng)基(Gibco)加入到2.4ml的鼠尾I型膠原中(在醋酸中，蛋白濃度=2.14mg/ml，F(xiàn)irstLink,Birmingham,UK)。用5MNaOH中和該溶液直到觀察到顏色改變?yōu)橹?由黃色變?yōu)閹喸品奂t)(Pmjapati等人.2000WoundRep.Regen.8227-238;Prajapati"a/.2000WoundRep.Regen.8239-247)。在室溫下將膠原凝膠插入井(22mmx33mmx10mm)中30分鐘。塑性壓縮插入之后，用修改后的標(biāo)準(zhǔn)塑性壓縮方法將膠原凝膠壓縮93%，所述修改是由Brown等人在(2005)Adv.Funct.Mater.15,1762-70中所作的。將膠原凝膠放在2張尼龍篩(35mmx70mm)之間，其下層放在不銹鋼篩上，再將不銹鋼篩放在單層WhatmanI級(jí)濾紙上。然后將125g的砝碼放在凝膠頂部5分鐘。隨后將壓縮凝膠切成三個(gè)7mmx33mm的縱向條帶。機(jī)械裝載循環(huán)載荷的施加使用氰基丙烯酸鹽粘合劑膠將膠原凝膠的三個(gè)部分粘到2個(gè)聚乙烯篩孔浮選桿上，然后又將聚乙烯篩孔浮選桿粘到不銹鋼金屬絲A形架上(圖8)。然后將膠原凝膠浸在Earls平衡鹽溶液中(EBSS)(Gibco)，再放入到含有5。/。C02的潤(rùn)濕孵化器中。一個(gè)A形桿被粘到固定點(diǎn)上，另外一個(gè)被粘到力傳感器上，所述的力傳感器能夠監(jiān)測(cè)力和載荷(EastwoodWa/.1996J,CellPhysiol.166:33-42;BrownWa/.(1996)J.CellPhysiol.169:439-447)。計(jì)算機(jī)控制的微步電動(dòng)機(jī)可以使外源的載荷作用在非細(xì)胞膠原凝膠上。建立培養(yǎng)物(t-CFM)壓縮膠原凝膠在兩個(gè)浮選桿之間被鑄型，然后再被粘到不銹鋼金屬絲A型架上(圖8)。這些A型架允許膠原凝膠和t-CFM系統(tǒng)之間有一個(gè)連接器。一個(gè)A型架被固定，另一個(gè)被粘到力傳感器上，所述力傳感器監(jiān)測(cè)力和載荷(Eastwood"a/.1998CellMotilityCytoskel.49:13-21)。通過(guò)'Labview'程序放大、數(shù)字化和處理模擬輸出信號(hào)(NationalInstruments,Berkshire,UK)。計(jì)算機(jī)控制的微步電動(dòng)機(jī)能將外源載荷作用于培養(yǎng)物，所述微步電動(dòng)機(jī)作用于平行于膠原凝膠栓系軸的平面。循環(huán)載荷方式可以使用各種循環(huán)載荷方式，每個(gè)循環(huán)持續(xù)20分鐘(也就是3/3600Hz)。每個(gè)循環(huán)由4個(gè)相等的階段組成(每個(gè)持續(xù)5分鐘)。階段1是20%應(yīng)力的線性應(yīng)用(33mm結(jié)構(gòu)的總位移是6.6mm);階段2是維持20%應(yīng)力；階段3是釋放應(yīng)力；階段4是維持0%應(yīng)力。每個(gè)循環(huán)期間，對(duì)膠原凝膠使用同樣的應(yīng)力?？刂品绞绞鞘褂靡淮窝h(huán)。其他的方式是4小時(shí)(12次循環(huán))、8小時(shí)(24次循環(huán))、16小時(shí)(48次循環(huán))、24小時(shí)(72次循環(huán))和48小時(shí)(144次循環(huán))。處理后直接分析膠原凝膠的原纖維直徑(電子顯微鏡)或準(zhǔn)靜態(tài)拉伸機(jī)械性能。透射電子顯微鏡法使用常規(guī)TEM測(cè)量循環(huán)載荷膠原凝膠中改變的膠原凝膠直徑。在O.IM的磷酸緩沖鹽液(PBS)中沖洗3D膠原凝膠，并在4'C下使其在含有2.5%戊二醛的O.IM磷酸緩沖液中固定1小時(shí)，然后用PBS沖洗兩次，并用含1%四氧化餓的O.IM二甲砷酸鹽緩沖液第二次固定，在室溫下固定1小時(shí)。然后通過(guò)增加丙酮級(jí)數(shù)使樣品脫水，用丙酮環(huán)氧樹(shù)脂CY212樹(shù)脂(l:l)滲透過(guò)夜，當(dāng)新鮮樹(shù)脂完全替換時(shí)通過(guò)兩個(gè)變化來(lái)結(jié)束滲透，每個(gè)變化至少持續(xù)3小時(shí)，并在6(TC下聚合18小時(shí)。使用金剛磚刀從平衡塊上切下超薄切片(80-100mm)，用2%的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色(10分鐘)，并在PhillipsCM12電子顯微鏡下觀察(AgarScientificLtd.,Essex,UK)。圖像分析用于TEM程序的樣品取自固定凝膠的"對(duì)準(zhǔn)"區(qū)，并沿著凝膠的橫斷面切開(kāi)。每個(gè)截面拍攝10張隨機(jī)照片，并用Openlabversion3丄5圖像分析軟件(I即rovision⑧，Coventry,UK)測(cè)量所有被橫切的膠原凝膠的直徑。只有當(dāng)圓形橫截面的Y和X方向相等時(shí)，也就是膠原原纖維是正圓且沒(méi)有從某個(gè)角度被切掉，也沒(méi)有兩個(gè)或多個(gè)原纖維重疊，該測(cè)量方法才有效。統(tǒng)計(jì)學(xué)所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都用GraphpadPrism第4版軟件(GraphpadPrismSoftware,SanDiego,USA)進(jìn)行分析。用Dunnetts多重比較后-測(cè)試法(multiplecomparisonspost-test)對(duì)所有組進(jìn)行單向方差分析。機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試設(shè)計(jì)拔出試驗(yàn)(Pull-outexperiment)來(lái)測(cè)試循環(huán)載荷膠原凝膠的斷裂強(qiáng)度。首先，凝膠被循環(huán)地載荷或留作對(duì)照，然后使用t-CFM將穩(wěn)定的單個(gè)變速載荷作用于凝膠直到它斷裂。然后從應(yīng)力/應(yīng)變曲線算出平均的斷裂力和其它參數(shù)。結(jié)論本發(fā)明所述方法的塑性壓縮(PC)步驟可以有效地促進(jìn)膠原原纖維緊密接近，并互相接觸，從而促使原纖維吻合。圖7顯示了引起(滑動(dòng))融合的載荷的假定機(jī)制。在1到144次載荷循環(huán)之后，通過(guò)PC材料橫剖面(也就是垂直于載荷軸)的電子透射顯微照片來(lái)測(cè)量平均膠原原纖維直徑。由顯微照片(圖1)中原纖維聚集和橫截面直徑增加判斷，發(fā)現(xiàn)增加壓縮膠原薄片的循環(huán)載荷導(dǎo)致逐漸增加纖維間的接觸和側(cè)面融合?？梢钥吹皆w維一原纖維交互作用的形式范圍隨著循環(huán)數(shù)量的增加而變的更加普通。所述增加包括了原纖維對(duì)稱橫截面直徑的簡(jiǎn)單增加、圓形橫截面的增加、"啞鈴"和"三葉草"形狀的增加、所述"啞鈴"和"三葉草"形狀在橫截面中有2個(gè)或3個(gè)部分成階層的原纖維。在該過(guò)程的最早階段可以發(fā)現(xiàn)許多緊密相鄰的原纖維通過(guò)細(xì)橋連接，所述細(xì)橋是電子密集的線材料。直接測(cè)量確定膠原原纖維直徑隨著載荷循環(huán)數(shù)量的增加而清楚的增加。通過(guò)隨機(jī)TEM區(qū)域(每個(gè)樣品IO個(gè)區(qū)域)的圖像分析來(lái)測(cè)量每次處理的3個(gè)重復(fù)膠原樣品的原纖維中值粒徑。原纖維的中值粒徑在1次循環(huán)時(shí)是29土4.6nm，在144次循環(huán)后(P〈0.001)大幅增加(〉2倍)到70±10nm(圖2和圖3)。除12—循環(huán)方式之外，所有測(cè)試組的原纖維中值直徑都比對(duì)照組顯著增加。原纖維直徑的總范圍也隨著循環(huán)的增加而清楚的增加。所述增加通過(guò)減少中值頻率來(lái)表現(xiàn)。然而，當(dāng)循環(huán)增加時(shí)，25"和75"百分?jǐn)?shù)范圍之間沒(méi)有區(qū)別。此外，通過(guò)一系列清楚的步驟來(lái)進(jìn)行的原纖維直徑的增加可以被視為通過(guò)六個(gè)處理組的3個(gè)步驟。在1次和12次循環(huán)(組1)、24次和48次循環(huán)(組2)及96次和144次循環(huán)(組3)之間沒(méi)有明顯的區(qū)別。但是，跟組1相比，組2和組3都逐漸地明顯增加(圖2)。在隨后的載荷循環(huán)中，15-40nm直徑的原纖維完全消失。原纖維直徑的增加主要是由對(duì)稱的、圓形橫截面的原纖維所引起，而不是由增加多葉片結(jié)構(gòu)(這里不將其計(jì)為單個(gè)原纖維)的數(shù)目所引起。這表明改造原纖維橫截面形狀在相當(dāng)大的程度上可以作為吻合過(guò)程的一部分。該結(jié)果與相鄰原纖維之間的連接"股"的出現(xiàn)是一致的，再一次表明表面改造和膠原遷移(圖7)。根據(jù)斷裂應(yīng)力監(jiān)測(cè)循環(huán)載荷結(jié)構(gòu)的機(jī)械性質(zhì)、斷裂應(yīng)變和彈性系數(shù)(圖4到圖6)。圖4顯示機(jī)械強(qiáng)度的增加，當(dāng)增加載荷循環(huán)的數(shù)量時(shí)可以觀察到機(jī)械強(qiáng)度增加。144次循環(huán)的膠原載荷的斷裂應(yīng)力是1次循環(huán)的4.5倍(P<0.001)。雖然48次載荷循環(huán)可以增加平均斷裂應(yīng)力，但是其沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。類似地，48次循環(huán)系數(shù)提高了23%，144次循環(huán)系數(shù)提高了56%，同時(shí)，斷裂應(yīng)變提高到133±35%，增加了2倍。將一系列樣品放在靜態(tài)的20%載荷下孵化48小時(shí)(和144次循環(huán)的時(shí)期相同，但是沒(méi)有循環(huán))。該處理沒(méi)有增加材料的斷裂應(yīng)力(圖6)，事實(shí)上其跟1次循環(huán)的對(duì)照樣品是相同的。因此，機(jī)械強(qiáng)度的增加不單獨(dú)地與孵化時(shí)間關(guān)聯(lián)，但是跟載荷循環(huán)的數(shù)量緊密相關(guān)，結(jié)果是膠原原纖維的直徑增加。對(duì)原纖維材料性質(zhì)的一般理解顯示增加原纖維直徑將增加整個(gè)材料的強(qiáng)度。通過(guò)在載荷的結(jié)尾進(jìn)行準(zhǔn)靜態(tài)拉伸實(shí)驗(yàn)和斷裂強(qiáng)度、斷裂應(yīng)變和彈性系數(shù)的參數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)循環(huán)載荷結(jié)構(gòu)的機(jī)械性質(zhì)。圖5顯示在循環(huán)載荷后，凝膠的代表性應(yīng)變一應(yīng)力行為。表l概括了獲得的數(shù)據(jù)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膠原凝膠的循環(huán)載荷導(dǎo)致膠原原纖維的融合，這通過(guò)原纖維直徑的增加及拉伸性質(zhì)的相應(yīng)增加來(lái)表現(xiàn)。直徑的分階段增加跟離散的小直徑原纖維的逐漸增加是一致的。因?yàn)槭褂昧藷o(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，控制原纖維直徑(從而控制得到的組織材料性質(zhì))被證明是主要的生物化學(xué)過(guò)程。其說(shuō)明組織在體內(nèi)的性質(zhì)是由局部的細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)變及外部載荷的結(jié)合控制的。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>參考文獻(xiàn)AmeyeL,YoungMFGWcobiologv.2002Sep;12(9):107R-16R.Review.BirkDE,etalJCellBiol.1988Mar;106(3):999隱1008.BirkDEetalJCellSci.1990Apr;95(Pt4):649-57.BrinckerhoffCEetalNatRevMolCellBiol.2002Mar;3(3):207-14,CantyEGetal.JCellSci.2005Aprl;118(Pt7):1341-53.ChapmanJA.Biopolymers.1989Aug;28(8):1367-82.Erratumin:Biopolymers1989Dec;28(12):2201-5.CorsiAetalJBoneMinerRes.2002Jul;17(7):1180-9.DoaneKJetal.ExpCellRes.1992Sep;202(l):l13-24.Ez戲YetalJCellBiol.2000Nov13;151(4):779-88.GrahamHKetalJMolBiol.2000Jan28;295(4):891-902.GuidrvCetalCollRelatRes.1987Feb;6(6):515-29.HavEDJCellBiol.1981Dec;91(3Pt2):205s-223s.Review.KadlerKEetalBiochemJ.1996May15;316(Ptl):l-ll.Review.LinsenmaverTFetalJCellBiol.1993Jim;121(5):1181-9.權(quán)利要求1.制備生物材料的方法，包含(i)塑性壓縮膠原凝膠，(ii)對(duì)壓縮凝膠施加單軸拉伸載荷，(iii)從壓縮凝膠移除所述的載荷，和；(iv)重復(fù)步驟(ii)和(iii)以生產(chǎn)所述的生物材料。2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述生物材料相對(duì)于壓縮凝膠具有增加的材料強(qiáng)度，或改變的流動(dòng)性和溶質(zhì)滲透性質(zhì)。3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述生物材料相對(duì)于壓縮凝膠具有增加的原纖維直徑。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生物材料用于制造組織等效植入物。5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(ii)包括將作用于凝膠的載荷逐步增加到預(yù)先確定的單軸拉伸載荷。6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述預(yù)先確定的單軸拉伸載荷使壓縮凝膠受到5—40%的應(yīng)變。7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于作用于凝膠的載荷以少于10%應(yīng)變/分鐘的速度逐步增加。8.權(quán)利要求6或7的方法，其特征在于預(yù)先確定的載荷維持至少1分鐘。9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(iii)包括逐步將載荷從凝膠移除。.10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于載荷以少于10%應(yīng)變/分鐘的速度被逐步移除。11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于移除載荷后，壓縮凝膠維持空載至少1分鐘。12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(ii)和(iii)被重復(fù)10次或更多次。13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟(ii)和(iii)每小時(shí)被重復(fù)10次或更少次。14.權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法，其特征在于凝膠被浸在水溶液中。15.權(quán)利要求14的方法，其特征在于液體是培養(yǎng)基。16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于凝膠包含活細(xì)胞。17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于活細(xì)胞選自以下細(xì)胞所組成的組肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、心臟細(xì)胞、肺細(xì)胞、腸細(xì)胞、支氣管細(xì)胞、眼細(xì)胞、生殖細(xì)胞、脈管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、分泌細(xì)胞、干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、許旺細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膀胱r.皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和腱細(xì)胞。18.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于塑性壓縮包括所述凝膠體積減少至少50%。19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于通過(guò)對(duì)凝膠作用壓縮力來(lái)塑性壓縮凝膠。20.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于通過(guò)對(duì)凝膠作用單軸張力使膠原凝膠的原纖維對(duì)準(zhǔn)。21.權(quán)利要求20的方法，其特征在于在塑性壓縮前施加單軸張力。22.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于其包括將所述生物材料植入到人體內(nèi)或動(dòng)物體內(nèi)以修復(fù)或替換受損組織。23.權(quán)利要求1至21任一項(xiàng)的方法，其特征在于其包括使生物材料模鑄或成形以制造組織等效植入物。24.權(quán)利要求23的方法，其特征在于其包括折疊或巻起所述生物材料以制造植入物。25.權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于所述生物材料受到進(jìn)一步的塑性壓縮以制造植入物。26.權(quán)利要求1至21任一項(xiàng)方法制造的生物材料。27.權(quán)利要求26的生物材料在制造過(guò)濾裝置、藥物釋放裝置、模型組織或試驗(yàn)臺(tái)中的應(yīng)用。28.組織等效植入物，其包含權(quán)利要求26的生物材料，或由權(quán)利要求26的生物材料組成。29.治療個(gè)體內(nèi)受損組織的方法，包括在受損組織處安裝權(quán)利要求28的組織等效植入物以修復(fù)和/或替換所述組織。30.權(quán)利要求28的組織等效植入物用于治療個(gè)體內(nèi)的受損組織的方法中。31.利用權(quán)利要求28的組織等效植入物在制造治療受損組織的藥物中的應(yīng)用。32.權(quán)利要求29的方法，權(quán)利要求30的植入物或權(quán)利要求31的應(yīng)用，其特征在于受損組織由關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)肌肉受損/退化、肌肉一腱受損和老化、創(chuàng)傷后的低再生能力、組織壞死或手術(shù)摘除所產(chǎn)生。全文摘要本發(fā)明涉及生物材料的制備方法，其通過(guò)對(duì)壓縮膠原凝膠施加多循環(huán)拉伸載荷以使膠原原纖維融合入壓縮凝膠。通過(guò)本發(fā)明的方法可以得到具有改良的材料性質(zhì)的生物材料。例如，通過(guò)本發(fā)明方法制得的生物材料可以作為組織等效植入物用于修復(fù)和/或替換個(gè)體內(nèi)受損組織。文檔編號(hào)A61L27/24GK101355974SQ200680050640公開(kāi)日2009年1月28日申請(qǐng)日期2006年11月24日優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日發(fā)明者卓子斌,昂伯·奇馬,羅伯特·布朗申請(qǐng)人:Ucl商業(yè)有限公司