專利名稱：癌癥和傳染病治療的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療癌癥或惡性疾病以及傳染病的新的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及促進(jìn)1型免疫應(yīng)答(如Thl細(xì)胞)的誘導(dǎo)和/ 或擾亂調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞的一種組合物和方法。本發(fā)明進(jìn)一步將本發(fā)明 的組合物的應(yīng)用延伸到了疾病治療中。
背景技術(shù)：
自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞，尤其是樹突狀細(xì)胞(DC),主導(dǎo)原態(tài)CD4+T細(xì)胞 分化為功能各異的Thl、 Th2或調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞亞型。由保守的 (conserved)微生物分子與病原識(shí)別受體(PRR)如Toll樣受體(TLR)和 粘合素等的結(jié)合引起的未成熟DC的激活，伴隨著成熟和向淋巴結(jié)的歸巢， 在淋巴結(jié)中成熟的DC將抗原(Ag)呈遞至原態(tài)T細(xì)胞。由病原來源分子 引起的DC的激活對(duì)于調(diào)控原態(tài)CD4+ T細(xì)胞分化為不同的T細(xì)胞亞型起 重要作用。Thl細(xì)胞可賦予針對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染和腫瘤的保護(hù)作用，但也與炎 癥反應(yīng)和自身免疫疾病偶聯(lián)，而Th2細(xì)胞參與過敏反應(yīng)。Treg細(xì)胞可抑制 Thl和Th2反應(yīng)。免疫活性個(gè)體中的腫瘤發(fā)展可能反映出免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原識(shí)別失 敗，或可能由通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)和激活導(dǎo)致的抗腫瘤免疫應(yīng)答的受 擾亂引起，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)和激活可能受到了肺瘤生長(zhǎng)環(huán)境的進(jìn)一步 影響。自身和適應(yīng)性免疫應(yīng)答可被誘導(dǎo)來抗腫瘤，保護(hù)性效應(yīng)細(xì)胞包括 CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL )、產(chǎn)生IFN-y的CD4+和CD8+ T細(xì)胞、 NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。雖然T細(xì)胞通常含一個(gè)結(jié)合于腫瘤位點(diǎn)的主要免疫 細(xì)胞群，但它們經(jīng)常對(duì)殺死胂瘤無效，有證據(jù)表明這可能由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 的功能引起(Woo, E. Y" et al., 2002 ￡wr J/mmw"o/ 32;3267 )。自然CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制因子Foxp3，作為胸腺來 源的成熟T細(xì)胞出現(xiàn)，在維持對(duì)自身抗原的耐受和防止自身免疫作用中起 重要作用(Sakaguchi， S. 2000. Ce〃 101:455-458 )。分泌IL-10 (定名為Trl細(xì)胞)或TGF - |3 (定名為Th3細(xì)胞)的誘導(dǎo)性 的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞響應(yīng)病原和自身抗原而在外周區(qū)域產(chǎn)生。在感染過程中， 自然的和誘導(dǎo)性的T細(xì)胞可通過防止病原誘導(dǎo)的免疫病癥而對(duì)寄主起有益 作用。然而，也有報(bào)道稱由病原誘導(dǎo)或激活的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能是擾亂保 護(hù)性免疫的一種策略，且顯示CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的損耗提高了特 定感染的存活率(Mills, K.H. and P. McGuirk. 2004. 5fem/" /附附w"o/ 16:107-117)。 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的損耗也可加強(qiáng)抗胂瘤免疫。效應(yīng) 性和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的平衡可能也受腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境的影響，與腫瘤生長(zhǎng) 的消散或發(fā)展可能存在相關(guān)。因此如果調(diào)節(jié)性T細(xì)胞受阻遏，使得效應(yīng)性 T細(xì)胞反應(yīng)加強(qiáng)，可能會(huì)使抗胂瘤疫苗或藥劑更有效。Toll樣受體Toll樣受體(TLR)超家族對(duì)入侵病原的識(shí)別和免疫應(yīng)答的啟動(dòng)起中 心作用。迄今已發(fā)現(xiàn)了 13個(gè)人類TLR。每個(gè)TLR識(shí)別不同的病原相關(guān)的 分子模式(PAMP)，導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，然后激活轉(zhuǎn)錄因子 NF- k B及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、 p38、 c-jun、 N末端激酶(JNK) 和p42/44。 TLR-3和TLR-4也激活另一途徑，在轉(zhuǎn)錄因子、干擾素調(diào)節(jié)因 子3 (IRF3)的激活中效應(yīng)最大，干擾素調(diào)節(jié)因子3結(jié)合于干擾素敏感效 應(yīng)元件(ISRE)，誘導(dǎo)包括IFN-P的一系列基因。TLR為一更大的超家族 的成員，稱為白介素-1受體(IL-R) /TLR超家族，其也包含IL-1R1亞 群和含TIR結(jié)構(gòu)域接頭亞群。所有三個(gè)亞群都具有細(xì)胞質(zhì)Toll/IL-l受體 (TIR)結(jié)構(gòu)域，它對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是重要的。TLR具有胞外富含亮氨酸的重 復(fù)序列，而IL-1R1亞群具有胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。接頭分子為細(xì)胞質(zhì)定 位的，不含胞外結(jié)構(gòu)域。Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑已作為腫瘤疫苗的佐劑在臨床試驗(yàn)中得到 檢驗(yàn)。此療法是基于TLR激動(dòng)劑促進(jìn)1型反應(yīng)，尤其是激活分泌IFN-y的 Thl細(xì)胞、NK細(xì)胞和CD8CTL。迄今的結(jié)果已顯示此療法增強(qiáng)了抗腫瘤 免疫應(yīng)答，但無真實(shí)跡象顯示可防止腫瘤生長(zhǎng)，雖然在小鼠模型中的數(shù)據(jù) 顯示可能有一定的效果(Micronnel， I., S. et al. 2002. J7mww"o/ M&72")。疫苗抗傳染病疫苗一般通過抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞的產(chǎn)生，賦予機(jī)體對(duì)傳 染的保護(hù)性(預(yù)防性)免疫，效應(yīng)T細(xì)胞促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生及介導(dǎo)抗病 原的細(xì)胞免疫。這些反應(yīng)可在記憶性T和B細(xì)胞產(chǎn)生后被召回，在量和質(zhì) 上受疫苗配方中佐劑的影響。佐劑可為加入抗原配方中的外源免疫調(diào)節(jié)劑 或減活或滅活的病毒或細(xì)菌疫苗的內(nèi)源組分，它通過與TLR和其它病原識(shí) 別受體的相互作用而非特異性地激活自身免疫應(yīng)答。TLR激動(dòng)劑包括LPS、 CPG -寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)和PolyIC，和全細(xì)菌體，包括百日咳 4干菌(5ordete〃a /7eWwss^)和結(jié)才亥分牙支桿菌(AfycoZj<3cfeWw/M fwZjerci/Zos^), 都具有佐劑活性，可促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞和對(duì)共注射抗原的抗體反應(yīng)?？寡仔约?xì)胞因子抑制劑已知環(huán)氧合酶-2(Cox-2)抑制劑被用作對(duì)多種癌癥有一定效果的藥 物。Cox-2是一種由炎癥刺激誘導(dǎo)的酶，可在腫瘤組織內(nèi)誘導(dǎo)前列腺素 E2(PGE2)合成。PGE2是IL-10的有效誘導(dǎo)劑。Cox-2促進(jìn)血管形成、細(xì)胞 增殖，使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡具有抗性，這解釋了 Cox-2的選擇性抑制劑(如 塞來昔布(CELECOXIB)和NS-398)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。MAP激酶抑制劑對(duì)炎癥疾病的作用已得到臨床驗(yàn)證，且之前ERK和 p38在體外細(xì)胞死亡和肺瘤細(xì)胞存活中被提到。本發(fā)明的驚人發(fā)現(xiàn)是用免疫系統(tǒng)已知調(diào)節(jié)劑的一種特殊聯(lián)合給藥可 使這些調(diào)節(jié)劑的效價(jià)得到協(xié)同提高，這使得發(fā)明人得出了改進(jìn)的治療組合 物，其通過阻遏可抑制促炎性免疫應(yīng)答的抗炎性反應(yīng)，而對(duì)治療和/或預(yù)防 癌性疾病和傳染病具有作用。已知調(diào)節(jié)性t細(xì)月包可表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子如il-10和/或tgf-P，已知 這些細(xì)胞因子的表達(dá)可阻遏免疫應(yīng)答。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也通過細(xì)胞-細(xì)胞接 觸阻遏免疫應(yīng)答。當(dāng)被阻遏的免疫應(yīng)答定向?yàn)榭鼓[瘤細(xì)胞發(fā)展時(shí)，免疫應(yīng)
答的阻遏可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。因此，抗炎性細(xì)胞因子如IL-10和/或TGF-卩或 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制劑，可對(duì)提高抗癌癥治療或傳染病治療的效果，尤其 是疫苗的效果有用。發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種組合物用于治療需要增強(qiáng)Thl介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病，所述組合物包括(i) 至少一種Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑，和(ii) 至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，其可抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，這種阻遏由對(duì) 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的選擇性抑制引起，或其引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，導(dǎo) 致至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)。受到阻遏的抗炎性細(xì)胞因子可能為IL-10和/或TGF-P。上調(diào)的促炎性 細(xì)胞因子可能為IL-12,或任何其它促炎性細(xì)胞因子如干擾素Y、 IL-1和 TNF國(guó)P。促炎性細(xì)胞因子的上調(diào)可促進(jìn)由效應(yīng)細(xì)胞如Thl細(xì)胞和CTL(細(xì)胞毒 性T淋巴細(xì)胞)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。免疫調(diào)節(jié)劑是一種抑制性化合物，其阻遏或抑制至少一種參與介導(dǎo)抗 炎免疫應(yīng)答的分子，或參與介導(dǎo)某種抗炎免疫應(yīng)答的途徑?？寡追磻?yīng)的特征是細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生和Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，如Trl 或Th3細(xì)月包。對(duì)IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或IL-12的上調(diào)的適宜的抑制作用，是 在自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)節(jié)。免疫調(diào)節(jié)劑引起IL-10的產(chǎn)生受到適當(dāng)阻遏或IL-10的功能受到適當(dāng)抑 制。免疫調(diào)節(jié)劑可進(jìn)一步引起TGF-(3的功能受到阻遏或抑制。這種對(duì)細(xì)胞 因子響應(yīng)(IL-10和/或TGF-p)的調(diào)節(jié)，尤其是對(duì)自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì) 胞因子表達(dá)譜的調(diào)節(jié)可抑制Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)，它是具有免疫抑制活性的T 細(xì)胞亞群。本發(fā)明的化合物除可調(diào)節(jié)IL-10和TGF-P外，也可調(diào)控更多的
已知可誘導(dǎo)抗炎效果的細(xì)胞因子的表達(dá)。免疫調(diào)節(jié)化合物可進(jìn)一步阻遏調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞之 間的細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸，阻止由此機(jī)制介導(dǎo)的對(duì)促炎免疫應(yīng)答的阻遏作 用。"調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的選擇性抑制，，意為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞受到抑制，以 至其不能阻遏促炎性免疫應(yīng)答或介導(dǎo)抗炎性免疫應(yīng)答，特別是通過細(xì)胞_ 細(xì)胞直接接觸的方式。如此處所定義，術(shù)語"上調(diào)"的^f吏用涉及細(xì)胞因子產(chǎn)生增加時(shí)，意為 其活性或表達(dá)強(qiáng)于靜止細(xì)胞中所觀察到的。如此處所定義，名詞"阻遏"的使用涉及細(xì)胞因子產(chǎn)生減少時(shí)，意為 其活性或表達(dá)低于靜止細(xì)胞中所觀察到的。如此處所定義，名詞"抑制，，的使用涉及細(xì)胞因子產(chǎn)生受到抑制時(shí)， 意為其活性或表達(dá)與靜止細(xì)胞中所觀察到的活性或表達(dá)水平相比受到抑 制或基本受到抑制。在一實(shí)施方案中，至少一種Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑可為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所知的任何合適的TLR激動(dòng)劑。TLR激動(dòng)劑具有對(duì)TLR的結(jié)合親 和力和特異性，它的結(jié)合可激活TLR并介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR激動(dòng)劑可對(duì)TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9中的至少一種具有結(jié)合特異性。適宜的TLR激動(dòng)劑的特 例包括但不限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、 單磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核香酸)、咪壹莫 特、R838和R837。此外，全細(xì)菌體如百日咳桿菌(萬or&te/to/ emmk ) 和結(jié)核分4支桿菌(鄉(xiāng)co6ac&Www ft^woz/ow; )也可作為TLR激動(dòng)劑(Toll 激動(dòng)劑)。此外，上面所列的TLR激動(dòng)劑的合適的類似物也可被利用，此 處所稱類似物的功能可激活至少一種Toll樣受體。免疫調(diào)節(jié)劑是一種可抑制免疫應(yīng)答的下游介質(zhì)的功能的合適的化合 物。調(diào)節(jié)效應(yīng)對(duì)靶具有合適的選擇性。抑制劑對(duì)靶的活性的抑制具有數(shù)量
號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)調(diào)節(jié)的能力。在更多實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑可包括以下至少 一種物質(zhì)的至少 一種抑制劑MAP激酶蛋白、Cox-2、 ERK、 p38或pl3k。免疫應(yīng)答是一種抗炎反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答，可適當(dāng)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 的誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為MAP激酶蛋白或MAP激酶途 徑的抑制劑，合適地為選擇性抑制劑。MAP激酶(促分裂原活化激酶)是 參與細(xì)胞反應(yīng)、炎癥和生長(zhǎng)的蛋白。p38激酶(p38 )是MAP激酶的應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)亞群的一 個(gè)成員。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，p38激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞對(duì)脅迫的反 應(yīng)，已知其也對(duì)細(xì)胞凋亡的上調(diào)具有功能。已知p38激酶的激活可增加使 炎性反應(yīng)形成的分子如IL-1、 TNF和Cox-2的產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中抑制劑為一種p38激酶抑制劑。該抑制劑可抑制至 少一種p38激酶異型體的功能。因而此抑制劑被用于抑制p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑的功能。優(yōu)選地，p38激酶抑制劑為SB203580或其藥學(xué)上可接受的鹽或 溶劑化物或類似物，此類似物具有p38抑制劑活性。選擇性地，抑制劑可 為SB220025或SB239063或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物或類似物，此 類似物具有p38激酶抑制劑活性。ERK(胞外調(diào)節(jié)的激酶)是MAP激酶的一個(gè)族，可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中抑制劑為ERK抑制劑，合適地為選擇性ERK抑制 劑。優(yōu)選地，ERK抑制劑為U0126或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物或類 似物，此類似物具有ERK抑制劑活性。選擇性地，抑制劑可為PD98059 或類似物，此類似物具有ERK抑制劑活性。在一另外的實(shí)施方案中ERK 抑制劑與p38抑制劑化合物同時(shí)提供。在另外的實(shí)施方案中免疫調(diào)節(jié)劑可為更多的MAP激酶如MEK1或 MEK2的抑制劑，可能是抑制或封閉Thl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中位于MAP激酶 下游某點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子的化合物。這種轉(zhuǎn)錄因子的其中一例是c-Fos。在另外一實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為磷酯酰肌醇激酶-3的抑制劑，
適宜地為選擇性抑制劑。磷酯酰肌醇激酶-3 (pI3K)為一種調(diào)控細(xì)胞壽 命的原癌基因。在一實(shí)施方案中pBK抑制劑為L(zhǎng)Y294002,其藥學(xué)上可接受的鹽或溶 劑化物或類似物，其類似物具有pI3K抑制劑活性。選擇性地，pI3K抑制 劑可為渡曼青霉素(WMN)。在另外一實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為Cox-2(環(huán)氧合酶2)抑制劑。合適 的Cox-2抑制劑包括塞來昔布(CELEBREX (NS-398), Pfizer公司)、 BEXTRA (Pfizer公司)、羅非可昔(Rofecoxib) (VIOXX， Merck)或其藥學(xué)上 可接受的鹽或溶劑化物或類似物，其類似物具有Cox-2抑制劑活性。合適 的Cox-2抑制劑為選擇性抑制劑。通過抑制能夠生成IL-10或TGF-p的誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或表達(dá) Foxp3的天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)，Cox-2抑制劑的給藥使免疫應(yīng)答向Thl 途徑偏移。依據(jù)本發(fā)明的此方面，Cox-2抑制劑和TLR激動(dòng)劑的共同給藥 可使天然的和誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞都受抑制。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)當(dāng)與TLR激動(dòng)劑一起給藥時(shí)，Cox-2的抑制可阻遏抗 炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-p的產(chǎn)生。此外在受Toll樣受體激動(dòng)劑刺激后， Cox-2抑制劑也顯示可誘導(dǎo)IL-27 mRNA的產(chǎn)生，進(jìn)一步也觀察到可增加 由樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12p40和IL-12p35,而同時(shí)減少了 IL-10mRNA的 表達(dá)。組合物可另含至少一種腫瘤特異性抗原。腫瘤特異性抗原可來源于熱 激蛋白與從癌細(xì)胞或癌性疾病個(gè)體中分離的抗原性肽之間形成的復(fù)合物。在一實(shí)施方案中，組合物可另含抑制可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞 產(chǎn)物的化合物。此化合物可能引起腫瘤存活時(shí)間的延長(zhǎng)，通過例如賦予耐 藥性或賦予對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知此類化合物的例 子。如此處所定義的，"需要Thl介導(dǎo)的免疫應(yīng)答得到加強(qiáng)的疾病"可為癌 癥或惡性疾病，或進(jìn)一步地，所稱疾病可為傳染病。此種疾病的例子將在 下文描述。 本發(fā)明的另一方面提供了 一種藥物組合物用于加強(qiáng)Thl介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答，此組合物包括至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和至少一種能夠抑制對(duì)免疫 應(yīng)答的阻遏的免疫調(diào)節(jié)化合物，此處的阻遏作用由對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能 的選擇性抑制引起，或其導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，如伴隨藥學(xué)上可接 受的賦形劑、稀釋液或載體的使用，使至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏 及至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)。在一實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，導(dǎo)致 其不能阻遏細(xì)胞-細(xì)胞接觸介導(dǎo)的促炎性免疫應(yīng)答。在一實(shí)施方案中，抗炎性細(xì)胞因子IL-10的生成受到調(diào)節(jié)劑的抑制或 阻遏而促炎性細(xì)胞因子IL-12的生成得到增強(qiáng)。免疫調(diào)節(jié)劑是能夠抑制免疫應(yīng)答的下游介質(zhì)的功能的合適的化合物， 且可能為一種特殊的MAP激酶蛋白的抑制劑。抑制劑可能為p38激酶抑 制劑、ERK抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制 劑中的至少一種。合適的TLR激動(dòng)劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全細(xì)菌體如百日咳桿菌 (^ordefe/Aa / erftwsis )和纟吉才亥分4支桿菌(柳co6acfen'w附/w6e/rw/os/s )也可 作為TLR激動(dòng)劑(Toll激動(dòng)劑)。在一實(shí)施方案中，Thl免疫應(yīng)答的增強(qiáng)使得該藥物組合物可被用于治 療或預(yù)防癌癥或惡性疾病或傳染病。在一實(shí)施方案中，組合物可能另含能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)育或能夠抑 制或阻遏可促進(jìn)肺瘤生長(zhǎng)的產(chǎn)物或介質(zhì)的功能的調(diào)節(jié)化合物。此調(diào)節(jié)化合 物可能抑制或阻遏任何引起肺瘤存活延長(zhǎng)的分子或途徑的功能。例如調(diào)節(jié) 化合物可抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥性或抑制其對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性。本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預(yù)防需要加強(qiáng)Thl介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答的疾病的方法，此方法含以下步驟-用至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑的治療有效量給藥，以及 -用至少 一種能夠抑制對(duì)免疫應(yīng)答阻遏的免疫調(diào)節(jié)劑的治療有效量給藥，此處的阻遏作用由對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能的選擇性抑制引起，或其 導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，使至少 一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少 一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)。在一實(shí)施方案中，抗炎性細(xì)胞因子IL-10的生成受到免疫調(diào)節(jié)劑的抑 制或阻遏而促炎性細(xì)胞因子IL-12的生成得到增強(qiáng)。免疫調(diào)節(jié)劑引起至少IL-10的功能的阻遏或抑制。調(diào)節(jié)劑可進(jìn)一步引 起TGF-P的功能的阻遏或抑制。這種對(duì)細(xì)胞因子響應(yīng)的調(diào)節(jié)，尤其是對(duì)自 身免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜的調(diào)節(jié)可抑制Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)，其為T 細(xì)胞的亞群，具有阻遏活性。除對(duì)IL-10和TGF-(3進(jìn)行調(diào)控外，本發(fā)明的 化合物可能調(diào)控更多的已知可誘導(dǎo)抗炎效果的細(xì)胞因子或介質(zhì)的表達(dá)。另外，免疫調(diào)節(jié)劑可介導(dǎo)IL-12的表達(dá)或功能活性的增強(qiáng)。也可觀察 到更多促炎性細(xì)胞因子如IL-1、 TNF-P或IFN-y的上調(diào)。IL-10和/或TGF-卩的產(chǎn)生的適當(dāng)抑制和/或IL-12的適當(dāng)?shù)纳险{(diào)是在自 身免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中受到調(diào)控的，如樹突狀細(xì)胞。免疫調(diào)節(jié)劑是一種抑制免疫應(yīng)答的下游介質(zhì)的功能的適當(dāng)化合物，可 特別作為一種MAP激酶蛋白抑制劑。抑制劑可能為以下物質(zhì)中的至少一 種p38激酶抑制劑、ERK抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制 劑或Cox-2抑制劑。合適的TLR激動(dòng)劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A (MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全細(xì)菌體如百日咳桿菌 (Sorde/e〃a/^Wmss/s )和纟吉斗玄分才支桿菌(聊co6acte〃'ww ^/Z)ercw/as7.51)也可 作為TLR激動(dòng)劑(Toll激動(dòng)劑)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物對(duì)接受者 進(jìn)行共同給藥?？蛇x地，將Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物分開或先 后給藥，且在此實(shí)施方案中，Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的給藥 方法可能不同。
接受者一般為哺乳動(dòng)物。在另外的實(shí)施方案中，接受者為人。 本發(fā)明可用于提供一種治療或預(yù)防任何已知類型的癌癥或惡性疾病的方法。癌癥或惡性疾病可包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨 肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮 肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、 胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、 汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、 腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、腎母細(xì)胞 瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、肺小細(xì)胞癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星 形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、 聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠i瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、^L網(wǎng)膜 母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血癥和重鏈病。本發(fā)明的組合物、藥物組合物和方法用于治療傳染病，傳染病可包含 但不限于以下細(xì)菌或病毒引起麻風(fēng)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、利什曼原蟲、 百日咳桿菌、瘧疾、流感病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒。本發(fā)明的另 一方面是提供了 一種組合物的應(yīng)用，它含至少一種Toll樣 受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑，其可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào) 控細(xì)胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種 促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，用于治療需要增強(qiáng)Thl介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中此疾病為惡性或癌性疾病。在另 一個(gè)實(shí)施方案中此 疾病為傳染病。在一個(gè)實(shí)施方案中抗炎性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生受到免疫調(diào)節(jié)劑的抑 制或阻遏，而促炎性細(xì)胞因子IL-12的產(chǎn)生得到增強(qiáng)。免疫調(diào)節(jié)劑引起至少IL-10的功能的適當(dāng)阻遏或抑制。此調(diào)節(jié)劑可能 進(jìn)一步引起TGF-P的功能的阻遏或抑制。這種對(duì)細(xì)胞因子響應(yīng)的調(diào)節(jié)，尤 其是對(duì)自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜的調(diào)節(jié)可抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的 誘導(dǎo)，它是T細(xì)胞的亞群，具有阻遏活性。除了對(duì)IL-10和TGF-卩調(diào)控夕卜,
本發(fā)明的化合物可能調(diào)控更多的已知可誘導(dǎo)抗炎效應(yīng)的細(xì)胞因子或介質(zhì)的表達(dá)。此調(diào)節(jié)劑也可能抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞接觸的阻遏。另外，此免疫調(diào)節(jié)劑可介導(dǎo)IL-12的表達(dá)或功能活性的增強(qiáng)。也可觀 察到更多的促炎性細(xì)胞因子如IL-1、 TNF-p或IFN-y的上調(diào)。對(duì)IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生的適當(dāng)抑制和/或IL-12的適當(dāng)上調(diào)的調(diào)節(jié) 作用是在自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞中進(jìn)行的，例如樹突狀細(xì)胞。合適的TLR激動(dòng)劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全細(xì)菌體如百日咳桿菌 (Bordetella pertussis)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)也可 作為TLR激動(dòng)劑(Toll激動(dòng)劑)。免疫調(diào)節(jié)劑是一種適當(dāng)抑制免疫應(yīng)答的下游介質(zhì)的功能的化合物，可 特別作為一種MAP激酶蛋白抑制劑。抑制劑可能為p38激酶抑制劑、ERK 抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制劑中的至少 一種。本發(fā)明的另 一方面是提供了至少 一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑 的應(yīng)用，此調(diào)節(jié)劑通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控細(xì)胞因子的 表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種促炎性細(xì)胞因 子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，用于制備治療需要增強(qiáng)Thl介導(dǎo)的或其 它效應(yīng)的免疫應(yīng)答的疾病的藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中此疾病為惡性或癌性疾病。在另 一個(gè)實(shí)施方案中此 疾病為傳染病。免疫調(diào)節(jié)劑是一種適當(dāng)抑制免疫應(yīng)答的下游介質(zhì)的功能的化合物，可 特別作為一種MAP激酶蛋白抑制劑。抑制劑可能為p38激酶抑制劑、ERK 抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制劑中的至少 一種。合適的TLR激動(dòng)劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A (MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-
寡脫氧核苷酸)、咪會(huì)莫特、R838和R837。此外，全細(xì)菌體如百日咳桿菌 (5orafefe〃a/ eWwswi)和結(jié)4亥分才支4干菌(iVfycc^acferfKm fw&ercM/osi's)也可 作為TLR激動(dòng)劑(Toll激動(dòng)劑)。在另外的特殊實(shí)施方案中，本發(fā)明延伸為改進(jìn)抗癌癥或黑色素瘤疫苗 的效價(jià)。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)一種組合物，其含抗癌疫苗成分(如腫瘤特異性 疫苗)和抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或IL-10產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)化合物，可作為治療 癌癥和惡性疾病的異常有效的藥物組合物。以非活性物質(zhì)如蛋白接種一般會(huì)引起抗體反應(yīng)和CD4+輔助性T細(xì)胞 反應(yīng)以及Thl或Th2反應(yīng)。另一方面，以活性物質(zhì)如活病毒或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌 接種或感染一般會(huì)引起CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。Thl和 CTL反應(yīng)對(duì)針對(duì)癌癥、病原性病毒和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的保護(hù)作用是重要的。Th2 反應(yīng)對(duì)針對(duì)細(xì)胞外細(xì)菌和寄生蟲的保護(hù)作用是重要的。相應(yīng)地，本發(fā)明的更多方面提供了一種治療癌癥或惡性疾病的組合 物，包括(i) 組合物，其包括至少一種可引發(fā)免疫應(yīng)答的腫瘤特異性抗原，所 述應(yīng)答對(duì)癌癥或惡性疾病特異，(ii) 至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑；和(iii) 免疫調(diào)節(jié)劑，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控細(xì) 胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到抑制及至少一種促炎 性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。含至少一種腫瘤特異性抗原的組合物為一種合適的癌癥疫苗，或含至 少一種抗原(Ag)的疫苗成分。腫瘤特異抗原可進(jìn)一步為一種已知的代表 某一特殊類型腫瘤的抗原。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。對(duì)細(xì)胞因子響應(yīng)特別是免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜的調(diào)控可抑 制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。這可能由對(duì)IL-10的阻遏或抑制而介導(dǎo)。腫瘤疫苗可為任何合適的疫苗或疫苗片l殳，例如全細(xì)胞疫苗、DNA疫
苗、亞單位疫苗或肽疫苗。免疫調(diào)節(jié)化合物與抗原一起給藥，IL-10的產(chǎn)生可能進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞 因子IL-12的產(chǎn)生。IL-12可使免疫應(yīng)答向'Thl，途徑偏移。在另外的情 況中，IL-10抑制劑可能并不特異地誘導(dǎo)IL-12產(chǎn)生，但是這可能由IL-IO 產(chǎn)生的減少而間接引起。Thl免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)一般伴隨著對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的擾亂。本發(fā)明的另 一 方面提供了 一種藥物組合物，用于治療或預(yù)防癌癥或惡 性疾病，此組合物包括至少一種引發(fā)免疫應(yīng)答的腫瘤特異性抗原，至少一 種TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋液或載 體。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，胂瘤特異抗原來源于癌癥疫苗或疫苗成分。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于治療癌癥或惡性疾病的方法，此方 法包括以下步驟-用抗癌疫苗或其含至少一種腫瘤特異性抗原的抗原性片段或決定 簇給藥；-用至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑給藥，以及-用治療有效量的至少一種免疫調(diào)節(jié)化合物向需要的接受者給藥，此 化合物可在自身免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中，通過抑制IL-10和/或TGF-P和/或上 調(diào)IL-12而調(diào)控細(xì)胞因子的反應(yīng)。調(diào)節(jié)劑通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)而 引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào) 而適當(dāng)抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。接受者一般為哺乳動(dòng)物。在另外的實(shí)施方案中，接受者為人。本發(fā)明還有另一方面是提供了包括至少一種腫瘤特異性抗原、至少一 種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的組合物用于治療癌癥或惡性疾病
的應(yīng)用，該免疫調(diào)節(jié)化合物可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控 細(xì)胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種促 炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。本發(fā)明還有另一方面是提供了包括至少一種腫瘤特異性抗原、至少一 種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的組合物用于制備治療癌癥或惡性 疾病的藥物的應(yīng)用，該免疫調(diào)節(jié)化合物可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的 功能或調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及 至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。接受者一般為哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施方案中，接受者為人。另一方面，本發(fā)明延伸為一種疫苗組合物，其包括從癌癥細(xì)胞或具有 癌癥疾病的個(gè)體中分離的熱激蛋白，且一種抗原性肽與其非共價(jià)復(fù)合。此 熱激蛋白-抗原性肽復(fù)合物(HSP-Ag)可向個(gè)體施藥，以誘導(dǎo)抗原性肽定 向的免疫應(yīng)答。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)用于抑制免疫系統(tǒng)的免疫介質(zhì)如Cox-2抑 制劑的共同給藥，能夠引起針對(duì)復(fù)合了 HSP的抗原的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。 HSP-Ag復(fù)合體的分離使得抗原可被抗原呈遞細(xì)胞呈遞至免疫系統(tǒng)，使在 抗原被識(shí)別為非自身物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這種HSP-Ag復(fù)合物的實(shí)例之一為熱激蛋白HSP-70與腫瘤特異性肽 形成的復(fù)合體。在此方面，本發(fā)明提供的用于治療癌癥或惡性疾病的組合 物包括(i) 與抗原性肽復(fù)合的熱激蛋白；和(ii) 免疫調(diào)節(jié)化合物，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào) 控細(xì)胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種 促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。免疫調(diào)節(jié)劑通過自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞抑制IL-10和/或TGF-卩和/或上調(diào) IL-12而適當(dāng)調(diào)控細(xì)^<因子反應(yīng)。對(duì)自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞細(xì)胞因子反應(yīng)的調(diào)節(jié)，尤其是對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)譜 的調(diào)節(jié)可抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。
合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。與熱激蛋白復(fù)合的抗原為一種合適的腫瘤特異性抗原，且來源于腫瘤 細(xì)胞。當(dāng)免疫調(diào)節(jié)劑為Cox-2抑制劑時(shí)，HSP-70-抗原復(fù)合物與Cox-2抑制 劑一起給藥可引起樹突狀細(xì)胞上CD80表達(dá)的增強(qiáng)。在一實(shí)施方案中以樹突狀細(xì)胞HSP-70疫苗的形式提供了 HSP-60/抗原 復(fù)合物。本發(fā)明在此方面進(jìn)一步延伸為對(duì)來源于癌癥細(xì)胞或感染了癌性疾病 的寄主的不同熱激蛋白的應(yīng)用。相應(yīng)地，熱激蛋白可為HSP-60、 HSP-90 和gp96,但不限于上述的種類，且可能延伸至任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的 熱激蛋白。本發(fā)明還有另 一方面提供了與腫瘤特異性抗原復(fù)合的熱激蛋白與至 少 一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑 一起用于治療癌癥或惡性疾病的應(yīng) 用，這種免疫調(diào)節(jié)劑可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控細(xì)胞因 子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種促炎性細(xì) 胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。本發(fā)明另 一方面延伸為與腫瘤特異性抗原復(fù)合的熱激蛋白與至少一 種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑一起在制備用于治療癌癥或惡性疾病的 藥物中的應(yīng)用，這種免疫調(diào)節(jié)劑可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或 調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一 種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。樹突狀細(xì)胞疫苗樹突狀細(xì)胞(DC)是高效的抗原呈遞細(xì)胞(APC),具有活化對(duì)外來 和自身抗原特異的初始T淋巴細(xì)胞的獨(dú)特能力。樹突狀細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生，經(jīng)血流遷移到機(jī)體的所有組織。這些細(xì)胞 通常發(fā)現(xiàn)于一些結(jié)構(gòu)區(qū)室如胸腺、淋巴結(jié)和脾之類的淋巴器官。然而它們 也^L發(fā)現(xiàn)于血流和機(jī)體的其它組織。情況適合時(shí)樹突狀細(xì)胞俘獲抗原并遷 移到引流淋巴結(jié)，此處啟動(dòng)免疫應(yīng)答。
樹突狀細(xì)胞通過主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-肽復(fù)合體加工和呈遞 肽至抗原特異性初始T、淋巴細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步將本發(fā)明的化合物和方法的使用延伸為誘導(dǎo)成熟樹突 狀細(xì)胞的一種特殊亞群的產(chǎn)生，其具有能夠促進(jìn)由一些細(xì)胞類型如Thl和 CTL介導(dǎo)的效應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)，并進(jìn)一步阻遏調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生的表型 和細(xì)胞因子表達(dá)語。髓系和淋巴樹突狀細(xì)胞群在本發(fā)明中都有用途。期望能夠?qū)渫粻罴?xì)胞進(jìn)行調(diào)控，以將其表型修飾為能夠表達(dá)可誘導(dǎo) Thl細(xì)胞譜和CTL反應(yīng)的細(xì)胞因子譜。此樹突狀細(xì)胞亞群的誘導(dǎo)用于避免 產(chǎn)生半成熟樹突狀細(xì)胞，半成熟樹突狀細(xì)胞的特征為可產(chǎn)生IL-10和 TGF-P，此種細(xì)胞因子語可引起調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生或CD80或CD86的 高表達(dá)而CD40低表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步延伸為樹突狀細(xì)胞疫苗。上文定義的組合物可向需要癌 性疾病或傳染病相關(guān)治療的個(gè)體施藥以向其提供預(yù)防性或治療性治療。此 介導(dǎo)抗傳染病免疫應(yīng)答的疫苗組合物一般是進(jìn)行預(yù)防性施藥以預(yù)防個(gè)體 的感染。但是當(dāng)用于傳染病如丙型肝炎和艾滋病病毒，疫苗為進(jìn)行治療性 施藥時(shí)，會(huì)有例外情況。然而， 一般由于受治療者的免疫妥協(xié)狀態(tài)， 一般 不將傳染病疫苗以治療方式施藥。當(dāng)將疫苗向具有癌性疾病的個(gè)體施藥時(shí)一般是進(jìn)行治療性施藥，因?yàn)?疫苗將包含腫瘤細(xì)胞或來源于胂瘤細(xì)胞的抗原。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了樹突狀細(xì)胞疫苗與癌性疾病治療有關(guān)的用途。另外， 發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)用包括樹突狀細(xì)胞、Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑的疫 苗組合物給藥可提高藥物的效價(jià)。因此，本發(fā)明的另一發(fā)明延伸為一種用于治療癌性疾病的疫苗組合 物，其包括-樹突狀細(xì)胞，-至少一種腫瘤細(xì)胞抗原，-至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控細(xì) 胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種促炎 性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文.中描述。合適的樹突狀細(xì)胞可通過過繼轉(zhuǎn)移樹突狀細(xì)胞提供，其在存在或不存 在Toll樣受體激動(dòng)劑和可對(duì)于抗腫瘤或惡性疾病或傳染病有效的抑制 IL-10及可誘導(dǎo)Thl細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)化合物時(shí)以腫瘤特異性抗原沖激 (pulse)。合適的樹突狀細(xì)胞具有半成熟表型。在一實(shí)施方案中，至少一種腫瘤抗原可通過用與抗原復(fù)合的熱激蛋白 給藥提供。與抗原性蛋白復(fù)合的熱激蛋白可來源于癌癥細(xì)胞或具有癌性疾 病的個(gè)體。本發(fā)明的另一方面提供了一種治療癌癥或惡性疾病的方法，此方法包 括以下步驟-用在腫瘤特異性抗原存在下沖激的樹突狀細(xì)胞給藥， -用至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑給藥，和-用至少一種治療有效量的可抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏的免疫調(diào)節(jié)化 合物向需要的接受者給藥，該阻遏作用由對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能的選擇性 抑制引起，或其引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)而導(dǎo)致至少一種抗炎性細(xì)胞因子 受到阻遏及至少 一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細(xì)胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至 少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物用于治療癌性疾病的應(yīng)用，該 化合物通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)， 導(dǎo)致至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào) 而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏作用。本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細(xì)胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至 少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療癌性疾病的疫 苗組合物中的應(yīng)用，該化合物通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或引起 細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏和至少一種 促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏作用。發(fā)明者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了一種可向個(gè)體施藥的樹突狀細(xì)胞疫苗，用于癌癥 或惡性疾病的治療，此組合物未提供腫瘤特異性抗原，而提供了被施用疫 苗組合物的個(gè)體來源的腫瘤特異性抗原。因此，本發(fā)明的另一方面為提供了一種用于癌性疾病的治療的疫苗組 合物，其包括-樹突狀細(xì)胞，-至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或調(diào)控細(xì) 胞因子的表達(dá)而引起至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏及至少一種促炎 性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面提供了一種治療癌癥或惡性疾病的方法，此方法包 括以下步驟-用在腫瘤特異性抗原存在下沖激的樹突狀細(xì)胞給藥，和-用至少一種治療有效量的可抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏的免疫調(diào)節(jié)化 合物向需要的接受者給藥，該阻遏作用由對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能的選擇性 抑制引起，或其引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)而導(dǎo)致至少一種抗炎性細(xì)胞因子 受到阻遏及至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)。合適的免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細(xì)胞、至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和 免疫調(diào)節(jié)化合物用于治療癌性疾病的應(yīng)用，該化合物通過選擇性抑制調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞的功能或引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致至少一種抗炎性細(xì)胞因 子受到阻遏和至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏作 用。
本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細(xì)胞、至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和 免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療癌性疾病的疫苗組合物中的應(yīng)用，該化合 物通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致 至少一種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)而抑 制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏作用。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種適合治療癌癥或傳染病的在接受 者體內(nèi)誘導(dǎo)Thl反應(yīng)的方法，此方法包括以下步驟-為使樹突狀細(xì)胞達(dá)到可促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞功能的成熟程度，在疫苗和/ 或TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物存在下將分離的樹突狀細(xì)胞間接體內(nèi)暴 露于疾病特異性抗原，此化合物可抑制由自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和/ 或TGF-P或上調(diào)IL-12產(chǎn)生，-向接受者施用樹突狀細(xì)胞，使接受者產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答，來防 止癌癥攻擊或選艮或預(yù)防病原性#:生物的感染以預(yù)防傳染病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的此方面的樹突狀細(xì)胞為接受者自體的。 在一個(gè)實(shí)施方案中此樹突狀細(xì)胞為成熟樹突狀細(xì)胞。疾病特異性抗原為合適的腫瘤特異性抗原。合適的TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面涉及到對(duì)利用間接體內(nèi)方法暴露于疫苗和/或TLR 激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的樹突狀細(xì)胞在制備治療癌性疾病或傳染病的 藥物中的應(yīng)用，該化合物抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏作用，這種阻遏作用通過 選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致至少一 種抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)引起。在可選實(shí)施方案中本發(fā)明此方面的樹突狀細(xì)胞可被任何其它合適的 抗原呈遞細(xì)胞代替。合適的抗原呈遞細(xì)胞為巨喧細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞。 在另外的實(shí)施方案中，通過間接體內(nèi)方法對(duì)樹突狀細(xì)胞進(jìn)行了調(diào)變。在優(yōu)選實(shí)施例中，再給藥的抗原呈遞細(xì)胞、優(yōu)選的樹突狀細(xì)胞為接受 者自身固有的。接受者一般為人。
本發(fā)明的另一方面提供了一種組合物用于預(yù)防或治療癌癥、惡性疾病或傳染病，所述組合物包括(i) 在可引發(fā)傳染病、癌癥或惡性疾病的特異性免疫應(yīng)答的疫苗或疫 苗成分存在下沖激的樹突狀細(xì)胞，(ii) 佐劑，如Toll樣受體激動(dòng)劑；和(iii) 可抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏作用的化合物，這種阻遏作用通過選 擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或引起細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致至少一種 抗炎性細(xì)胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細(xì)胞因子上調(diào)引起；以及藥學(xué) 上可接受的賦形劑、稀釋液或載體。對(duì)IL-10和/或TGF-(3產(chǎn)生的抑制和/或IL-12的上調(diào)是在自身免疫系統(tǒng) 中進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)的，例如樹突狀細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，用全細(xì)胞癌癥疫苗如熱激的受輻射的B16腫瘤細(xì) 胞與和可作為MAP激酶抑制劑的化合物ERK —起的TLR激動(dòng)劑CpG共 同處理樹突狀細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，ERK抑制劑可能^皮替換為p38 抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制劑。在另外的實(shí)施方案中，DC可能受由癌癥細(xì)胞或感染了傳染病的細(xì)胞 來源的HSP-70沖激，所述DC進(jìn)一步暴露于可抑制抗炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生 的化合物， 一個(gè)特殊例子為可抑制IL-10和/或抑制天然Treg表達(dá)的Cox-2 抑制劑的施藥。
具體實(shí)施方式
初始CD4+T細(xì)胞可分化為效應(yīng)Thl或Th2細(xì)胞或Treg細(xì)胞，這些不 同亞型的選擇性誘導(dǎo)可能由許多因素決定，包括樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟 程度和自身免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子。 一些病原來源的免疫調(diào) 節(jié)性分子如TLR配體促進(jìn)Thl細(xì)胞的誘導(dǎo)。別的病原來源的分子，如來 自百日咳桿菌和CT的FHA和Cya，選擇性地或與Th2細(xì)胞一起促進(jìn)Tr 細(xì)胞的誘導(dǎo)。Treg細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞的同時(shí)誘導(dǎo)可能是一種寄主保護(hù)性策 略，以控制過度的Thl和Th2反應(yīng)，由此限制病原誘導(dǎo)的炎癥和免疫病理。Thl細(xì)胞被TLR配體誘導(dǎo)與它們的功能關(guān)聯(lián)，即促進(jìn)從自身細(xì)胞，尤其是 巨噬細(xì)胞和DC中產(chǎn)生IL-12和IL-27。然而，也顯示TLR配體可誘導(dǎo)IL-10 從巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，且顯示促進(jìn)Th2的TLR-2激動(dòng)劑Pam3Cys可誘導(dǎo)IL-10 從DC中產(chǎn)生。
本發(fā)明的發(fā)明者最近證明表達(dá)IL-IO和TGF-P的CD4+和CD8+ Treg細(xì) 胞可能干擾抗腫瘤免疫和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。他們證明，T細(xì)胞對(duì)旁觀者抗原 的反應(yīng)在CT26腫瘤生長(zhǎng)區(qū)域的抗原皮下免疫的小鼠中受到阻遏。生長(zhǎng)的 腫瘤中的T細(xì)胞表達(dá)IL-IO、 TGF-p和Foxp3的mRNA, CD4+和CD8+ T 細(xì)胞高頻率浸潤(rùn)腫瘤，引流'淋巴結(jié)中T細(xì)胞分泌IL-10,而分泌IFN-y的 頻率低。分泌IL-10的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞也浸潤(rùn)生長(zhǎng)中的腫瘤。CD8+ CTL反應(yīng)在患有肺轉(zhuǎn)移瘤的小鼠中檢測(cè)不到，在皮下注射CT26結(jié)腸癌細(xì) 胞后可微量瞬時(shí)檢測(cè)到，但在抗IL-10和抗TGF-p存在下得到增強(qiáng)。體內(nèi) 使CD4+或CD25+ T細(xì)胞損耗后顯著增加了 CD8+ T細(xì)胞IFN-y的產(chǎn)生，減 小了皮下腫瘤的體積、減少了肺轉(zhuǎn)移瘤以及提高了存活率。相反，CD8+T 細(xì)胞的去除取消了 CTL反應(yīng)，促進(jìn)了皮下腫瘤的發(fā)展但減少肺轉(zhuǎn)移癌。這 些發(fā)現(xiàn)表明腫瘤生長(zhǎng)使分泌IL-10和TGF-P的CD4+ Treg細(xì)胞能夠被誘導(dǎo) 和募集，并阻遏效應(yīng)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。然而表達(dá)IL-IO和TGF-P的008+ Treg細(xì)胞也被肺的免疫抑制環(huán)境募集或激活，它們?cè)诖颂幙赡茏瓒艨鼓[瘤 免疫的誘導(dǎo)。
本發(fā)明的發(fā)明人此前證明了 TLR激動(dòng)劑給藥的同時(shí)誘導(dǎo)了分泌IL-10 的Treg和Thl細(xì)胞。TLR配體誘導(dǎo)分泌IFN-y、 IFN-y和IL-10或僅IL-10 的T細(xì)胞。另外，這些不同類群的分泌IL-10的Trl和分泌IL-lO和IFN-y 的Thl樣Treg細(xì)胞阻遏Thl細(xì)胞產(chǎn)生IFN- y ,表明TLR配體同時(shí)誘導(dǎo)不 同類群的調(diào)節(jié)性和效應(yīng)T細(xì)胞。此前報(bào)道了自身IL-12和IL-10分別主導(dǎo) Thl和Tregl細(xì)胞的談導(dǎo)。發(fā)明人證明TLR-2、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9可激活DC的IL-10和IL-12的產(chǎn)生。另外，TLR配體誘 導(dǎo)ERK和p38 MAP激酶的磷酸化，ERK和P38的抑制劑能阻遏TLR配 體誘導(dǎo)的IL-10并促進(jìn)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。
本發(fā)明的發(fā)明人不希望受理論的束縛，確信p38抑制劑、pI3K抑制劑、ERK抑制劑和/或Cox-2抑制劑通過阻遏自身細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞)產(chǎn) 生IL-10和促進(jìn)IL-12產(chǎn)生，由此促進(jìn)Thl和CTL而非Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)， 從而增強(qiáng)TLR激動(dòng)劑和/或HSP-70疫苗的效價(jià)。此作用限制了與Treg細(xì) 胞的誘導(dǎo)和激活相關(guān)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的擾亂。定義如此處所用，術(shù)語"T細(xì)胞，，包括CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞。術(shù)語 T細(xì)胞也包括1型輔助性T細(xì)胞和2型輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞(CTL )。本發(fā)明上下文中的"接受者"包括哺乳動(dòng)物如人類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和家 畜(例如綿羊、豬、牛、馬、驢)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、兔、大鼠和豚鼠， 以及伴倡動(dòng)物如狗和貓。處理/治療此處所用的術(shù)語"治療"指任何對(duì)人和非人類動(dòng)物有益的處理方式。 治療可針對(duì)存在的疾病或可為預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。治療可包括治愈、 減輕或預(yù)防效果。更特殊的是，此處提及的"治療性，，和"預(yù)防性"治療應(yīng)從其最廣泛 的意義考慮。術(shù)語"治療，，并不一定表示將接受者治療至完全康復(fù)。類似 地，"預(yù)防"不一定表示接受者最終將不患病。因此，治療性和預(yù)防性治療包括對(duì)某一特殊疾病癥狀的改善或預(yù)防或 減少某種特定疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)語"預(yù)防"可看作減少某種特定疾病的 嚴(yán)重程度或發(fā)作。"治療"也可減少某一存在疾病的嚴(yán)重程度。施藥本發(fā)明所使用的活性成分可分開向同一接受者給藥或作為藥物組合 物共同給藥。藥物組合物一般包括根據(jù)預(yù)期的給藥途徑選擇的合適的賦形 劑、稀釋液或載體?；钚猿煞?任選地采取藥物組合物的形式)可通過任何合適的途徑向 需治療的受治療者施藥。準(zhǔn)確的劑量依賴于一系列因素，以下將作更詳細(xì) 的討論。一種合適的給藥途徑為腸道外給藥(包括例如利用滴注器皮下給藥、 肌肉給藥、靜脈內(nèi)給藥)。其它合適的給藥途徑包括(但不限于)經(jīng)口腔 給藥、直腸給藥、鼻內(nèi)給藥、局部給藥(包括口腔和舌下)、輸注給藥、 陰道給藥、皮層內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、顱骨內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥和硬腦膜外 給藥或利用霧化器、吸入器通過口或鼻吸入，或通過植入。為進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，活性成分將采取腸道外可接受的液體溶液形式，其無熱原，具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用例 如等滲賦形劑如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格氏液制備合適的溶 液。需要時(shí)可包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液和抗氧化劑和/或其它添加物。用于口服給藥的藥物組合物可以為片劑、膠嚢、粉劑或液體形式。片 劑可能含固體載體如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般含液體載體如水、 石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油?？赡馨ㄉ睇}水、葡萄糖或其 它糖類溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此組合物的給藥也可能通過孩i球、脂質(zhì)體、其它樣t粒輸送系統(tǒng)或置于 特定組織包括血液中的持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放載體的合適例子包括可共 享文獻(xiàn)中的形式的半透性高分子基質(zhì)，例如栓劑或微膠嚢?？芍踩氲幕蛭?膠嚢持續(xù)釋放基質(zhì)包括L-谷氨酸的聚乳酸(US專利號(hào)3773919或歐洲專 利申請(qǐng)?zhí)?058481 )共聚物和y乙酉旨-L-谷氨酸(Sidman et al， Biopolymers 22(1):547-556，1985)、聚曱基丙烯酸-2-羥基乙酯或乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al, J. Biomed. Mater. Res， 15:167-277, 1981, and Langer, Chem. Tech. 12:98-105， 1982 )。以上提到的技術(shù)與操作方法的例子和其它根據(jù)本發(fā)明可能用到的技 術(shù)和才喿作方法可見于《Remington，s Pharmaceutical Sciences》第18版，作 者Gennaro, A.R. ,Lippincott Williams & Wilkins;第20版(December 15,2000 ) ISBN 0-912734-04國(guó)3和《Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Dellivery Systems》，作者Ansel，H.C.等,第7版，ISBN 0-683305-72-7,其全部?jī)?nèi)容 因在此以引用的方式并入本文。
藥物組合物如上文所述，本發(fā)明延伸為一種藥物組合物用于癌癥或惡性疾病和/或傳染病的治療，尤其用于Thl免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和Treg免疫應(yīng)答的阻遏或 抑制。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物及其使用除包括活性成分外，還可包括藥 學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的材料。這些材料應(yīng)無毒，且不干擾活性成分的效價(jià)。載體或其它材料的 具體性質(zhì)取決于給藥途徑，例如可為口腔、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或通過口腔或鼻 腔吸入。制劑可能為液體，例如生理鹽水，其含pH為6.8-7.6的無磷緩 沖液，或?yàn)閮銮Щ蚶鋬龈稍锏姆?。劑量此組合物優(yōu)選地以"治療有效量"或"期望的劑量"向個(gè)體施藥，即 足以顯示對(duì)個(gè)體有益。如此處所定義，術(shù)語"有效量"意為治療某特定疾病可至少部分獲得 期望的反應(yīng)，或延遲發(fā)作或阻遏發(fā)展，或完全阻止發(fā)作或發(fā)展所必需的劑 量。劑量可根據(jù)接受治療者的健康和生理狀況、接受治療者所屬類群、所 期望的保護(hù)程度、組合物的配方、醫(yī)療形勢(shì)的評(píng)估和其它有關(guān)因素而改變。 期望將劑量定在一個(gè)相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，其可通過常規(guī)試驗(yàn)確定。治療處方如劑量的確定的責(zé)任和決定權(quán)最終屬于一般從業(yè)者、醫(yī)師或 其他醫(yī)學(xué)醫(yī)生， 一般需考慮所治療的失調(diào)狀態(tài)、受治療者的個(gè)體條件、給 藥方法和從業(yè)者所知的其它因素。優(yōu)化劑量可由醫(yī)師基于一系列參數(shù)確定，包括例如年齡、性別、體重、 所治療疾病的嚴(yán)重性、所用活性成分和給藥途徑。可應(yīng)用一較寬范圍劑量。例如針對(duì)受治療者，可每天用大約O.l亳克 到約1毫克每千克體重藥物?？烧{(diào)整劑量方案以取得優(yōu)化的治療反應(yīng)。例 如，可以在每天、星期、月份或其它合適的時(shí)間間隔用數(shù)個(gè)不同劑量，或 根據(jù)情況需要相應(yīng)減少劑量。除另有規(guī)定之處外，本發(fā)明所用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域技
術(shù)人員普遍理解的意義。除上下文另有需要外，術(shù)語"含(comprise)"或"包括(include)"或 其變化形式如"comprises"或"comprising" 、 "includes"或"including" 理解為包括申明的整體或群體，但不排除其它任何整體或群體。本發(fā)明將通過參考下文的例子和附圖加以描述，這些例子是作為例證 提供的，不可論釋為本發(fā)明的局限。


圖1示CT26腫瘤細(xì)胞抑制T細(xì)胞增殖和旁》見者抗原引起的IFN-y產(chǎn)生；圖2示CT26腫瘤細(xì)胞體外分泌TGF-|3，體內(nèi)分泌IL-10;圖3示IL-IO、 TGF-P和Foxp3 mRNA在浸潤(rùn)T細(xì)胞的腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)；圖4示腫瘤位點(diǎn)的CD4+和CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的 IL-10產(chǎn)生；圖5示腫瘤上清誘導(dǎo)Cox-2在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)； 圖6示CpG在DC和腹腔巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)Cox-2的表達(dá)； 圖7示促Thl的TLR配體也諸導(dǎo)分泌IL-10的T細(xì)胞； 圖8示TLR配體促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)； 圖9示TLR配體刺激DC產(chǎn)生IL-10和IL-12;圖10示TLR配體i秀導(dǎo)的DC中IL-10的產(chǎn)生通過ERK和p38 MAP 激酶的激活而介導(dǎo)；圖11示單獨(dú)的p38抑制劑單獨(dú)或聯(lián)合ERK抑制劑阻遏CpG誘導(dǎo)的 IL-10而增加IL-12產(chǎn)生；圖12示將p38抑制劑單獨(dú)或與ERK抑制劑一同加入外源抗原和CpG 刺激的樹突狀細(xì)胞可使之誘導(dǎo)Thl的能力增強(qiáng)并阻遏分泌IL-10的T細(xì)胞
的誘導(dǎo)；
圖13示將p38、 ERK和Cox-2抑制劑加入外源抗原和CpG刺激的樹 突狀細(xì)胞可使之誘導(dǎo)Thl的能力增強(qiáng)并阻遏分泌IL-10的T細(xì)胞的誘導(dǎo)；圖14示體內(nèi)Cox-2的抑制可阻遏CpG誘導(dǎo)的IL-10和TGF-p;
圖15示在引流淋巴結(jié)中抑制Cox-2增加了 CpG誘導(dǎo)的IL-27 mRNA 而減少了 IL-10 mRNA;
圖16示Cox-2的抑制阻遏了 DC中CpG誘導(dǎo)的IL-10而增強(qiáng)了 IL-12p40的產(chǎn)生；
圖17示Cox-2的抑制增加了 DC中CpGi秀導(dǎo)的IL-27 mRNA而減少 了了 IL-10 mRNA的表達(dá)；
圖18示Cox-2的抑制增加了 DC中CpG誘導(dǎo)的IL-12p35和IL-12p40 mRNA而減少了 IL-10 mRNA的表達(dá)；圖19示Cox-2抑制劑和CpG聯(lián)合用藥減弱了腫瘤生長(zhǎng)；
圖20示Cox-2抑制劑增強(qiáng)了 CpG對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的治療效果；
圖21示Cox-2抑制劑和CpG聯(lián)合用藥增加了肺瘤攻擊的小鼠的成活率；圖22示Cox-2或ERK抑制劑增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的治療效果；
圖23示Cox-2抑制劑增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞HSP-70疫苗的治療效果；
圖24示Cox-2抑制劑和HSP70疫苗聯(lián)合用藥增強(qiáng)了 DC中CD80的 表達(dá)；
圖25示ERK的抑制在樹突狀細(xì)胞中阻遏TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PGE2;
圖26示Cox-2抑制劑阻遏樹突狀細(xì)胞中TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PGEa和 IL-10產(chǎn)生；圖27示p38的抑制減少CpG誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生；
圖28示p38的抑制阻遏腫瘤疫苗和TLR激動(dòng)劑刺激的樹突狀細(xì)胞中 IL-10產(chǎn)生并增強(qiáng)了 IL-12產(chǎn)生；
圖29示p38的抑制增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞疫苗的治療效果；圖30示p38的抑制增強(qiáng)了腫瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細(xì)胞的治療 效杲；圖31示在存在p38抑制劑下，腫瘤細(xì)胞疫苗沖激的樹突狀細(xì)胞的治 療學(xué)給藥增加了小鼠的存活率；圖32示用全腫瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細(xì)胞治療增加了腫瘤中T 細(xì)月包IFN-y產(chǎn)生；圖33示用B16疫苗、CpG和p38抑制劑處理的樹突狀細(xì)胞治療增加 了腫瘤塊中CD4+T細(xì)胞的頻率但減少了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率；圖34示瘤周(pertumoural)注射CpG和p38抑制劑增加成活率；圖35示pI3K抑制劑增強(qiáng)了腫瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細(xì)胞的治療 效果；圖36示移植肺瘤疫苗、CpG和pI3激酶抑制劑沖激的樹突狀細(xì)胞增加 了患有生長(zhǎng)腫瘤的小鼠的成活率；圖37示以CpG為佐劑的p38抑制劑增強(qiáng)了無細(xì)胞百日咳疫苗的保護(hù) 效果；圖38示p38抑制劑對(duì)以CpG為佐劑的無細(xì)胞百日咳疫苗的反應(yīng)增加 了 IFN-y而減少IL-10;圖39示p38抑制劑對(duì)以CpG為佐劑的無細(xì)胞百日咳疫苗的反應(yīng)減少 了 IL-10;圖40示在以CpG為佐劑的非細(xì)胞性百日咳疫苗中加p38抑制劑增加 小鼠受百日咳桿菌攻擊后的局部IL-l卩；圖41以腫瘤疫苗、TLR激動(dòng)劑和p38抑制劑對(duì)小鼠治療性免疫化后 減少了 B16腫瘤生長(zhǎng)，和圖42示在IL-10缺陷型小鼠中腫瘤生長(zhǎng)未顯著惡化。
小鼠BALB/c和C57BL/6小鼠購(gòu)于Harlan UK公司(Bicester, Oxon， U.K.)。 DO.11.10OVAT細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠于室內(nèi)飼養(yǎng)。所有小 鼠按照愛爾蘭衛(wèi)生部的規(guī)定和指導(dǎo)保持特定的無病原狀態(tài)。腫瘤系CT26結(jié)腸癌來源的細(xì)胞系保持于加10%熱滅活的FCS的RPMI 1640 中，皮下注射(s.c.)攻擊時(shí)在BALB/c小鼠中形成實(shí)體瘤。B16F10腫瘤 細(xì)胞系保持于加10%熱滅活的FCS的DMEM中，皮下攻擊時(shí)在C57BL/6 小鼠中形成實(shí)體瘤。除另有申明外，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)it型中均向小鼠注射了 2xl05 個(gè)肺瘤細(xì)月包。腹腔巨噬細(xì)胞用5毫升溫暖培養(yǎng)基洗滌腹腔。將細(xì)胞置培^中，2小時(shí)后移除非 黏附細(xì)胞。黏附細(xì)胞以106每毫升濃度放置。熱激-輻射的B16腫瘤細(xì)月包B16腫瘤細(xì)胞于43。C孵育一^J、時(shí)。然后于20KGy輻射細(xì)胞，后于37 。C孵育4小時(shí)。將細(xì)胞以1: 1比例加入BMDC。腫瘤對(duì)增殖和細(xì)胞因子反應(yīng)對(duì)不相關(guān)抗原的影響D011.10小鼠于腋下皮下單獨(dú)注射200嗎OVA或與2xl()S個(gè)CT26細(xì) 胞一同注射。7天后以200嗎OVA注射小鼠，14天后制備淋巴結(jié)細(xì)胞懸 浮系并于96孔圓底板、37°C、 5%C02、 2xl()6/ml濃度與OVA(50、 100和 500pg/ml)共同培養(yǎng)。3天后移除上清，用雙位點(diǎn)ELISA檢測(cè)IFN-y濃度。 4天培養(yǎng)后，每孔加入2pC"H標(biāo)記的胸苷(Amersham)。 96孔板再孵育 6小時(shí)，之后收集細(xì)胞(Tomtec Harvester 96 March III M)至Filtermat噴 霧千燥器，用P計(jì)數(shù)儀(1450MicroTrilux，Wallac)確定每分鐘閃爍計(jì)數(shù)(cpm) 值。疫苗
小鼠皮下注射鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH; 5嗎)、KLH和CpG-ODN (25 jxg)、 脂多糖(20嗎)、PolylC(25嗎)、滅活的百日咳桿菌(lxlO"或霍亂毒素(CT) (10ng)使之免疫化。間接體內(nèi)細(xì)胞因子反應(yīng)C57BL/6小鼠腋下注射100 pl的CpG(lO嗎)或Cox-2抑制劑 Celecoxib(100嗎)。2小時(shí)和6小時(shí)后移出引流腹股溝淋巴結(jié)，過篩并重懸 于1 ml PBS。 ELISA法測(cè)上清中IL-10和TGF-(3的S/N，從細(xì)胞中提取 mRNA，用RT-PCR測(cè)IL-10和IL-27p28?？乖禺愋约?xì)胞因子的產(chǎn)生將免疫7天后移出的淋巴結(jié)或脾臟細(xì)胞(2xl06/ml )培養(yǎng)于含KLH (50 Hg/ml)、超聲粉碎的百日咳桿菌(5|ig/ml)或僅培養(yǎng)基中。72小時(shí)后移出 上清，ELISA方法4企測(cè)IL-4、 IL-10和IFN-Y的濃度。抗原特異性T細(xì)胞系KLH特異性CD4+T細(xì)胞系建立自免疫了 KLH和CpG-ODN的小鼠脾 臟或、淋巴結(jié)，脾臟或、淋巴結(jié)通過抗原(10 pg/mlKLH)和抗原呈遞細(xì)胞的 刺激而免疫化。特定情形下于培養(yǎng)起始時(shí)加抗IFN-y或IL-12和抗IL-IO。 抗原再刺激2-3輪后建立的T細(xì)胞系培養(yǎng)于KLH (10 ng/ml)和APC; 3 天后用ELISA測(cè)上清中IFN-y、 IL-4和IL-10的濃度。淋巴結(jié)細(xì)胞與抗原 (KLH或在一些實(shí)驗(yàn)中為百日咳桿菌抗原)共同培養(yǎng)，6天后用于細(xì)胞內(nèi) 染色。阻遏物檢測(cè)免疫了 KLH和CpG-ODN的小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)于加IL-12的KLH，以 產(chǎn)生KLH特異性Thl型T細(xì)胞系。通過抗IFN-y存在下進(jìn)行初代培養(yǎng)， 從自免疫了 KLH和CpG的小鼠中建立分泌IL-10且分泌少量或不分泌 IFN- Y或IL-4的Trl型細(xì)胞系。通過培養(yǎng)來自免疫了 KLH、帶抗原的CpG 和APC且未加細(xì)胞因子或抗體的小鼠脾臟細(xì)胞，建立表達(dá)IFN-y和IL-10 的Thl Tr型T細(xì)胞系。Thl細(xì)胞系(lxloVml)僅與APC (受輻射的脾臟 細(xì)胞；2xl09ml)和KLH共培養(yǎng)或在Trl或ThlTr細(xì)胞存在下以1: 3、 1:l或3: 1的比例培養(yǎng)。3天后移除上清，ELISA檢測(cè)IFN-y濃度。結(jié)果表 示為與對(duì)單獨(dú)Thl細(xì)胞的反應(yīng)的相對(duì)值。DC激活骨髓來源的未成熟DC (BMDC)通過用GM-CSF(40 ng/ml)培養(yǎng)提取 的骨髓細(xì)胞10天產(chǎn)生。來自BALB/c或C57BL/6小鼠的BMDC用1 ng/ml -10iig/ml的TLR激動(dòng)劑、Pam3CSK4、酵母多糖、脂多糖、鞭毛蛋白、 PolyIC、 CpG-ODN或僅培養(yǎng)基孵育。在抑制試驗(yàn)中，活化的細(xì)胞用或未用 MEK1/2(ERK)抑制劑U0126(1.25-5 ^M)、 Cox-2抑制劑NS-398 (0.1-10 ^M) 或p38抑制劑SB203580(0.1-10nM)預(yù)處理(1小時(shí))。也用各種濃度的B16 上清(S/N)處理BMDC 24小時(shí)。通過培養(yǎng)5xl05 B16細(xì)胞/ml —周并移 除消耗的培養(yǎng)基制備B16S/N。 6或24小時(shí)后移出上清，用ELISA檢測(cè)細(xì) 胞因子濃度，或勻漿化細(xì)胞，RT-PCR分析所得mRNA。DC轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)活化的C57BL/6小鼠BMDC用CpG(5嗎)和KLH(5嗎)孵育，用 Cox-2(NS-398:5 pM)、 p38 ( SB203580: 1 一)和ERK(U0126: 5 pM)的抑 制劑組合預(yù)處理。將2.5xl()S個(gè)處理的細(xì)胞注射到每足墊中。5天后移出胭 窩淋巴結(jié)和脾臟，單細(xì)胞懸液用KLH(2、 10、 50 pg/ml)再刺激。3天后移 出S/N， ELISA測(cè)等份試樣的IFN-y和IL-10。為進(jìn)行腫瘤實(shí)驗(yàn)，用2.5xl(^個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下注射攻擊C57BL/6 小鼠，從第三天開始，以一周為間隔向腫瘤位點(diǎn)皮下注射3次處理的 BMDC(l-5x105)。用加CpG(5 pg/ml)或Cox-2抑制劑Celecoxib(5 nM)和 ERK抑制劑U0126(5 nM)之一的熱激的-輻射的B16腫瘤細(xì)胞加載到 BMDC中24小時(shí)。小鼠進(jìn)行常規(guī)管理以生長(zhǎng)肺瘤。受調(diào)節(jié)的DC對(duì)T細(xì)胞的體外激活來自BALB/c的DC用OVA CLASS II肽(5昭)孵育。細(xì)胞兼用CpG(10 嗎)或p38抑制劑SB203580(1或5 ^M)之一和ERK抑制劑U0126(5 pM)刺 激24小時(shí)。然后將D011.10VA-TCRT細(xì)胞加入BMDC中(10: 1)。 3天 和11天后移出上清，ELISA才企測(cè)等份試樣的IL-10和IFN-y。
腫瘤直接治療用2xl()S個(gè)腫瘤細(xì)胞皮下注射攻擊C57BL/6小鼠，在第3、 5、 7天時(shí) 用CpG(lO或20 pg)、 Cox-2抑制劑Celecoxib(100或500嗎)或兩者的組合 皮下注射腫瘤位點(diǎn)。小鼠進(jìn)行常少見管理以生長(zhǎng)腫瘤和^f吏之存活。用卡尺測(cè) 量腫瘤的二維尺寸并用以下公式計(jì)算大小(寬、長(zhǎng))x兀/6,此處寬指較小 測(cè)量值。當(dāng)腫瘤的測(cè)量長(zhǎng)度大于15mm時(shí)將小鼠殺死。Western印跡分析DC于lxl06/ml濃度與TLR配體一起培養(yǎng)15分鐘至8小時(shí)。在特定 實(shí)驗(yàn)中，于TLR配體前1小時(shí)加入ERK或p38抑制劑。細(xì)胞裂解物用 SDS-PAGE重新溶解，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜并用磷酸化p38 (pp38; Cell Signal Technology,MA， USA)或石粦酸化ERK (pERK; Santa Cruz Biotechnologies, USA)的特異性抗體和連接辣根過氧化物酶的二抗印跡。剝離硝酸纖維素并 用總p38或總ERK特異性的抗體為探針雜交。利用磁性細(xì)胞分選純化T細(xì)胞從淋巴結(jié)、肺或手術(shù)移出的腫瘤制備細(xì)胞懸浮系。用培養(yǎng)基洗滌組織 樣品，用解剖刀片充分切碎，在加0.1 。/。膠原酶D (Sigma)的Hanks平衡 液中于37。C孵育30分鐘。細(xì)胞懸浮物通過70 urn細(xì)胞濾網(wǎng)裂解紅細(xì)胞。 將細(xì)胞洗滌、計(jì)數(shù)后重懸于加10 pl抗CD4或抗CD8磁珠(Miltenyi Biotech) 的90 ^ MACS緩沖液中，于4 - 8'C孵育15分鐘。將MACS緩沖液(2 ml) 加入每個(gè)樣品中，然后于300xg離心10分鐘。然后將每個(gè)樣品重懸于500 pi的MACS緩沖液中，利用AutoMacs(Miltenyi Biotech)分選。流式細(xì)胞儀分析和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色自淋巴結(jié)、肺或腫瘤制備單細(xì)胞懸浮系。在加0.1 。/o膠原酶D( Sigma) 的Hanks平衡液中消化肺或腫瘤。用PMA(10 ng/ml)和離子霉素(1 pg/ml) 刺激細(xì)胞1小時(shí)，然后加入布雷菲德菌素A (10 pg/ml),于37°C4小時(shí)。 用CD4 (Caltag )、 CD8(BD Pharmingen)、 CDllc(BD Pharmingen)或F4/80 (Caltag )特異性抗體重懸細(xì)胞。然后用50^1固定培養(yǎng)基A( Fix&Perm細(xì) 胞滲透試劑盒，Caltag Laboratories)固定細(xì)胞。用50 pi固定培養(yǎng)基B (Fix&Perm細(xì)月包透4匕試劑盒，Caltag Laboratories )和5 (il抗IL-10或抗 IFN-y抗體(BD Pharmingen)孵育細(xì)胞，并在FACScalibur 上用 CELLQuestTM軟件(Becton-Dickson, San Jose， CA)進(jìn)行免疫熒光分析。反轉(zhuǎn)錄酶-PCR利用TriReagent(SigmaAldrich)從脾、肺、淋巴結(jié)或腫瘤細(xì)胞或純化的 CD4+和CD8+ T細(xì)胞中提取RNA，用Superscript II RT(Invitrogen)和 01igodT(n-i8)引物(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄。利用鼠TGF-(3(有義AGACGGAATACAGGGCTTTCGATTCA CTTGGGCTTGCGACCCACGTAGTA) 、 CTGGACAACATACTGCTAACCGAC , TTCATTCATGGCCTTGTAGACACC) 、 CAGCTGCCTACAGTGCCCCTA，反義反 義IL-IO( 有 義反 義Foxp3( 有 義Cox誦2( 有 反. IP畫IO(反義 義有 義 義CATTTGCCAGCAGTGGGTAG) 、 GTATCAGAACCGCATTGCCTCTGA CGGCTTCCAGTATTGAGGAGAACAGAT) CGCACCTCCACATAGCTTACAG CCTATCCTGCCCACGTGTTGAG) 、 IL-23pl9( 有 義TCTCGGAATATATGCATGC，反義CTGGAGGAGTTGGCTGAGTQ 、 IL-15( 有 義CATATGGAATCCAACTGGATAGATGTAAGATA， 反 義CATATGCTCGAGGGACGTGTTGATGAACAT)和肌動(dòng)蛋白(有義 GGACTCCTATGTGGGTGACGGG，反義TGCCAATAGTGATGACTTGGC)特異性引物與2嗎樣品cDNA，以及Taq 聚合酶(Promega)和Peltier熱循環(huán)儀擴(kuò)增。熱激蛋白(HSP)涉及較多產(chǎn)自蛋白降解過程的細(xì)胞肽。任何細(xì)胞(例 如腫瘤細(xì)胞)來源的HSP制備物都含該細(xì)胞的一個(gè)肽謙系。用HSP肽復(fù) 合物接種可產(chǎn)生抗此肽的T細(xì)胞反應(yīng)。
HSP70-肺瘤肽復(fù)合體的純化將B16月中瘤細(xì)胞(lx106)注射到C57BL/6小鼠中，14天后將小鼠殺 死，移出腫瘤。在4倍體積低滲緩沖液(2 mM NaHC03， PMSF pH 7.1 )中 勻漿化腫瘤，于100，000g離心后回收上清。將樣品轉(zhuǎn)移到PD10柱中的緩 沖液D中(20 mM Tris-乙酸，20 mM NaCl， 15 mM P-巰基乙醇，3 mM MgCl2, 0.5 mM PMSF, pH 7.5 )。將樣品直接上樣于緩沖液D平衡的ADP-瓊脂糖柱 (5ml)。用含0.5MNaCl的緩沖液D洗柱，之后單獨(dú)用緩沖液D洗，直 到用蛋白分析檢測(cè)不到蛋白為止。最后用含3mMADP的緩沖液D于室溫 下孵育柱子30分鐘，之后用相同緩沖液(25 ml)洗脫。用Bradford蛋白 才企測(cè)方法對(duì)HSP70定量。制備物的純度用銀染膠估測(cè)，其特異性用Western 印跡和特異性抗體檢測(cè)。實(shí)施例1-CT26腫瘤生長(zhǎng)抑制T細(xì)胞對(duì)無關(guān)抗體的響應(yīng) 才才料和方法用OVA (200昭)單獨(dú)或與2x 105個(gè)CT26細(xì)胞皮下注射DO.11.10 小鼠。7天后注射200 p g OVA且14天后用OVA再刺激淋巴結(jié)細(xì)胞，4天 后檢查增殖情況(圖1A),并在3天后測(cè)定移出的上清液中的IFN-y的濃 度(圖1B)。結(jié)果為每組5只小鼠的平均值土SD且一式三份進(jìn)行化驗(yàn)。 OVA對(duì)比OVA + CT26 ,方差分析"PO.Ol, ***P<0.001。結(jié)果為了測(cè)驗(yàn)這種可能性，即在腫瘤生長(zhǎng)期間不能生成有效的獲得性免疫 應(yīng)答可能是由于腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生了免疫抑制性環(huán)境，我們檢查了生長(zhǎng)著的胂 瘤對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答無關(guān)抗原的影響。OVA-TCRTg小鼠在存在或不存在CT26 細(xì)胞時(shí)于皮下注射OVA，且在7天后，給小鼠注射OVA,并在14天后殺 死小鼠。移出引流淋巴結(jié)并檢驗(yàn)OVA特異的T細(xì)胞增殖和IFN-y的產(chǎn)量。 與僅用OVA注射的小鼠比較，用CT26細(xì)胞和OVA攻擊的小鼠中OVA特 異性T細(xì)胞增殖顯著減少(圖1A)。與CT-26細(xì)胞的聯(lián)合給藥也顯著減少 了淋巴結(jié)中ova-特異性IFN-y的產(chǎn)量(圖ib ),證實(shí)生長(zhǎng)著的ct26胂瘤
阻遏對(duì)其它抗原的免疫應(yīng)答，特別是在注射的位點(diǎn)。實(shí)施例2-生長(zhǎng)著的腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生 才才泮+和方法從培養(yǎng)的CT-26細(xì)胞提取RNA,用對(duì)IL-IO、 TGF-卩、IL-23pl9、 IL-15 和IP-10特異的引物進(jìn)行RT-PCR (圖2A )。培養(yǎng)的CT26細(xì)胞的上清液中 的TGF-P蛋白質(zhì)用ELISA定量(圖2B )。從體外培養(yǎng)的CT26細(xì)胞或者從 攜帶皮下CT26腫瘤的小鼠上切下的實(shí)體CT26腫瘤的勻漿中提取RNA(集 合5只小鼠的RNA),用對(duì)IL-10和(3-肌動(dòng)蛋白特異性引物進(jìn)行RT-PCR (圖2C )。結(jié)果代表3次試驗(yàn)。用CT26細(xì)胞靜脈(圖3A)或者皮下(圖3B )注射BALB/c小鼠(每 組5只)。腫瘤攻擊后14天，從原態(tài)(N)和荷瘤小鼠(T)中取得淋巴結(jié) (LN)和皮下腫瘤塊(T)或肺。用》茲性細(xì)胞分選法分離CD4+和CD8+細(xì) 胞，用IL-10和TGF-p特異性引物進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果為了檢測(cè)在胂瘤生長(zhǎng)過程中免疫抑制的可能介質(zhì)，我們測(cè)定了體外培 養(yǎng)的腫瘤和間接體內(nèi)生長(zhǎng)著的腫瘤中的促進(jìn)和抗炎性細(xì)胞因子的mRNA 的表達(dá)。對(duì)培養(yǎng)的CT26腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測(cè)證實(shí)了抗 炎性細(xì)胞因子、TGF-(3的mRNA的表達(dá)(圖2A)。而且，在生長(zhǎng)著的腫瘤 上清液中檢測(cè)到TGF-p蛋白質(zhì)(圖2B)。在CT26細(xì)胞中也有Cox-2、 IL-23pl9、 IL-15和IP-10 mRNA的表達(dá)(圖2A )，但我們沒能檢測(cè)到IL-ip、 IL-2、 IL-5、 IL-6、 IL畫IO、 IL-12p35、 IL-12p40、 IL-13、 IL畫18、 IL-27p28、 IL-27EB13、 TNF-a和IFN々的mRNA的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然在體外 培養(yǎng)的腫瘤中不能檢測(cè)到IL-10 mRNA (圖2A),甚至在用PMA刺激細(xì)胞 后也不能(數(shù)據(jù)未顯示)，但是在間接體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞塊中探測(cè)到(圖2C )， 表明細(xì)I包體內(nèi)浸潤(rùn)腫瘤的細(xì)月包分泌IL-IO。于是我們用RT-PCR法檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞塊、肺中和引流淋巴結(jié)中的T 細(xì)胞IL-10和TGF-P mRNA的表達(dá)。從CT26肺轉(zhuǎn)移小鼠的肺和頸淋巴結(jié)及皮下注射CT26細(xì)胞小鼠的實(shí)體瘤和腹股溝淋巴結(jié)中純化CD4+和CD8+ T細(xì)胞。與原態(tài)小鼠的淋巴結(jié)相比，肺CD4+T細(xì)胞中IL-10mRNA的組成 性表達(dá)高。與原態(tài)小鼠的肺T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的相比，荷瘤小鼠的肺的004+ 和CD8+T細(xì)胞兩者中IL-10的表達(dá)都大量的提高了 ，但是在肺轉(zhuǎn)移小鼠的 頸淋巴結(jié)中IL-10 mRNA表達(dá)變化小(圖3A)。此外，與原態(tài)小鼠相比， 從CT26肺轉(zhuǎn)移瘤攜帶的小鼠的肺純化出的CD4+和CD8+T細(xì)胞中TGF-(3 mRNA的表達(dá)都急劇增高，淋巴結(jié)變化小(圖3C)。從皮下注射CT26的 小鼠的實(shí)體瘤純化出的CD4+和CD8+中都檢測(cè)到高的IL-10的表達(dá)(圖 3B )。用CD26細(xì)胞皮下攻擊14天后的小鼠的腹股溝淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞 中IL-10 mRNA表達(dá)和CD8+T細(xì)胞中TGF-|3 mRNA表達(dá)都有少量增加(圖 3B)。然而，在腹股溝淋巴結(jié)中TGF-P表達(dá)為高的組成性表達(dá)。這些結(jié)果 表明CT26腫瘤的生長(zhǎng)增強(qiáng)了肺中已具免疫抑制性的環(huán)境和促進(jìn)表達(dá)IL-IO 和TGF-P的CD4+和CD8+T細(xì)月包對(duì)腫瘤位點(diǎn)的浸潤(rùn)。實(shí)施例3- CD26腫瘤塊內(nèi)CD4+T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)增強(qiáng) 才才料和方法BALB/c小鼠(每組5只)靜脈(i.v.)(圖3A)或皮下(s.c.)(圖3B ) 注射CT26細(xì)胞。腫瘤攻擊后14天從原態(tài)(N)和荷瘤小鼠(T)中取得 淋巴結(jié)(LN)和皮下腫瘤塊(T)或肺。用磁性細(xì)胞分選法分離CD4+和 CD8+T細(xì)胞，分離RNA且用Foxp3特異性引物進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果已證實(shí)生長(zhǎng)期間T細(xì)胞表達(dá)IL-10和TGF-p在生長(zhǎng)胂瘤中積累后，我 們檢測(cè)了天然Treg細(xì)胞募集到腫瘤位點(diǎn)的可能性。CD4+和CD8+T細(xì)胞從 皮下模型的腹股溝淋巴結(jié)及實(shí)體瘤和肺轉(zhuǎn)移模型的腹股溝淋巴結(jié)及肺中 純化出來，且用Foxp3特異性引物進(jìn)行RT-PCR。與原態(tài)小鼠的相同組織 相比，在肺轉(zhuǎn)移模型中，從荷瘤小鼠的肺和引流淋巴結(jié)純化出的CD4+T細(xì) 胞中Foxp3的表達(dá)急劇增加(圖3A)。在浸潤(rùn)的皮下腫塊的CD4+T細(xì)胞中 也檢測(cè)到Foxp3的表達(dá)(圖3B)。與肺模型不一樣，F(xiàn)oxp3的表達(dá)在具皮下肺瘤的小鼠的引流淋巴結(jié)中未增強(qiáng)。在來自原態(tài)或者荷瘤小鼠的任何組織的CD8+T細(xì)胞中未檢測(cè)到Foxp3的表達(dá)。實(shí)施例4-高頻率的分泌IL-10的CD4和CD8 T細(xì)胞和低頻率的分泌IFN-y 的T細(xì)胞"浸潤(rùn)生長(zhǎng)腫瘤材料與方法分別用2 x 105或3 x 105個(gè)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞皮下或靜脈注射BALB/c 小鼠。按指示的天數(shù)切除實(shí)體皮下腫瘤或肺。用PMA和離子霉素刺激細(xì) 胞且用表面CD4、 CD8和細(xì)胞內(nèi)IL-10和IFN-Y特異性抗體標(biāo)記，然后進(jìn) 行了免疫熒光分析(圖4A)。結(jié)果已證實(shí)了在生長(zhǎng)著的腫瘤中存在分泌IL-10和Foxp3+的T細(xì)胞后， 我們運(yùn)用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)期間效應(yīng)T細(xì)胞和募集到肺 或胂瘤塊的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相對(duì)頻率。用CT26細(xì)胞皮下或靜脈攻擊小鼠， 在3或14天后取下腫瘤，且進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色以檢測(cè)標(biāo)記了表面 CD4或CD8的T細(xì)胞上的IL-10和IFN-y。在荷CT26轉(zhuǎn)移的小鼠的肺和 皮下注射CT26細(xì)胞的小鼠的腫瘤塊中探測(cè)到分泌IL-10的CD4+和CD8+ T 細(xì)胞為高頻率(24-37%)(圖4A)。相比之下，僅有6-7%CD4+ T細(xì)胞和 9-27%的CD8+ T細(xì)胞分泌IFN-y (圖4A )。實(shí)施例5-分泌IL-10的巨噬細(xì)胞和DC浸潤(rùn)生長(zhǎng)肺瘤 材料和方法用3 x 105個(gè)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞靜脈注射BALB/c小鼠，取下原態(tài)小鼠 (第0天)或者腫瘤攻擊后3和14天的小鼠的肺。用表面CDllc及F4/80 和細(xì)胞內(nèi)IL-10特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行免疫熒光分析(圖4B)。結(jié)果已才艮道巨噬細(xì)胞和DC分泌的天然的IL-10,在來自外周原態(tài)T細(xì)胞 的可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化中起關(guān)鍵作用。已證實(shí)在CT-26轉(zhuǎn)移瘤發(fā)展過程 中，分泌IL-10 T細(xì)胞募集到肺，于是我們檢驗(yàn)了這可能涉及募集和肺中 產(chǎn)生IL-10的巨噬細(xì)胞或DC的激活的可能性。用CT26細(xì)胞靜脈攻擊小鼠， 且在3或14天后取下肺和頸淋巴結(jié)，并對(duì)用表面CDllc或F4/80標(biāo)記的 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。肺中CT26腫瘤的發(fā)育與巨噬細(xì)胞和DC 到肺上的募集相關(guān)，且這些天然細(xì)胞中有高比例的細(xì)胞分泌IL-IO(圖4B)。 在腫瘤攻擊3天和14天后，原態(tài)小鼠的肺中CDllc+細(xì)胞的百分率從11% 分別增加到17%和34%,而在腫瘤攻擊14天后，原態(tài)小鼠的肺中F4/80+ 細(xì)胞的百分率從原態(tài)小鼠的12%增加到27%。并且腫瘤攻擊后14天，79% 的浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞和38%的浸潤(rùn)DC分泌IL-IO。相比之下，肺瘤攻擊后3 和14天，淋巴結(jié)中CDllc+和F4/80+細(xì)胞的百分率低于原態(tài)對(duì)照小鼠。而 且，這些細(xì)胞分泌IL-10的頻率很低且在腫瘤攻擊后不發(fā)生顯著改變。實(shí)施例6-B16腫瘤誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Cox-2的表達(dá) 材料和方法骨髓來源的樹突狀細(xì)胞或C57BL/6小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞與多種B16 上清液的稀釋液溫育24小時(shí)。勻漿細(xì)胞，用Cox-2特異性引物RT-PCR分 析生成的mRNA，并與J3-肌動(dòng)蛋白表勤目比。通過培養(yǎng)5 x 105個(gè)B16細(xì) 胞/ml—個(gè)星期，制備B16上清液，然后去掉消耗的培養(yǎng)基。結(jié)果Cox-2抑制劑多次成功地用于治療癌癥。已表明Cox-2和Cox-2誘導(dǎo) 的PGE2可促ii^達(dá)Foxp-3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。我們已經(jīng)顯示CT26腫瘤表 達(dá)Cox-2mRNA。在此我們用B16腫瘤細(xì)胞系檢驗(yàn)了腫瘤細(xì)胞也可能誘導(dǎo) Cox-2在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)的可能性。用來自生長(zhǎng)著的B16 細(xì)胞的上清液刺激骨髓來源的DC或腹膜巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)DC和巨嗟細(xì)胞 中Cox-2 mRNA表達(dá)(圖5 )。因此腫瘤細(xì)胞不^J^達(dá)Cox-2，也誘導(dǎo)Cox-2 在先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中的表達(dá)。
實(shí)施例7-CpG-ODN誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Cox-2的表達(dá) 材料和方法C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC和IIJ^巨噬細(xì)胞與多種濃度的CpG溫 育24小時(shí)。勻漿細(xì)胞，用Cox-2特異性引物進(jìn)行RT-PCR分析生成的 mRNA，并與(3-肌動(dòng)蛋白表達(dá)對(duì)比。結(jié)果CpG-ODG作為胂瘤的治療物和傳染性疾病疫苗的佐劑而被測(cè)試。它 們的潛力基于它們能增強(qiáng)先天性免疫應(yīng)答，特別是IL-12和通過在先天性 免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中與TLR9相互作用，從而得到的獲得 性免疫力。然而TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不局限于炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，如IL-12的 產(chǎn)生，其它介質(zhì)也被激活。我們檢測(cè)了在先天性免疫細(xì)胞中CpG對(duì)Cox-2 誘導(dǎo)的影響。在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，CpG劑量依賴性誘導(dǎo)樹突狀細(xì) 胞和巨噬細(xì)胞中Cox-2 mRNA的表達(dá)(圖6 )。既然Cox-2可能有助于血管 生成和抗炎反應(yīng)，這是腫瘤治療或者作為癌癥或傳染性疾病疫苗的佐劑時(shí) 需要避免的。實(shí)施例8-TLR配體謙導(dǎo)具調(diào)節(jié)活性的分泌IL-10 T細(xì)胞，也誘導(dǎo)分泌IFN-y 的Thl細(xì)胞^材料和方法用僅PBS、 KLH ( 5嗎)或KLH和CpG-ODN ( 25 pg)、 LPS(1嗎)、 PloylC(25 )Lig)、滅活的百日咳桿菌全細(xì)胞疫苗(Pw)或CT (10ng)免 疫BALB/c小鼠。7天后用KLH ( 50 pg/ml)和IFN-y刺激小鼠引流淋巴結(jié) 細(xì)胞，3天后ELISA法測(cè)定IL-4和IL-10濃度(圖7 )。CD4+ T細(xì)胞系通過KLH免疫小鼠建立，且CpG-ODN用KLH (10 pg/ml)和APC剌激(圖8A )。在存在抗-IFN-y時(shí)，林系6和7最初用抗 原刺激，其在模擬培養(yǎng)時(shí)加入(在多個(gè)重培養(yǎng)步驟中通過沖洗取得)以防 止分泌IFN-y T細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。檢測(cè)T細(xì)胞系中通過用抗原和APC刺激 產(chǎn)生的IFN國(guó)y和IL-10 (圖8a )。 PBS (對(duì)照)或KLH和CpG-ODN免疫的小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞用KLH (50ng/ml)刺激，6天后用PMA和離子霉素再刺激6小時(shí)(圖8B)。最 后4小時(shí)加入布雷菲德菌素A ( 10 pg/ml)。對(duì)CD4+細(xì)胞門控后進(jìn)行免疫 焚光分4斤測(cè)定細(xì)月包內(nèi)IL-10和IFN-y (圖8B )。在存在IL-12和抗IL-10時(shí)，通過培養(yǎng)T細(xì)胞，從KLH和CpG-ODN 免疫的小鼠建立了分泌高濃度IFN-y和低或無IL-4和IL-10的Thl細(xì)胞系 (圖8C)。在存在抗-IFN-y時(shí)，通過初始培養(yǎng)建立一種Trl型細(xì)胞系，其 分泌IL-10且低水平或不分泌IFN-y或IL-4，且在不加細(xì)胞因子或抗體時(shí)， 通過與抗原和APC培養(yǎng)建立混合分泌IFNi和IL-10的T細(xì)胞系(稱為 ThlTr)。 Thl細(xì)胞系與APC和單獨(dú)的抗原或在存在比率為1: 3、 1: l或 3: 1的Trl或Thl細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)。3天后移去上清液，ELISA法測(cè)定IFN-丫 的濃度(圖8C)。結(jié)果以相對(duì)于單獨(dú)Thl細(xì)胞的反應(yīng)表示。結(jié)果已有大量的報(bào)道認(rèn)為TLR配體，如CpG或LPS選擇性誘導(dǎo)Thl應(yīng)答， 或者在有某些TLR-2激動(dòng)劑的情況下，誘導(dǎo)Th2應(yīng)答。我們測(cè)定了 TLR 配體在指導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)模型旁觀抗原KLH的應(yīng)答時(shí)的作用。單獨(dú)用KLH免 疫產(chǎn)生分泌IL-10和低濃度的IL-4但無IFN-y的T細(xì)胞。聯(lián)合應(yīng)用TLR配 體、CpG-ODN、 LPS或PolyIC,產(chǎn)生分泌高濃度IFN個(gè)但分泌低或檢測(cè) 不到IL-4的T細(xì)胞，細(xì)胞因子表達(dá)鐠與Thl細(xì)胞誘導(dǎo)的一致(圖7 )。然而，除了 IFN-y,在存在TLR配體時(shí)，從來自KLH免疫小鼠的抗 原刺激的淋巴結(jié)細(xì)胞的上清液中，在也檢測(cè)到顯著的IL-10 (但不是IL-4) (圖6 )。滅活的百日咳桿菌和百日咳全細(xì)胞疫苗具有有效的佐劑活性。在 此我們發(fā)現(xiàn)滅活的百日咳桿菌促進(jìn)了抗原特異性T細(xì)胞的謙導(dǎo)，其分泌 IL-10和IFN-y到聯(lián)合應(yīng)用的抗原KLH上。相比之下，我們先前已經(jīng)顯示 了 ，用CT免疫誘導(dǎo)Trl和Th2細(xì)胞，增強(qiáng)KLH-特異性IL4和IL-10的產(chǎn) 生。KLH特異性CD4+ T細(xì)胞系從免疫小鼠產(chǎn)生，表明用KLH和CpG-ODN (圖8A)免疫產(chǎn)生僅分泌IFN-y或IFN-y和IL-10的T細(xì)胞。當(dāng)T細(xì)胞系 產(chǎn)生自用抗原和CpG-ODN或者百日咳桿菌免疫的小鼠，在存在抗-IFN-y (其后來通過多個(gè)清洗步驟和再培養(yǎng)步驟取得)時(shí)，通過體外初始培養(yǎng)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，這些T細(xì)胞分泌IL-10,但不分泌IFN-7和IL-4 (圖8A)。 這些結(jié)果表明促進(jìn)Thl佐劑也產(chǎn)生分泌IL-10的Trl型T細(xì)胞和分泌IL-10 和IFN-Y的T細(xì)胞，其叫4故Thl Tr細(xì)胞。對(duì)來自KLH和CpG-ODN免疫 的小鼠的CD4+ T細(xì)胞上進(jìn)4亍細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，也顯示有明顯的單獨(dú) 分泌IFN-y或IL-10或分泌IFN-y和IL-10的細(xì)胞群(圖8B ),證實(shí)這種 TLR激動(dòng)劑促進(jìn)Thl及Trl細(xì)胞和分泌兩種細(xì)胞因子的獨(dú)特細(xì)胞群的誘 導(dǎo)。接著我們檢測(cè)了由KLH和CpG-ODN免疫誘導(dǎo)的抗原特異的IL-10或 分泌IL-10和IFN-y的T細(xì)胞對(duì)建立的KLH特異性CD4+ Thl細(xì)胞系的阻 遏功能。這種Thl細(xì)胞系從KLH和CpG-ODN免疫小鼠上建立且在當(dāng)應(yīng) 答抗原和APC刺激時(shí)，分泌高濃度的IFN-y。在存在中和抗-IFN-y抗體時(shí)， 通過初始培養(yǎng)，也從KLH和CpG-ODN免疫的小鼠的脾細(xì)胞，擴(kuò)增分泌 IL-IO，但不分泌IFN-y或IL-4的Trl細(xì)胞。以3: 1、 1: 1和1: 3的比率， 這些Trl細(xì)胞顯著的阻遏Thl細(xì)胞中IFN-y產(chǎn)生，在Trl細(xì)胞數(shù)量最高時(shí) 觀察到的阻遏最高(圖8C)。 Thl 'Tr細(xì)胞，其分泌IFlSPy和IL-10,也阻 遏IFN-y的分泌，但僅在l: l和3: 1的比率。這些結(jié)果表明除了誘導(dǎo)效 應(yīng)IFN-y分泌型細(xì)胞，CpG-ODG憑其抑制活性可同時(shí)促進(jìn)T細(xì)胞的誘導(dǎo)。實(shí)施例9-TLR配體通過激活ERK和p38誘導(dǎo)DC IL-10產(chǎn)生 材泮+和方法將DC與1 n/ml-10 pg/ml Pam3CSK4( Pam3 )、酵母多糖(Zym )、 PolyIC、 LPS、鞭毛蛋白(Flag)、 CpG-ODN或僅培養(yǎng)基溫育。24小時(shí)后，移去上 清液，用ELISA法測(cè)定IL-IO、 IL-12p40和IL-12p70的濃度。NT表示未 才全測(cè)(圖9 )。將DC與MEK 1/2抑制劑(U0126)預(yù)溫育1小時(shí)，然后〗又與培養(yǎng)基 或與Pam3Cys、酵母多糖、LPS、鞭毛蛋白或CpG-ODN (1或5 pg/ml) 溫育15分鐘。裂解細(xì)胞并用pERKl和pERK2特異性抗體進(jìn)行Western雜
交(圖IOA)。僅用培養(yǎng)基(0)或與LPS ( 100ng/ml) —起刺激DC0.5、 1、 2、 4、 8或12小時(shí)。用pERK或p38特異性抗體進(jìn)行Western雜交(圖 IOB)。雜交洗脫后用總ERK或p38特異性抗體再檢測(cè)。在加入CpG-ODN(5 pg/ml )、 LPS (100 ng/ml)或4義培養(yǎng)基之前，DC僅與培養(yǎng)基(對(duì)照)、 U0126C 1.25-5 pM)(圖10C)或p38抑制劑、SB203580 ( SB; 0.1-10 一)(圖10D)預(yù)溫育1小時(shí)，24小時(shí)后，用ELISA法測(cè)定IL-10濃度。用 DMSO處理的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。來自BALB/c小鼠的骨髓來源的DC單獨(dú)與CpG (10 pg)或與p38抑 制劑SB203580 (Io: 1 pM， hi: 5 )，或與ERK抑制劑U0126 (5 nM) 溫育24小時(shí)。移去上清液，等分液用ELISA測(cè)定IL-IO、 IL-12p70和IL-6 (圖11)。結(jié)果已證實(shí)TLR配體和滅活的百日咳桿菌，其包含TLR配體，誘導(dǎo)Tr細(xì) 胞和Thl細(xì)胞后，我們檢測(cè)了這表明DC同時(shí)誘導(dǎo)IL-10和IL-12的可能 性。我們發(fā)現(xiàn)每種檢測(cè)的TLR配體Pam3CSK4( TLR-2 )、酵母聚糖(TLR-2 )、 PolyIC( TLR-3 )、 LPS( TLR-4 )、鞭毛蛋白和CpG-ODN( TLR-9 )誘導(dǎo)IL-10 的產(chǎn)生，也誘導(dǎo)IL-12p40和IL-12p70從不成熟的骨髓來源的DC產(chǎn)生(圖 9)。 IL-10和IL-12的誘導(dǎo)分別與ERK和p38的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，于是我們 檢測(cè)了這些MAP激酶在TLR誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生中的作用。我們發(fā)現(xiàn)每 種測(cè)定的TLR配體誘導(dǎo)DC中ERK的磷酸化(圖10A )。 LPS-誘導(dǎo)的ERK 在第30分鐘最高，但在共8小時(shí)內(nèi)仍然顯著(圖IOB)。與MEKl/2抑制 劑U0126預(yù)溫育后，抑制IL-10從CpG-ODN-或LPS-刺激的DC的產(chǎn)生(圖 IOC)， U0126抑制TLR-配體誘導(dǎo)的ERK磷酸化(圖IOA)。 MEK 1/2抑 制劑增強(qiáng)IL-12p70的產(chǎn)生且這一效應(yīng)在來自IL-10+小鼠的DC中保留，表 明它對(duì)于IL-10產(chǎn)生的減少不是次要的(數(shù)據(jù)未顯示)。TLR配體也誘導(dǎo) DC中p38的磷酸化。DC與p38特異性抑制劑SB203580預(yù)溫育，在對(duì)于 LPS或CpG-ODN反應(yīng)時(shí)，抑制IL-10且增強(qiáng)IL-12p70產(chǎn)生(圖10D和圖 11 )。我們也發(fā)現(xiàn)p38和ERK抑制劑的結(jié)合進(jìn)一步抑制CpG誘導(dǎo)的IL-10 的產(chǎn)生且增強(qiáng)IL-12p35,但對(duì)IL-6沒有影響(圖11)。以前曾推測(cè)ERK 和p38可能差異性的調(diào)節(jié)IL-10和IL-12產(chǎn)生，ERK促進(jìn)IL-10而p38促 進(jìn)IL-12。然而我們的發(fā)現(xiàn)，與近來的運(yùn)用可探測(cè)IRF-5的小鼠(Takaoka， A., H. Yanai， S. Kondo, G. Duncan, H. Negishi， T. Mizutani， S丄Kano, K. Honda, Y. Ohaba， T. W. Mak，和T. Taniguchi. 2005. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Atowe)和 NF-k抑制劑(Kabashima， K.， T. Honda, Y. Nunokawa,和Y Miyachi. 2004. A new NF-kappaB inhibitor attenuates a THl type immune response in a murine model. 578: 36-40)的報(bào)道結(jié)合，表明TLR配體通過MAP激酶、ERK和p38激活I(lǐng)L-10,而IL-12p70利用IRF-5和NF-k B途徑。實(shí)施例10-加入p38、 ERK和Cox-2抑制劑到用外源抗原和CpG刺激的樹 突狀細(xì)胞增強(qiáng)它們誘導(dǎo)Thl的能力且阻遏分泌IL-10的T細(xì)胞的誘導(dǎo)材料和方法來自BALB/c的骨髓來源的DC與OVAII型肽(5昭)溫育。同時(shí)， 細(xì)胞或單獨(dú)用CpG (lOpg)，或與p38抑制劑SB203580 (Io: 1 jjM， hi: 5pM)或P38抑制劑和ERK抑制劑UO-126 (5pM) —起溫育24小時(shí)。 來自D011.10 OVA-TCR Tg小鼠的純化的CD4+ T細(xì)胞用DC (10: 1)刺 激，且在抗原刺激3天后移去上清液且用ELISA法對(duì)IL-10和IFN-y定量 (圖12)。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與僅培養(yǎng)基(-)、KLH (5嗎) 和CpG ( 5嗎)和標(biāo)明的Cox-2抑制劑(NS-398: 5 )、 p38 ( SB203580: 1 和ERK (UO-126: 5 |nM)的混合物溫育。將2.5 x 10 5個(gè)處理的細(xì) 胞注射到57BL-6小鼠的每只爪墊。在5天后取下腦窩淋巴結(jié)和脾，且單 個(gè)細(xì)胞懸浮液用KLH再刺激(2、 10、 50ng/ml)。 3天后移去上清液，ELISA 法對(duì)IFN-y和IL-10的濃度定量(圖13 )。結(jié)果TLR配體增強(qiáng)IL-10和IL-12從樹突狀細(xì)胞和巨謹(jǐn)細(xì)胞的產(chǎn)生。而且， 從先天性免疫細(xì)胞中產(chǎn)生的IL-12和IL-10分別促進(jìn)Thl和Treg細(xì)胞的誘
導(dǎo)。這解釋了將TLR激動(dòng)劑作為佐劑時(shí)，同時(shí)誘導(dǎo)了 Thl和Treg細(xì)胞。 在此我們顯示了 p38或ERK抑制劑或兩者的組合物與CpG共同作用，增 強(qiáng)Thl和阻遏Tr對(duì)外源抗原的體外和體內(nèi)誘導(dǎo)。DC用單獨(dú)的OVA肽或 與CpG —起或在存在p38抑制劑或p38和ERK抑制劑時(shí)用CpG刺激，接 著用于刺激從DO11.10OVA-T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的脾純 化出的CD4+T細(xì)胞。在用抗原進(jìn)行一輪或兩輪刺激后，檢測(cè)T細(xì)胞細(xì)胞 因子的產(chǎn)生。結(jié)果表明在存在CpG時(shí)，OVA沖激DC誘導(dǎo)分泌IL-10和IFN-Y T細(xì)胞，這與體內(nèi)誘導(dǎo)Thl和Treg細(xì)胞一致(圖12 )。加入p38抑制劑阻 遏分泌IL-10的T細(xì)胞的誘導(dǎo)且增加分泌IFN-y的T細(xì)胞。這在加入ERK 抑制劑后進(jìn)一步增強(qiáng)。我們接著4企測(cè)了 p38、ERK和Cox-2抑制劑對(duì)CpG-激活的樹突狀細(xì)胞 體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力。骨髓來源的DC用單獨(dú)的KLH或單獨(dú)的CpG 或p38、 ERK和Cox-2抑制劑的組合物一起刺激，然后皮下注射到小鼠中。 5天后取下引流淋巴結(jié)和脾，用抗原(KLH)刺激細(xì)胞且評(píng)估細(xì)胞因子產(chǎn) 生。數(shù)據(jù)顯示，在存在CpG時(shí)用抗原沖激的DC在體內(nèi)誘導(dǎo)分泌IL-10和 IFN-Y的T細(xì)胞(圖13)。在注射入小鼠前，用CpG和抗原刺激時(shí)，加入 p38或Cox-2抑制劑到DC增強(qiáng)DC誘導(dǎo)分泌IFN-y的T細(xì)胞的能力，而 阻遏分泌IL-10的T細(xì)胞。ERK抑制劑阻遏分泌IL-10的T細(xì)胞的誘導(dǎo)， 但也阻遏Thl細(xì)胞。ERK、p38和Cox-2抑制劑的組合物完全阻遏產(chǎn)生IL-10 的T細(xì)胞，但也減少分泌IFN-y的T細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)，將TLR激動(dòng) 劑作為佐劑時(shí)，p38和Cox-2抑制劑增強(qiáng)Thl和阻遏Treg細(xì)胞對(duì)外源抗原 的感應(yīng)。ERK抑制劑也阻遏產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞。實(shí)施例ll-Cox-2抑制劑阻遏TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的IL-10和TGF-P的產(chǎn)生且 增強(qiáng)內(nèi)源IL-12和IL-27的產(chǎn)生材料和方法用CpG (10嗎)或用CpG和CoxJ抑制劑塞來昔布(100嗎)側(cè)腹 注射C57BL/6小鼠。2和6小時(shí)后，取下引流區(qū)腹股溝淋巴結(jié)，過篩并在 1 ml的PBS中重懸。移取細(xì)胞，且用ELISA法對(duì)上清液中的IL-10和TGF-卩 的濃度進(jìn)行定量(圖14)。用單獨(dú)的CpG (10嗎)或用不同濃度的Cox-2抑制劑塞來昔布(5、 50或500嗎)側(cè)腹注射C57BL/6小鼠。6小時(shí)后，取下引流區(qū)腹股溝淋巴 結(jié)，制備單個(gè)細(xì)胞的懸浮液。勻漿細(xì)胞，且生成的mRNA通過RT-PCR分 析IL-27和IL-10的表達(dá)，且與p-肌動(dòng)蛋白表勤目比較(圖15 )。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與具不同濃度Cox-2抑制劑 NS-398的CpG( 10嗎)溫育24小時(shí)。移去上清液且用ELISA法測(cè)定IL-10 和IL-12p40的濃度(圖16)。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與具不同濃度的Cox-2抑制劑 NS-398的CpG ( 10 pg)溫育24小時(shí)。勻漿細(xì)胞，且用IL-10和IL-27p38 特異性引物進(jìn)行RT-PCR分析生成的mRNA，且與P-肌動(dòng)蛋白表W目對(duì)比 (圖17)。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與CpG(10嗎)或與1或10 的Cox-2抑制劑NS-398的溫育24小時(shí)。勻漿細(xì)胞，且用IL-10、 IL-12p35 或IL-12p40特異性引物進(jìn)行RT-PCR分析生成的mRNA,且與|3-肌動(dòng)蛋白 表勤目對(duì)比(圖18)。結(jié)果因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)Cox-2且胂瘤上清液和CpG誘導(dǎo)Cox-2在先天 性免疫細(xì)胞中的表達(dá)，所以我們檢測(cè)了 Cox-2抑制劑對(duì)樹突狀細(xì)胞中TLR 激動(dòng)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞因子體內(nèi)或體外的表達(dá)的影響。用單獨(dú)的CpG或在存在 Cox-2抑制劑時(shí)皮下注射小鼠，6小時(shí)后取下淋巴結(jié)且評(píng)估細(xì)胞因子的產(chǎn) 生。注射CpG誘導(dǎo)IL-10和TGF-p的產(chǎn)生，其在與Cox-2抑制劑共同給藥 時(shí)被阻遏(圖14)。 CpG-誘導(dǎo)的小鼠中IL-10 mRNA的表達(dá)也被與Cox-2 抑制劑的共同給藥所阻遏，而IL-27 mRNA的表達(dá)被增強(qiáng)(圖15)。 CpG 體外刺激DC誘導(dǎo)IL-10和IL-12p40的產(chǎn)生。加入一種Cox-2抑制劑到培 養(yǎng)基中阻遏IL-10且增強(qiáng)IL-12產(chǎn)生(圖16)。 CpG也誘導(dǎo)IL-12pG40、 IL-12p35和IL-27p28 mRNA的表達(dá)，其在加入Cox-2抑制劑時(shí)4皮增強(qiáng)(圖 17和18)。相比之下，CpG誘導(dǎo)的IL-10 mRNA的表達(dá)被此Cox-2抑制劑
阻遏。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)兩種不同的Cox-2抑制劑在增強(qiáng)引導(dǎo)Thl細(xì)胞誘導(dǎo)的 調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子時(shí)，具有阻遏抗炎性和Treg促進(jìn)細(xì)胞因子的作用。因此 TLR激動(dòng)劑和Cox-2抑制劑的組合物為有效的啟動(dòng)體內(nèi)對(duì)外源和腫瘤抗原 的天然和獲得性效應(yīng)應(yīng)答的方法。實(shí)施例12-用Cox-2抑制劑和CpG的組合物治療阻遏腫瘤生長(zhǎng) 材料和方法C57BL/6小鼠用2x 1()S個(gè)B16肺瘤細(xì)胞皮下攻擊，且在第3、 5和7 天，用CpG (10嗎)、Cox-2抑制劑塞來昔布(100嗎)或兩者的組合物在 腫瘤位點(diǎn)皮下注射。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)(圖19)。C57BL/6小鼠用2 x 105個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下激發(fā)，且在第3、 5和7 天，用CpG ( 20嗎)、Cox-2抑制劑塞來昔布(500 jxg)或兩者的組合物在 腫瘤位點(diǎn)皮下注射。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)(圖20)。C57BL/6小鼠用2x 105個(gè)腫瘤細(xì)胞皮下攻擊，且在第3、 5和7天， 用CpG ( 20嗎)、Cox-2抑制劑塞來昔布(500嗎)或兩者的組合物在腫瘤 位點(diǎn)皮下注射。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤和存活情況(圖21)。結(jié)果我們用鼠科腫瘤模型評(píng)價(jià)與Cox-2抑制劑結(jié)合的TLR激動(dòng)劑的治療療 效。用B16肺瘤皮下攻擊小鼠，在第3、 5和7天不處理或通過在腫瘤位 點(diǎn)皮下注射CpG(10嗎)，與或不與Cox-2抑制劑(塞來昔布100嗎)，或 僅以Cox-2抑制劑處理小鼠。用單獨(dú)的Cox-2抑制劑處理增強(qiáng)了腫瘤的生 長(zhǎng)而單獨(dú)的CpG效果很小(圖19)。然而CpG和Cox-2抑制劑的組合導(dǎo) 致腫瘤生長(zhǎng)完全降低。用高劑量的CpG ( 20嗎)和Cox-2抑制劑(500嗎) 重復(fù)了這些研究。高劑量的CpG確實(shí)降低腫瘤的生長(zhǎng)，但是當(dāng)與Cox-2 抑制劑組合治療時(shí)保護(hù)療效顯著的增強(qiáng)(圖20)。 CpG和Cox-2抑制劑超 過單獨(dú)CpG或單獨(dú)的Cox-2抑制劑的保護(hù)效果，在幸存曲線和無瘤小鼠的 數(shù)量上也非常顯著(圖21 )。所有的未處理的小鼠在45天內(nèi)死亡，而所有 的CpG處理的小鼠僅在55天內(nèi)死亡。20%的用Cox-2抑制劑處理的小鼠
幸存，而用CpG和Cox-2抑制劑處理的小鼠，有40%存活。實(shí)施例13-Cox-2或ERK抑制劑增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞接種疫苗對(duì)腫瘤的治療療 效材料和方法C57BL/6小鼠用2x 1()S個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下攻擊，且用處理的DC( 1-5 x 105)在第3天開始每隔一周皮下注射到腫瘤位點(diǎn)處理小鼠3次。用熱激 /輻射的B16腫瘤細(xì)胞和單獨(dú)的CpG (5 ng/ml)或與Cox-2抑制劑塞萊昔 布(5^M)或ERK抑制劑U0126 (5mM)沖激DC24小時(shí)。常規(guī)性的監(jiān) 測(cè)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)(圖22)。 11只C57BL/6小鼠組用2xl()4個(gè)B16腫瘤 細(xì)胞皮下攻擊，且在腫瘤攻擊后第3、 10和17天，用處理的DC( l-5x 105) 注射小鼠3次(皮下注射到腫瘤位點(diǎn))。DC單獨(dú)與或與具Cox-2抑制劑 NS398 (5 pM)的HSP-70 (5pg/ml)溫育24小時(shí)。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)小鼠腫 瘤生長(zhǎng)和存活情況。括號(hào)中的數(shù)字為卡方(log rank)檢驗(yàn)的顯著性值(圖 23 )。骨髓來源的DC與僅培養(yǎng)基(對(duì)照)、HSP70疫苗(5 mg/ml )、 Cox-2 抑制劑NS398 ( 5 mM )、 HSP70和Cox-2抑制劑或LPS ( 10 ng/ml)溫育。 24小時(shí)后細(xì)胞用抗CD80和CD11C抗體標(biāo)記，且進(jìn)行細(xì)胞熒光分析。結(jié) 果以CDllc+的DC群體細(xì)胞上的平均熒光強(qiáng)度(MFI)顯示(圖24)。結(jié)果除了潛在的治療癌的療效外，TLR激動(dòng)劑也具有佐劑特性且增強(qiáng)病原 體或腫瘤抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。已顯示TLR激動(dòng)劑CpG可增強(qiáng)天然細(xì)胞 中IL-10的產(chǎn)生且由此誘導(dǎo)Treg細(xì)胞，其可對(duì)癌或傳染性疾病疫苗不利。 本發(fā)明驚人地顯示，通過與Cox-2或ERK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，他們可增強(qiáng) 腫瘤疫苗的療效。我們的方式是在存在CpG和有或無抑制劑時(shí)，使用抗原 沖激的樹突狀細(xì)胞，而不是用腫瘤抗原和佐劑直接免疫，其會(huì)被腫瘤的免 疫抑制性環(huán)境影響(如圖1顯示)。我們運(yùn)用熱激的和輻射的B16細(xì)胞作 為全細(xì)胞瘤疫苗，其在存在或無Cox-2或ERK抑制劑時(shí)與DC和CpG溫
育。在存在CpG時(shí)，用腫瘤抗原沖激的樹突狀細(xì)胞治療性免疫，不影響腫 瘤生長(zhǎng)(圖22 )。然而在存在Cox-2或ERK抑制劑時(shí)，用B16抗原和CpG 沖激的DC免疫，顯著減緩了腫瘤生長(zhǎng)速率。我們也檢測(cè)了 Cox-2抑制劑對(duì)用熱激蛋白疫(HSP) -70疫苗治療性免 疫的療效。HSP-70疫苗通過從B16腫瘤純化制備，已顯示對(duì)小鼠B16腫 瘤具預(yù)防性免疫的療效，但當(dāng)將其治療用給藥于具生長(zhǎng)著的腫瘤的小鼠 時(shí)，效果甚孩i。在此，在存在或不存在Cox-2抑制劑時(shí)，我們用HSP-70 疫苗沖激樹突狀細(xì)胞，然后在B16腫瘤攻擊后3、 10和17天，將細(xì)胞轉(zhuǎn) 移。Cox-2抑制劑沖激的DC單獨(dú)給藥，無保護(hù)效果(圖23)。而且，相比 用未沖激的DC給藥觀察到的結(jié)果，單獨(dú)用HSP-70疫苗沖激的DC免疫不 增強(qiáng)存活率或無瘤小鼠的數(shù)量。然而，在存在Cox-2抑制劑時(shí)用HSP-70 疫苗沖激的DC治療性免疫小鼠，使我們觀察到最多數(shù)量的無瘤小鼠(77%) 和最高百分率的幸存率(77%)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，相比于單獨(dú)用一種治療， 聯(lián)合應(yīng)用Cox-2抑制劑和HSP-70疫苗具有驚人的增強(qiáng)治療癌的療效。對(duì)Cox-2和HSP70對(duì)DC活化的效果的枱r驗(yàn)揭示，單獨(dú)用Cox-2或 HSP70不能增強(qiáng)CD80的表達(dá)，然而聯(lián)合應(yīng)用顯著增強(qiáng)CD80平均熒光強(qiáng) 度，達(dá)到用LPS的水平(圖24 )。這些結(jié)果表明聯(lián)合用HSP70和Cox-2抑 制劑使樹突狀細(xì)胞成熟，此影響在單獨(dú)用一種分子時(shí)不能觀察到。實(shí)施例14-ERK、 Cox-2或p38的抑制阻遏樹突狀細(xì)胞中TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo) 的PGE2材料和方法在體外用CpG (5嗎)或ERK抑制劑、U0126 (5 pM)，或兩者一起 刺激骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(DC) 24小時(shí)。移去上清液且用ELISA法測(cè) 定PGE2的濃度。方差分析"PO.Ol, CpG + p38對(duì)比CpG (圖25)。單獨(dú)用CpG (5嗎)或與Cox-2抑制劑NS-398 —起存在時(shí)，刺激骨 髓來源的DC。 24小時(shí)后移去上清IE用ELISA法測(cè)定PGE2的濃度(圖 26(a))。方差分析承P〈0.05， CpG + p38對(duì)比CpG。 用熱激的或輻射的B16肺瘤細(xì)胞處理骨髓來源的DC 4小時(shí)，然后用 CpG(5嗎)、p38抑制劑SB 203580 (5 mM),或兩者一起刺激24小時(shí)。 移去上清液且用ELISA法測(cè)定PGE2的濃度。方差分析* <0.05， CpG + p38 對(duì)比CpG (圖27)。結(jié)果圖25顯示對(duì)ERK活化的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞中PGE2的 產(chǎn)生。圖26 (a)顯示對(duì)Cox-2的產(chǎn)生的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞中 PGE2的產(chǎn)生。圖27顯示對(duì)p38 MAP激酶活化的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞中 PGE2的產(chǎn)生。實(shí)施例15-Cox-2抑制劑阻遏TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞中IL-10的產(chǎn) 生才才料和方法單獨(dú)用CpG (5嗎)或與Cox-2抑制劑NS-398 —起存在時(shí)，刺激骨 髓來源的DC。 24小時(shí)后移去上清液且用ELISA法測(cè)定IL-IO的濃度(圖 26(b))。方差分析承P〈0.05， CpG + p38對(duì)比CpG。方差分析*卩<0.05， CpG 十p38對(duì)比CpG。結(jié)果圖26( b )顯示對(duì)Cox-2產(chǎn)生的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞中IL-10 的產(chǎn)生。實(shí)施例16-對(duì)p38的抑制在腫瘤疫苗和TLR激動(dòng)劑刺激的樹突狀細(xì)胞中阻 遏IL-10且增強(qiáng)IL-12的產(chǎn)生材料和方法將骨髓來源的DC與熱激過的B16肺瘤細(xì)胞一起孵育4小時(shí)，與輻射 過的B16腫瘤細(xì)胞孵育4小時(shí)，然后用CpG( 5 jig )、 p38抑制劑SB 203580 (5^M)或兩者刺激。24小時(shí)后移去上清液，且采用ELISA法測(cè)定IL-IO、 IL-12p40、 IL-12p70和IL-23的濃度。方差分析承P0.05， ***P<0.0001, CpG 十p38對(duì)比CpG。結(jié)果圖28顯示對(duì)p38 MAP激酶活化的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞中的 IL-10,而增強(qiáng)IL-12的產(chǎn)生。IL-23的產(chǎn)生不被p38抑制劑影響。實(shí)施例17-對(duì)p38的抑制增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞疫苗和用腫瘤疫苗和CpG沖激的 樹突狀細(xì)胞的治療效果材料和方法將骨髓來源的DC與熱激過的B16胂瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，和輻射過的 B16腫瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，然后用僅培養(yǎng)基或p38抑制劑SB 203580( 5 ) 刺激24小時(shí)。用2 x 105個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下(s.c.)攻擊C57BL/6小鼠且 在攻擊后3、 10和17天通過注射5xl()S個(gè)DC到腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行處理。常 規(guī)性的監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果以單個(gè)小鼠的肺瘤體積表示(圖29)。將骨髓來源的dc用熱激過的b16腫瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，和輻射過的 B16腫瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，然后用單獨(dú)的CpG (5嗎)或在存在p38抑制 劑sb 203580 ( 5 mM )時(shí)刺激24小時(shí)。用2 x 105個(gè)b16腫瘤細(xì)胞皮下攻 擊C57BL/6小鼠且在攻擊后3、 10和17天通過注射5 x 105個(gè)DC到肺瘤 位點(diǎn)進(jìn)行處理。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果以單個(gè)小鼠的腫瘤體積表示 (圖30)。將骨髓來源的DC與熱'^L/輻射的B16腫瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，然后用僅 培養(yǎng)基、CpG ( 5 pg )、 CpG和p38抑制劑SB 203580 ( 5 yM)或僅p38抑 制劑刺激24小時(shí)。用2x 1()S個(gè)B16胂瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6小鼠且在 攻擊后3、 10和17天通過注射5 x 105個(gè)DC到腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行處理。常規(guī) 性的監(jiān)測(cè)小鼠的存活率。括號(hào)中的數(shù)字表示相對(duì)對(duì)照組具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 31)。
結(jié)果圖29顯示p38抑制劑增強(qiáng)腫瘤疫苗的保護(hù)效果，該疫苗包含滅活的 全瘤細(xì)胞激活的樹突狀細(xì)胞。圖30顯示p38抑制劑增強(qiáng)腫瘤疫苗的保護(hù)效果，該疫苗包含在存在 TLR激動(dòng)劑CpG時(shí)滅活的全瘤細(xì)胞激活的樹突狀細(xì)胞。圖31顯示在用包含用單獨(dú)的滅活的全瘤細(xì)胞或在存在TLR激動(dòng)劑 CpG時(shí)激活的樹突狀細(xì)胞的疫苗給藥治療后，p38抑制劑增強(qiáng)小鼠的存活 率。實(shí)施例18-用全瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細(xì)胞治療增加腫瘤中T細(xì)胞 IFN-y的產(chǎn)生材料和方法骨髓來源的DC用與熱^t/輻射的B16腫瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，然后用僅 培養(yǎng)基或CpG (5 jig)刺激24小時(shí)。用2x 1()S個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下攻擊 C57BL/6小鼠且在攻擊后3和10天通過注射5 x 105個(gè)DC到腫瘤位點(diǎn)進(jìn) 行處理。在第15天提取腫瘤，CD4+和CD8+細(xì)胞內(nèi)的IL-17和IFN-y用FACS 通過免疫熒光方法測(cè)定。結(jié)果圖32顯示將用滅活的肺瘤細(xì)胞和CpG沖激的樹突狀細(xì)胞給藥，治療 具皮下腫瘤的小鼠，增加生長(zhǎng)著的腫瘤中CD4+和CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y 的頻率。實(shí)施例19-用B16疫苗、CpG和p38抑制劑處理過的樹突狀細(xì)胞治療增加 CD4+細(xì)胞的頻率，但是減小肺瘤塊中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率材料和方法將骨髓來源的DC與熱'^L/輻射的B16腫瘤細(xì)胞處理4小時(shí)，然后用僅
培養(yǎng)基、CpG ( 5 jxg )、 CpG和p38抑制劑SB 203580 ( 5 |iM)或僅p38抑 制劑刺激24小時(shí)。用2x 1()S個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6小鼠，且 在攻擊后3和10天通過注射5 x 105個(gè)DC到腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行處理。在第15 天提取腫瘤，腫瘤塊中CD4+細(xì)胞(A)和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞(B) 的百分率用FACS通過特異性抗體免疫熒光方法測(cè)定。結(jié)果圖33顯示用滅活的胂瘤細(xì)胞和CpG沖激的樹突狀細(xì)胞給藥，治療具 皮下肺瘤的小鼠，增強(qiáng)CD4+ T細(xì)胞到生長(zhǎng)著的腫瘤的募集且阻遏表達(dá) Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的募集。實(shí)施例20-瘤體注射CpG和p38抑制劑增加存活率 材料和方法用2x 1(^個(gè)B16肺瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6小鼠且在攻擊后3、 5和 7天通過將CpG ( 25嗎)、p38抑制劑SB204580 ( 50昭)或兩者同時(shí)注射 到腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行處理。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)小鼠存活率。結(jié)果圖34顯示相比單獨(dú)用CpG或p38抑制劑治療后觀察到的情況，在存 在p38抑制劑時(shí)將CpG治療性給藥，能增加具皮下B16腫瘤的小鼠的存 活率。實(shí)施例21-pl3K抑制劑增強(qiáng)腫瘤疫苗和CpG沖激過的樹突狀細(xì)胞的治療效 果，增加具生長(zhǎng)腫瘤的小鼠的存活率材料和方法骨髓來源的DC首先體外用熱激和輻射過的B16腫瘤細(xì)胞沖激4小時(shí)， 然后單獨(dú)用CpG (5 pg/ml)或與pl3K抑制劑渥曼青霉素(2.5 ^M)刺激 24小時(shí)。用2 x 105個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6小鼠，且在攻擊后 3、 10和17天，通過將2x 1()S個(gè)處理過的DC注射到腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行處理。
常規(guī)性的監(jiān)測(cè)肺瘤生長(zhǎng)且將每組的平均值繪制成圖(圖35)。骨髓來源的DC首先體外用熱激和輻射過的B16腫瘤細(xì)胞沖激4小時(shí)， 然后單獨(dú)用CpG ( 5 pg/ml)或與p13激酶(pl3K)抑制劑渥曼青霉素(2.5 pM)刺激24小時(shí)。用2 x 105個(gè)B16肺瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6小鼠， 且在攻擊后3、 10和17天，通過將5xl()S個(gè)處理過的DC注射到腫瘤位 點(diǎn)進(jìn)行處理。常規(guī)性的監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)以得到生存率(圖36)。結(jié)果結(jié)果顯示在存在p13激酶時(shí)，用滅活的腫瘤細(xì)胞和CpG沖激的DC治 療性給藥比用腫瘤細(xì)胞和單獨(dú)的CpG或pl3K抑制劑沖激過的DC具更好 的治療效果(圖35)。而且，在存在p13激酶抑制劑時(shí)，用滅活的腫瘤細(xì) 胞和CpG沖激的DC治療性給藥，相比用腫瘤細(xì)胞和單獨(dú)的CpG或pl3K 抑制劑沖激過的DC治療后觀察到的情況，增加了具皮下B16腫瘤小鼠的 存活率(圖36)。實(shí)施例22- CpG作為佐劑時(shí)用p38抑制劑增加了無細(xì)胞百日咳疫苗的保護(hù) 效果材料和方法單獨(dú)用0.02人用量的無細(xì)胞百日咳疫苗(JNIH-3，包括FHA和脫毒 百曰咳毒素)或在存在CpG( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB20358(K 50 mM ) 時(shí)腹腔(i. p.)免疫小鼠兩次(0和4周)。2周后，用百日咳桿菌氣霧攻 擊小鼠。經(jīng)過百日咳桿菌感染后，在攻擊后的0、 3、 7、 14和21天，對(duì) 來自四個(gè)為一組的小鼠肺上的CFU (菌落形成單位)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在無菌條 件下取下肺并于冰上在1 ml的含1%的酪蛋白的無菌生理鹽水中勻漿。未 稀釋的和連續(xù)稀釋的來自個(gè)體的肺的勻漿(100 nl) —式三份的點(diǎn)涂布在 Bordet-Gengou瓊脂糖平板上，于37。C溫育5天后計(jì)算CFU數(shù)。適合的檢 出限制為每個(gè)肺0.6 log1()CFU。結(jié)果圖37顯示低劑量的無細(xì)胞百日咳疫苗，甚至加有CpG作為佐劑時(shí)，
對(duì)小鼠的保護(hù)弱，但是與p38抑制劑共同給藥顯著增強(qiáng)保護(hù)效果。在存在 CpG和p38抑制劑時(shí)，用疫苗免疫過的小鼠肺中百日咳桿菌CFU數(shù)顯著 低一些。
實(shí)施例23-對(duì)加有CpG作為佐劑的無細(xì)胞百日咳疫苗的應(yīng)答時(shí)，p38抑制 劑增強(qiáng)IFN-y且減少IL-10
材料和方法
單獨(dú)用0.02人用量的無細(xì)胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脫毒的 百日咳毒素)或在存在CpG ( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB203580 ( 50 )腸外免疫小鼠兩次(0和4周)。2周后小鼠用百日咳桿菌氣霧攻擊小 鼠。在攻擊前或攻擊后取得脾單核細(xì)胞(2x 106/ml)，于37。C在5% C02 中培養(yǎng)，其含從百日咳桿菌純化的絲狀血凝素(FHA )或含PMA( 250 ng/ml， Sigma)和抗鼠CD3 (1 pg/ml; Pharmingen，圣地亞哥，美國(guó))或僅培養(yǎng) 基作為陰性對(duì)照。72小時(shí)后移去上清且通過雙位點(diǎn)ELISA法測(cè)定IL-10和 IFN-y的濃度(圖38)。
單獨(dú)用無細(xì)胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脫毒的百日咳毒素) 或在存在CpG ( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB203580 ( 50 一 )時(shí)腹腔免 疫小鼠兩次(0和4周)。2周后小鼠用百日咳桿菌氣霧攻擊小鼠。在攻擊 后14天取得脾單核細(xì)胞(2x l06/ml)，在存在布雷菲德菌素A時(shí)，于37 。C在5。/。C02中培養(yǎng)，其含PMA( 250 ng/ml, Sigma)和離子霉素(1 pg/ml) 或僅培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。4小時(shí)后用特異性抗體通過免疫熒光分析測(cè)定 且用FACS分析細(xì)胞內(nèi)IL-10 (圖39 )。
結(jié)果
結(jié)果表明用CpG作為佐劑的無細(xì)胞百日咳疫苗免疫后，p38抑制劑增 強(qiáng)IFN-y且減少IL-10的響應(yīng)(圖38和圖39 )。
實(shí)施例24-在用百日咳桿菌攻擊小鼠后，加入p38抑制劑到CpG作為佐劑 的無細(xì)力包百日咳疫苗增加局部的IL-ip
才才料禾口方法
單獨(dú)用無細(xì)胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脫毒的百日咳毒素) 或在存在CpG ( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB203580 ( 50 pM)時(shí)腹腔免 疫小鼠兩次(0和4周)。2周后小鼠用百曰咳桿菌氣霧攻擊小鼠。在攻擊 4小時(shí)后取下肺，勻漿，且用ELISA法測(cè)定IL-(3的濃度。
結(jié)果
圖40顯示在接種疫苗時(shí)，用百日咳桿菌攻擊免疫過的小鼠后，p38抑 制劑增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)。在百日咳桿菌攻擊后，加p38抑制劑到CpG作為 佐劑的無細(xì)胞百日咳疫苗中，增加肺中局部的IL-ip。
實(shí)施例25-用肺瘤疫苗、TLR激動(dòng)劑和p38抑制劑治療性免疫能減小小鼠 中B16腫瘤的生長(zhǎng)
用2 x 105個(gè)B16腫瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6小鼠，且在攻擊后3、 5 和7天，將僅賦形劑(未處理的)熱激和輻射過的B16腫瘤細(xì)胞(1 x 106) 單獨(dú)注射或與CpG (10嗎)或與CpG和p38抑制劑SB203580 (50嗎) 一起注射到小鼠腫瘤位點(diǎn)。常規(guī)性地監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。
結(jié)果
結(jié)果(圖41)顯示相比單獨(dú)用B16腫瘤或B16疫苗和CpG治療后觀 察到的情況，在存在p38抑制劑時(shí)將CpG作為佐劑用滅活的腫瘤疫苗治療 性免疫增加了具皮下B16腫瘤的小鼠的存活率。
實(shí)施例26-在IL-10缺陷的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)未顯著性的加劇
用2x 105個(gè)B16胂瘤細(xì)胞皮下攻擊C57BL/6或IL-10缺陷的小鼠且 17天后估計(jì)腫瘤的大小。結(jié)果為5只一組的小鼠的平均腫瘤體積。
結(jié)果
結(jié)果(圖42)顯示在IL-10缺陷的小鼠中，胂瘤生長(zhǎng)未顯著性的加劇。 因此顯示IL-10不是介導(dǎo)抗炎反應(yīng)的唯一介質(zhì)。
涉及本說明書的所有的文獻(xiàn)在此引為參考。對(duì)本發(fā)明所描述的實(shí)施例 的各種修飾和變化不偏離本發(fā)明的范圍，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說容易理
解。雖然本發(fā)明連同特殊的優(yōu)選的實(shí)施例已被描述，應(yīng)了解被要求;t又利的 本發(fā)明不受到這些特殊的實(shí)施例的不適當(dāng)?shù)南拗啤?shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說，顯而易見地本發(fā)明涵蓋本發(fā)明
具體實(shí)施例方式
權(quán)利要求
1. 一種用于治療需要增強(qiáng)Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病的組合物，所述的組合物包括:(i)至少一種Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑；和(ii)至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，其抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，其中所述阻遏源于選擇性的抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或源于對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)以致至少一種抗炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應(yīng) 答的下游介質(zhì)的功能，其中所述下游介質(zhì)選自包括下列組成的組肌醇磷 脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為肌醇磷脂3 激酶抑制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述肌醇磷脂3激酶抑制劑為 LY294002或渥曼青霉素(WMN)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)氧合酶2 抑制劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述環(huán)氧合酶2抑制劑為塞來 昔布(NS-398)或羅非可昔。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制MAP 激酶蛋白的功能。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下列 組成的組p38激酶抑制劑、ERK抑制劑、MEK 1抑制劑和MEK 2抑制 劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所迷的組合物，其中所述p38激酶抑制劑選自包括 下列組成的組SB203580、 SB220025或SB239063。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述ERK (胞外調(diào)節(jié)激酶) 抑制劑為U0126或PD98059。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述肌醇磷脂3激酶抑制劑 為L(zhǎng)Y294002或渥曼青霉素(WMN)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 免疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中的任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 Toll樣受體激動(dòng)劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( CpG-寡聚脫氧核苷酸)、咪查莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進(jìn)一步包 括至少 一種腫瘤特異性抗原。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進(jìn)一步包 括調(diào)節(jié)性化合物，其抑制具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活功能的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中該調(diào)節(jié)性化合物為腫瘤生長(zhǎng) 抑制性產(chǎn)物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述調(diào)節(jié)性的組合物促進(jìn)凋 亡發(fā)生。
18. —種用于治療需要增強(qiáng)Thl-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病的藥物組合 物，其中該組合物包4舌-至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑，和-至少一種免疫調(diào)節(jié)化合物，及藥物可接受的賦形劑、稀釋劑或載體， 所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制免疫應(yīng)答的阻遏，其中所述阻遏源于對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞功能的選擇性抑制或源于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)以致至少 一種抗炎性細(xì) 胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制免 疫應(yīng)答下游介質(zhì)的功能。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述下游介質(zhì)選自包括 下列組成的組肌醇^粦脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK 1或MEK 2。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中 所述Toll樣受體激動(dòng)劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、 PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分 枝桿菌。
22. —種用于治療或預(yù)防需要增強(qiáng)Thl介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病的方 法，該方法包括以下步驟-將治療有用量的至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑給藥；和-給藥治療有用量的至少 一種免疫調(diào)節(jié)劑，其抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏， 其中所述阻遏源于對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的選擇性抑制或源于細(xì)胞因子表達(dá) 的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被 上調(diào)。
23. 至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑在治療需要增強(qiáng)Thl介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病中的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻 遏，該阻遏通過對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能的選擇性抑制或源于對(duì)細(xì)胞因子表 達(dá)的調(diào)節(jié)以致至少一種抗炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子 被上調(diào)。
24. 至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑在制備用于治療需要增 強(qiáng)Thl介導(dǎo)或其他效應(yīng)因子的免疫應(yīng)答疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述免 疫調(diào)節(jié)劑抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，該阻遏通過對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能的選 擇性抑制或源于對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少 一種抗炎性細(xì)胞因子被 阻遏且至少 一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
25. —種用于治療癌癥和惡性疾病的組合物，其包括(i )包括至少一種可引發(fā)免疫應(yīng)答的腫瘤特異性抗原的組合物，所 述的應(yīng)答對(duì)所述癌癥或惡性疾病特異，(ii )至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑；和(iii)免疫調(diào)節(jié)劑，其抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，該阻遏通過對(duì)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的功能選擇性抑制或源于對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗 炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述腫瘤特異性的抗原來源 于熱激蛋白與來自癌細(xì)胞或患癌性疾病個(gè)體的抗原性肽的復(fù)合體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應(yīng) 答下游介質(zhì)的功能。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述下游介質(zhì)選自包括下列 組成的組肌醇磷脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下 列組成的組肌醇磷脂3激酶抑制劑、環(huán)氧合酶2抑制劑、p38激酶抑制 劑、ERK抑制劑、MEK 1抑制劑或MEK2抑制劑。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25至29中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 免疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
31. 根據(jù)權(quán)利要求25至30中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 Toll樣受體激動(dòng)劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
32. 根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進(jìn)一步 包括調(diào)節(jié)性化合物，其抑制有效增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)物。
33. —種治療癌癥或惡性疾病的方法，所述方法包括以下步驟-將抗癌疫苗或包括至少一種腫瘤特異性抗原的其抗原部分或抗原決 定簇給藥；-將至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑給藥，且-將治療有用量的免疫調(diào)節(jié)劑給藥于需要它的受治療者，所述調(diào)節(jié)劑抑 制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，該阻遏通過對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的選擇性抑制或源于細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子^:上調(diào)。
34. 包括至少一種腫瘤特異性抗原、至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免 疫調(diào)節(jié)化合物的組合物在制備用于治療癌癥或惡性疾病的藥物中的應(yīng)用， 其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制對(duì)免疫應(yīng)答阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞的功能或源于細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少 一種抗炎性細(xì)胞 因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
35. —種用于治療癌性疾病的疫苗組合物，其包括 -樹突狀細(xì)胞，-至少一種肺瘤細(xì)胞抗原， -至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，該阻遏通過選擇性抑制 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或源于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，以致至少一種抗炎性細(xì) 胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應(yīng)答 的下游介質(zhì)的功能。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中該下游介質(zhì)選自包括下列組 成的組肌醇磷脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下列 組成的組肌醇磷脂3激酶抑制劑、環(huán)氧合酶2抑制劑、p38激酶抑制劑、 ERK抑制劑、MEK1抑制劑或MEK2抑制劑。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35至38中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該免 疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-j3的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35至39中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該Toll 樣受體激動(dòng)劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
41. 根據(jù)權(quán)利要求35至40中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進(jìn)一步 包括調(diào)節(jié)性化合物，該化合物抑制有效增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn) 物。
42. 樹突狀細(xì)胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至少一種Toll樣受體激 動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在治療癌性疾病中的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合 物抑制對(duì)免疫應(yīng)答阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或源 于細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種 促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
43. 樹突狀細(xì)胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至少一種Toll樣受體激 動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療癌性疾病的疫苗組合物中的應(yīng)用， 其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制對(duì)免疫應(yīng)答阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞的功能或源于細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細(xì)胞 因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
44. 一種用于治療癌性疾病的疫苗組合物，其包括 -樹突狀細(xì)胞，-至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，該阻遏通iM"調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的功能的選擇性抑制或源于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，以致至少 一種抗炎性 細(xì)胞因子被阻遏且至少一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應(yīng)答 的下游介質(zhì)的功能。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中該下游介質(zhì)選自包括下列組 成的組肌醇磷脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
47. 根絕權(quán)利要求45所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下列 組成的組肌醇磷脂3激酶抑制劑、環(huán)氧合酶2抑制劑、p38激酶抑制劑、 ERK抑制劑、MEK 1抑制劑或MEK 2抑制劑。
48. 根據(jù)權(quán)利要求44至47中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-p的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
49. 根據(jù)權(quán)利要求44至48中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該Toll 樣受體激動(dòng)劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
50. 根據(jù)權(quán)利要求44至49中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進(jìn)一步 包括調(diào)節(jié)性化合物，其抑制有效增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)物。
51. 樹突狀細(xì)胞、至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在治 療癌性疾病中的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏， 該阻遏通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或源于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，以 致至少 一種抗炎性細(xì)胞因子^皮抑制和至少 一種促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
52. 樹突狀細(xì)胞、至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在制 備用于治療癌性疾病的疫苗組合物中的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑 制對(duì)免疫應(yīng)答的阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能或源于 對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細(xì)胞因子被阻遏且至少一種 促炎細(xì)胞因子被上調(diào)。
53. —種誘導(dǎo)受治療者中的Thl應(yīng)答以治療癌癥或傳染性疾病的方 法，該方法包括以下步驟-在疫苗或TLR激動(dòng)劑和免疫調(diào)節(jié)化合物存在下，其中該免疫調(diào)節(jié)化 合物抑制先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或上調(diào) IL-12的產(chǎn)生，使分離的樹突狀細(xì)胞間接體內(nèi)暴露于疾病特異性抗原，以 便使所述樹突狀細(xì)胞成熟為促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞功能的表型，-將所述樹突狀細(xì)胞給藥到受治療者，由此在受治療者中產(chǎn)生的免疫應(yīng) 答足以阻止癌癥的發(fā)病或發(fā)展，或阻止病原微生物的感染且由此阻止傳染 寸生疾病。
全文摘要
本發(fā)明通過施用一種組合物，提供了一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，該組合物包括Toll樣受體激動(dòng)劑和能夠下調(diào)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)和上調(diào)促炎性細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)的免疫介質(zhì)。此方法可用于提供癌性疾病和傳染病的治療性治療。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101394865SQ200680051686
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者安德魯·亞尼克, 迪爾德麗·托米, 金斯敦·米爾斯 申請(qǐng)人:都柏林伊麗莎白女皇神學(xué)院院長(zhǎng)、研究員及專家協(xié)會(huì)