專利名稱：：治療疾病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及血管疾病的治療干預(yù)。更具體而言，本發(fā)明涉及用于治療與血管功能障礙有關(guān)的內(nèi)皮功能障礙的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：糖尿病及其心血管并發(fā)癥是美國和西方世界死亡和發(fā)病的主要原因。這些疾病的發(fā)展與一些致病因素有關(guān)，包括疾病的遺傳易感性、性別、諸如吸煙和飲食等生活方式因素、年齡、胰島素抵抗、高血壓和高血脂(包括高膽固醇血癥)。糖尿病和相關(guān)的心血管疾病的治療可選方案包括各種治療藥物，例如降膽固醇藥物(如，他汀類)、血管活性藥物(如，PPAR-y配體、p-阻斷劑)、ACE抑制劑、血管緊張素II受體阻斷劑、鈣通道阻斷劑、維生素和抗氧化劑(如，煙酸、抗壞血酸或維生素C)。用他汀藥物降低血漿膽固醇的基本原理無法解釋為什么冠心病發(fā)作通常出現(xiàn)在阻塞并不嚴(yán)重的個體中，以及為什么阻塞并不發(fā)生在毛細(xì)管或靜脈中。使用時，他汀藥物僅能將冠心病事件再次發(fā)生的風(fēng)險降低30%40%。血管活性藥物的基本原理是通過直接或間接作用于血管的和/或心臟的平滑肌從而減小血管的血流阻力來降低血壓。然而，這樣的藥物并不治療高血壓和不正常血流的起因，而是試圖降低該紊亂造成的影響。這樣的藥物通過壓力感受性反射刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)，從而使心率和心肌收縮力增加，這并不是有益的或所希望的效果。維生素E、維生素C、普羅布考(probucol)和(3-胡蘿卜素構(gòu)成了目前用于治療糖尿病的大多數(shù)抗氧化劑。然而，不幸的是，單獨施用或與其他藥劑聯(lián)合施用時，這些藥劑中沒有一個能充分地解決細(xì)胞(即，皮膚或內(nèi)皮)功能障礙和其他氧化應(yīng)激介導(dǎo)的病癥。由于它們的作用"方式"、組織吸收和其他相關(guān)特征，所有目前可用的抗氧化劑都只能間接影響內(nèi)皮源舒張因子代謝，并且僅作用于某些活性氧(ROS)。此外，如果給藥劑量不正確，它們對疾病進(jìn)程會有不利影響。而且，目前對這些紊亂的治療是短期的，長期效力嚴(yán)重不足。至今為止，將治療藥物用于糖尿病和相關(guān)的心臟中心血管系統(tǒng)和外周血管系統(tǒng)的急性和慢性閉塞性血管疾病時并沒有有效地產(chǎn)生有利的長期效果，并且無法治療潛在的病癥或?qū)⒀艿慕Y(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)到正常狀態(tài)。所述各治療藥物在對患者具有一些有利效果的同時也存在嚴(yán)重的副作用，并且通常需要以較高的非生理劑量給藥。這些副作用通常與劑量有關(guān)。上述那些種類的治療藥物的不良反應(yīng)包括低血糖癥、腎功能障礙、肌病(包括橫紋肌溶解)、肝中毒、氣道阻力和孕婦服用后的致畸作用。這樣的藥物的其他副作用包括頭痛、心悸、焦慮、輕度抑郁、心肌梗塞、充血性心力衰竭、疲勞和虛弱。此外，藥理劑量對疾病活動性的初始分子起因的影響可能不具有特異性，而且對疾病的療效范圍——取決于若干因素——也有局限。某些情況下，所述不良反應(yīng)可能如臉紅和消化不良一樣普通，但會使患者對治療方案嚴(yán)重缺乏依從性。為了抵消藥物的不良反應(yīng)，已提出各種聯(lián)合治療法作為治療可選方案。因此，仍需要持續(xù)有效且具有特異性的藥劑在不造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)的情況下治療作為血管疾病的病因的內(nèi)皮功能障礙。本發(fā)明的目的是滿足這樣的需求。
發(fā)明內(nèi)容一般而言，本發(fā)明描述了對導(dǎo)致血管疾病的內(nèi)皮功能障礙的治療干預(yù)。本發(fā)明旨在提供用于治療患有特征在于內(nèi)皮功能障礙的疾病或紊亂的對象的組合物和方法，所述方法包括將包含四氫生物蝶呤(BH4)或其前體或衍生物的組合物單獨施用于所述對象或與治療劑一起聯(lián)合施用于所述對象，其中與不施用所述含BH4的組合物的情況下的所述內(nèi)皮功能障礙相比，所述施用可有效緩解所述對象的內(nèi)皮功能障礙。本發(fā)明還要提供一種治療患有內(nèi)皮功能障礙的對象的方法，所述方法包括單獨施用可增強(qiáng)血管舒張物一氧化氮(NO)的產(chǎn)生的一種因子或多種因子的組合，或?qū)⑺鲆环N因子或多種因子的組合與治療劑一起聯(lián)合施用。在一個方案中，本發(fā)明提供一種治療被診斷為患有與糖尿病有關(guān)的血管并發(fā)癥的對象的方法，所述方法包括單獨施用BH4或其前體或其衍生物，或?qū)H4或其前體或其衍生物與其他藥劑聯(lián)合施用，其中所述藥劑是治療劑或可增強(qiáng)血管舒張劑一氧化氮(NO)產(chǎn)生的因子。在一個實施方式中，與糖尿病有關(guān)的血管并發(fā)癥包括但不局限于一般的血管功能紊亂，例如異常的血管順應(yīng)性、內(nèi)皮功能障礙和高血壓；頑固性高血壓以及胰島素敏感性和血糖控制的紊亂。在另一個實施方式中，與糖尿病有關(guān)的血管并發(fā)癥包括但不局限于異常的外周灌注，例如間歇性跛行、外周灌注減少、皮膚血液流動減少和傷口愈合不全。在另一個實施方式中，與糖尿病有關(guān)的血管并發(fā)癥包括但不局限于心臟病，例如充血性心力衰竭、有或沒有充血性心力衰竭的肺動脈高壓癥、與運(yùn)動相關(guān)的心絞痛、冠心病以及相關(guān)的動脈粥樣硬化癥；眼疾病，例如視神經(jīng)萎縮和由糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變；以及腎病，例如由糖尿病引起的腎病中的微量白蛋白尿、腎衰竭和腎小球濾過率減少。在一個相關(guān)的實施方式中，所述治療劑是用于治療糖尿病的藥劑，包括但不局限于可改善胰島素敏感性的藥劑，例如PPAR-y配體(噻唑烷酮類、格列酮類、曲格列酮類、羅格列酮(文迪雅)和吡格列酮)；胰島素促泌劑，例如磺脲類(格列喹酮、甲苯磺丁脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲和醋磺己脲)和格列奈類(美格列奈、瑞格列奈、那格列奈)；以及降低肝葡萄糖產(chǎn)生的藥劑，例如二甲雙胍。在第二方案中，本發(fā)明提供治療被診斷為患有與糖尿病無關(guān)的血管疾病的對象的方法，所述方法包括單獨施用BH4或其前體或其衍生物，或?qū)H4或其前體或其衍生物與其他藥劑聯(lián)合施用，其中所述藥劑是治療劑或可增強(qiáng)血管舒張物一氧化氮(NO)產(chǎn)生的因子。這樣的與糖尿病無關(guān)的血管疾病選自由肺血管疾病、溶血性貧血、中風(fēng)和相關(guān)的缺血'性血管疾病(例如中風(fēng)、心臟病或冠心病、動脈硬化或外周血管疾病)、血栓癥、與移植相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙以及心臟病或冠心病組成的組。在一個實施方式中，肺血管疾病包括但不局限于鐮狀細(xì)胞性貧血和其他血紅蛋白病中的肺動脈高壓癥、特發(fā)性肺動脈高壓癥和新生兒持續(xù)肺動脈高壓癥(PPHN)。在另一個實施方式中，溶血性貧血包括遺傳性溶血性貧血和獲得性溶血性貧血。遺傳性溶血性貧血包括但不局限于鐮狀細(xì)胞性貧血、地中海貧血、由G6PD缺乏、丙酮酸激酶缺乏導(dǎo)致的溶血性貧血、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性口形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性卵形紅細(xì)胞增多癥、陣發(fā)性睡眠型血紅蛋白尿癥以及血紅蛋白鐮狀細(xì)胞(SC)病。獲得性溶血性貧血包括但不局限于微血管性溶血性貧血、特發(fā)性自身免疫性溶血性貧血、由化學(xué)制劑或物理因素或裝置(左心室輔助裝置、機(jī)械心臟瓣膜和旁路裝置)導(dǎo)致的非免疫性溶血性貧血以及繼發(fā)性免疫性溶血性貧血。在另一個實施方式中，中風(fēng)和相關(guān)的缺血性血管疾病包括但不局限于血管痙攣，例如中風(fēng)后的腦血管痙攣。血栓癥包括但不局限于血栓形成、血栓癥、血凝固(clotting)和血凝結(jié)(coagulation)。在另一個實施方式中，與移植相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙包括但不局限于實體器官移植后的血管功能障礙和環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙。在另一個實施方式中，心臟病和冠心病包括但不局限于充血性心力衰竭、與高膽固醇血癥有關(guān)的血管功能障礙和心絞痛，以及與吸煙有關(guān)的血管功能障礙和心絞痛。在一個相關(guān)的實施方式中，所述治療劑是用于治療血管疾病的藥劑，所述藥劑包括但不局限于通常用于治療髙血壓和其他與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的紊亂的內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如波生坦、達(dá)盧生坦、恩拉生坦、替唑生坦、阿曲生坦、安貝生坦和西他生坦；平滑肌松弛劑，例如PDE5(磷酸二酯酶5)抑制劑(間接作用)和米諾地爾(直接作用)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，例如卡托普利、依那普利、賴諾普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、群多普利、苯那普利和雷米普利；血管緊張素II受體阻斷劑，例如厄貝沙坦、氯沙坦、纈沙坦、依普羅沙坦、奧美沙坦、坎地沙坦和替米沙坦；P-阻斷劑，例如阿替洛爾、美托洛爾、納多洛爾、比索洛爾、吲哚洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾和普萘洛爾；利尿劑，例如氫氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米和美托拉宗；鈣通道阻斷劑，例如氨氯地平、非洛地平、尼索地平、硝苯地平、維拉帕米和地爾硫卓(diltiazem);a-受體阻斷劑多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿夫唑嗪和坦索羅辛；以及中樞a激動劑，例如可樂定。在一個實施方式中，BH4或BH4的前體或衍生物與PDE5抑制劑的組合提供了對一個或多個血管壓力參數(shù)的出乎意料的有利效果。因此，BH4或其前體或衍生物有望減輕這些藥物的不良反應(yīng)，例如減輕血壓的升高。在一個相關(guān)方案中，本發(fā)明提供通過以至少200mg/天(例如，每次給藥100mg，每天兩次)，或至少150mg/天，或至少100mg/天的劑量向患有高血壓的人施用經(jīng)純化的6RBH4來治療人高血壓的方法。在這樣的示例性實施方式中，BH4的劑量范圍也可以是小于500mg/天，或小于400mg/天，或小于300mg/天。在一個實施方式中，BH4的日施用劑量是至少5mg/kg/天，或至少10mg/kg/天，至多20mg/kg/天或30mg/kg/天。BH4可以單獨施用，也可以與用于治療血管疾病或高脂血癥的其他治療劑(例如上面或下面列出的那些治療劑中的任何治療劑)聯(lián)合施用。在第三方案中，本發(fā)明提供治療被診斷為患有高脂血癥的對象的方法，所述方法包括單獨施用BH4或其前體或其衍生物，或?qū)H4或其前體或其衍生物與其他藥劑聯(lián)合施用，其中所述藥劑是治療劑或可增強(qiáng)血管舒張物一氧化氮(NO)的產(chǎn)生的因子。在一個相關(guān)的實施方式中，所述治療劑是用于治療高脂血癥的藥劑，包括但不局限于降低LDL(低密度脂蛋白)的藥劑，例如他汀類(阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀鈣和辛伐他汀)和煙酸、膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑(例如torcetrapib)、PPAR-a刺激劑(例如貝特類、吉非羅齊、非諾貝特、苯扎貝特、環(huán)丙貝特)、結(jié)合膽汁酸并防止膽汁酸的重吸附且降低膽固醇水平的藥劑(例如膽汁酸螯合劑、考來烯胺和考來替泊，以及膽固醇吸收抑制劑)。BH4或其前體或其衍生物可以與這樣的藥劑的組合(例如他汀與膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的組合)一起施用，并有望減輕與血壓升高相關(guān)的不良效果。在第四方案中，本發(fā)明還要提供一種治療患有內(nèi)皮功能障礙的對象的方法，所述方法包括單獨施用可使血管舒張物一氧化氮(NO)的產(chǎn)生增強(qiáng)或正?；囊环N因子或多種因子的組合，或?qū)⑺鲆环N因子或多種因子的組合與治療劑聯(lián)合施用。在一個實施方式中，這樣的因子增強(qiáng)了BH4的從頭生物合成的活性或表達(dá)，且選自由三磷酸鳥苷環(huán)水解酶I(GTPCHl)、6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶(PTPS)和墨蝶呤還原酶組成的組。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，通過使用任何一種或多種環(huán)磷酸腺苷(cAMP)類似物或激動劑來增加GTPCH1表達(dá)的表達(dá)，從而增加BH4合成，所述環(huán)磷酸腺苷(cAMP)類似物或激動劑包括毛喉萜(forskolin)、8-溴cAMP或起增加cAMP介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用的其他藥劑，例如細(xì)胞因子和生長因子，包括白細(xì)胞介素-1、干擾素-y(IFN-y)、腫瘤壞死因子-a(THF-a)、c-反應(yīng)蛋白、HMG-CoA-還原酶(諸如阿托伐他汀等他汀類)、神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、激素類(包括腎上腺髓質(zhì)素和苯甲酸雌二醇酯)，以及其他化合物，例如NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和NADPH類似物、咖啡因、環(huán)孢霉素A、甲基-黃嘌呤(包括3-異丁基-l-甲基黃嘌呤)、茶堿、利血平和過氧化氫。因此，本發(fā)明的一個實施方式旨在提供通過用十一個磷酸二酯酶家族(PDEl-ll)(包括PDEl、PDE3和PDE5)抑制劑抑制3，,5，-環(huán)核苷的降解，以增加GTPCH1水平。本發(fā)明的PDE抑制劑包括萬艾可/西地那非、西力士/他達(dá)拉非、伐地那非/艾力達(dá)(levitm)、尤地那非(udenafil)、8-甲氧基甲基-IBMX、UK-90234、地塞米松、橙皮素、橙皮苷、伊索拉定、長春西汀、西洛酰胺、咯利普蘭(rolipram)、(3-咔啉-3-羧酸乙酯(P-CCE)、四氫-f3-咔啉衍生物、3-0-甲基槲皮素等。本發(fā)明的另一個實施方式旨在提供通過基因療法或BH4合成方法的多核苷酸的內(nèi)皮靶向遞送來增加BH4-合成酶的水平，從而增加BH4的水平。本發(fā)明的另一個實施方式旨在提供通過補(bǔ)充BH4-合成酶GTPCH1、PTPS、SR、PCD、DHPR和DHFR來增加BH4水平。所述的BH4-合成酶旨在涵蓋這些酶的所有天然形式和非天然形式，包括蛋白質(zhì)的突變異種。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過抑制堿性磷酸酶(AP)活性以使底物7,8-三磷酸二氫新蝶呤轉(zhuǎn)向BH4合成酶PTPS而不是堿性磷酸酶，從而增加BH4水平。抑制AP活性的試劑或化合物包括磷酸酯類似物、左旋咪唑和L-苯丙氨酸。本發(fā)明的另一個實施方式旨在提供抑制堿性磷酸酶的藥劑或化合物，包括抑制堿性磷酸酶合成的小干擾RNA(siRNA)、反義RNA、dsDNA、小分子、中和抗體(單鏈的、嵌合的和/或人源化的)以及抗體片段。本發(fā)明的另一個實施方式包括增強(qiáng)BH4合成的從頭合成路線的酶合成所需的催化劑或輔助因子的活性的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式包括防止BH4合成所需的酶發(fā)生降解的試劑或化合物。本發(fā)明的又一個實施方式包括防止BH4合成所需的催化劑和BH4的合成酶(包括GTPCH1、PTPS和SR)發(fā)生降解的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式涉及經(jīng)由補(bǔ)救途徑增加BH2的還原從而增力口BH47夂平。在體內(nèi)，BH4可被氧化成BH2。以醌式(qBH2)和7,8-二氫蝶呤形式存在的BH2分別被DHPR(二氫蝶呤還原酶)禾BDHFR(二氫葉酸還原酶)還原為BH4。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式涉及通過用這條途徑上的試劑或化合物NADPH、硫醇類、對氯苯甲酸汞(perchloromercuribenzoate)、過氧化氫等調(diào)節(jié)酶PCD、DHPR和DHFR的活性和合成來增加從BH2到BH4的再生或補(bǔ)救。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過用諸如抗氧化劑等試劑或化合物減少BH4的氧化來穩(wěn)定BH4的試劑，所述抗氧化劑包括抗壞血酸(維生素C)、a-生育酚(維生素E)、生育酚類(例如維生素A)、硒、(3-胡蘿卜素、類胡蘿卜素、黃酮、類黃酮、葉酸、黃酮、黃垸酮、異黃酮、兒茶酚、花色素和査耳酮。在進(jìn)一步的實施方式中，所述一種或多種因子可增加一氧化氮合成酶的活性或表達(dá)，從而增強(qiáng)NO的產(chǎn)生。在又一個實施方式中，本發(fā)明旨在提供抑制GTPCH反饋調(diào)節(jié)蛋白(GFRP)的因子。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式涉及抑制BH4與GTPCH1/GFRP絡(luò)合物的結(jié)合、從而防止由BH4導(dǎo)致的反饋抑制的試劑或化合物。本發(fā)明的所述試劑或化合物包括競爭性抑制劑，例如具有改變的對絡(luò)合物的親和力的BH4的替代形式和結(jié)構(gòu)類似物等。本發(fā)明的再一個實施方式包括增強(qiáng)L-苯丙氨酸與可誘導(dǎo)BH4合成的CTPCH1/GFRP的結(jié)合的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式包括諸如L-苯丙氨酸的前體等增加L-苯丙氨酸(起抑制GFRP和BH4對GTPCH1的反饋抑制的作用)的水平的試劑或化合物。本發(fā)明的又一個實施方式旨在提供調(diào)節(jié)GFRP的活性或合成的試劑或化合物。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式包括抑制GFRP活性的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式包括用siRNA、小分子、抗體和抗體片段等抑制GFRP的合成。本發(fā)明進(jìn)一步提供作為BH4前體的試劑或化合物，包括三磷酸鳥苷、7，8-二氫-三磷酸新蝶呤和6-丙酮酰-四氫生物蝶呤。BH4的日施用量為約0.1mg/kg約30mg/kg，例如約5mg/kg10mg/kg?？蓪H4每天單劑量施用，或者每天多劑量施用。在一些實施方式中，BH4療法不是連續(xù)的，而是以天為基礎(chǔ)給藥，直至臨床終點的改善(例如，患有頑固性高血壓的患者的血壓變得正常)得到維持。在本發(fā)明的另一個方案中，以出乎意料的低劑量進(jìn)行BH4衍生物的施用，仍能達(dá)到治療功效。預(yù)計這樣的BH4衍生物相對于天然的BH4具有改善的生物特性。在一個實施方式中，預(yù)計BH4衍生物對高血壓、血管疾病或本文所述的任何疾病的有效劑量將低于用于治療其他BH4反應(yīng)性紊亂(例如高苯丙氨酸血癥)的BH4的通常劑量。特別而言，本發(fā)明預(yù)計此處所述的任何l'，2，-二?；?(6R，S)-5，6，7，8-四氫-L-生物蝶呤或脂醛四氫生物蝶呤均可在低劑量下顯示改善的生物特性。本發(fā)明還在于提供一種組合物，所述組合物包含可在室溫穩(wěn)定的時間長于8小時的穩(wěn)定化的結(jié)晶態(tài)的BH4和可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。優(yōu)選的是，所施用的BH4是比非結(jié)晶的穩(wěn)定化BH4具有更高穩(wěn)定性的穩(wěn)定化結(jié)晶態(tài)的BH4。更優(yōu)選的是，所述穩(wěn)定化結(jié)晶態(tài)的BH4包含至少99.5%或99.9^純度的6RBH4。也可施用諸如二氫生物蝶呤(BH2)和墨蝶呤等前體。BH4可口服?？赏ㄟ^肌內(nèi)給藥、皮下給藥或靜脈給藥、經(jīng)肺內(nèi)給藥來單獨施用BH4或?qū)⑵渑c其他治療劑或通常用于治療內(nèi)皮功能紊亂的干預(yù)措施一起施用，其中所述干預(yù)措施包括但不局限于用于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的藥劑和干預(yù)措施、輔助療法和特異性療法。特異性療法可包括用于治療糖尿病的藥劑，所述藥劑包括但不局限于改善胰島素敏感性的藥劑，例如PPAR-y配體(噻唑烷酮類、格列酮類、曲格列酮類、羅格列酮(文迪雅)和吡格列酮)；胰島素促泌劑，例如磺脲類(格列喹酮、甲苯磺丁脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲和醋磺己脲)和格列奈類(美格列奈、瑞格列奈、那格列奈)；以及降低肝葡萄糖的產(chǎn)生的藥劑，例如二甲雙胍。特異性療法可包括用于治療血管疾病的藥劑，所述藥劑包括但不局限于通常用于治療高血壓和與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的其他紊亂的內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如波生坦、達(dá)盧生坦、恩拉生坦、替唑生坦、阿曲生坦、安貝生坦和西他生坦；平滑肌松弛劑，例如PDE5抑制劑(間接作用)和米諾地爾(直接作用)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，例如卡托普利、依那普利、賴諾普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、群多普利、苯那普利和雷米普利；血管緊張素II受體阻斷劑，例如厄貝沙坦、氯沙坦、纈沙坦、依普羅沙坦、奧美沙坦、坎地沙坦和替米沙坦；P-阻斷劑，例如阿替洛爾、美托洛爾、納多洛爾、比索洛爾、吲哚洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾和普萘洛爾；利尿劑，例如氫氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米和美托拉宗；鈣通道阻斷劑，例如氨氯地平、非洛地平、尼索地平、硝苯地平、維拉帕米和地爾硫卓(diltiazem;);a-受體阻斷劑，例如多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿夫唑嗪和坦索羅辛；以及中樞a激動劑，例如可樂定。特異性療法可包括用于治療高脂血癥的藥劑，所述藥劑包括但不局限于降低LDL的藥劑，例如他汀類(阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀鈣和辛伐他汀)和煙酸、PPAR-a刺激劑(例如貝特類、吉非羅齊、非諾貝特、苯扎貝特、環(huán)丙貝特)、結(jié)合膽汁酸并防止膽汁酸的重吸附且降低膽固醇水平的藥劑(例如膽汁酸螯合劑、考來烯胺和考來替泊，以及膽固醇吸收抑制劑)。用于維持BH4和/或NO產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定水平的藥劑可包括增強(qiáng)BH4的從頭生物合成的活性或表達(dá)的因子，例如三磷酸鳥苷環(huán)水解酶I(GTPCHl)、6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶(PTPS)和墨蝶呤還原酶；可用于穩(wěn)定BH4的因子，例如維生素C、抗壞血酸、(x-生育酚；增加一氧化氮合成酶的活性和表達(dá)并因此增強(qiáng)NO產(chǎn)生的因子；以及抑制GTPCH反饋調(diào)節(jié)蛋白GFRP的因子。本發(fā)明旨在提供施用選自由晶體多晶型A、晶體多晶型B、晶體多晶型F、晶體多晶型J、晶體多晶型K、晶體水合型C、晶體水合型D、晶體水合型E、晶體水合型H、晶體水合型O、溶劑化晶體型G、溶劑化晶體型I、溶劑化晶體型L、溶劑化晶體型M、溶劑化晶體型N及其組合組成的組中的一種或多種晶體形式的BH4。在另一個實施方式中，可以選擇將BH4與葉酸鹽(包括葉酸鹽前體)、葉酸和葉酸鹽衍生物一起施用。這樣的葉酸鹽包括但不局限于四氫葉酸鹽，例如5-甲?；?(6S)-四氫葉酸及其鹽、5-甲基-(6S)-四氫葉酸及其鹽、5，10-亞甲基-(6R)-四氫葉酸及其鹽、5，10-次甲基-(6R)-四氫葉酸及其鹽、lO-甲?；?(6R)-四氫葉酸及其鹽、5-亞胺甲基-(6S)-四氫葉酸及其鹽、(6S)-四氫葉酸及其鹽，以及上述化合物的組合。在另一個實施方式中，可以選擇將BH4與精氨酸一起施用。從下面的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)的描述和具體的實施例，在指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的同時，以僅為說明的方式給出，因為從本文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的要旨和范圍內(nèi)的各種變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都將變得顯而易見。下列附圖形成了本說明書的一部分，并用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的方案。通過參考附圖并結(jié)合此處所述的具體實施方式的詳細(xì)說明，可以更好地理解本發(fā)明。圖1:NO的產(chǎn)生。圖2:內(nèi)皮功能障礙和BH4缺乏。圖3:繼發(fā)性BH4缺乏的病理生理學(xué)。圖4:繼發(fā)性BH4缺乏和解偶聯(lián)eNOS。圖5:糖尿病和BH4缺乏。圖6:B型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖7:A型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖8:F型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖9:J型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖10:K型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖11:C型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖12:D型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖13:E型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖14:H型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖15:0型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖16:G型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖17:I型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖18:L型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖19:M型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖20:N型(6R)-BH4顯示的特征X-射線衍射圖樣。圖21:以5mg/kg/天的劑量施用以BH4的人的血壓反應(yīng)。圖22:以每天2次共200mg的劑量被施用以BH4的人的血壓反應(yīng)。圖23:以每天2次共100mg的劑量被施用以BH4的人的血壓反應(yīng)。圖24:用BH4和西地那非單獨治療或聯(lián)合治療后，在劑量給藥后24小時期間的平均收縮壓。圖25:用BH4和西地那非單獨治療或聯(lián)合治療后，在劑量給藥后24小時期間的平均舒張壓。圖26:用BH4和西地那非單獨治療或聯(lián)合治療后，在劑量給藥后24小時期間的平均動脈壓。圖27:用BH4和西地那非單獨治療或聯(lián)合治療后，在劑量給藥后24小時期間的平均動脈脈壓。圖28:用BH4和西地那非單獨治療或聯(lián)合治療后，在劑量給藥后24小時期間的平均(+dP/dtmaO。圖29:用BH4和西地那非單獨治療或聯(lián)合治療后，在劑量給藥后24小時期間的平均心率。具體實施例方式I.BH4在內(nèi)皮功能障礙中的作用如圖l所示，BH4是通過內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)從精氨酸生物合成NO時的必需輔助因子。由于無法從精氨酸和BH4產(chǎn)生NO是由內(nèi)皮區(qū)域所致，因此稱為內(nèi)皮功能障礙。如圖2所示，內(nèi)皮功能障礙的特征在于內(nèi)皮(形成血管壁和血液間的屏障的單細(xì)胞層襯里)無法正常地利用內(nèi)皮的eNOS產(chǎn)生血管舒張物NO(Alp等，JClinInvest2003;112(5):725-735;Katusic,AmJPhysiolHeartCircPhysiol2001;281(3):H981畫H986;Meininger等，BiochemJ2000;349(Pt1):353-356;Pieper，JCardiovascPharmacol1997;29(1):8畫15;Fukuda等,Heart2002;87(3):264-269;Ueda等，JAmCollCardiol2000;35(l):71-75;Maier等，JCardiovascPharmacol2000;35(2):173畫178;Kakoki等，JAmSocNephrol2000;11(2):301-309;deVriese等，BrJPharmacol2000;130(5):963-974;Pannirselvam等，BrJPharmacol2002;136(2):255-263;Shinozaki等，CircRes2000;87(7):566-573;Cosentino等，EurHeartJ1998;19SupplG:G3-G8)。NO缺乏的直接效應(yīng)是導(dǎo)致血管收縮過度，繼發(fā)效應(yīng)是產(chǎn)生的自由基增加(Channon,TrendsCardiovascMed2004;14(8):323-327;Meininger等,BiochemJ2000;349(Pt1):353畫356;Berka等，Biochemistry2004;43(41):13137匿13148;Vasquez-Vivar等，BiochemJ2002;362(Pt3):733-739;Cosentino等，CardiovascRes1999;43(2):274-278;Guzik等，Circulation2002;105(14):1656-1662)、血管損傷和動脈粥樣硬化加速(Cosentino等，EurHeartJ1998;19SupplG:G3-G8;Vasquez畫Vivar等，BiochemJ2002;362(Pt3):733-739)以及凝血性(thrombogenicity)和凝結(jié)性(coagulation)增加。全部數(shù)據(jù)顯示NO支持血液流動，在缺乏NO的情況下，血液流動減小，動脈粥樣硬化和血凝結(jié)的可能性增加。因此，內(nèi)皮功能障礙與血管收縮/高血壓、舒張不充分、動脈粥樣硬化加速、凝血性增加、選擇素增加和心臟事件發(fā)生率較高有關(guān)。用患有鐮狀細(xì)胞病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行的研究一致顯示組織NOS水平和基礎(chǔ)NOS活性增加，而血管舒張對內(nèi)皮依賴型激動劑(例如乙酰膽堿)的響應(yīng)削弱(Reiter等，CurrentOpinionsinHematology10:99-107(2003))。因此，來自動物研究的發(fā)現(xiàn)表明，作為對與鐮狀細(xì)胞病有關(guān)的慢性血管損傷的響應(yīng)，NO可起補(bǔ)償作用。然而，在人的研究中，似乎有其他因素影響NO的生物利用度。在患有鐮狀細(xì)胞病的女性中，卵巢產(chǎn)生的雌激素通過增強(qiáng)NOS的表達(dá)和基礎(chǔ)內(nèi)皮NO的產(chǎn)生來保護(hù)內(nèi)皮功能。因此，患有鐮狀細(xì)胞病的女性具有正常的基礎(chǔ)NO產(chǎn)生和受激NO產(chǎn)生。然而，患有鐮狀細(xì)胞病的男性和患有血管閉塞危象和急性胸腔綜合征的所有患者的基礎(chǔ)NO產(chǎn)生和受激NO產(chǎn)生都有所減少。血漿血色素和超氧化物的循環(huán)的綜合效應(yīng)導(dǎo)致NO的破壞。在鐮狀細(xì)胞病中，NO產(chǎn)生的增加減少了粘附分子的內(nèi)皮表達(dá)以及隨后的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的粘附，從而防止血管閉塞危象的發(fā)展(Space等，Am.J.Hematology63:200-204(2000))。NO也可降低血小板的活化和凝血酶的產(chǎn)生，從而防止血凝結(jié)。NO在鐮狀細(xì)胞病的治療方面的其他有利作用包括使患有哮喘和鐮狀細(xì)胞病的對象體內(nèi)的活性氧(ROS)失活，使平滑肌松弛。最近幾年內(nèi)，BH4影響內(nèi)皮功能障礙的原理已經(jīng)清楚，如表1所示，其通過可歸因于繼發(fā)性BH4缺乏的各種機(jī)制而成為關(guān)鍵的病理生理步驟(Meininger等，BiochemJ2000;349(Ptl):353-356;Meininger等，F(xiàn)ASEBJ2004)。在可從精氨酸制備NO的eNOS酶反應(yīng)中，BH4是以1摩爾對1摩爾比例參與的必需的輔助因子(圖1)，己表明，在許多情況下，由各種因素導(dǎo)致的BH4缺乏是無法產(chǎn)生NO的根本原因。圖3提供了表示繼發(fā)性BH4缺乏的病理生理學(xué)的圖示。表1.基于BH4缺乏的疾病和機(jī)制<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>作為第二功能，近來的數(shù)據(jù)表明BH4對于穩(wěn)定正常工作的偶聯(lián)、二聚形式的eNOS(圖4)也是必需的。當(dāng)BH4缺乏時，eNOS離解成功能障礙性單體并發(fā)生解偶聯(lián)，導(dǎo)致諸如過氧亞硝酸鹽等自由基的產(chǎn)生，這些自由基進(jìn)而導(dǎo)致BH4庫的進(jìn)一步破壞，加劇了BH4的潛在缺乏(Channon，TrendsCaxdiovascMed2004;14(8):323-327;Werner等，ExpBiolMed(Maywood)2003;228(11):1291-1302;Vasquez-Vivar等，BiochemJ2002;362(Pt3):733-739;Wei,ChemRev2003;103(6):2365-2383)。在糖尿病患者中，高血糖水平可通過減少第一種酶GTP環(huán)水解酶(GTPCH)的表達(dá)直接抑制BH4的生物合成(Meininger等，BiochemJ2000;349(Pt1):353-356;Meininger等，F(xiàn)ASEBJ2004;Cai等，CardiovascRes2005;65(4):S23-831)，并導(dǎo)致動物體內(nèi)(Alp等，JClinInvest2003;112(5):725-735;Yu等，JOculPharmacolTher2001;17(2):123-129;Meininger等，BiochemJ2000;349(Pt1):353隱356;Pieper，JCardiovascPharmacol1997;29(1):8畫15;Pannirselvam等，BrJPharmacol2002;136(2):255-263;Hamon等，ClinChimActa1989;181(3):249-253)和人體內(nèi)(Nystrom等，AmJPhysiolEndocrinolMetab2004;Channon,TrendsCardiovascMed2004;14(8):323-327;Werner等，ExpBiolMed(Maywood)2003;228(11):1291-1302;Heitzer等，Diabetologia2000;43(11):1435-1438;Guzik等，Circulation2002;105(14):1656-1662)的血管功能障礙，該血管功能障礙可對BH4替代物作出響應(yīng)。高膽固醇血癥患者體內(nèi)過量的膽固醇似乎也會壓制GTPCH，這種壓制能通過BH4施用而被逆轉(zhuǎn)(Fukuda等，Heart2002;87(3):264-269)?；加行牧λソ吆凸谛牟〉幕颊咚坪跻簿哂杏葿H4缺乏引起的內(nèi)皮功能障礙(Setoguchi等，JCardiovascPharmacol2002;39(3):363-368;Maier等，JCardiovascPharmacol2000;35(2):173-178)。吸煙時，來自煙的過量的氧化性化合物破壞了BH4庫，但可通過BH4替代物恢復(fù)功育^(Katusic,AmJPhysiolHeartCircPhysiol2001;281(3):H981-H986;Ueda等，JAmCollCardiol2000;35(1):71-75)。在溶血性貧血中，游離血紅素產(chǎn)生也可損耗BH4庫的自由基(Rother等，JAMA2005;293(13):1653-1662)。由此發(fā)生的BH4缺乏導(dǎo)致無法產(chǎn)生NO。在患有鐮狀細(xì)胞病的對象中，BH4替代物可有效治療因血管流動不足導(dǎo)致的肺動脈高血壓癥、缺血性再灌注損傷和器官損傷、由紅細(xì)胞和白細(xì)胞的阻塞和/或粘附導(dǎo)致的血管閉塞性危象以及血凝結(jié)。在近來的文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，適于使用6R-BH4的可能的適應(yīng)癥清單包括糖尿病(Nystrom等，AmJPhysiolEndocrinolMetab2004;Channon，TrendsCardiovascMed2004;14(8):323-327;Werner等，ExpBiolMed(Maywood)2003;228(11):1291-1302;Alp等，JClinInvest2003;112(5):725-735;Katusic，AmJPhysiolHeartCircPhysiol2001;281(3):H981-H986;Yu等，JOculPharmacolTher2001;17(2):123-129;Heitzer等，Diabetologia2000,43(11):1435-1438;.Meininger等，BiochemJ2000;349(Pt1):353-356;Pieper等，JCardiovascPharmacol1997;29(1):8-15)、高膽固醇血癥(Fukuda等，Heart2002;87(3):264-269)、吸煙(Lowe等，DrugMetabDispos2004;Ueda等，JAmCollCardiol2000;35(l):71-75)、充血性心力衰竭(Setoguchi等，JCardiovascPharmacol2002;39(3):363-368)、動脈粥樣硬化癥(Channon,TrendsCardiovascMed2004;14(8):323-327;Katusic,AmJPhysiolHeartCircPhysiol2001;281(3):H981-H986;Maier等，JCardiovascPharmacol2000;35(2):173-178)、肺動脈高壓癥(Pritchard等，Circulation2005;111(16):2022-2024;Khoo等，Circulation2005;111(16):2126-2133)、冠心病(Nyst匪等，AmJPhysiolEndocrinolMetab2004;Maier等，JCardiovascPharmacol2000;35(2):173-178;Setoguchi等，JAmCollCardiol2001;38(2):493-498)、器官移植后的再灌注損傷/血管功能障礙(Yamashiro等，JCardiovascSurg(Torino)2003;44(1):37-49;Kakoki等，JAmSocNephrol2000;11(2):301-309;Duranski等，JClinInvest2005)、中風(fēng)后的血管痙攣(Pluta等，JAMA2005;293(12):1477-1484)以及溶血性貧血，包括鐮狀細(xì)胞病(美國專利申請第2003/0078231號；Wood等，F(xiàn)reeRadicalBiology&Medicine40:1443-1453(2006))。在所有這些適應(yīng)癥中，都出現(xiàn)BH4缺乏，并導(dǎo)致一氧化氮(NO)產(chǎn)生的不足和血管系統(tǒng)無法對正常的舒張信號作出反應(yīng)。一般而言，本發(fā)明描述了對導(dǎo)致血管疾病的內(nèi)皮功能障礙的治療干預(yù)。本發(fā)明旨在提供治療患有特征在于內(nèi)皮功能障礙的疾病和紊亂的對象的方法和組合物，所述方法包括將包含四氫生物蝶呤(BH4)或其前體或其衍生物的組合物單獨施用于所述對象或?qū)⑺鼋M合物與治療劑一起聯(lián)合施用于所述對象，其中與不施用所述包含BH4的組合物的情況下的所述內(nèi)皮功能障礙相比，所述的單獨施用或聯(lián)合施用可有效緩解所述對象的內(nèi)皮功能障礙。本發(fā)明還要提供治療患有內(nèi)皮功能障礙的對象的方法，所述方法包括單獨施用可增強(qiáng)血管舒張物一氧化氮(NO)的產(chǎn)生的一種因子或多種因子的組合，或?qū)⑺鲆环N因子或多種因子與治療劑一起聯(lián)合施用。1.與糖尿病有關(guān)的血管并發(fā)癥糖尿病和其他心血管疾病狀態(tài)的特征在于一氧化氮(NO)生物活性的喪失，這導(dǎo)致內(nèi)皮中的血管舒張物和血管收縮物間的平衡改變并造成內(nèi)皮功能障礙。由于諸如活性氧(ROS)(例如超氧化物分子)等自由基產(chǎn)生過量所致，內(nèi)皮功能障礙構(gòu)成了以下各癥狀的基本原因血管收縮幅度增大(導(dǎo)致高血壓)、對血流或其他信號的舒張反應(yīng)不足、血栓形成和血小板凝集增加、諸如選擇素等細(xì)胞表面粘附分子增多、凝血因子增加和動脈粥樣硬化加速。因為NO在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用，所以NO生物活性的喪失促進(jìn)了血管疾病的發(fā)病機(jī)理，并成為所述疾病的不良結(jié)局的標(biāo)志。近來的發(fā)現(xiàn)表明BH4在暴露于氧化應(yīng)激的動脈中的加速分解代謝促進(jìn)了已知存在于糖尿病患者動脈中的內(nèi)皮功能障礙的發(fā)病機(jī)理。此外，血糖升高阻礙了BH4的細(xì)胞水平的增加。在糖尿病患者中觀察到的抗壞血酸不足也造成BH4水平對eNOS的可用性降低。幸運(yùn)的是，在動物體和人體內(nèi)，已證實BH4的實驗性補(bǔ)充對內(nèi)皮功能有有利效果。利用患有糖尿病或動脈粥樣硬化癥的動物的血管環(huán)和糖尿病患者的乳腺動脈環(huán)進(jìn)行的高濃度BH4補(bǔ)充的研究支持這樣的觀點BH4可潛在改善內(nèi)皮功能障礙并恢復(fù)血管功能。關(guān)于BH4對心血管病和糖尿病患者的積極作用的一些實例包括施用BH4似乎能增加NO介導(dǎo)的對患有糖尿病或高膽固醇血癥的患者的前臂血液流動的效果，而對正常受試者無效果(Hdtzer等，Diabetologia.43(11):1435-8(2000))。大量施用BH4可恢復(fù)經(jīng)受冠狀動脈旁路搭橋術(shù)的糖尿病患者的靜脈移植物和動脈中的血管功能(Guzik等，Circulation105(14):1656-1662(2002))。與對照組受試者相比，BH4可增加患有II型糖尿病和冠心病的患者的胰島素敏感性(Nystrom等，AmJPhysiolEndocrinolMetab.2004Nov;287(5):E919-25.Epub(2004))。在生物合成途徑中補(bǔ)充BH4前體已顯示有助于增加細(xì)胞內(nèi)的BH4水平、改善體內(nèi)NO合成并改善內(nèi)皮功能。圖5表示BH4缺乏在糖尿病中的影響。2.未控制的高血壓在高血壓患者中對BH4的效果進(jìn)行了研究。給患有控制較差的高血壓(動脈收縮BP〉135mmHg)并處于傳統(tǒng)抗高血壓療法治療期的8位患者口服BH4(5mg/kg/天，10mg/kg/天)，持續(xù)8周。評定患者在含服硝化甘油后在基線處、治療8周后、治療后1周的肱動脈血流介導(dǎo)的血管舒張(FMD)和擴(kuò)張，以及這9周和治療后6周的血壓的周變化。8周的BH4治療后FMD顯著增加，停止BH4治療1周之后FMD恢復(fù)到基線?？诜﨎H4顯著降低收縮壓和舒張壓，并且停止治療后6周時，血壓恢復(fù)到基線值。治療3周后，血壓顯著降低，并且兩種劑量的BH4產(chǎn)生相似的效果。該發(fā)現(xiàn)表明BH4改善了控制較差的高血壓患者的內(nèi)皮依賴型血管舒張(Lefeve等，AmericanHeartAssociationScientificSessions2003,SessionNo.AOP.43.3,PresentationNumber2378)。3.冠心病冠心病的特征可能是內(nèi)皮功能障礙和加速的動脈粥樣硬化的組合。多項研究中都表明BH4可恢復(fù)血管功能。BH4增加了冠狀血管的血流(Fukuda等，2002)。在患有基于冠狀動脈血流速度變化的內(nèi)皮功能紊亂的患者中，在血管造影過程中灌注BH4防止了對乙酰膽堿的異常血管收縮(Maier等(2000)J.CardiovascPharmacol35:173-178)。BH4治療既提供了改善的冠狀動脈血流，又提供了減少的動脈粥樣硬化/凝血。糖尿病患者的反復(fù)MI(心肌梗塞)導(dǎo)致的死亡率非常高。4.肺部血管疾病——肺動脈高壓癥有證據(jù)表明在肺動脈高壓癥(PAH)中存在NO不足(1)PAH患者顯示出具有降低的呼出NO水平；(2)具有BH4生物合成缺陷和BH4缺乏缺陷的基因敲除小鼠發(fā)展出肺動脈高壓癥作為其主要表現(xiàn)(Nandi等，2005,Circulation111:2086);(3)近來關(guān)于西地那非的數(shù)據(jù)表明在PAH中NO信號傳導(dǎo)不足。然而，至今尚無人的BH4替代物數(shù)據(jù)。5.溶血性貧血，包括鐮狀細(xì)胞病現(xiàn)有的一些數(shù)據(jù)表明在溶血性貧血患者中出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙，并且NO的缺乏是出現(xiàn)該問題的基礎(chǔ)原因。BH4的缺乏很可能是由BH4庫的氧化破壞導(dǎo)致的。動物研究表明，作為對與鐮狀細(xì)胞病相關(guān)的慢性血管損傷的響應(yīng)，NO起補(bǔ)償作用。循環(huán)的血漿血色素和超氧化物的聯(lián)合效應(yīng)會導(dǎo)致NO的破壞(Reiter等，CurrentOpinionsinHematology10:99-107(2003))。己經(jīng)考慮新治療方法來增加NO的生物利用度或抵消與鐮狀細(xì)胞病有關(guān)的氧化應(yīng)激和未控制的自由基增殖。精氨酸與羥基脲聯(lián)合施用可以增加NO的產(chǎn)生，并改善精氨酸在處于穩(wěn)態(tài)下的SCD(心臟猝死)患者中的利用(Morris等，J.PediatricHematology25(8):629-634(2003))。除了羥基脲和精氨酸以外，已經(jīng)考慮了其他療法，例如吸入NO以增加NO水平，施用別嘌呤醇以降低NO破壞，以及施用他汀類和西地那非以增強(qiáng)NO響應(yīng)(Mack等，Intl.J.Biochem.CellBiol.,付印中(2006))。美國專利申請公開號2003/0078231描述了用磺基-腺苷甲硫氨酸衍生物作為具有抗氧化性質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)或食品增補(bǔ)劑來治療由氧化應(yīng)激和未控制的自由基增殖導(dǎo)致的幾種疾病(包括鐮狀細(xì)胞性貧血癥)。美國專利申請公開號2005/0239807A1描述了用包含提供NO供體生物活性的基團(tuán)的活性氧生成酶抑制劑(例如別嘌呤醇)來治療與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病(例如鐮狀細(xì)胞性貧血癥)。在鐮狀細(xì)胞病中，NO降低粘附分子的內(nèi)皮表達(dá)和隨后的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的粘附，從而防止血管閉塞危象的發(fā)展(Space等，Am.J.Hematology63:200-204(2000))。已證實與細(xì)胞有關(guān)的NADPH氧化酶是超氧化物的來源(Wood等，F(xiàn)ASEBJ.19(8):989-991(2005))。與鐮狀細(xì)胞病有關(guān)的超氧化物基團(tuán)的快速產(chǎn)生會引發(fā)已知可氧化BH4的諸如OH和ONOO等二級活性氧和氮代謝物的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致BH4缺乏。在一項研究中，給鐮狀細(xì)胞轉(zhuǎn)基因(PS)小鼠施用墨蝶呤(一種BH4的前體)與血細(xì)胞粘附減弱有關(guān)(Wood等，J.FreeRadicalBiology&Medicine40:1443-1453(2006))。雖然與本發(fā)明一致，但該作者具體指出墨蝶呤缺乏外源BH4的抗氧化特性和自氧化特性，而本發(fā)明旨在提供外源BH4的使用。此外，如上所述，轉(zhuǎn)基因鐮狀細(xì)胞癥小鼠模型可能無法精確反映在人類中觀察到的控制NOS、NO禾DBH4水平的復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制(Reiter等，CurrentOpinioninHematology10:99-107(2003))。6.間歇性跛行間歇性跛行是外周動脈疾病的最顯著癥狀。它通常由髂動脈和股動脈的粥樣硬化性變窄導(dǎo)致，往往伴有腿末梢動脈的損傷。在間歇性跛行中，血液流動足以滿足人休息時的要求。然而，這樣的人運(yùn)動時，血管變得阻塞，從而限制血液流動并使供氧降低到不足以滿足運(yùn)動肌肉的需求的水平。相應(yīng)地，身體降低諸如NO等舒張血管的因子的釋放并增加收縮血管的因子(例如血栓素、5-羥色胺、血管緊張素II、內(nèi)皮素和去甲腎上腺素)的釋放。也有證據(jù)表明血細(xì)胞會變得異常并易于形成凝塊。間歇性跛行的癥狀包括小腿肌肉萎縮、腳趾和腳上的體毛缺失、腳趾甲變厚、皮膚閃亮緊繃、腳趾疼痛潰瘍、發(fā)黑但并不流血，在某些情況下，腿動脈處會形成血凝塊。間歇性跛行會影響多達(dá)5%的50歲以上的男性。10%20%的患者癥狀惡化，并且在20人中會有1人因壞疽性肢體的發(fā)展而導(dǎo)致截肢。間歇性跛行的治療包括改變生活方式(運(yùn)動、戒煙、戒酒)、運(yùn)動療法、藥物治療(己酮可可堿、萘呋胺、抗血栓劑、磷酸二酯酶抑制劑西洛他唑)以及增補(bǔ)劑(維生素E、B和C)、低膽固醇飲食和血管內(nèi)修復(fù)(Hiatt,AtherosclerosisSupplements(2005)，印刷中；Wolosker等，Clinics60(3):193-200(2005))。糖尿病患者中的研究表明BH4施用與改善由缺血導(dǎo)致的血液流動和FMD有關(guān)。7.新生兒持續(xù)肺動脈高壓癥患有新生兒持續(xù)肺動脈高壓癥(PPHN)的足月兒有較高的死亡率，數(shù)量可能為每年40,000嬰兒。死亡率非常高，大概為20%50%。許多這些嬰兒都是LGA(大于胎齡兒)和糖尿病母親的孩子，符合高血糖癥引起的BH4缺乏的關(guān)系。8.中風(fēng)和相關(guān)的缺血性血管疾病來自犬中風(fēng)模型的數(shù)據(jù)表明中風(fēng)后血凝塊部位周圍的血管痙攣導(dǎo)致?lián)p傷蔓延，且比最初事件更嚴(yán)重，該血管痙攣可通過灌注亞硝酸鹽溶液加以預(yù)防。ILBH4和血管紊亂的治療本發(fā)明描述以BH4施用為基礎(chǔ)的血管紊亂的藥物干預(yù)。本發(fā)明還要提供任何類型的BH4(穩(wěn)定形式或者其他形式)在治療包括患有各種形式的血管疾病的對象在內(nèi)的患者人群中的用途，所述血管疾病包括但不局限于在有和沒有糖尿病存在時的頑固性高血壓或未控制高血壓、間歇性跛行、冠心病、肺動脈高壓癥和溶血性貧血(包括鐮狀細(xì)胞病)。這樣的基于BH4的組合物可單獨施用，也可與任何其他治療劑和/或通常用于治療血管紊亂的干預(yù)聯(lián)合施用。這樣的治療劑包括但不局限于用于治療糖尿病的藥劑，所述用于治療糖尿病的藥劑包括但不局限于改善胰島素敏感性的藥劑，例如PPAR-Y配體(噻唑垸酮類、格列酮類、曲格列酮類、羅格列酮(文迪雅)和吡格列酮)；胰島素促泌劑，例如磺脲類(格列喹酮、甲苯磺丁脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲和醋磺己脲)和格列奈類(美格列奈、瑞格列奈、那格列奈)；以及降低肝葡萄糖產(chǎn)生的藥劑，例如二甲雙胍。這樣的藥劑包括但不局限于用于治療血管疾病的藥劑，所述用于治療血管疾病的藥劑包括但不局限于通常用于治療高血壓和其他與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的紊亂的內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如波生坦、達(dá)盧生坦、恩拉生坦、替唑生坦、阿曲生坦、安貝生坦和西他生坦；平滑肌松弛劑，例如PDE5抑制劑(間接作用)和米諾地爾(直接作用)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，例如卡托普利、依那普利、賴諾普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、群多普利、苯那普利和雷米普利；血管緊張素II受體阻斷劑，例如厄貝沙坦、氯沙坦、纈沙坦、依普羅沙坦、奧美沙坦、坎地沙坦和替米沙坦；P-阻斷劑，例如阿替洛爾、美托洛爾、納多洛爾、比索洛爾、吲哚洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾和普萘洛爾；利尿劑，例如氫氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米和美托拉宗；鈣通道阻斷劑，例如氨氯地平、非洛地平、尼索地平、硝苯地平、維拉帕米和地爾硫卓(diltiazem);a-受體阻斷劑多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿夫唑嗪和坦索羅辛；以及中樞(X激動劑，例如可樂定。這樣的藥劑包括但不局限于用于治療高脂血的藥劑，所述用于治療高脂血的藥劑包括但不局限于降低LDL的藥劑，例如他汀類(阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀f丐和辛伐他汀)和煙酸、PPAR-a刺激劑(例如貝特類、吉非羅齊、非諾貝特、苯扎貝特、環(huán)丙貝特)、結(jié)合膽汁酸并防止膽汁酸的重吸附并降低膽固醇水平的藥劑(例如膽汁酸螯合劑、考來烯胺和考來替泊，以及膽固醇吸收抑制劑)。本發(fā)明的一些實施方式旨在提供通過將包含BH4或其前體或其衍生物的組合物單獨施用于對象或?qū)⒃摻M合物與常規(guī)的血管治療聯(lián)合施用于對象來治療血管功能障礙，其中與不進(jìn)行BH4的單獨施用或與常規(guī)血管療法的聯(lián)合施用時的所述濃度相比，單獨施用BH4或與常規(guī)血管療法聯(lián)合施用BH4都可有效改善所述對象的臨床相關(guān)終點(clinicallyrelevantendpoint)。本發(fā)明的一個實施方式需要將BH4組合物以可有效使數(shù)值正常化的量施用于具有異常終點的任何個體。在一個優(yōu)選實施方式中，這樣的個體經(jīng)診斷患有特定的血管疾病。本發(fā)明旨在提供將此處所述的穩(wěn)定的BH4組合物以可將終點有效改善至正常水平的量施用于被診斷為患有特定血管疾病的患者，所述特定血管疾病的特征在于特定癥狀和/或用于診斷特定血管疾病的常規(guī)測試。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，本發(fā)明旨在提供以BH4治療具有典型癥狀的患者從而產(chǎn)生臨床相關(guān)終點的正常值。此外，對于臨床相關(guān)終點，在最小正常范圍內(nèi)的終點值的任何變化都將被認(rèn)為是對患者所采用的治療方案的治療結(jié)局。1.聯(lián)合治療本發(fā)明還要提供通過單獨施用BH4或與通常用于治療血管功能障礙的藥劑或干預(yù)聯(lián)合施用BH4而進(jìn)行的對各種類型的血管功能障礙的治療干預(yù)。應(yīng)當(dāng)理解，可將BH4治療與用于治療血管功能障礙的常規(guī)藥劑或干預(yù)聯(lián)合，從而達(dá)到使這樣的患者中的這樣的疾病的臨床相關(guān)終點提高的治療效果。如上所述，對血管功能障礙進(jìn)行治療的目的是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、提供輔助治療并提供特異性治療以改善臨床相關(guān)終點。通過校正易受血管功能障礙影響的因素(包括BH4的水平和NO產(chǎn)生)而不增加破壞性自由基的產(chǎn)生來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。輔助治療由施用可增加首選治療的有效性的藥劑或干預(yù)組成。特異性治療的目的在于維持正常的臨床相關(guān)終點。上文已對通常用于治療血管功能障礙的常規(guī)藥劑和干預(yù)進(jìn)行了討論。一些用于控制或治療血管功能障礙的常規(guī)干預(yù)包括抗糖尿病藥劑、用于治療各種類型的血管疾病的藥劑和抗高脂血癥治療。用于治療糖尿病的藥劑包括但不局限于改善胰島素敏感性的藥劑，例如PPAR-Y配體(噻唑烷酮類、格列酮類、曲格列酮類、羅格列酮(文迪雅)和吡格列酮)；胰島素促泌劑，例如磺脲類(格列喹酮、甲苯磺丁脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲和醋磺己脲)和格列奈類(美格列奈、瑞格列奈、那格列奈)；以及降低肝葡萄糖產(chǎn)生的藥劑，例如二甲雙胍。用于治療血管疾病的藥劑包括但不局限于通常用于治療高血壓和其他與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的紊亂的內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如波生坦、達(dá)盧生坦、恩拉生坦、替唑生坦、阿曲生坦、安貝生坦和西他生坦；平滑肌松弛劑，例如PDE5抑制劑(間接作用)和米諾地爾(直接作用)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，例如卡托普利、依那普利、賴諾普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、群多普利、苯那普利和雷米普利；血管緊張素II受體阻斷劑，例如厄貝沙坦、氯沙坦、纈沙坦、依普羅沙坦、奧美沙坦、坎地沙坦和替米沙坦；(3-阻斷劑，例如阿替洛爾、美托洛爾、納多洛爾、比索洛爾、吲哚洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾和普萘洛爾；利尿劑，例如氫氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米和美托拉宗；鈣通道阻斷劑，例如氨氯地平、非洛地平、尼索地平、硝苯地平、維拉帕米和地爾硫卓；a-受體阻斷劑多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿夫唑嗪和坦索羅辛；以及中樞a激動劑，例如可樂定。用于治療高脂血的藥劑包括但不局限于降低LDL的藥劑，例如他汀類(阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀鈣和辛伐他汀)和煙酸、PPAR-a刺激劑(例如貝特類、吉非羅齊、非諾貝特、苯扎貝特、環(huán)丙貝特)、結(jié)合膽汁酸或防止膽汁酸的重吸附并降低膽固醇水平的藥劑(例如膽汁酸螯合劑、考來烯胺和考來替泊，以及膽固醇吸收抑制劑)。單獨施用或與治療劑和干預(yù)聯(lián)合施用以控制和/或治療血管功能障礙的BH4并不一定是此處所述的穩(wěn)定化的BH4組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在室溫和光照條件下不穩(wěn)定的BH4組合物的制備方法。雖然該BH4組合物的不穩(wěn)定性限制了采用這樣的組合物進(jìn)行的治療，但在以BH4治療和用于治療血管疾病的常規(guī)療法治療患有血管功能障礙的患者的某些聯(lián)合治療中仍可采用不穩(wěn)定的BH4組合物。本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述了制備這樣的穩(wěn)定化的BH4組合物的方法和成分。本發(fā)明的穩(wěn)定化的BH4組合物包含在室溫可穩(wěn)定的時間長于8小時，或至少為24小時、3個月、6個月、9個月、12個月或者更長的BH4晶體。本發(fā)明的方法和組合物旨在提供穩(wěn)定化的單獨BH4的藥用組合物，所述藥用組合物可通過任何常規(guī)施用途徑遞送，包括但不局限于口服、肌內(nèi)注射、皮下注射和靜脈注射等。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步是組合有抗氧化劑的BH4組合物，所述抗氧化劑是有助于延長BH4組合物的穩(wěn)定性的抗氧化劑。本發(fā)明的一些方法包括將BH4與常規(guī)藥劑和干預(yù)組合使用，從而在患有血管疾病的患者中達(dá)到治療結(jié)局。為了在此處涉及的聯(lián)合治療中達(dá)到適當(dāng)?shù)闹委熃Y(jié)局，通?？梢杂每捎行Мa(chǎn)生所需治療結(jié)局的組合量將BH4組合物和所述藥劑/干預(yù)施用于對象。該方法可包括同時施用BH4組合物和所述藥劑/干預(yù)。這可以通過施用既包含治療劑又包含BH4的以組合劑型存在的單一組合物或藥理制劑來實現(xiàn)，或通過在進(jìn)行干預(yù)的同時施用BH4制劑來實現(xiàn)。作為選擇，可在施用BH4的藥理制劑(片劑、注射劑、飲劑)的幾乎同時服用所述藥劑/進(jìn)行所述干預(yù)。在其他選擇方案中，BH4治療可在藥劑/干預(yù)之前或之后進(jìn)行，時間間隔可以是幾分鐘到幾小時。在將藥劑/治療干預(yù)和BH4組合物分開施用的實施方式中，通常應(yīng)確保兩種藥劑可協(xié)同發(fā)揮作用，以使BH4仍能夠發(fā)揮對患者的有利作用。在這樣的情況下，設(shè)想可在藥劑/干預(yù)的約26小時內(nèi)(之前或之后)施用BH4，最優(yōu)選的是延遲時間僅約為1小時。然而，應(yīng)當(dāng)理解，兩種藥劑施用間的26小時的時間范圍僅僅是示例性的，BH4和第二種藥劑/干預(yù)的施用之間的時間間隔可以更長，例如，24小時、36小時、48小時、72小時、一周或更長。在某些實施方式中，BH4治療將是連續(xù)治療，其中將日劑量BH4無限期地施用于患者。2.用于治療的BH4組合物本部分討論可用于此處所涉及的治療的組合物。美國專利第5,698,408號、第2，601，215號、第3505329號、第4,540,783號、第4，550，109號、第4，587，340號、第4,595,752號、第4,649,197號、第4,665,182號、第4,701,455號、第4,713,454號、第4,937,342號、第5,037,981號、第5,198,547號、第5,350,851號、第5,401,844號、第5,698,408和加拿大申請CA2420374(在此通過引證將各自內(nèi)容引入)各自描述了可用作本發(fā)明組合物的二氫生物蝶呤、BH4及其衍生物的制備方法。任何這樣的方法均可用于制備本發(fā)明的治療方法中所用的BH4組合物。美國專利第4,752,573號、第4,758,571號、第4,774,244號、第4,920,122號、第5,753,656號、第5,922,713號、第5,874;433號、第5,945,452號、第6,274,581號、第6,410,535號、第6,441,038號、第6,544,994號和美國專利公開US20020187958、US20020106645、US2002/0076782、US20030032616(在此通過引證將各自內(nèi)容引入)各自描述了施用BH4組合物以進(jìn)行各種治療的方法。在此通過引證將這些專利均引入本文，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的施用BH4組合物的方法的一般教導(dǎo)，所述方法可適合用于治療此處所述的血管疾病。特別而言，美國專利第4,540,783號描述了可用于本發(fā)明的治療方法的BH4衍生物即r,2，-二?；?(6R,S)-5，6，7，8-四氫-L-生物蝶呤及其無機(jī)鹽或有機(jī)鹽。優(yōu)選的是將可藥用的鹽用于本發(fā)明的治療方法。美國專利第4,540,783號中描述的化合物具有通式(I):其中R'和W相同或不同，并且各自是?；?。所述?；鶅?yōu)選具有110個碳原子，特別是310個碳原子。優(yōu)選的?；赏ㄊ絉5CO代表——其中尺5是氫或具有1個以上碳原子、特別是29個碳原子的烴基。由RS代表的所述烴基的優(yōu)選實例是，例如，直鏈或支化的具有1個以上碳原子、優(yōu)選為29個碳原子的飽和的或不飽和的脂肪烴基；由下述通式代表的具有取代基的或不具有取代基的苯基R7Rs其中R6、R7、R8、W和R^是氫或者直鏈或支化的烷基(其中R6、R7、R8、W和RW的碳原子的總數(shù)優(yōu)選為不大于3);由下述通式代表的具有取代基的或不具有取代基的苯基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>其中R"和尺12是氫、甲基或乙基(其中R"和R^的碳原子總數(shù)優(yōu)選為不大于2);和下述通式代表的具有取代基的或不具有取代基的芳基f^~~CH2—CH2—其中1113是氫或甲基。上述?；?，最優(yōu)選的是甲酰基、乙酰基、丙?；?、丁酰基、異丁?；⑽祯；愇祯；捅郊柞；?。優(yōu)選的是R1與W相同。通式(I)的化合物具有兩種非對映異構(gòu)體，即在6位非對映異構(gòu)的r，2，-二?；?(6R)-5,6,7,8-四氫-L-生物蝶呤和1，，2，-二酰基-(6S)-5，6,7，8-四氫-L-生物蝶呤。本發(fā)明的化合物包括這兩種非對映異構(gòu)體及其混合物。本發(fā)明的化合物(I)可以是諸如鹽酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽等無機(jī)鹽的形式，或者諸如乙酸鹽、草酸鹽等有機(jī)鹽的形式，或者復(fù)鹽的形式。美國專利第4,550,109號描述了作為BH4衍生物的類脂生物蝶呤和四氫生物蝶呤。這些類脂BH4衍生物可根據(jù)本發(fā)明的治療方法作為藥用鹽施用。在美國專利第4，550，109號中描述的化合物由下述結(jié)構(gòu)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>其中——當(dāng)環(huán)B中有兩個雙鍵時，沒有R;——當(dāng)環(huán)B中沒有兩個雙鍵時，R是氫；且——R'和R"獨立地是飽和的或不飽和的、分子量平衡以使其具有類脂化合物的類脂特性的脂肪族烴基。通常R'和R"選自具有131個碳原子的烴基，限制條件是R'+2R"的碳單元的總和大于10且小于33。在這些衍生物中，2-N-酰基最好具有932個碳單元，優(yōu)選為920個，以使最終產(chǎn)物具有類脂特征。2-N-?；膶嵗枪秕；?、棕櫚酰基、硬脂?；蛠営王；?-N-?；梢允秋柡偷?例如硬脂?；?，也可以是不飽和的(例如亞油?；?。此夕卜，如苯乙?；@種無毒芳香族2-N-?；部墒棺罱K產(chǎn)物具有所需的類脂特征。理想的r，2'-二-o-?；蔷哂?8個(優(yōu)選為24個)碳單元的低分子量垸基和烯基，其實例是乙?；Ｃ绹鴮＠?,550,109號也描述了下式的生物蝶呤化合物其中R是天然存在的飽和或不飽和的脂肪酸，而且Ac-COCH3?？蓪⑦@些生物蝶呤化合物氫化以形成相應(yīng)的四氫生物蝶呤，四氫生物蝶呤可用于本發(fā)明的治療方法。脂肪酸基團(tuán)R的示例性的鏈長度是CI()C18單元。示例性化合物包括2-N-乙?；?r,2，-二-0-乙?；?L-生物蝶呤、2-N-癸?；?l，，2，-二-0-乙酰基-L-生物蝶呤、2-N-棕櫚酰基-l，,2，-二-0-乙?；?L-生物蝶呤、2N-硬脂?；?l，,2，-二-0-乙酰基-L-生物蝶呤、2-N-亞油?；?l，，2，-二-0-乙?；?L-生物蝶呤和2-^苯乙酰基-1，，2，-二-0-乙?；鶃A-生物蝶呤，以及相應(yīng)的四氫生物蝶呤。除了上述制備BH4的一般方法外，本發(fā)明還具體包括制備和使用BH4組合物，所述BH4組合物是穩(wěn)定化的BH4組合物，優(yōu)選為99.5%或99.9%純度的6RBH4。如果施用BH4自身，則可以以純化的形式施用美國專利申請第11/143,887號(和2004年11月17日提交的相應(yīng)的國際申請PCT/US04/38296，公開號為WO2005/049000)以及美國專利申請第10/990,316號(和2004年11月17日提交的相應(yīng)的國際申請PCT/IB04/04447，公開號為WO2005/065018)中所描述的任何的鹽或多晶型或晶體形式?？蓪⒏鞣N晶體形式方便地制成用于口服的片劑、粉劑或其他固體劑型。所述晶體形式也可用作常規(guī)食品的添加劑。如2005年11月16日提交的國際申請PCT/US05/41252(公開號為WO2006/055511，在此通過引證將其全部內(nèi)容引入)所述，可將BH4作為穩(wěn)定的固體制劑來施用。下文中將對BH4施用的形式和途徑做進(jìn)一步的詳細(xì)討論。在優(yōu)選實施方式中，設(shè)想本發(fā)明的方法將給需要BH4的患者提供曰劑量為約10mg/kg約20mg/kg的BH4。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)通過施用所達(dá)到的功效上下調(diào)整該劑量。所述日劑量可以單劑量給藥，也可以以方便的時間間隔多劑量給藥。在示例性實施方式中，日劑量可以是5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg、24mg/kg、26mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、32mg/kg、34mg/kg、36mg/kg、38mg/kg、40mg/kg、42mg/kg、44mg/kg、46mg/kg、48mg/kg、50mg/kg或更多。在本發(fā)明的低劑量治療方法中，所包括的低劑量是，例如每天0.1mg/kg5mg/kg，包括0.1mg/kg2mg/kg、0.1mg/kg3mg/kg或lmg/kg5mg/kg。優(yōu)選的是小于每天5mg/kg的劑量。根據(jù)本發(fā)明，這樣的劑量有望改善相關(guān)的研究終點，預(yù)計BH4衍生物相對于這樣劑量的天然BH4具有改善的生物特性。特別而言，本發(fā)明包括，此處所述的任何l',2，-二?；?(6R，S)-5，6,7,8-四氫-L-生物蝶呤或類脂四氫生物蝶吟均可在低劑量顯示改善的生物特性。具體而言，本發(fā)明旨在提供BH4或其前體或其衍生物在治療本申請?zhí)峒暗娜魏渭膊顟B(tài)或2005年6月1日提交的美國申請第11/143,887號(以及2004年11月17號提交的相應(yīng)的國際申請PCT/US04/38296，公開號為WO2005/049000)(在此通過引證將其全部內(nèi)容引入)所涉及的任何血管疾病狀態(tài)中的用途，其中劑量為O.lmg/千克體重/天5mg/千克體重/天，可通過任何途徑給藥(包括但不局限于口服)，可每天給藥一次，也可每天多次(例如，2次或3次或4次)分批給藥，給藥持續(xù)時間為至少1周、2周、3周、4周或更長，或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長。示例性的劑量包括少于5mg/kg/天、4.5mg/kg/天以下、4mg/kg/天以下、3.5mg/kg/天以下、3mg/kg/天以下、2.5mg/kg/天以下、2mg/kg/天以下、1.5mg/kg/天以下、1mg/kg/天以下或0.5mg/kg/天以下。等效的單位體表面積的劑量也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對于具有平均水平的體重/體表面積(例如70kg)的人，本發(fā)明還包括少于400mg的總?cè)談┝俊＿@樣的總?cè)談┝康膶嵗?60mg/天、350mg/天、300mg/天、280mg/天、210mg/天、180mg/天、175mg/天、150mg/天或140mg/天。例如，可通過每天口服一次或兩次175mg的口服劑型，容易地實現(xiàn)350mg/天或175mg/天的給藥劑量?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?20mg/天以下、160mg/天以下或80mg/天以下。這樣的劑量可通過80mg或160mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?5mg/天、90mg/天、135mg/天、180mg/天、225mg/天、270mg/天、315mg/天或360mg/天以下，可通過45mg或90mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?0mg/天、120mg/天、180mg/天、240mg/天、300mg/天或360mg/天，可通過60mg或120mg的口服劑型得到容易的施用。總?cè)談┝康钠渌麑嵗?0mg/天、140mg/天、210mg/天、280mg/天或350mg/天，可通過70mg或140mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康膶嵗€包括55mg/天、110mg/天、165mg/天、220mg/天、275mg/天或330mg/天，可通過55mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?5mg/天、130mg/天、195mg/天、260mg/天或325mg/天，或75mg/天、150mg/天、225mg/天、300mg/天或375mg/天，可通過例如65mg或75mg的劑型來施用。3.藥物組合物本發(fā)明的用于施用的藥物組合物可包括第一組合物，所述第一組合物包含藥用形式的BH4，必要時可與藥用載體組合。可通過能達(dá)到他們的預(yù)期目的的任意方式施用這些組合物。本發(fā)明的組合物用于治療血管疾病的施用量和施用方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員最初可采用當(dāng)前在醫(yī)療背景下建議的BH4的量和方案，例如為了調(diào)節(jié)NOS活性而提出的那些組合物?？蓪⑺枋龅囊言谪?fù)荷實驗中用于施用BH4的任何施用方案、施用制劑、施用途徑等容易地改進(jìn)，以便用于本發(fā)明。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有以可有效實現(xiàn)其預(yù)期目的的量包含本發(fā)明的BH4、BH4類似物和衍生物的組合物。同樣地，由于本發(fā)明的某些治療方法旨在提供這樣一種聯(lián)合療法除了通常用于治療血管疾病的藥劑和干預(yù)外還施用基于BH4的組合物，所以本發(fā)明的藥物組合物也旨在提供所有這樣的組合物當(dāng)將該組合物與用于治療血管疾病的常規(guī)藥劑和干預(yù)聯(lián)合施用時，該組合物至少包含可有效緩解一種或多種血管疾病癥狀的量的基于BH4的治療劑、其類似物或同系物。當(dāng)然，所能緩解的最顯著的癥狀是聯(lián)合治療使得臨床相關(guān)終點得以改善，但也對其他癥狀等進(jìn)行了監(jiān)控。這些適應(yīng)癥是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)監(jiān)控的。(6R)-L-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的晶體多晶型已發(fā)現(xiàn)BH4，特別是BH4的二鹽酸鹽，顯示晶體的同質(zhì)多晶現(xiàn)象。BH4的結(jié)構(gòu)如下所示BH4的(6R)型是己知的生物活性形式，然而，也已知BH4在室溫下不穩(wěn)定。己發(fā)現(xiàn)BH4的一種晶態(tài)多晶型更加穩(wěn)定，在室溫下不易分解。BH4由于具有吸濕性和氧化敏感性，因而難以處理，因此將其制成二鹽酸鹽的形式并以這種形式出售(SchircksLaboratories,Jona，瑞士)，在氮氣下將其用安瓿瓶封裝以防止物質(zhì)的降解。美國專利第4,649,197公開了由于6(R,S)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的結(jié)晶性較差，所以難以將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽和(6S)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽分離成它的非對映異構(gòu)體。歐洲專利第0079574號描述了四氫生物蝶呤的制備，其中得到了作為中間體的固體四氫生物蝶呤二鹽酸鹽。S.Matsuura等在"ChemistryLetter,1984，735-738"和"Heterocycles，Vol.23,No.12，1985,3115-3120"中描述了無色針狀的結(jié)晶固體的6(R)-四氫生物蝶呤，J.Biochem.98,1341-1348(1985)中披露的X-射線分析對該結(jié)晶固體進(jìn)行了表征。發(fā)現(xiàn)所述晶體產(chǎn)物的旋光度為6.81°，這與歐洲專利EP-A2-0191335的實施例6中報道的白色晶體形式的結(jié)晶固體的6.51°的旋光度非常接近。在(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的開發(fā)過程中所得的結(jié)果表明所述化合物可能存在不同的晶型，包括多個多晶型和溶劑化物。該領(lǐng)域中的持續(xù)的興趣需要有效且可靠的制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的單獨的晶型的方法以及可控的結(jié)晶條件以提供晶型，所述晶型優(yōu)選的是在制劑的制造和配制中穩(wěn)定且易于處理和加工，并且所述晶型在物質(zhì)形式或作為制劑產(chǎn)品都可提供較高的儲存穩(wěn)定性，或者提供較不穩(wěn)定的形式，其適合作為可控結(jié)晶的中間體以用于制備穩(wěn)定形式。多晶型B在此將已發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的結(jié)晶多晶型稱為"B型"，或者稱為"多晶型B"。在(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的研究和開發(fā)過程中所得的結(jié)果顯示已制備了幾種已知的結(jié)晶固體，但無人認(rèn)識到同質(zhì)多晶現(xiàn)象和該同質(zhì)多晶現(xiàn)象對BH4晶體的穩(wěn)定性的影響。多晶型B是略有吸濕性的無水物，在約2(TC以上具有最高的熱力學(xué)穩(wěn)定性。此外，由于B型的熱穩(wěn)定性、可通過目標(biāo)條件制備的可能性、合適的形態(tài)和粒徑，所以B型易于加工和處理。B型的熔點約為260°C(AHf>140J/g)，但由于其在熔融前和熔融過程中就會分解，所以無法測定清晰的熔點。這些突出的特性使得高溫制備的多晶型B特別適用于藥物用途?？傻玫郊?xì)粉狀的多晶型B，粒徑可以是0.2iiim500^im。B型顯示的X-射線粉末衍射圖樣用d值(A)表示為8.7(vs)，6.9(w),5.90(vw),5.63(m)，5.07(m)，4.76(m),4,40(m),4.15(w),4.00(s),3.95(m)，3.52(m),3.44(w)，3.32(m)，3.23(s),3.17(w)，3.11(vs),3.06(w)，2.99(w),2.96(w),2.94(m)，2.87(w)，2.84(s),2.82(m)，2.69(w)，2.59(w),2.44(w)。圖6是B型(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽顯示的特征X-射線衍射圖樣。此處所用的括號內(nèi)的下述縮寫的意思是(VS)二極高強(qiáng)度；(3)=高強(qiáng)度；(m"中等強(qiáng)度；(w"弱強(qiáng)度；(vw"極弱強(qiáng)度。特征X-射線粉末衍射圖樣示于圖6。已發(fā)現(xiàn)BH4的其他多晶型具有令人滿意的化學(xué)和物理穩(wěn)定性，在制備和配制過程中可安全地處理，并且在純凈物形式或制劑形式都提供較高的儲存穩(wěn)定性。此外，已發(fā)現(xiàn)可以大批量(例如，100kg規(guī)模)制備BH4的B型和其他多晶型，并將其儲存較長的時間。所有的晶型(多晶型、水合物和溶劑化物)，包括晶型B，都可用于制備最穩(wěn)定的多晶型B?？赏ㄟ^無定形形式或除了多晶型B以外的其他形式(例如多晶型A)在合適的極性非水溶劑中的懸浮物的相平衡來得到多晶型B。因此，此處所述的藥物制備是指(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型B的制備?？赏ㄟ^在室溫將BH4的其他形式分散在溶劑中，在室溫將懸浮液攪拌至足以產(chǎn)生多晶型B的時間，而后分離出結(jié)晶的B型，并除去分離出的B型中的溶劑，從而將BH4的其他形式轉(zhuǎn)化為B型。此處所用的室溫指0。C6(TC范圍內(nèi)的溫度，優(yōu)選為15。C40。C。在處理和攪拌過程中可通過逐步降低溫度或連續(xù)降低溫度來改變所施加的溫度。適用于將其他形式轉(zhuǎn)化為B型的合適的溶劑包括但不局限于甲醇、乙醇、異丙醇、其他C3C4醇、乙酸、乙腈、四氫呋喃、甲基叔丁基醚、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、其他C3C6醇乙酸酯、甲基乙基酮和其他甲基-C3C5烷基酮。完成相平衡的時間可以最高達(dá)30小時，優(yōu)選為最多20小時或小于20小時。也可通過從含至多約5%水的混合溶劑，特別是乙醇、乙酸和水的混合溶劑中結(jié)晶而得到多晶型B。已發(fā)現(xiàn)可通過將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶吟二鹽酸鹽的優(yōu)選為能量比B型低的固體形式或B型溶解在包含乙醇、乙酸和水的混合溶劑中，必要時該溶解可在較高溫度進(jìn)行，然后將晶種加入所述溶液中，將所得的懸浮液冷卻，并分離所形成的晶體，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型B。溶解可在室溫進(jìn)行，或在最高7(TC進(jìn)行，優(yōu)選為最高50°C。可以用最終的溶劑混合物來溶解，也可以將起始材料先溶解在水中，然后一起添加其他溶劑，或逐一添加其他溶劑。溶劑混合物的組成可以是體積比為1:3:21:9:4(優(yōu)選為1:5:4)的水:乙酸:四氫呋喃。優(yōu)選的是攪拌所述溶液。冷卻可以指溫度降至-4(TC0°C，優(yōu)選為降至10°C30°C。合適的晶種是其他批次的多晶型B或具有相似或相同形態(tài)的晶體。分離后，可用諸如丙酮或四氫呋喃等非溶劑洗滌結(jié)晶的B型，并以通常方式干燥。也可通過添加諸如甲醇、乙醇或乙酸等非溶劑從水溶液中得到多晶型B。有利的是，可在室溫進(jìn)行結(jié)晶和分離過程，而不必冷卻溶液。因此該方法非常適合以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行。在此處所述的組合物和方法的一個實施方式中，通過將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的除了B型以外的其他固體形式或B型在室溫溶解在水中，以足以形成懸浮液的量添加非溶劑，必要時將所述懸浮物攪拌一定時間，隨后將所形成的晶體分離，從而制備包含(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型B的組合物?？蓪⑺鼋M合物進(jìn)一步修飾成如下所述的藥物組合物。相對于溶液，(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽在水溶液中的濃度可以是10重量％80重量％，更優(yōu)選為20重量％60重量％。優(yōu)選的非溶劑(即，在制備BH4的懸浮液中所用的溶劑)是甲醇、乙醇和乙酸?？蓪⑺龇侨軇┨砑拥剿芤褐小８鼉?yōu)選的是，將所述水溶液添加到非溶劑中。形成懸浮液后的攪拌時間可以是至多30小時，優(yōu)選為至多20小時或少于20小時。以如上所述的已知方式進(jìn)行過濾分離和干燥。多晶型B是非常穩(wěn)定的結(jié)晶態(tài)，易于過濾、干燥和研磨至藥物制劑所需的粒徑。這些突出的特性使得多晶型B特別適用于藥物用途。多晶型A已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種晶體多晶型是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"A型"或"多晶型A"。多晶型A略具吸濕性，吸水量約為3重量％，當(dāng)以1(TC/分鐘的速度加熱時，所吸收的水在5(TC20(TC間連續(xù)釋放。多晶型A是吸濕性無水物，相對于B型而言是一種亞穩(wěn)態(tài)；然而，如果保存在緊密密封的容器中，它可以在環(huán)境條件下穩(wěn)定數(shù)月。A型特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和起始原料?？蓪⒍嗑虯制備成具有所需的通常為1pm約500jam的中位粒徑范圍的固體粉末。多晶型A顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為15.5(vs,)，12.0(m)，6.7(m)，6.5(m)，6.3(w)，6.1(w),5.96(w),5.49(m)，4.89(m)，3.79(m),3.70(s)，3.48(m),3.45(m)，3.33(s),3.26(s)，3.22(m)，3.18(m)，3.08(m),3.02(w),2.95(w)，2.87(m),2.79(w)，2.70(w)。圖7是A型(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽顯示的特征X-射線衍射圖樣。多晶型A顯示的特征拉曼光譜帶用波數(shù)(cm")表示為2934(w),2880(w)，1692(s),1683(m),1577(w),1462(m)，1360(w)，1237(w),1108(w),1005(vw),881(vw)，813(vw)，717(m)，687(m)，673(m)，659(m)，550(w),530(w)，492(m)，371(m)，258(w),207(w),101(s),87(s)cm-1?？赏ㄟ^將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的水溶液冷凍干燥或去除水從而得到多晶型A?？赏ㄟ^在室溫將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在水中，(l)將所述溶液冷卻到低溫以使溶液固化，并在減壓下去除水，或(2)從所述水溶液中去除水，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型A。可通過過濾分離結(jié)晶的A型，然后干燥以使所吸收的水從產(chǎn)物中揮發(fā)。干燥條件和方法是已知的，分離物的干燥或此處所述的變化方案(2)中的除水可在施加高溫的條件下進(jìn)行，例如最高8(TC，優(yōu)選為3(TC80°C，或在真空下進(jìn)行，或在高溫真空下進(jìn)行。在將變化方案(2)中得到的沉淀分離前，可將懸浮液攪拌一定時間以實現(xiàn)相平衡。相對于溶液，(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽在水溶液中的濃度可以是5重量％40重量％。優(yōu)選進(jìn)行快速冷卻以得到固溶體作為原料。進(jìn)行減壓直到完全去除溶劑。冷凍干燥是本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)。完成溶劑去除的時間取決于所施加的真空度(可以是0.01毫巴1毫巴)、所使用的溶劑和冷凍溫度。多晶型A在實質(zhì)上無水的條件下在室溫或低于室溫時是穩(wěn)定的，這可以通過在室溫將四氫呋喃或叔丁基甲基醚中的懸浮液在氮氣下分別攪拌5天和18小時而進(jìn)行的相平衡測試得到證實。室溫時進(jìn)行過濾和風(fēng)干得到未變化的多晶型A。多晶型F己發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種晶體多晶型是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"F型"或"多晶型F"。多晶型F略具吸濕性，吸水量為約3重量％，當(dāng)以1(TC/分鐘的速度加熱時，所吸收的水在50。C20(TC間連續(xù)釋放。多晶型F是亞穩(wěn)態(tài)，并且是吸濕性無水物，在室溫時比A型穩(wěn)定，在更高的溫度時不如B型穩(wěn)定，且F型特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料?？蓪⒍嗑虵制備成具有所需的通常為1nm約500)Lim的中位粒徑范圍的固體粉末。多晶型F顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為17.1(vs.)，12.1(w)，8.6(w),7.0(w)，6.5(w),6.4(w)，5.92(W),5.72(w),5.11(w),4.92(m),4.86(w)，4.68(m)，4.41(w)，4.12(w),3.88(w)，3.83(w)，3.70(m)，3.64(w),3.55(m),3.49(s)，3.46(vs)，3.39(s),3.33(m),3.31(m)，3.27(m)，3.21(m),3.19(m),3.09(m)，3.02(m)，和2.96(m)。圖8是F型(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^多晶型A在合適的極性非水溶劑中的懸浮液的相平衡得到多晶型F，所述溶劑幾乎不溶解所述的低能量形式，特別是諸如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇等醇類。也可通過在低于室溫時將所述A型(611)丄-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的固體顆粒分散于幾乎不溶解所述(6&)丄-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的非水溶劑中，在所述溫度將該懸浮物攪拌至足以產(chǎn)生多晶型F的時間，然后分離結(jié)晶的F型并從所分離的F型中除去溶劑，從而得到(6R)-L-赤式-四氫生物蝶昤二鹽酸鹽的多晶型F。溶劑的去除和干燥可在室溫或低于室溫(例如低至(TC)在空氣、干燥空氣或諸如氮氣或稀有氣體等干燥保護(hù)性氣體下進(jìn)行。相平衡過程中的溫度優(yōu)選為5。C15T，最優(yōu)選為約1(TC。多晶型J已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種晶體多晶型是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"J型"或"多晶型J"。多晶型J略具吸濕性，當(dāng)在潮濕空氣中處理時，它會吸水。多晶型J是亞穩(wěn)態(tài)，并且是吸濕性無水物，可將其轉(zhuǎn)化回如下所述的E型，E型是通過將J型暴露在高相對濕度(例如高于75%的相對濕度)的條件下得到的。J型特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料。可將多晶型J制備成具有所需的通常為1pm約500pm的中位粒徑范圍的固體粉末。多晶型J顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為:14.6(m)，6.6(w)，6.4(w),5.47(w)，4.84(w),3.29(vs),和3.21(vs)。圖9是J型(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^在中等溫度時在真空下將E型脫水得到J型。特別而言，可通過取得E型并在真空干燥器中在中等溫度處理E型以除去E型中的水而得到J型，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型J，所述中等溫度可以是25。C7(TC，最優(yōu)選為30°C50°C。多晶型K已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種晶體多晶型是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"K型"或"多晶型K"。多晶型K略具吸濕性，吸水量為約2.0重量％，當(dāng)以1(TC/分鐘的速度加熱時，所吸收的水在5(TC10(TC間連續(xù)釋放。多晶型K是亞穩(wěn)態(tài)，并且是吸濕性無水物，在較高溫度時不如B型穩(wěn)定，且K型特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型(特別是B型)的中間體和原料?？蓪⒍嗑蚄制備成具有所需的通常為1)im約500nm的中度粒徑范圍的固體粉末。多晶型J顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為:14.0(s)，9.4(w)，6.6(w),6.4(w)，6.3(w)，6.1(w)，6.0(w)，5.66(w)，5.33(w),5.13(vw)，4.73(m),4.64(m),4.48(w)，4.32(vw),4.22(w),4.08(w)，3.88(w)，3.79(w),3.54(m)，3.49(vs),3.39(m),3.33(vs),3.13(s)，3.10(m),3.05(m),3.01(m)，2.99(m)禾口2.90(m)。圖10是K型(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽顯示的特征X-射線衍射圖樣。可通過在存在少量抗壞血酸的情況下從含少量水的極性溶劑混合物中結(jié)晶而得到多晶型K。溶劑混合物所用的溶劑可以選自乙酸和諸如甲醇、乙醇、正丙醇或異丙醇等醇。特別而言，可通過在較高溫度時將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在包含少量水和少量抗壞血酸的乙酸和醇或四氫呋喃混合物中，將溫度降低到低于室溫以使所述二鹽酸鹽結(jié)晶，分離沉淀，并在較高溫度干燥分離出的沉淀，必要時可在真空下進(jìn)行戶萬述干燥，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型K。合適的醇是例如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇，優(yōu)選的是乙醇。乙酸與醇或四氫呋喃的比例可以是2:11:2，優(yōu)選為約1:1?？稍诖嬖诟吆康乃那闆r下進(jìn)行(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的溶解，并可添加更多的反溶劑混合物(anti-solventmixture),從而得到完全的沉淀。相對于所述溶劑混合物，最終組合物中的水的量可以是0.5重量％5重量％，抗壞血酸的量可以是0.01重量％0.5重量^。溶解溫度可以是3(TC10(TC，優(yōu)選為35。C7(TC，干燥溫度可以是30。C5(TC。分離后(例如過濾后)可用諸如乙醇等醇洗滌沉淀?？赏ㄟ^高于室溫時(例如30°C40°C)在例如異丙醇中的相平衡將多晶型K容易地轉(zhuǎn)化為最穩(wěn)定的B型，必要時以B型晶體作為晶種。(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的水合物形式如同下面所進(jìn)一步描述的，己發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽存在許多結(jié)晶的水合物，在此對其進(jìn)行描述并將其定義為C型、D型、E型、H型和O型。這些水合物形式可用作此處所述的藥物制劑用BH4的穩(wěn)定形式，并可用在包含BH4的穩(wěn)定晶體多晶型的組合物的制備中。C型水合物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的一種水合物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"C型"或"水合物C"。C型水合物略具吸濕性，含水量為約5.5重量％，表明C型是單水合物。水合物C的熔點為約94。C(AHf為約31J/g)，且C型水合物特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料。可將多晶型C制備成具有所需的通常為1pm約500pim的中位粒徑范圍的固體粉末。C型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為18.2(m)，15.4(w)，13.9(vs)，10.4(W)，9.6(w)，9,1(w)，8,8(m),8.2(w)，8.0(w),6,8(m),6,5(w),6.05(m),5.77(w),5.64(w),5.44(w),5.19(w)，4.89(w)，4.76(w),4.70(w),4.41(w)，4.25(m)，4.00(m)，3.88(m),3,80(m)，3.59(s),3.50(m)，3.44(m),3,37(m),3.26(s)，3.19(vs),3.17(s)33.11(m)，3.06(m)，3.02(m)，2.97(vs),2.93(m)，2.89(m),2.83(m),和2.43(m)。圖11是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的C型水合物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^室溫時非溶劑中的諸如多晶型B等多晶型的懸浮液的相平衡得到C型水合物，其中相對于所述溶劑，所述懸浮液中包含優(yōu)選為約5重量％的水?？赏ㄟ^將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽懸浮在諸如庚垸、C1C4醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇或2-丙醇)、乙酸酯(例如乙酸乙酯)、乙腈、乙酸或醚(例如四氫呋喃、二噁垸、叔丁基甲基醚)等非溶劑或這樣的非溶劑的二元混合物或三元混合物中，向其中添加足夠的水以形成單水合物，并在室溫或低于室溫(例如，0"C30'C)將該懸浮液攪拌至足以形成單水合物的時間，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的C型水合物。相對于溶劑的量，足夠的水可以是1重量％10重量％、優(yōu)選為3重量％8重量％的水?？蓪⒐腆w濾出，并在約為室溫時在空氣中千燥。所述固體可吸收一些水，因而具有比5.5重量％的理論值更高的含水量。相對于D型和B型，C型水合物并不穩(wěn)定，約4(TC時在空氣中且在較低的相對濕度下容易轉(zhuǎn)化為多晶型B?？赏ㄟ^室溫時的懸浮液平衡將C型轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的水合物D。D型水合物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種水合物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"D型"或"水合物D"。D型水合物略具吸濕性，可具有約5.0重量％7.0重量％的含水量，表明D型是單水合物。水合物D的熔點為約153°C(AHf為約11U/g)，具有比C型高得多的穩(wěn)定性，甚至當(dāng)在室溫暴露于大氣濕度時都是穩(wěn)定的。因此可將D型水合物用于制備制劑或用作制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料?？蓪⒍嗑虳制備成具有所需的通常為1Hm約500nm的中位粒徑范圍的固體粉末。D型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為8,6(s),6.8(w)，5.56(m),4.99(m)，4.67(s)，4.32(m),3.93(vs)，3.88(w),3.64(w)，3.41(w),3.25(w),3.17(m)，3.05(s)，2.94(w)，2.92(w),2.88(m)，2.85(w),2,80(w),2.79(m),2.68(w)，2.65(w)，2.52(vw)，2.35(w),2.34(w)，2.30(w),和2.29(w)。圖12是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的D型水合物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^在約室溫時將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的濃縮水溶液添加到過量的非溶劑(例如己烷、庚垸、二氯甲烷、正丙醇或2-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或諸如四氫呋喃、二噁垸、叔丁基甲基醚等醚，或這樣的非溶劑的二元混合物或三元混合物)中，并在室顯攪拌該懸浮液，從而得到D型水合物。可將該結(jié)晶的固體濾出，然后室溫時在干燥氮氣下干燥。優(yōu)選的非溶劑是異丙醇。水溶液的添加可逐滴進(jìn)行，以避免急劇沉淀?？赏ㄟ^在約室溫將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的濃縮水溶液添加到過量的非溶劑中，并在室溫攪拌該懸浮液，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的D型水合物。過量的非溶劑可以是指水溶液與非水溶劑的比例為1:101:1000。D型包含相對于單水合物稍稍過量的水，據(jù)信該水由于該晶體水合物的輕微吸濕性而是吸附水。D型水合物被認(rèn)為是在室溫和小于70%的相對濕度下已知的水合物中最穩(wěn)定的一個。D型水合物可用于在該水合物穩(wěn)定的條件下所制備的制劑。室溫可以是指2(TC3(TC。E型水合物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種水合物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"E型"或"水合物E"。E型水合物的含水量約為10重量％14重量％，表明E型是二水合物。水合物E在低于室溫的溫度下形成。E型水合物特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料。E型特別適合通過在氮氣下(必要時在真空下)干燥來制備無水的J型。E型不具吸濕性，在相當(dāng)高的相對濕度(即，高于約60%且最高約85%的相對濕度)下仍是穩(wěn)定的?？蓪⒍嗑虴制備成具有所需的通常為1pm約500|um的中位粒徑范圍的固體粉末。E型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為15.4(s)，6.6(w)，6.5(w),5.95(vw)，5.61(vw)，5.48(w)，5.24(w)，4.87(w)，4.50(vw),427(w),3.94(w)，3.78(w),3.69(m)，，3.60(w)，3.33(s),3.26(vs),3.16(w),3.08(m),2.98(w)，2.95(m),2.91(w)，2.87(m)，2.79(w)，2.74(w)，2.69(w)和2.62(w)。圖13是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的E型水合物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的濃縮水溶液添加到過量的且己冷卻到約io°c-io°c(優(yōu)選為ox:-i(rc)的非溶劑中，并在所述溫度攪拌該懸浮液，從而得到E型水合物?？蓪⒃摻Y(jié)晶的固體濾出，然后室溫時在干燥氮氣下干燥。非溶劑是，例如己烷、庚垸、二氯甲烷、正丙醇或2-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或諸如四氫呋喃、二噁垸、叔丁基甲基醚等醚，或這樣的非溶劑的混合物。優(yōu)選的非溶劑是異丙醇。水溶液的添加可逐滴進(jìn)行，以避免急劇沉淀?？赏ㄟ^將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的濃縮水溶液添加到過量的且冷卻到約10。C-1(TC的非溶劑中，并在室溫攪拌該懸浮物，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的E型水合物。過量的非溶劑可以是指水溶液與非水溶劑的比例為1:101:1000。優(yōu)選的非溶劑是四氫呋喃。另一種制備方法包括將多晶型B暴露于相對濕度為70%90%，優(yōu)選為約80%的氛圍中。E型水合物被認(rèn)為是二水合物，從而可吸附一些額外的水?？赏ㄟ^在中等溫度在真空下(可以是溫度為20°C50°C，壓力為0毫巴100毫巴)干燥而將多晶型E轉(zhuǎn)化為多晶型J。由于E型在較高的相對濕度中的穩(wěn)定性，它特別適合用于半固體形式的制劑。H型水合物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種水合物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"H型"或"水合物H"。H型水合物的含水量約為5.0重量％7.0重量％，表明H型是吸濕性的單水合物。H型水合物在低于室溫的溫度下形成。H型水合物特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料?？蓪⒍嗑虷制備成具有所需的通常為1^m約500pm的中位粒徑范圍的固體粉末。H型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為8.615.8(vs)，10.3(w),8,0(w),6.6(w)，6.07(w),4.81(w),4.30(w)，3.87(m):3.60(m),3.27(m),3,21(m)，3.13(w),3.05(w),296(m)，2.89(m)，2.82(w),和2.67(m)。圖14是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的H型水合物顯示的特征X-射線衍射圖樣。司通過在室溫時將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在乙酸和水的混合物中，然后添加非溶劑以沉淀出結(jié)晶固體，將所得的懸浮液冷卻并將冷卻的懸浮液攪拌一定時間，從而得到H型水合物。將所述結(jié)晶固體濾出，然后在真空下室溫干燥。非溶劑是，例如己垸、庚烷、二氯甲烷、正丙醇或2-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或諸如四氫呋喃、二噁烷、叔丁基甲基醚等醚，或這樣的非溶劑的混合物。優(yōu)選的非溶劑是四氫呋喃?？赏ㄟ^在室溫將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在乙酸和比乙酸的量少的水的混合物中，添加非溶劑并將所得的懸浮液冷卻到-l(TCl(TC，優(yōu)選為-5。C5"C，并在所述溫度將該懸浮液攪拌一定時間，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的H型水合物。一定時間可以指1小時20小時。乙酸與水的重量比可以是2:125:1，優(yōu)選為5:115:1。乙酸/水與非溶劑的重量比可以是1:21:5。H型水合物似乎是因吸濕性而含有稍稍過量的吸附水的單水合物。O型水合物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種水合物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"O型"或"水合物O"。O型水合物在接近室溫的溫度形成。O型水合物特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料?？蓪⒍嗑蚈制備成具有所需的通常為1pm約500)Lim的中位粒徑范圍的固體粉末。O型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為15.9(w)，14.0(w),12.0(w)，8.8(m),7.0(w)，6.5(w),6.3(m),6.00(w)，5.75(w)，5.65(m),5.06(m),4.98(m)，4.92(m)，4.84(w)，4.77(w)，4.42(w)，4.33(w),4.00(m)，3.88(m)，3.78(w)，3.69(s),3.64(s)，3.52(vs),3.49(s),3.46(s)，3.42(s),3.32(m),3.27(m)，3.23(s),3.18(s)，3.15(vs)，3.12(m),3.04(vs)，2.95(m)，2.81(s)，2.72(m)，2.67(m)和2.61(m)。圖15是(6R)-L陽赤式腸四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的O型水合物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^將多晶型F在含水汽的氮氣氛圍(最終相對濕度為約52。/0中暴露約24小時，從而制備O型水合物。F型是略具吸濕性的無水物，可用于在52%的相對濕度下制備0型，這一事實表明O型是水合物，在室溫和潮濕條件下比F型更穩(wěn)定。(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的溶劑化物形式如同下面所進(jìn)一步描述的，已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽存在許多結(jié)晶的溶劑化物形式，在此對其進(jìn)行描述，并將其定義為G型、I型、L型、M型和N型。這些溶劑化物形式可用作此處所述的藥物制劑用BH4的穩(wěn)定形式，并可用在包含BH4的穩(wěn)定晶體多晶型的組合物的制劑中。G型溶劑化物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的一種乙醇溶劑化物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"G型"或"水合物G"。G型乙醇溶劑化物的乙醇含量為約8,0重量％12.5重量％，表明G型是吸濕性單乙醇溶劑化物。G型溶劑化物在低于室溫的溫度形成。G型特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料。可將多晶型G制備成具有所需的通常為1pm約500nm的中位粒徑范圍的固體粉末。G型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為14.5(vs)，10.9(w),9.8(w),7.0(w)，6.3(w)，5.74(w)，5.24(vw),5.04(vw),4.79(w),4.41(w)，4.02(w),3.86(w),3.77(w)，3.69(w),3.63(m)，3.57(m)，3,49(m)，3.41(m)，3.26(m),3.17(m)，3.07(m)，2.97(m)，2.95(m)，2.87(w)和2.61(w)。圖16是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的G型溶劑化物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^將L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在水中，并添加大大過量的乙醇，將所得的懸浮液在室溫或低于室溫的溫度攪拌，并在大致室溫時將分離出的固體在空氣或氮氣下干燥，從而得到G型乙醇溶劑化物。在此，大大過量的乙醇是指所得的乙醇和水的混合物中的水少于10%，優(yōu)選為約3%6%。可通過在約室溫75。C時將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在水或水與乙醇的混合物中，將熱溶液冷卻到室溫并降至5。C1(TC，必要時可添加乙醇以完成沉淀，在20。C5。C攪拌所得的懸浮液，濾出白色結(jié)晶固體，并在大致室溫時將所述固體在空氣下或諸如氮氣等保護(hù)性氣體下干燥，從而制備(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的G型乙醇化物。第一變化方案中，該方法可這樣進(jìn)行在約室溫時將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在少量的水中，然后添加過量的乙醇，然后將所得的懸浮液攪拌至足以相平衡的時間。在第二變化方案中，可將(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽懸浮在乙醇中，必要時添加少量的水，并將該懸浮液加熱，使(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解，將該溶液冷卻到約5。C15。C，向該懸浮物中添加另外的乙醇，然后將所得的懸浮液攪拌至足以相平衡的時間。I型溶劑化物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的一種乙酸溶劑化物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"I型"或"水合物1"。I型乙酸溶劑化物的乙酸含量為約12.7重量％，表明I型是吸濕性乙酸單溶劑化物。1型溶劑化物在低于室溫的溫度形成。I型乙酸溶劑化物特別適合作為制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料。可將多晶型I制備成具有所需的通常為1^mi約500nm的中位粒徑范圍的固體粉末。I型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為14.5(m)，14.0(w)，11.0(w),7.0(vw),6.9(vw),6.2(vw),5.30(w),4.79(w)，4,44(w)，4.29(w)，4.20(vw)，4.02(w),3.84(w)，3.80(w)，3.67(vs)，3.61(m)，3.56(w),3.44(m),3.27(w),3.19(w),3.1l(s),3.00(m),2.94(w)，2.87(w)和2.80(w)。圖17是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的I型溶劑化物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^將L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽于高溫溶解在乙酸和水的混合物中，向所述溶液中進(jìn)一步添加乙酸，冷卻到約10°C，然后將所形成的懸浮液加熱到約15°C，然后將所得到的懸浮液攪拌至足以相平衡的時間，攪拌時間可以持續(xù)高達(dá)3天，從而得到I型乙酸溶劑化物。然后濾出該結(jié)晶固體，并在空氣或諸如氮氣等保護(hù)性氣體下在約室溫的溫度干燥。L型溶劑化物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的一種乙醇溶劑化物/水合物晶體形式的混合體是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"L型"或"水合物L(fēng)"。L型可含4%到高至13%的乙醇和0%約6%的水。當(dāng)在約0。C2(TC在乙醇中處理時，L型可轉(zhuǎn)化為G型。此外，當(dāng)在室溫(10°C60°C)在有機(jī)溶劑中處理時，L型可轉(zhuǎn)化為B型?？蓪⒍嗑蚅制備成具有所需的通常為1pm約500pm的中位粒徑范圍的固體粉末。L型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為14.1(vs),10.4(w)，9.5(w),9.0(vw)，6.9(w)，6.5(w),6.1(w),5.75(w)，5.61(w),5.08(w)54.71(w)，3.86(w)，3.78(w),3.46(m)，3.36(m)，3.06(w)，2.90(w)和2.82(w)。圖18是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的L型溶劑化物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^將E型水合物于室溫下懸浮在乙醇中，并在0'C1(TC，優(yōu)選為約5"C，將該懸浮液攪拌至足以相平衡的時間，攪拌時間可以是10小時20小時，從而得到L型。然后將結(jié)晶固體濾出并干燥，干燥條件優(yōu)選是在3(TC時進(jìn)行減壓，或在氮氣下。TG-FTIR分析表明L型可能含有不定量的乙醇和水，即，它可作為多晶型(無水物)存在，或作為乙醇溶劑化物/水合物的混合體存在，甚至作為水合物存在。M型溶劑化物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的一種乙醇溶劑化物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"M型"或"水合物M"。M型可含4X到高至13%的乙醇和0%約6%的水，表明M型是略具吸濕性的乙醇溶劑化物。M型溶劑化物在室溫形成。因為當(dāng)在約-10。C15。C在乙醇中處理時，M型可轉(zhuǎn)化為G型，當(dāng)在諸如乙醇、C3醇和C4醇或環(huán)醚(例如THF和二噁烷)等有機(jī)溶劑中處理時，M型可轉(zhuǎn)化為B型，因此M型特別適合用作制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料?？蓪⒍嗑蚆制備成具有所需的通常為1pm約500pm的中位粒徑范圍的固體粉末。M型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為18.9(s),6.4(m)，6.06(w),5.66(w)，5.28(w)，4.50(w),4.23(w)禾口3.22(vs)。圖19是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的M型溶劑化物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^在室溫(即，1(TC4(TC)將L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽乙醇溶解在乙醇中，并在氮氣下使溶液蒸發(fā)，從而得到M型乙醇溶劑化物。也可通過在速度為約20ml/分鐘100ml/分鐘的干燥氮氣微氣流下將G型干燥從而得到M型。取決于氮氣下的干燥程度，乙醇的殘余量可以是變化的，即約3%13%。N型溶劑化物已發(fā)現(xiàn)(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的另一種溶劑化物晶體形式是用于此處所述的藥物制劑的BH4的優(yōu)選的穩(wěn)定形式，在此將其稱為"N型"或"水合物N"。N型總共可含最高100%的異丙醇和水，表明N型是略具吸濕性的異丙醇溶劑化物?？赏ㄟ^以異丙醇洗滌D型，然后在約3(TC真空干燥而得到N型。N型特別適合用作制備穩(wěn)定多晶型的中間體和原料。可將多晶型N制備成具有所需的通常為1pm約500pm的中位粒徑范圍的固體粉末。N型顯示的特征X-射線粉末衍射圖樣的特征峰用d-值(A)表示為19.5(m)，9.9(w),6.7(w),5.15(w)，4.83(w)，3.91(w)，3.56(m)，3.33(vs)，3.15(w)，2.89(w)，2.81(w),2.56(w)和2.36(w)。圖20是(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的N型溶劑化物顯示的特征X-射線衍射圖樣?？赏ㄟ^將L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽溶解在4.0ml的異丙醇和水的混合物(混合體積比為例如4:1)中，從而得到異丙醇型N。向該溶液緩慢添加異丙醇(IPA，例如約4.0ml)，將所得懸浮液冷卻到0'C，并在該溫度攪拌數(shù)小時(例如，約10小時18小時)。在室溫將該懸浮物過濾，并用異丙醇洗滌固體殘留物。然后將所得的晶體材料在室溫(例如，約20°C30°C)且減壓(約2毫巴10毫巴)下干燥數(shù)小時(例如，約5小時20小時)。TG-FTIR顯示在25。C200。C之間有9.0%的重量損失，這是異丙醇和水共同造成的。該結(jié)果表明N型可以以異丙醇溶劑化物的形式存在，也可以以異丙醇溶劑化物/水合物的混合形式存在，或者以包含少量水的非溶劑化形式存在。對于多晶型的制備，可以采用本領(lǐng)域公知的結(jié)晶技術(shù)，例如攪拌懸浮液(相平衡)、沉淀、重結(jié)晶、蒸發(fā)、溶劑(如水)吸附法或溶劑化物的分解?？捎孟♂尩摹柡偷幕蜻^飽和的溶液進(jìn)行結(jié)晶，可以以合適的成核劑作為晶種，也可以不加入晶種?？刹捎米罡?0(TC的溫度以形成溶液?？蛇M(jìn)行降至-IO(TC，優(yōu)選為降至-3(TC的冷卻以引發(fā)結(jié)晶和沉淀。可將亞穩(wěn)態(tài)的多晶型或偽多晶型用于制備溶液或懸浮液(該溶液或懸浮液用于制備更穩(wěn)定形式)，以及用于達(dá)到更高的溶液濃度。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)D型水合物是水合物中最穩(wěn)定的形式，B型和D型特別適合用在藥物制劑中。B型和D型具備一些優(yōu)點，例如目標(biāo)性制備、因適宜的晶體大小和形態(tài)而具有的良好的處理性、在各種類型制劑的生產(chǎn)條件下的非常好的穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性、更高的水溶性和較高的生物相容性。因此，在此所公開的組合物和方法的一個實施方式是包含(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的多晶型B和/或D型水合物以及藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。(6R)-L-赤式-四氫生物蝶呤二鹽酸鹽的晶體形式可以與葉酸或四氫葉酸或它們的藥用鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或銨鹽)中的一種一起使用，或者與其中的一種再加上精氨酸一起使用。晶體形式:葉酸或其鹽:精氨酸的重量比可以是約1:10:10約10:1:1。本發(fā)明提供將此處所述的任何四氫生物蝶呤多晶型或包含任何這樣的多晶型的穩(wěn)定的藥物制劑用于治療與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)的病癥的方法。還涉及這樣一種方法以葉酸類(包括葉酸前體、葉酸或葉酸衍生物)進(jìn)行協(xié)同治療，以既包含四氫生物蝶呤或BH4前體或BH4衍生物又包含葉酸的藥物組合物或食品進(jìn)行治療也是一樣的。美國專利第6,011,040和6，544，994(在此將這兩份專利都通過引證引入本文)中披露了示例性的葉酸，所述示例性葉酸包括葉酸(蝶酰單谷氨酸)、二氫葉酸、四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、5,10-亞甲基四氫葉酸、5，10-次甲基四氫葉酸、5,10-亞胺甲基四氫葉酸、5-甲?；臍淙~酸(亞葉酸)、10-甲?；臍淙~酸、10-甲基四氫葉酸、一種以上的葉酰聚谷氨酸、其中葉酸或葉酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪環(huán)被還原以給出二氫葉酸或四氫葉酸的這樣的化合物、或在N-5或N-10位上帶有各種氧化水平的一個碳單元的所有前述化合物的衍生物、或它們的藥用鹽、或兩種以上上述化合物的組合。示例性四氫葉酸包括5-甲?；?(6S)-四氫葉酸、5-甲基-(6S)-四氫葉酸、5，10-亞甲基-(6S)-四氫葉酸、5，10-次甲基-(6S)-四氫葉酸、10-甲?；?(6S)-四氫葉酸、5-亞胺甲基-(6S)-四氫葉酸或(6S)-四氫葉酸，以及它們的鹽。4.藥物制劑優(yōu)選的是將此處所述的制劑作為口服制劑施用?？诜苿﹥?yōu)選為諸如膠囊、片劑、丸劑和錠劑等固體制劑，或諸如水懸浮液、酏劑和糖漿等液體制劑。可將此處所述的BH4的各種形式以粉末(微粉化顆粒)、顆粒、懸浮液或溶液方式直接使用，或者可將其與其他藥用成分組合到一起，包括將所述組分混合，必要時將其細(xì)細(xì)粉碎，然后裝入由例如硬明膠或軟明膠組成的膠囊，或者壓成片劑、丸劑或錠劑，或者將其懸浮或溶解在用于懸浮液、酏劑和糖漿的載體中。壓縮成丸劑后可涂布包衣。用于各種形式的制劑的藥用成分是眾所周知的，例如，可以是各種制劑類型所用的諸如天然或合成聚合物等粘合劑、賦形劑、潤滑劑、表面活性劑、甜味劑、芳香劑、包衣材料、防腐劑、染料、增稠劑、佐劑、抗菌劑、抗氧化劑和載體。此處所述的組合物中所用的粘合劑的非限制性實例包括黃蓍膠、阿拉伯樹膠、淀粉、明膠和可生物降解的聚合物，例如二羧酸、垸撐二醇、聚烷撐二醇和/或脂肪族羥基羧酸的均聚酯或共聚酯；二羧酸、烷撐二胺和/或脂肪族氨基羧酸的均聚酰胺或共聚酰胺；相應(yīng)的聚酯-聚酰胺共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈和聚碳酸酯。所述可生物降解的聚合物可以是直鏈的、支化的或交聯(lián)的。具體實例是聚乙醇酸、聚乳酸和聚-d,1-丙交酯/乙交酯。聚合物的其他實例是諸如聚氧化烯(聚氧乙烯、聚氧丙烯及其混合聚合物、聚丙烯酰胺和羥垸基化的聚丙烯酰胺、聚馬來酸及其酯或酰胺、聚丙烯酸及其酯或酰胺、聚乙烯醇及其酯或醚、聚乙烯咪唑、聚乙烯吡咯烷酮等水溶性聚合物，以及諸如殼聚糖等天然聚合物。此處所述的組合物中所用的賦形劑的非限制性實例包括諸如磷酸二鈣等磷酸鹽。此處所述的組合物中所用的潤滑劑的非限制性實例包括天然或合成油、脂肪、蠟或諸如硬脂酸鎂等脂肪酸鹽。此處所述的組合物中所用的表面活性劑可以是陰離子的、陰離子的、兩性離子的或中性的。此處所述的組合物中所用的表面活性劑的非限制性實例包括卵磷脂、磷脂、硫酸辛酯、硫酸癸酯、硫酸十二烷基酯、硫酸十四烷基酯、硫酸十六烷基酯和硫酸十八烷基酯、油酸鈉或癸酸鈉、l-酰氨基乙烷-2-磺酸(例如l-辛酰氨基乙烷-2-磺酸、1-癸酰氨基乙烷-2-磺酸、l-十二烷酰氨基乙烷-2-磺酸、l-十四垸酰氨基乙烷-2-磺酸、1-十六垸酰氨基乙烷-2-磺酸、l-十八烷酰氨基乙垸-2-磺酸)，以及?；悄懰岷团；敲撗跄懰?、膽汁酸以及它們的鹽，例如膽酸、脫氧膽酸和甘膽酸鈉、癸酸鈉或月桂酸鈉、油酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十六垸基硫酸鈉、硫酸化蓖麻油和二辛基磺基琥珀酸鈉、椰油酰胺丙基甜菜堿和月桂基甜菜堿、脂肪醇、膽固醇、單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯或二油酸甘油酯，和單棕櫚酸甘油酯或二棕櫚酸甘油酯，以及硬脂酸聚氧乙烯基酯。此處所述的組合物中所用的甜味劑的非限制性實例包括蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜。此處所述的組合物中所用的芳香劑的非限制性實例包括薄荷、冬青油或諸如櫻桃或桔子等水果香料。此處所述的組合物中所用的包衣材料的非限制性實例包括明膠、蠟、蟲膠、糖或其他可生物降解的聚合物。此處所述的組合物中所用的防腐劑的非限制性實例包括對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、山梨酸、氯丁醇、苯酚和乙基汞硫代水楊酸鈉。也可將此處所述的D型水合物配制成泡騰片或泡騰粉，它們在含水環(huán)境中分解以提供可飲用的溶液。糖漿或酏劑可包含此處所述的多晶型、作為甜味劑的蔗糖或果糖、諸如對羥基苯甲酸甲酯等防腐劑、染料和芳香劑。為了實現(xiàn)與體液接觸的活性劑在胃腸道中的可控釋放，并在血漿中提供基本不變且有效的水平的活性劑，也可將此處所述的多晶型配制成緩釋制劑。為此目的，可將該晶體形式包埋入可生物降解的聚合物、水溶型聚合物或兩者的混合物組成的聚合物基質(zhì)中，必要時也可包含合適的表面活性劑。在本文中包埋可以指將微粒摻入聚合物基質(zhì)中?？蒯屩苿┮部赏ㄟ^由已知的分散或乳化包衣技術(shù)將分散的微?；蛉榛奈⒌伟舛频谩ｋm然個體需要有所不同，但每種成分的有效量的最佳范圍的確定屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)。BH4的典型劑量包括約1mg/千克體重/天約20mg/千克體重/天，通常等于約5mg/天(1mg/kgx5千克體重)3000mg/天(30mg/kgx100千克體重)。這樣的劑量可以單劑量給藥，也可將其分成多劑量。雖然可以每天連續(xù)給藥，但理想的是當(dāng)具體臨床指標(biāo)提高到高于一定閾值水平時就停止BH4治療。當(dāng)然，在臨床改善指標(biāo)惡化的情況下可重新開始該治療。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的組合物的合適劑量將取決于接受者的年齡、健康狀況和體重、協(xié)同治療(如果有的話)的種類、治療頻率、所期望達(dá)到的效果的性質(zhì)(即，所期望的肺壓降低量)。給藥頻率也取決于對動脈氧壓的藥效。然而，如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解且可確定的，無需通過過多的試驗即可按個體對象定制最優(yōu)選劑量。這通常包括標(biāo)準(zhǔn)劑量的調(diào)整，例如，如果患者的體重較低，則降低劑量。如上所述，可將每次治療所需的總劑量分成多次給藥，也可單劑量給藥。可將BH4組合物單獨施用，也可將其與針對該疾病或該疾病的其他癥狀的治療聯(lián)合施用。從此處所呈現(xiàn)的公開內(nèi)容可明顯看出，廣義而言，本發(fā)明旨在提供包含結(jié)晶的BH4制劑的組合物的臨床應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)將所述組合物配制成合適的藥物組合物，即，在這樣的聯(lián)合治療中適合用于體內(nèi)應(yīng)用的形式。通常而言，這將需要制備基本不含熱原以及會對人和動物有害的其他雜質(zhì)的組合物。優(yōu)選的是，包含結(jié)晶的BH4組合物的制劑可以是這樣的可直接用于治療血管疾病。通常需要采用合適的鹽和緩沖劑以使BH4適于吸收。本發(fā)明的水性組合物包含有效量的溶解或分散在藥用載體或水性介質(zhì)中的BH4。這樣的組合物可口服給藥或注射給藥。術(shù)語"藥用(的)"是指當(dāng)該分子實體和組合物施用于動物或人時不產(chǎn)生不良反應(yīng)、過敏反應(yīng)或其他不利反應(yīng)。此處所用的"藥用載體"包括任意的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸附延遲劑等。將這樣的介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的。除非與所述治療組合物不相容，任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑在所述治療組合物中的用途也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可將增補(bǔ)性活性成分添加到所述組合物中。在示例性實施方式中，藥物蛋白制劑可包含玉米糖漿固體、高油酸紅花油、椰子油、大豆油、L-亮氨酸、磷酸三鈣、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸乙酸鹽、DATEM(—種乳化劑)、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、磷酸二鉀、L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-絲氨酸、檸檬酸鉀、L-蘇氨酸、檸檬酸鈉、氯化鎂、L-組氨酸、L-蛋氨酸、抗壞血酸、碳酸鈣、L-谷氨酸、L-胱氨酸二鹽酸鹽、L-色氨酸、L-天冬氨酸、氯化膽堿、?；撬?、m-肌醇、硫酸亞鐵、棕櫚酸抗壞血酸酯、硫酸鋅、L-肉堿、乙酸a-生育酸酯、氯化鈉、煙酰胺、混合生育酚、泛酸鈣、硫酸銅、氯化硫胺鹽酸鹽、維生素A棕櫚酸酯、硫酸鎂、核黃素、吡哆醇鹽酸鹽、葉酸、卩-胡蘿卜素、碘化鉀、葉綠醌、生物素、硒酸鈉、氯化鉻、鉬酸鈉、維生素D3和氰鈷維生素。增補(bǔ)物中的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素的提供量應(yīng)當(dāng)能提供各個組分的推薦日劑量。此處所用的"藥用載體"包括任意的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的。除非與所述活性成分不相容，任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑在所述治療組合物中的用途也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可將增補(bǔ)性活性成分添加到所述組合物中。本發(fā)明的活性組合物包含BH4的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑，在此已對這些制劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些制劑進(jìn)行了討論。本發(fā)明的這些組合物將通過任何用于膳食補(bǔ)充的常規(guī)途徑施用。與BH4—樣，優(yōu)選的是將所述蛋白質(zhì)口服。在某些實施方式中，本發(fā)明包括將用于治療血管疾病的BH4或其前體或其衍生物配制成通過吸入給藥的吸入用制劑。同樣地，可將BH4或其前體或其衍生物制備成氣霧制劑。用可吸入的組合物治療肺動脈高壓癥的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在例如美國專利第6,756,033號(在此通過引證將其引入)中有過描述，該專利提供了通過吸入法遞送前列腺素制劑從而治療肺動脈高壓癥的教導(dǎo)。在前面提到的專利中所描述的用于前列腺素的吸入技術(shù)也可用于制備BH4和/或其前體和衍生物的吸入用制劑。此外，本發(fā)明還包括可通過基于BH4的組合物和前列腺素制劑的聯(lián)合施用來治療內(nèi)皮功能障礙。可將所述活性化合物配制成適當(dāng)?shù)鼗煊斜砻婊钚詣?例如羥丙基纖維素)的游離堿或藥用鹽的水溶液，以用于施用。也可配制成在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物以及油中的分散液。在通常的儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長?？蓪H4組合物配制成適合注射使用的藥物形式。這樣的組合物可以是無菌水溶液或分散液，以及用于配制無菌注射用水溶液或分散液這種即時制劑(extemporaneouspreparation)的無菌粉末。在所有的情況下，所述藥物形式都必須是無菌的，并且必須是具有易注射性的流體。它在制備和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須經(jīng)防腐處理以避免微生物(例如細(xì)菌和真菌)污染。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的合適的混合物以及植物油的溶劑或分散介質(zhì)。可通過例如使用諸如卵磷脂等包衣、在分散的情況下保持所需的粒徑以及使用表面活性劑來維持合適的流動性?？赏ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和乙基汞硫代水楊酸鈉等)，來抑制微生物的作用。在很多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。可通過將延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)用在可注射組合物中使該可注射組合物的吸收延長。通過將所需量的活性化合物添加到適當(dāng)?shù)娜軇┲?，必要時添加上面列舉的各種其他成分，然后進(jìn)行過濾滅菌，從而制備無菌注射溶液。一般而言，通過將各種經(jīng)滅菌的活性成分添加到包含基本分散介質(zhì)和所需的來自上面列舉的那些成分中的其他成分的無菌介質(zhì)中來制備分散液。就用于制備無菌注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是可得到包含來自先前的無菌過濾溶液的活性成分以及任何想要的附加成分的粉末的真空干燥和冷凍干燥技術(shù)。BH4組合物的優(yōu)選制劑和隨此處所述方法使用的優(yōu)選制劑是片劑。令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)將抗壞血酸添加到片劑中可提高制劑的穩(wěn)定性。不希望局限于特定的穩(wěn)定化機(jī)理，據(jù)信當(dāng)將BH4混入包含多種賦形劑的藥物制劑中時，即使很少量的抗壞血酸(例如，少于2重量％)也能與BH4一起產(chǎn)生絡(luò)合物，并抑制BH4降解的一種或多種途徑。因此，如在2005年11月16日提交的國際申請PCT/US05/41252(公開號W02006/055511，在此通過引證將其全部內(nèi)容引入)中所詳細(xì)闡明的，此處所用的BH4的一個示例性片劑包含抗壞血酸。示例性的穩(wěn)定口服制劑包含一種以上可提高所述制劑的穩(wěn)定性或其他特性的下述附加成分粘合劑、崩解劑、酸性抗氧化劑或潤滑劑或它們的組合。示例性的穩(wěn)定片劑包含粘合劑和崩解劑，必要時包含酸性抗氧化劑，必要時進(jìn)一步包含潤滑劑。粘合劑的示例性濃度是約1重量％約5重量％，或約1.5重量％3重量％;粘合劑與BH4的示例性重量比是約1:10約l:20。崩解劑的示例性濃度是約1重量％約20重量％;崩解劑與BH4的示例性重量比是約l:5約1:10?？寡趸瘎┑氖纠詽舛仁羌s1重量％約3重量％，抗氧化劑與BH4的示例性重量比是約1:51:30。在一個實例中，抗壞血酸就是抗氧化劑，其用量與BH4的比為小于l:l，例如，1:2以下，或1:10以下。本發(fā)明的穩(wěn)定片劑中的潤滑劑的示例性濃度是約0.1重量％約2重量％;潤滑劑與BH4的示例性重量比為約1:251:65。所述穩(wěn)定固體制劑必要時可包含適合于要治療的病癥的其他治療劑(例如，葉酸類，包括葉酸前體、葉酸或葉酸衍生物)；和/或精氨酸；和/或維生素(例如維生素C和/或維生素B2(核黃素)和/或維生素B12);和/或諸如L-多巴或卡比多巴等神經(jīng)遞質(zhì)前體；和/或5-羥色氨酸。優(yōu)選的是將此處所述的組合物中所用的BH4制成二鹽酸鹽，然而，估計BH4的其他的鹽形式也具備所需的生物活性，因此，也可使用BH4其他的鹽形式?？梢砸越饘倩虬?例如堿金屬和堿土金屬或有機(jī)胺)形成藥用堿加成鹽。也可以制備具有藥用陽離子的化合物藥用鹽。合適的藥用陽離子是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括堿陽離子、堿土陽離子、銨和季銨陽離子。碳酸鹽或碳酸氫鹽也是可以的。用作陽離子的金屬的實例是鈉、鉀、鎂、銨、鈣或鐵(三價)等。合適的胺的實例包括異丙胺、三甲基胺、組氨酸、N，N，-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普魯卡因。藥用的酸加成鹽包括無機(jī)或有機(jī)酸鹽。合適的酸鹽的實例包括鹽酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽。其他合適的藥用鹽是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括例如與下述酸形成的鹽乙酸、檸檬酸、草酸、酒石酸或扁桃酸、鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸；有機(jī)羧酸、磺酸、硫代酸(sulfoacid)或膦酸或N-取代氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡萄糖醛酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、雙羥萘酸、煙酸或異煙酸；以及氨基酸，例如，諸如谷氨酸或天冬氨酸等在天然蛋白質(zhì)的合成中所涉及的20種(x-氨基酸，以及苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙垸-l，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-l,5-二磺酸、2-磷酸甘油酸酯或3-磷酸甘油酸酯、葡萄糖-6-磷酸酯、N-環(huán)己基氨基磺酸(形成了環(huán)己基氨基磺酸鹽)或其他酸性有機(jī)化合物，例如抗壞血酸。具體而言，優(yōu)選的是BH4與無機(jī)酸或有機(jī)酸的鹽。可選的BH4的鹽形式的非限制性實例包括BH4乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽和扁桃酸鹽。BH4的給藥頻率將取決于藥劑的藥代動力學(xué)參數(shù)和施用途徑。最佳藥劑將由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)施用途徑和所需的劑量來確定。參見，例如"Remington'sPharmaceuticalSciences"(第18版，1990,MackPubl.Co,伊斯頓(賓夕法尼亞州)18042)，第14351712頁，在此通過引證將其引入本申請。這樣的制劑會影響所施用的藥劑的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度和體內(nèi)清除速度。取決于施用途徑，可根據(jù)體重、體表面積或器官尺寸來計算合適的劑量。確定合適的治療劑量所必需的計算的進(jìn)一步細(xì)化由本領(lǐng)域技術(shù)人員按常規(guī)方法，特別是根據(jù)此處所公開的劑量信息和檢驗，以及在動物或人的臨床試驗中所觀測到的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)來進(jìn)行，而無需進(jìn)行過多的試驗。可通過使用已確立的用于測定苯丙氨酸的血液水平以及相關(guān)劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)的檢測來確定合適的劑量。最終劑量范圍將由主治醫(yī)生考慮改變藥物作用的因素(例如，藥物的比活，傷害的嚴(yán)重性和患者的響應(yīng)、患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食、任何感染的嚴(yán)重性、給藥時間和其他臨床因素)來確定。隨著研究的進(jìn)行，將會出現(xiàn)關(guān)于具體疾病和病癥的合適的劑量水平和治療持續(xù)時間的進(jìn)一步的信息。應(yīng)了解本發(fā)明的藥物組合物和治療方法可用于人藥領(lǐng)域和獸藥領(lǐng)域。因此，所要治療的對象可以是哺乳動物，優(yōu)選為人或其他動物。對獸藥用途而言，對象包括，例如農(nóng)場動物，包括牛、綿羊、豬、馬和山羊；寵物，例如狗和貓；外來動物和/或動物園動物；實驗室動物，包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和倉鼠；以及家禽，例如雞、火雞、鴨和鵝。在本發(fā)明的某些方面，可將通過單獨使用BH4或?qū)H4與通常用于治療此處所述的疾病的其他藥劑或干預(yù)聯(lián)合使用來治療這樣的疾病的所有必需成分包裝在試劑盒中。具體而言，本發(fā)明提供用于此處所述的疾病的治療干預(yù)的試劑盒，所述試劑盒包含成套包裝的藥物，所述藥物包含BH4或其衍生物或其前體以及用于制備所述藥物的可遞送形式的緩沖劑和其他成分；和/或遞送這樣的藥物的裝置；和/或與這樣的基于BH4的藥物一起用于聯(lián)合療法的任何藥劑；和/或與所述藥物包裝在一起的指示如何治療此處所述的疾病的說明書?？蓪⑺稣f明書固定在任何能看到的介質(zhì)中，例如打印紙，或計算機(jī)可讀取的磁盤或光盤，或引用遠(yuǎn)程計算機(jī)信息源(例如可通過因特網(wǎng)獲得的萬維網(wǎng)網(wǎng)頁)的說明書。III.改變BH4合成和/或NO產(chǎn)生的因子本發(fā)明旨在提供治療特征為內(nèi)皮功能障礙的疾病或紊亂的方法，所述方法包括將包含可增加四氫生物蝶呤(BH4)或其前體或其衍生物的藥劑的組合物單獨施用于所述對象或與治療劑聯(lián)合施用于所述對象，其中與不施用所述含BH4的組合物的情況下的所述內(nèi)皮功能障礙相比，所述施用可有效緩解所述對象的內(nèi)皮功能障礙。本發(fā)明的一個實施方式包括通過增加BH4合成途徑中的酶(包括第一酶和速率控制酶GTPCH1、PTPS和SR)的表達(dá)或合成或活性來增加BH4水平的一種以上的藥劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，通過使用任何一種或多種環(huán)磷酸腺苷(cAMP)類似物或激動劑來增加GTPCH1的表達(dá)，從而增加BH4的合成，所述cAMP類似物或激動劑包括毛喉萜、8-溴cAMP或其他起增加cAMP介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用的藥劑，例如細(xì)胞因子和生長因子，包括白細(xì)胞介素-1、干擾素-y(IFN-力、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、c反應(yīng)蛋白、HMB-CoA-還原酶(他汀類，例如阿托伐他汀)、神經(jīng)生長因子(NFG)、內(nèi)皮生長因子(EGF)、激素(包括腎上腺髓質(zhì)素和苯甲酸雌二醇酯)，以及其他的化合物，例如NADPH和NADPH類似物、咖啡因、環(huán)孢霉素A、甲基-黃嘌呤(包括3-異丙基-1-甲基黃嘌呤)、茶堿、利血平、過氧化氫。本領(lǐng)域已經(jīng)確證磷酸二酯酶降解3',5'-環(huán)核苷，例如cGMP和cAMP。cAMP是BH4合成(eNOS的必需輔助因子)的速率控制酶GTPCH1的已知活化劑。因此，磷酸二酯酶家族的抑制劑對BH4-合成酶GTPCH1具有二級活化作用。因而本發(fā)明的一個實施方式涉及通過用11個磷酸二酯酶家族(PDE111)(包括PDE1、PDE3禾f!PDE5)的抑制劑來抑制3',5'-環(huán)核苷的降解，從而增加GTPCH1水平。本發(fā)明的PDE抑制劑包括萬艾可/他達(dá)拉非、西力士/西地那非、伐地那非/艾力達(dá)(levitm)、8-甲氧基甲基-IBMX、UK-90234、地塞米松、橙皮素、橙皮苷、伊索拉定、長春西汀、西洛酰胺、咯利普蘭(rolipram)、卩-咔啉-3-羧酸乙酯(卩-CCE)、四氫-卩-咔啉衍生物、3-0-甲基槲皮素等。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過BH4合成機(jī)制的多核苷酸的基因療法或內(nèi)皮靶向遞送來增加BH4-合成酶的水平，從而增加BH4的水平。提交的要求保護(hù)用于基因療法的BH4合成用基因的專利包括US20030198620。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過補(bǔ)充BH4合成酶GTPCH1、PTPS、SR、PCD、DHPR和DHFR來增加BH4的水平。在此聲明，本申請利用BH4合成酶來涵蓋這些酶的所有天然和非天然形式(包括蛋白質(zhì)的活性和非活性突變體)。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過抑制堿性磷酸酶(AP)活性以使底物7,8-三磷酸二氫新嘌呤轉(zhuǎn)向BH4合成酶PTPS而不是AP，從而增加BH4水平。抑制AP活性的試劑或化合物包括磷酸酯類似物、左旋咪唑和L-苯丙氨酸。本發(fā)明的另一個實施方式涉及抑制堿性磷酸酶的試劑或化合物，包括抑制堿性磷酸酶合成的小干擾RNA(siRNA)、反義RNA、dsDNA、小分子、單鏈的、嵌合的、人源化的中和抗體以及抗體片段。本發(fā)明的另一個實施方式包括增強(qiáng)BH4合成的從頭合成途徑的酶合成所需的催化劑或輔助因子的活性的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式包括防止BH4合成所需的酶降解的試劑或化合物。本發(fā)明的再一個實施方式包括防止BH4合成所需的催化劑和BH4合成酶(包括GTPCH1、PTPS禾QSR)降解的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過抑制由BH4導(dǎo)致的對GTPCH1/GFRP絡(luò)合物的反饋調(diào)節(jié)，從而增加BH4水平。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式涉及抑制BH4與GTPCH1/GFRP絡(luò)合物的結(jié)合，由此防止由BH4導(dǎo)致的反饋抑制的試劑或化合物。本發(fā)明的試劑或化合物包括競爭性抑制劑，例如對所述絡(luò)合物有不同親和力的BH4的替代形式和結(jié)構(gòu)類似物等。本發(fā)明的另一個實施方式包括增強(qiáng)L-苯丙氨酸與可誘導(dǎo)BH4合成的CTPCH1/GFRP的結(jié)合的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式涉及例如L-苯丙氨酸的前體等增加L-苯丙氨酸的水平的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式涉及調(diào)節(jié)GFRP的活性或合成的試劑或化合物。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式包括抑制GFRP活性的試劑或化合物。本發(fā)明的另一個實施方式包括用siRNA、小分子、抗體、抗體片段等抑制GFRP的合成。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過補(bǔ)救途徑增加BH2的還原，從而增加BH4的水平。在體內(nèi)，BH4可被氧化成BH2。以醌式形式(qBH2)和7，8-二氫蝶呤形式存在的BH2分別被DHPR(二氫蝶呤還原酶)和DHFR(二氫葉酸還原酶)還原為BH4。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式涉及通過用這條途徑上的試劑或化合物NADPH、硫醇類、對氯苯甲酸汞、過氧化氫等調(diào)節(jié)酶PCD、DHPR和DHFR的活性和合成來增加從BH2到BH4的再生或補(bǔ)救。本發(fā)明的另一個實施方式涉及通過用諸如抗氧化劑等試劑或化合物減少BH4的氧化來增加BH4的水平，所述抗氧化劑包括抗壞血酸(維生素C)、維生素E、生育酚類(例如維生素A)、硒、|3-胡蘿卜素、類胡蘿卜素、黃酮、類黃酮、葉酸、黃酮、黃垸酮、異黃酮、兒茶酚、花色素和查耳酮等。美國專利和專利申請US6544994、US20050119270、US20030007961和US20020052374描述了BH4和抗氧化劑的使用。本發(fā)明的另一個實施方式包括作為BH4前體的試劑和化合物，包括三磷酸鳥苷、7，8-三磷酸二氫新蝶呤和6-丙酮酰-四氫生物蝶呤。VII.實施例納入下述實施例以演示本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下述實施例中所公開的技術(shù)代表發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的、在本發(fā)明的實踐中能很好地實行的技術(shù)，因此可認(rèn)為它們組成了優(yōu)選的實施方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明的要旨和范圍的情況下，在所公開的具體實施方式中可以做許多改變并仍獲得相同或相類似的結(jié)果。實施例16R-四氫生物蝶呤的臨床評價下述實施例提供了對用于本發(fā)明的治療方法中的臨床評價BH4的參數(shù)的指導(dǎo)。如同此文各處所述，BH4將被用于治療與糖尿病有關(guān)的和非糖尿病的心血管并發(fā)癥，包括但不局限于頑固性高血壓、間歇性跛行、冠狀動脈高壓、冠狀動脈病、肺動脈高壓癥和溶血性貧血(包括鐮狀細(xì)胞病)。將進(jìn)行臨床試驗以提供對BH4每日口服安全劑量、藥代動力學(xué)、替代品的最初反應(yīng)和所定義的臨床終點的評價。每個患者最少進(jìn)行一周試驗(但不一定局限于一周)以評價在逆轉(zhuǎn)相關(guān)研究終點(例如，間歇性跛行患者歩行過程中疼痛的發(fā)展)時的有效性，并收集30個可評價患者的足夠的安全性信息。試驗的最初劑量將在約2mg/kg約10mg/kg，或者約1mg/kg約20mg/kg范圍內(nèi)變化。在該劑量沒有改善患者的臨床終點，或者沒有產(chǎn)生顯著的直接臨床效果的情況下，必要時應(yīng)將劑量增加，并維持一周的額外最短時期(但必須將其限制為一周)以確定安全性，并進(jìn)一步評價有效性。也可考慮更低的劑量，例如，0.1mg/kg2mg/kg的劑量，以及1mg/kg5mg/kg的劑量。期望這樣的劑量可以改善相關(guān)研究終點，包括但不局限于涉及動脈粥樣硬化并發(fā)癥或肺部高壓癥的那些研究終點。具體而言，本發(fā)明旨在提供BH4或其前體或其衍生物在治療本申請?zhí)峒暗娜魏窝芗膊顟B(tài)或2005年6月1日提交的美國申請第11/143,887號(在此通過引證將其全部內(nèi)容引入本申請)所提及的任何一種血管疾病狀態(tài)中的用途，其中劑量為lmg/千克體重/天5mg/千克體重/天，可通過任何途徑給藥(包括但不局限于口服)，可每天給藥一次，也可每天多次(例如，2次或3次或4次)分批給藥，給藥持續(xù)時間為至少l周、2周、3周、4周或更長，或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長。示例性的劑量包括少于5mg/kg/天、4.5mg/kg/天以下、4mg/kg/天以下、3.5mg/kg/天以下、3mg/kg/天以下、2.5mg/kg/天以下、2mg/kg/天以下、1.5mg/kg/天以下、1mg/kg/天以下或0.5mg/kg/天以下。還等效的單位體表面積的劑量也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對平均體重/體表面積(例如70kg)的人而言，本發(fā)明還提供了少于400mg的總?cè)談┝?。這樣的總?cè)談┝康膶嵗?60mg/天、350mg/天、300mg/天、280mg/天、210mg/天、180mg/天、175mg/天、150mg/天或140mg/天。例如，可通過每天口服一次或兩次175mg的口服劑型，容易地實現(xiàn)350mg/天或175mg/天的給藥劑量?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?20mg/天以下、160mg/天以下或80mg/天以下。這樣的劑量可通過80mg或160mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?5mg/天、90mg/天、135mg/天、180mg/天、225mg/天、270mg/天、315mg/天或360mg/天以下，可通過45mg或90mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?0mg/天、120mg/天、180mg/天、240mg/天、300mg/天或360mg/天，可通過60mg或120mg的口服劑型得到容易的施用?？?cè)談┝康钠渌麑嵗?0mg/天、140mg/天、210mg/天、280mg/天或350mg/天，可通過70mg或140mg的口服劑型得到容易的施用。總?cè)談┝康膶嵗€包括55mg/天、110mg/天、165mg/天、220mg/天、275mg/天或330mg/天，可通過55mg的口服劑型得到容易的施用。總?cè)談┝康钠渌麑嵗?5mg/天、130mg/天、195mg/天、260mg/天或325mg/天，或75mg/天、150mg/天、225mg/天、300mg/天或375mg/天，可通過，例如，65mg或75mg的劑型得到施用。如果施用BH4自身，則可施用美國申請第11/143,887號中所描述的鹽或多晶型形式中的任何一種和/或2005年11月16日提交的國際申請PCT/US05/41252(在此通過引證將其全部內(nèi)容引入本申請)中所描述的穩(wěn)定的固體制劑。能保持其有利活性的BH4的前體和衍生物的實例在美國申請第11/143,887號有所描述。安全性測定將包括不良反應(yīng)、過敏反應(yīng)、全部的臨床化學(xué)檢驗(腎功能和肝功能)、尿分析以及全血細(xì)胞分類計數(shù)。此外，也可監(jiān)控其他參數(shù)。本實施例還旨在提供對所述藥物在體內(nèi)循環(huán)中的藥代動力學(xué)參數(shù)以及6R-BH4在血液中的總體分布和半衰期的測定。希望這些測定有助于將劑量與臨床反應(yīng)聯(lián)系起來。方法對患有與糖尿病有關(guān)的或與糖尿病無關(guān)的血管紊亂的患者進(jìn)行基線測試，包括記錄用藥史，進(jìn)行身體檢査，并進(jìn)行通常用于診斷臨床背景中的具體適應(yīng)癥(例如，患有間歇性跛行的患者在平板測試過程中的疼痛發(fā)展)的各種診斷測試，包括但不局限于血壓測定、6分鐘步行測試和超聲心動圖研究。將BH4的所建議的人用劑量2mg/kg約10mg/kg分成每天13次給藥。以頻繁的時間間隔監(jiān)測臨床終點。治療期完成后一周進(jìn)行全面的評價。如果需要增加劑量，則患者遵循上述相同程序。在整個測試過程中都將監(jiān)測安全性。診斷和入選標(biāo)準(zhǔn)/排除標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)性別、年齡和通過通常的診斷測試確定的具體血管紊亂的診斷記錄來選擇受試者。劑量、途徑和方案患者每天將接受5mg/kg劑量的BH4。如果合理的量沒有改善臨床終點，并且沒有觀察到臨床受益，則必要時可以增加劑量，直到總的曰劑量達(dá)到20mg/kg為止。BH4日劑量通過口服給藥或作為液體、粉末、片劑或膠囊經(jīng)鼻胃管給藥?？梢詫⒖偟娜談┝孔鳛閱蝿┝拷o藥，也可將其分成23個日劑量給藥。對患者進(jìn)行臨床監(jiān)測，并監(jiān)測任何不良反應(yīng)。如果觀察到任何不尋常的癥狀，則立即停止研究藥物施用，并作出是否繼續(xù)研究的決定。BH4安全性如果在研究過程中沒有出現(xiàn)明顯的急性或慢性藥物反應(yīng)，則確定BH4治療是安全的。如果在臨床實驗室的臨床檢査或其他適當(dāng)?shù)难芯恐袥]有觀察到明顯的異常，則確定藥物的長期施用是安全的。實施例26R-四氫生物蝶呤在糖尿病患者中的臨床評價1/2或2a期的糖尿病患者中的劑量效果、劑量間隔期和安全性的確在開始任何2a期的劑量/療效研究之前，在各種糖尿病人群中進(jìn)行較短的1/2期劑量漸增研究以確定對血管順應(yīng)性的劑量效果，并應(yīng)當(dāng)考慮安全性。第一次研究將確定劑量范圍和方案以及能被監(jiān)測以支持臨床終點的血管功能終點的范圍。第一次研究的受試者將是患有明顯的血管疾病(微脈管的順應(yīng)性降低)和高血壓的糖尿病患者，以每天給藥一次或每天給藥兩次的方式施用BH4，日口服劑量為0mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg。將在為期一周的治療期間監(jiān)測患者的血管順應(yīng)性、灌注/再灌注/前臂血流和血壓，并且一旦在一個劑量穩(wěn)定下來就在一天的跨度內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測。所述研究將評價2期中的合適的劑量范圍和每日給藥方案，并建立用于支持臨床開發(fā)的定量功效測量，以及在該人群中的安全性。對2a和2b期的糖尿病人群中的適應(yīng)癥的探究在2a期程序中評價合適的人群、劑量/方案和適應(yīng)癥，進(jìn)行兩次以上研究，時間是30天60天的相對較短的生命治療期(lifetreatmentperiod)。在任何由存在特殊醫(yī)療需要的糖尿病患者組成的受到密切關(guān)注的組(任何2a期研究中都包含這樣的組)中，將對各種其他測量進(jìn)行平行評價，以評定血管功能障礙中的變化的其他臨床影響，以及內(nèi)皮功能和胰島素抵抗性的生物化學(xué)標(biāo)記的評價。在適當(dāng)?shù)娜巳?適應(yīng)癥中進(jìn)行2b期研究以充分考査更長的治療期，從而幫助在更大的人群中設(shè)計3期研究，并評價具體劑量。在選出的糖尿病患者中對選中的第一適應(yīng)癥進(jìn)行的3期研究3期研究著眼于關(guān)鍵指標(biāo)，但也包括作為二級終點或三級終點的血管功能的支持性信息。將進(jìn)行至少兩次對照3期研究，但考慮進(jìn)行額外的2期或3期設(shè)計，以將其他高危人群包含進(jìn)去，例如使用不同伴隨藥物的患者、有特別的醫(yī)學(xué)問題的患者(例如腎衰竭患者)或在疾病譜的另一端的患者。一般血管功能血管順應(yīng)性/內(nèi)皮功能障礙/HTN:在有血管順應(yīng)性、C2(小動脈彈性指數(shù))異常和HTN(高血壓)的變化跡象的各種糖尿病患者中評定小脈管血管順應(yīng)性C2測量，所述評定是在為期一周的劑量漸增過程(從0mg/kg開始，漸增至1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg)中進(jìn)行的。將在各種患者人群中評定增加BH4對血管順應(yīng)性和HTN的影響，并確定BH4的劑量效果。測定一天中的藥效以幫助建立給藥方案。頑固性高血壓開始2a期研究，其基于隨機(jī)化、雙盲安慰劑研究設(shè)計。該研究包括80名血壓高于140mmHg/90mmHg的患者，并采用三種藥物治療?；颊呖倲?shù)中包括40名糖尿病患者。每組20名患者，包括安慰劑組在內(nèi)，一共四組。排除標(biāo)準(zhǔn)包括急性肢體缺血、心力衰竭和骨科并發(fā)癥。以0mg/kg10mg/kg的劑量向患者施用BH4，持續(xù)四周。對患者的收縮壓和舒張壓進(jìn)行評價，并監(jiān)測動態(tài)血壓。胰島素敏感性/血糖控制將基于血糖/胰島素水平、HgbAlc(糖化血色素)的測定評定血糖控制較差，并對通常的抗糖尿病口服藥物無響應(yīng)性或響應(yīng)性較差的糖尿病患者。期望BH4的施用能改善葡萄糖耐受性測試中的結(jié)果，并改善血糖控制(HgbAlc降低)。可在不同的方案中對這樣的患者進(jìn)行評定。外周灌注與糖尿病有關(guān)的具體適應(yīng)癥的研究間歇性跛行將基于1:1、雙盲的安慰劑對照研究設(shè)計進(jìn)行2a期研:究。該研究包括80名患有間歇性跛行的患者，其中包括40名糖尿病患者。排除標(biāo)準(zhǔn)包括急性肢體缺血、心力衰竭和骨科并發(fā)癥。將以10mg/kg的劑量向患者施用安慰劑或BH4，持續(xù)12周。評價小腿疼痛且長距離步行能力受限的患者在平板上步行一段時間和一段距離的能力，直到開始疼痛為止。具體而言，是評價下述臨床相關(guān)終點有坡度的平板上的最長步行時間、無疼痛的步行距離、血壓、血流、血流介導(dǎo)性血管舒張(FMD)和生活質(zhì)量(QoL)。期望BH4的施用能改善血管對運(yùn)動的舒張反應(yīng)，并提高長距離步行的能力，這是外周灌注的最重要的臨床相關(guān)終點。較差的外周灌注以通過漸增方式施用BH4時四肢血流的改善和截肢頻率的減少來評價四肢血流較差的患者。較差的皮膚血流和傷口愈合以BH4治療時皮膚血流的改善和傷口愈合的增強(qiáng)來評價患有糖尿病潰瘍或皮膚血流較差的患者。心臟病充血性心力衰竭(CHF)或肺動脈高壓癥在通過超聲心動圖、心輸出量/射血分?jǐn)?shù)和六分鐘步行測試提供的測定結(jié)果的基礎(chǔ)上，評價因血壓上升和血管功能不良而并發(fā)CHF的糖尿病患者。期望BH4治療能降低血壓、改善心臟血流從而協(xié)同增強(qiáng)心臟功能，并改善六分鐘步行測試。運(yùn)動過程中的心絞痛測定受試者在接受BH4治療時從能在平板上行走到開始出現(xiàn)心絞痛的時間，并監(jiān)控冠脈血流量，以評定患有運(yùn)動限制性心絞痛而需要硝化物治療的糖尿病患者。期望BH4治療能提高冠脈流量，從而延遲或消除平板測試時的心絞痛。冠心病(CAD)和相關(guān)的動脈粥樣硬化癥以對動脈粥樣硬化癥進(jìn)展的阻止和/或MI(心肌梗塞)/中風(fēng)/死亡的減少來評價患有早期或晚期動脈粥樣硬化癥和冠心病且之前有心肌梗塞或缺血事件的糖尿病患者?；陔S機(jī)化、雙盲、安慰劑-對照研究設(shè)計進(jìn)行2a期研究。該研究包括80名患者，其中有40名患有CAD、需要冠狀動脈旁路搭橋術(shù)(CABG)的糖尿病患者。每組20名患者，包括安慰劑組在內(nèi)，共四組。排除標(biāo)準(zhǔn)是心力衰竭和不穩(wěn)定心絞痛的出現(xiàn)。以O(shè)mg/kg10mg/kg的劑量向患者施用BH4或安慰劑，持續(xù)四周。評價患者的冠狀動脈功能障礙、大血管功能障礙、CAD、活性氧的組織水平和BH4水平。期望BH4治療能降低動脈粥樣硬化癥的進(jìn)展速度、減少M(fèi)I和其他血管事件的發(fā)生次數(shù)。重要的是，期望血管舒張的改善和凝血性的減低能夠增強(qiáng)冠狀動脈功能，期望隨后減少的動脈粥樣硬化能改善血管病的進(jìn)展。眼科疾病視神經(jīng)萎縮或糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變以視力和視網(wǎng)膜血流測量來評價因視網(wǎng)膜血管機(jī)能不全而導(dǎo)致視力逐漸衰退的糖尿病患者。期望BH4能改善血流，從而改善視力。腎病糖尿病導(dǎo)致的腎病或腎衰竭/降低的腎小球濾過率(GFR)中的微量白蛋白尿以24小時樣本中的尿蛋白丟失和GFR的測定來評價出現(xiàn)與腎血管病變一致的尿蛋白丟失或肌氨酸酐水平升高的糖尿病患者。期望BH4治療能降低蛋白尿并改善GFR。糖尿病患者中的肺動脈高壓癥以執(zhí)行六分鐘步行測試的能力的測定、CHF的發(fā)展和肺動脈壓的測定來評價患有肺動脈高壓癥的有或沒有充血性心力衰竭的糖尿病患者。期望BH4治療能改善肺動脈壓和心血管性能。動物模型中存在的一些數(shù)據(jù)表明BH4缺乏與肺動脈高壓癥相關(guān)。實施例3與糖尿病無關(guān)的其他心血管適應(yīng)癥的研究肺血管病原發(fā)性肺動脈高壓癥(PAH):基于開放標(biāo)記式劑量滴定研究設(shè)計進(jìn)行l(wèi)b期臨床。該研究包括1020名患有原發(fā)性PAH的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)包括對藥物的不穩(wěn)定反應(yīng)。從0mg/kg開始到10mg/kg進(jìn)行BH4劑量的滴定，持續(xù)4周12周。以六分鐘步行測試、紐約心臟病協(xié)會(NYHA)計分、Borgdyspnea計分、肺動脈和心臟功能的超聲心動圖評估對患者進(jìn)行評價。鐮狀細(xì)胞病或其他血紅蛋白病(Hb)中的肺動脈高壓癥以執(zhí)行六分鐘步行測試的能力、CHF的發(fā)展以及肺動脈壓的測定結(jié)果來評價患有肺動脈高壓癥、有或沒有充血性心力衰竭的Hb-S患者。期望BH4治療能改善肺動脈壓和心血管性能。特發(fā)性肺動脈高壓癥(IPH):以六分鐘步行測試、CHF的發(fā)展以及肺動脈壓的測定結(jié)果來評價沒有已知的心血管致病因的IPH患者，特別是年齡小于40歲的年輕患者。期望BH4治療能改善肺動脈壓和心血管(CV)性能。新生兒持續(xù)肺動脈高壓癥(PPHN):以壓力的消除、氧合作用的恢復(fù)和死亡率來評價患有PPHN的足月嬰兒。期望BH4治療能使肺動脈高壓癥快速、完全地逆轉(zhuǎn)并轉(zhuǎn)向，從而改善氧合作用。與不實用且有毒的一氧化氮吸入治療不同，BH4是無毒且有效的。中風(fēng)和相關(guān)的缺血性血管疾病中風(fēng)后的腦血管痙攣受試者包括因為急性中風(fēng)而住院治療的中風(fēng)后患者。以梗死面積以及治療前和治療后的腦灌注來評價受試者。期望BH4治療能使痙攣松弛，并減小梗死面積。來自犬中風(fēng)模型的數(shù)據(jù)表明中風(fēng)后血凝塊部位周圍的血管痙攣導(dǎo)致?lián)p傷擴(kuò)大，使損傷比最初事件更嚴(yán)重，該血管痙攣可通過灌注亞硝酸鹽溶液加以預(yù)防。與器官移植相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙實體器官移植后的血管功能障礙該研究包括已經(jīng)歷了實體器官移植的患者。以移植后的血管功能障礙所導(dǎo)致的器官功能障礙來評價受試者。期望BH4能改善移植后的器官功能，并降低移植器官的損失。環(huán)孢霉素A(CsA)誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙以移植后的血管功能障礙所導(dǎo)致的器官功能障礙來評價器官移植后服用CsA的患者。期望BH4治療能改善移植后的器官功能，并降低血管并發(fā)癥的發(fā)生次數(shù)。Brandacher等在Transplantation,81(4):583(2006)中報道了以四氫生物蝶呤和環(huán)孢霉素A顯著延長同種異基因移植物的存活。與未經(jīng)治療的異基因?qū)φ战M相比，所有組中的移植物內(nèi)過氧化亞硝酸鹽形成都有所降低。簡單地說，得到了兩個完全異基因的近交系雄性小鼠品系。進(jìn)行了頸部異位心臟移植并通過每日觸診和檢査來確定心臟異基因移植的存活率，心跳完全停止表明嚴(yán)重的排異反應(yīng)，這可以通過組織學(xué)證實。每組5IO只動物，移植后以BH4(每8小時50mg/kg，新溶解在磷酸鹽緩沖鹽水中，肌內(nèi)給藥)治療7天。術(shù)后1天或6天殺死小鼠，并對取下的移植物進(jìn)行組織學(xué)評價。收集相應(yīng)的血漿樣品以用于通過HPLC測定硝酸鹽和亞硝酸鹽。將組織樣品立即在液氮中冷凍并儲存在-75'C中，或者用福爾馬林將組織樣品固定，并埋入石蠟中，直到通過H&E染色或免疫組織化學(xué)進(jìn)行分析。未經(jīng)治療的異基因移植物在移植后約7天和8天被排斥(移植物平均存活時間為7.1±0.7天)，而四氫生物蝶呤將存活期延長至12.3土4.9天(p<0.05，有別于未經(jīng)治療的異基因移植)。在組織學(xué)評價方面，經(jīng)BH4治療的心臟顯示單核細(xì)胞滲入物和一些炎癥滲入物病灶。在未經(jīng)治療的動物和經(jīng)BH4治療的動物中，第六天硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度升高。這些數(shù)據(jù)表明四氫生物蝶呤顯著延長了異基因移植物的存活。心臟疾病或冠心病血管功能障礙/心絞痛以對動脈粥樣硬化癥進(jìn)展的阻止和/或MI、中風(fēng)或死亡的減少來評價高膽固醇血癥患者和吸煙者。期望BH4治療能降低動脈粥樣硬化癥的進(jìn)展速度、改善冠狀動脈血管舒張并降低凝血性。充血性心力衰竭(CHF):以由超聲心動圖所測定的CHF的發(fā)展、心輸出量/射血分?jǐn)?shù)和六分鐘步行測試來評價患有CHF的非糖尿病患者。期望BH4治療能降低血壓、改善心臟血流從而協(xié)同增強(qiáng)心臟功能，并改善六分鐘步行測試。溶血性貧血——鐮狀細(xì)胞病溶血性貧血的特征在于紅細(xì)胞的過早破壞所導(dǎo)致的循環(huán)紅細(xì)胞數(shù)目不足(貧血癥)。溶血性貧血的一些病因包括感染、藥物治療、自身免疫障礙和遺傳性障礙。有各種類型的溶血性貧血，包括但不局限于鐮狀細(xì)胞性貧血、陣發(fā)性睡眠型血紅蛋白尿癥、血紅蛋白SC病、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性卵形紅細(xì)胞增多癥、特發(fā)性自體免疫型溶血性貧血、化學(xué)藥物或物理手段導(dǎo)致的非免疫型溶血性貧血、繼發(fā)性免疫型溶血性貧血以及地中海貧血。溶血性貧血的一些常規(guī)治療包括葉酸、補(bǔ)鐵和皮質(zhì)類固醇，以及緊急時的輸血。治療類型、預(yù)后和并發(fā)癥會隨溶血性貧血的類型而改變。并發(fā)癥包括心血管衰竭以及先前存在的心臟病、肺病或腦血管病的惡化。將對患者的癥狀進(jìn)行評價，包括寒戰(zhàn)、疲勞、皮膚顏色蒼白、呼吸短促、心率加速、黃疸、尿色深和脾腫大。通過檢測間接膽紅素水平升高、血清結(jié)合珠蛋白較低、尿中有血紅蛋白、尿中有血鐵黃素、尿和排泄物的尿膽素原增加、網(wǎng)狀細(xì)胞絕對計數(shù)增加、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)和血紅蛋白較低和血清LDH升高來確定溶血的存在。通過同位素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行的對紅細(xì)胞壽命的直接測定將用于測定壽命。一旦確定了溶血，就用更具體的測試來確定溶血性貧血的具體類型。受該疾病影響的其他相關(guān)測量包括尿酸、TIBC、RBC指數(shù)、蛋白電泳-血清、鉀測試、血小板計數(shù)、外周血涂片、白細(xì)胞堿性磷酸酶、血清鐵、紅細(xì)胞壓積、鐵蛋白、熱凝集素或冷凝集素、Donath-Lansteiner試驗、直接和間接的Coombs氏試驗、CBC、血液分析(blooddifferential)、AST和24小時尿蛋白。鐮狀細(xì)胞病鐮狀細(xì)胞病也稱為鐮狀細(xì)胞性貧血癥或血紅蛋白SS病(HbSS)，是一種遺傳性障礙，特征在于異常的月牙狀紅細(xì)胞，其異常作用引起小血凝塊的形成，導(dǎo)致被稱為"鐮狀細(xì)胞疼痛危象"的復(fù)發(fā)型疼痛發(fā)作的發(fā)展。鐮狀細(xì)胞病是由被稱為血紅蛋白S的異常類型的血紅蛋白導(dǎo)致的，血紅蛋白S發(fā)生聚合，并扭曲紅細(xì)胞的形狀，導(dǎo)致紅細(xì)胞的過早破壞和/或破裂。易碎的鐮狀細(xì)胞很少向身體組織遞送氧氣，并且可以破裂成碎片從而阻礙血流。鐮狀細(xì)胞性貧血癥為常染色體隱性遺傳病，每500個非裔美國人中大概有一個鐮狀細(xì)胞性貧血癥患者，也感染了其他種族的許多人。雖然鐮狀細(xì)胞病從出生就存在，但癥狀通常在4個月以后才發(fā)展，并可威脅生命。閉塞的血管和被損壞的器官會導(dǎo)致急性疼痛發(fā)作或疼痛"危象"，包括溶血性危象(被損壞的紅細(xì)胞衰竭)、脾滯留危象(由血細(xì)胞的積聚導(dǎo)致的脾腫大)和再生障礙性危象(感染誘導(dǎo)的骨髓停止產(chǎn)生紅細(xì)胞)。這些疼痛危象可影響背部骨骼、長骨和胸腔，并且會嚴(yán)重到需要住院以進(jìn)行止痛和靜脈輸液的地步。反復(fù)的危象可導(dǎo)致對腎、肺。骨骼、眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。治療是長期進(jìn)行的，包括補(bǔ)充葉酸(產(chǎn)生細(xì)胞時的基本要素，因紅細(xì)胞的快速更替而需要進(jìn)行補(bǔ)充)。治療著眼于癥狀的處理和控制，并嘗試限制危象的發(fā)生頻率。以鎮(zhèn)痛劑和足夠的液體攝入來治療疼痛發(fā)作。發(fā)現(xiàn)羥基脲可通過降低疼痛危象的發(fā)生頻率和急性胸腔綜合征的發(fā)作，以及降低輸血需要來幫助一些患者。擔(dān)心羥基脲可能會導(dǎo)致白血病，但對此并無定論。己開發(fā)了其他一些較新的療法，包括誘導(dǎo)身體產(chǎn)生更多的胎兒血紅蛋白以降低鐮狀細(xì)胞的量的藥物，或者增加氧與鐮狀細(xì)胞的結(jié)合的藥物。骨髓移植可治療該病，但由于移植處理中所用的藥物具有毒性、難以找到合適的供體并且費(fèi)用高昂，所以僅可用于少數(shù)患者?？捎每咕幒鸵呙鐏眍A(yù)防鐮狀細(xì)胞病的兒童患者?；嫉募?xì)菌感染。附加治療可包括針對急性胸腔綜合征的部分交換輸血、針對神經(jīng)系統(tǒng)事件(例如中風(fēng))的輸血或手術(shù)、針對腎病的透析或腎移植、針對陰莖異常勃起的沖洗法或手術(shù)、針對眼睛問題的手術(shù)、針對髖關(guān)節(jié)缺血性壞死的髖關(guān)節(jié)置換、在嚴(yán)重膽石病存在的情況下去除膽囊、傷口護(hù)理、氧化鋅、或者針對腿部潰瘍的手術(shù)、針對心理并發(fā)癥的藥物復(fù)原和心理咨詢。過去，鐮狀細(xì)胞病患者常常死于器官衰竭，大部分鐮狀細(xì)胞病患者在20歲40歲死亡，但經(jīng)過改善治療，存活率已得到提高，患者能活到40歲50歲。死亡的原因包括器官衰竭、感染和肺動脈高壓癥。并發(fā)癥包括復(fù)發(fā)性再生障礙危象和溶血性危象，其導(dǎo)致貧血和膽石、多系統(tǒng)疾病(腎、肝、肺)、麻醉藥濫用、脾滯留綜合征、急性胸腔綜合征、陰莖持續(xù)勃起癥導(dǎo)致的勃起功能障礙、失明/視力受損、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和中風(fēng)、關(guān)節(jié)破壞、膽石、感染(包括肺炎、膽囊炎、骨髓炎和尿路感染、導(dǎo)致再生障礙危象的細(xì)小病毒B19感染)、腎組織壞死、脾功能喪失和腿部潰鐮狀細(xì)胞性貧血癥由兩個具有鐮狀細(xì)胞特征的攜帶者產(chǎn)生，建議對所有的鐮狀細(xì)胞特征的攜帶者(12個非裔美國人中約有1人有鐮狀細(xì)胞特征)進(jìn)行遺傳性心理咨詢。鐮狀細(xì)胞性貧血癥的出生前診斷是可行的。感染的快速治療、足夠的氧合作用以及防止脫水可預(yù)防紅細(xì)胞的鐮狀化?？股睾徒臃N疫苗可預(yù)防感染。為了預(yù)防組織脫氧合，建議患者避免劇烈的體育活動(特別是當(dāng)脾腫大時)，避免情緒壓力，避免處在諸如高海拔和不加壓的飛行等氧氣含量較低的環(huán)境，避免接觸已知的感染源，避免發(fā)生脫水。將評價患者的常見癥狀，包括蒼白、黃色眼睛/皮膚、疲勞、氣喘、心率加速、生長和青春期延遲、易感染、下肢潰瘍、黃疸、骨骼疼痛、腹痛發(fā)作和發(fā)燒。也監(jiān)控其他癥狀，包括血尿(血尿癥)、尿頻、過度口渴、勃起疼痛(陰莖持續(xù)勃起癥，10%40%的此病的男性患者有該癥狀)、胸腔疼痛、視力較差/失明。對鐮狀細(xì)胞性貧血癥患者進(jìn)行診斷和監(jiān)控的測試將包括全血計數(shù)(CBC)、血紅蛋白電泳和鐮狀細(xì)胞測試。其他測試包括顯示鐮狀細(xì)胞的外周血涂片、尿圓柱或血尿、血清血紅蛋白降低、膽紅素升高、白細(xì)胞計數(shù)較高、血清鉀升高、血清肌氨酸酐升高和血液氧飽和度降低。某些情況下，CT掃描或MRI可顯示中風(fēng)。實施例4在臨床研究中將BH4施用于高血壓患者初步研究先期研究采用BH4的胃腸外灌注或單劑量口服；因此不知道數(shù)天到數(shù)周的長期口服BH4是否會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的持續(xù)改善。本項研究評價在高血壓患者中進(jìn)行BH4長期口服治療是否會因內(nèi)皮功能障礙的改善而引起動脈血壓(BP)減低。進(jìn)行兩次研究以考察口服BH4的作用持續(xù)時間以及高血壓受試者對不同劑量的BH4的響應(yīng)。征募18歲75歲、患有未控制性高血壓并以傳統(tǒng)穩(wěn)定的抗高血壓療法予以治療(BP〉135/85)或者被新診斷為高血壓(BP〉140/90)的受試者?；颊呃^續(xù)他們當(dāng)前的抗高血壓治療并保持不變。排除標(biāo)準(zhǔn)是可能分娩的女性受試者、近來有冠狀動脈或外周血管疾病癥狀的病史、已知的高血壓繼發(fā)性原因、嚴(yán)重的未控制高血壓(收縮壓大于180mmHg和/或舒張壓大于110mmHg)、使得預(yù)期壽命小于6個月的嚴(yán)重的合并癥、腎功能障礙或肝功能障礙、最近6周內(nèi)任何伴隨的抗高血壓治療的改變，以及任何出血性紊亂。BH4粉末得自SchircksLaboratories(佐納，瑞士)。當(dāng)與維生素C一起施用時，將BH4與維生素C以1mg維生素C/lmgBH4的比例混合，并裝入適當(dāng)大小的膠囊中。建議受試者將該藥丸保存在冷凍機(jī)或冰箱中。研究l:口服BH4的起效時間和作用持續(xù)時間征募8名受試者，其中3名男性，平均年齡60.5士10.9歲。將受試者分配至兩組中的一組。一組接受10mg/kg/天(n-4)的BH4，另一組接受5mg/kg/天(r^4)的BH4，每天分兩次口服給藥，持續(xù)8周。這些劑量是根據(jù)苯丙酮尿癥中所用的BH4劑量給藥確定的。在整個治療期間和停止治療后的第一周和第六周，每周進(jìn)行BP測定。平均血壓計算為(SBP+2xDBP)/3。在基線處、BH4治療8周后和停止治療后一周用超聲波測定肱動脈內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性功能。所實施的測定技術(shù)如Prasad等的Circulation,2000,101(20),2349-2354中所述。簡單來說，在控溫房間內(nèi)用11MHz高分辨率超聲傳感器(AcusonInc.)在非優(yōu)勢臂的肘窩之上測量肱動脈直徑。將前臂上的BP袖帶充氣至高于200mgHg并持續(xù)5分鐘，快速放氣，并在充血開始后的一分鐘測量肱動脈直徑，從而測量血流介導(dǎo)的血管舒張(FMD)。在所有的測量中，在三個單獨的舒張末期畫面上測定三個直徑，并取平均值。用下述公式計算代表FMD的最大的肱動脈舒張(平均充血直徑-平均基線直徑)+平均基線直徑x100。為了測量非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，受試者舌下含服0.4mg硝化甘油，5分鐘后按上述方法測量肱動脈直徑。用下述公式計算非內(nèi)皮依賴性血管舒張(含服硝化甘油后的平均直徑-平均基線直徑)+平均基線直徑x100。在研究1和研究2中，統(tǒng)計學(xué)分析后的第一終點(primaryendpoint)是BH4治療過程中收縮BP、平均BP和舒張BP的降低。二級終點(secondaryendpoint)包括內(nèi)皮功能(例如FMD)的改善。用重復(fù)測量的數(shù)據(jù)的線性混合效應(yīng)模型來分析從基線到治療期終點的BP變化，以及100mg和200mg劑量組之間的變化的區(qū)別。在計算治療期內(nèi)的非線性趨勢的模型中包括周數(shù)的二次項。劑量、周數(shù)和周數(shù)的平方是所述模型中的主要效應(yīng)項；周劑量和周劑量的平方是所述模型的相互作用項。顯著的相互作用項表明兩個劑量組之間的變化模式存在區(qū)別。用雙尾studentt-檢驗分析FMD數(shù)據(jù)。將所有的結(jié)果表示為平均值iSD，可將p值0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。研究1的結(jié)果表明，在聯(lián)合治療組，BH4治療使收縮壓(p-0.005,二次趨勢)和平均動脈BP(p-0.01)顯著降低。圖A顯示血壓反應(yīng)。數(shù)值是平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。SBP-收縮血壓，MBP-平均血壓，DBP二舒張血壓；p值通過ANOVA確定。結(jié)果表明收縮BP下降，3周后收縮BP平均值為13±9mmHg(p=0.004)，5周后收縮BP平均值為15±15mmHg(p=0.04)，并且這種降低在治療的8周內(nèi)一直持續(xù)。治療停止后的第6周，BP回復(fù)到治療前的水平(與基線相比p二ns(沒有統(tǒng)計學(xué)意義))。施用BH4后心率沒有顯著變化，并且舒張BP的變化沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著的程度。在5mg/kg劑量的BH4和10mg/kg劑量的BH4之間也沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。8周的BH4治療后，肱動脈血流介導(dǎo)的血管舒張的平均值從3.4±1%增加到8.2±3.4%(p=0.05，n=6)，并在停止治療后的第6周回復(fù)到基線水平(3.7±1.3%，與基線相比p-ns)。硝化甘油介導(dǎo)的血管舒張保持不變(BH4治療之前為11.9士3%，BH4治療之后為16.1±5%，p=0.1)。研究2:口服BH4的劑量反應(yīng)性考察在20名滿足參加條件的受試者中有4人由于無法回來接受隨訪而在導(dǎo)入期被排除。有6名男性受試者，平均年齡為59.5士8.3歲。8名受試者口月艮200mgb丄d(—天兩次)的BH4，8名受試者口服100mgb.i,d(—天兩次)的BH4。這兩組之間在基線特征方面沒有顯著性差異。由于BH4與維生素C以1:1的比例混合，因此在第一個兩周內(nèi)所有的受試者都以指定的BH4劑量服用維生素C，每天兩次。在該兩周的導(dǎo)入期之后，接下來的四周時間受試者只以指定劑量服用BH4。在導(dǎo)入期和治療期中，每周測量心率和BP。平均血壓計算為(SBP+2xDBP)/3。然后停止BH4治療，并在停止治療的第1周和第4周進(jìn)行跟蹤調(diào)査，測量BP和心率。在開始藥物治療前、BH4治療終點和停止BH4治療后一個月進(jìn)行常規(guī)化學(xué)檢査和LFT(肝功能檢查)。在研究2中，如上所述，在2周的維生素C導(dǎo)入期的終點、4周的口服BH4治療的終點和停止BH4之后的第4周測量肱動脈內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性功能。兩組的維生素C導(dǎo)入期過程中，心率或BP都沒有顯著變化；導(dǎo)入期之前，16名受試者的收縮BP、舒張BP和平均動脈BP分別為152±11mmHg、84±13mmHg和106±10mmHg，維生素C治療2周后分別為148士19mmHg、86±11mmHg和106±12mmHg(所有的p:ns)。口月艮200mgb丄d(—天兩次)的BH4的受試者的收縮壓(p二0.03)和平均BP顯著降低(經(jīng)線性趨勢分析p-0.04)。圖B顯示以200mgBH4b丄d治療的組中的血壓反應(yīng)。數(shù)值是平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。SBP:收縮血壓，MBP:平均血壓，DBP:舒張血壓；p值通過ANOVA確定。舒張BP的降低沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著的程度(p-0.08)。一周后平均BP顯著降低(p=0.02)。在隨后的幾周，BP進(jìn)一步顯著降低，3周后達(dá)到最低點，此時收縮BP的平均值降低了16mmHg;p=0.04(圖B)。停止治療一周后，BP保持下降，但停止BH4后的第4周，BP升高并回復(fù)到基線水平。200mgb.i.d的BH4治療(n=7)使FMD顯著改善。FMD從BH4治療開始時的3.7±3%增加到治療4周后的7.1±4.9%(p=0.016)。停止BH4治療后一個月，F(xiàn)MD回復(fù)到基線水平(3.2±1.1%,與基線相比p=0.6)。在服用100mgb.i.d的BH4的受試者中沒有觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著的BP變化。圖C顯示以100mgBH4b.i.d治療的組的血壓反應(yīng)。數(shù)值是平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。SBP-收縮血壓，MBP:平均血壓，DBP-舒張血壓。以100mg或200mgb丄d的BH4治療的組中均沒有顯著的心率變化。在服用100mgb丄d的BH4的受試者中沒有顯著的FMD變化(5.3±2.5%相對6.2±3.5%，p=0.55)。研究過程中，兩組中硝化甘油介導(dǎo)的血管舒張和非內(nèi)皮依賴性血管舒張均無顯著變化。在所有的研究過程中都沒有明顯的不利事件。該結(jié)果表明口服BH4的長期治療可有效降低高血壓控制較差的受試者或新診斷為高血壓的受試者的動脈BP。在200mgb丄d的劑量或更高的劑量觀察到該效果，并且心率沒有任何變化。所述劑量的BH4治療之后，受試者的內(nèi)皮功能障礙得到顯著改善，還使得BP降低。BP的降低在治療1周內(nèi)就很明顯，并且維持到連續(xù)治療的第8周，沒有快速抗藥反應(yīng)。至少在治療停止后的一周內(nèi)血壓保持下降，但在4周后回復(fù)到基線。口服BH4看起來具有良好的耐受性且沒有任何嚴(yán)重的不良效果。進(jìn)一步臨床研究進(jìn)行2期、多中心、隨機(jī)化、雙盲、安慰劑-對照的平行研究以評價10mg/kg/天6RBH4(每天給藥兩次(b丄d)，持續(xù)8周)對患有控制較差的系統(tǒng)性高血壓的受試者的血壓(BP)的影響。評估了大量參數(shù)，包括動脈收縮壓(SBP)、動脈舒張壓(DBP)、內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)活性和內(nèi)皮功能障礙。在II型糖尿病患者和高血壓控制較差的患者中，還評估對胰島素敏感性的效果。在整個研究過程中抗高血壓治療和糖尿病治療(如果有的話)保持不變。研究中的入選標(biāo)準(zhǔn)包括經(jīng)記錄的原發(fā)性高血壓史(在2次不同的測試中，收縮BP至少為140mmHg和/或舒張BP至少為90mmHg)，并且雖然同時使用至少兩種作用機(jī)理不同的傳統(tǒng)抗高血壓藥物，并在隨機(jī)選擇之前堅持了至少3個月，但高血癥控制性仍較差，最初兩周的篩選期中平均SBP和平均DBP在下述范圍內(nèi)平均SBP至少為135mmHg但不大于160mmHg;平均DBP至少為85mmHg但不大于110mmHg。此外，糖尿病受試者必須有經(jīng)記錄的II型糖尿病史，并且已經(jīng)用相同療法治療了至少3個月。從研究中排除的標(biāo)準(zhǔn)包括計劃懷孕或可能懷孕；任何BH4制劑的在前治療；對任何6RBH4的賦形劑的己知的過敏反應(yīng)或超敏反應(yīng)；已知的高血壓繼發(fā)性原因；會影響研究參與性或安全性的并發(fā)性疾病或病癥，例如出血性紊亂、昏厥史或眩暈史、嚴(yán)重的胃食管反流性疾病(GERD)、有癥狀的冠狀動脈或外周血管疾病、心律不齊、器官移植、器官衰竭或I型糖尿??；使得預(yù)期壽命小于6個月的任何嚴(yán)重的合并癥；血清肌氨酸酐〉2.0mg/dL或肝酶水平高于正常值上限的2倍；以下述藥物進(jìn)行伴隨治療(a)任何己知可抑制葉酸代謝的藥物(例如甲氨蝶呤)，(b)左旋多巴或(c)任何磷酸二酯酶(PDE)-5抑制劑(例如萬艾可⑧、西力士⑧、艾力達(dá)⑧或RevatioTM)或任何PDE-3抑制劑(例如西洛他唑、米力農(nóng)(milrinone)或維司力農(nóng)(vesnarinone))。滿足入選標(biāo)準(zhǔn)并未被排除標(biāo)準(zhǔn)排除的受試者接受6RBH4或安慰劑，治療期持續(xù)8周，并在第9周和第12周進(jìn)行隨訪(即，隨訪期的第l周和第4周)。在治療期期間每周測量BP和心率(HR)，并在兩次隨訪時測量BP和HR。在所有的研究中心，得到BP的方法都是經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的，并且對每個受試者進(jìn)行BP測量的時間選擇也是經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的。在第0周、第4周、第8周和第12周收集用于常規(guī)臨床實驗室檢測和用作生物標(biāo)志的血樣和尿樣。對糖尿病患者，在第0周、第8周和第12周收集用于測試空腹胰島素水平和血糖水平和HgbA1C的血液。在第8周和第12周評價ECG。每次拜訪都記錄重要體征SBP禾nDBP，單位為mmHg;心率(HR)，單位為每分鐘心跳次數(shù)；和呼吸率(RR)，單位為每分鐘呼吸次數(shù)。身體檢查包括對體重、整體外觀、頸部、胸腔/肺、心臟聲音、腹部和下肢的評定。在兩周的篩選期期間，三次拜訪中每次都測量BP三次(在10分鐘內(nèi)重復(fù)三次)。用這9次測試結(jié)果計算平均SBP值和平均DBP值以確定BP是否滿足入選標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)化分組后，再次測量BP三次(0周拜訪)，這三個值的平均值就是基線值。在治療期(從第1周開始)期間，每周在早晨服用研究藥物之前測量波谷BP。應(yīng)當(dāng)在一天中幾乎相同的時間(在約90分鐘內(nèi))測量BP。記錄標(biāo)準(zhǔn)的12導(dǎo)聯(lián)心電圖，并收集下述測量值心率、節(jié)律、間期測量值(即PR、QRS、QT禾BQTc)和心軸。在治療的第0周和第8周，使用全自動動態(tài)血壓監(jiān)測儀(ABPM)進(jìn)行24小時監(jiān)測。ABPM測量并記錄收縮BP和舒張BP;可將多個BP測量值標(biāo)示于圖表中以表示BP曲線。收集血液(血漿)樣品和尿樣以評定內(nèi)皮功能障礙和氧化應(yīng)激的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志。對一些受試者還用超聲心電圖另外測試FMD、全身血管抵抗性和動脈順應(yīng)性。對血樣和尿樣的臨床實驗室評定包括下述內(nèi)容血液學(xué)白細(xì)胞分類計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積血清化學(xué)白蛋白、堿性磷酸酶、ALT(SGPT)、AST(SGOT)、膽紅素、BUN、鈣、氯化物、總膽固醇、肌氨酸GGT、球蛋白、葡萄糖、LDH、磷、鉀、總蛋白、鈉和尿酸甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)空腹葡萄糖和胰島素，以及HgbA^常規(guī)尿分析外觀、顏色、pH、比重、酮、葡萄糖、膽紅素、亞硝酸鹽、尿膽素原和顯微鏡空腹(46小時)血清脂質(zhì)患有II型糖尿病的受試者的附加血清化學(xué)尿分析收集早晨第一次的尿樣作為標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志(下面)微量白蛋白尿內(nèi)皮功能障礙和氧化應(yīng)硝酸鹽/亞硝酸鹽、CGMP和異前列腺素激的生物標(biāo)志標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志(血漿和尿)用身體質(zhì)量系數(shù)(BMI)和空腹血清胰島素水平和血糖水平結(jié)果來評價患有II型糖尿病的受試者的胰島素敏感性。還測量HgbA1C。研究完成后，評定10mg/kg/天的口服BH4治療對血壓、內(nèi)皮功能和胰島素敏感性的影響。本發(fā)明的目的在于觀察到收縮血壓和/或舒張血壓的統(tǒng)計學(xué)顯著性降低。BH4治療后，內(nèi)皮功能和/或胰島素敏感性也會改善。在進(jìn)一步的研究中評價了在每天2mg/kg每天10mg/kg范圍內(nèi)的附加劑量的效果。實施例5BH4與PDE5抑制劑在體內(nèi)聯(lián)用的效果該研究評價6R-BH4與PDE5抑制劑檸檬酸西地那非在體內(nèi)高劑量聯(lián)用時的心血管效果。按照下表中描述的雙拉丁方交叉設(shè)計(doubleLatinsquarecrossoverdesign)將藥物施用于8只雄性的、試驗過和未試驗過的畢爾格獵犬。所有的動物都通過灌胃給藥。以5mL/kg的劑量體積施用測試品(聯(lián)合給藥時總體積為10mL/kg);對照動物以10mL/kg的劑量體積給藥。以300mg的片劑(100mg活性6R-BH4/片)提供的6R-BH4(沙丙蝶呤二鹽酸鹽)與干燥劑一起存于室溫。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>a.給動物施用6R-BH4，劑量為100mg/kg，劑量體積為5mL/kg。b.動物接受聯(lián)合治療，先接受6R-BH4(100mg/kg，劑量體積為5mL/kg)，然后接受檸檬酸西地那非(30mg/kg，劑量體積為5mL/kg)，總體積為10mL/kg。c.對照組動物接受反滲透水，劑量體積為10mL/kg。d.給動物施用檸檬酸西地那非，劑量為30mg/kg，劑量體積為5mL/kg。治療開始時，動物約7月齡10月齡，給藥前動物的體重為7.8kg12.0kg。治療開始前的至少2周，使動物禁食過夜，將其麻醉并將心電圖(ECG)和血壓傳送器植入腹部并縫合在腹壁上。將血壓導(dǎo)管置于動脈中，并推進(jìn)到腹部大動脈。每天檢查兩次(上午和下午)動物的死亡率、異常性以及疼痛和不適的跡象。按照觀察到的情況記錄額外的發(fā)現(xiàn)。所有的動物都活到了預(yù)定的研究終點。在給藥前階段(包括給藥前的那一天)和給藥階段的第3天和第10天進(jìn)行了三次詳細(xì)的觀測。各給藥日都記錄ECG和血壓測量結(jié)果，給藥前進(jìn)行至少90分鐘的記錄，給藥后持續(xù)記錄至少8小時，然后每小時進(jìn)行至少15分鐘的記錄，并持續(xù)到給藥后至少24小時。血壓測量結(jié)果包括收縮壓、舒張壓和平均動脈壓，以及脈壓(收縮-舒張)。各給藥日都在給藥前和給藥后的大約2小時、4小時、8小時、12小時和24小時進(jìn)行血壓評定。進(jìn)行ECG測量結(jié)果(包括RR間期、QT和經(jīng)心率校正的QT(QTc，采用Fridericia法))的定量評價。根據(jù)給藥前和給藥后大約2小時、4小時、8小時、12小時和24小時的左室內(nèi)壓信號計算正性肌力作用(+dP/dtn^)和心率?；谒劳雎?、臨床體征、體重、腹溫測量、包括心電圖分析和血、液動力學(xué)數(shù)據(jù)(收縮壓、舒張壓和平均動脈壓)在內(nèi)的心血管參數(shù)、肌力狀態(tài)(+dP/dtmJ和心率進(jìn)行心血管影響和毒性的評定。圖D顯示各種治療的給藥后24小時期間的平均收縮壓。圖E顯示各種治療的給藥后24小時期間的平均舒張壓。圖F顯示各種治療的給藥后24小時期間的平均動脈壓。圖G顯示各種治療的給藥后24小時期間的平均動脈脈壓。圖H顯示平均(+dP/dtn^)。圖I顯示平均心率。在接受了檸檬酸西地那非單獨給藥或接受了檸檬酸西地那非與6R-BH4聯(lián)合給藥的動物中，在給藥后的2小時和4小時，ECG上測得的QT間期降低。檸檬酸西地那非單獨給藥時的QT間期和檸檬酸西地那非與6R-BH4聯(lián)合給藥時的QT間期并無不同。在接受了6R-BH4單獨給藥的動物中沒有發(fā)現(xiàn)與對照組相比的QT變化。因此，將QT變化歸因于單獨施用檸檬酸西地那非。沒有觀察到心率校正QT間期(QTc)的變化。QTc使QT間期數(shù)據(jù)正?；氖聦嵄砻鱍T間期降低是由施用檸檬酸西地那非后發(fā)現(xiàn)的心率增加(RR間期降低)引起的。在施用測試品之前和之后，兩只動物顯示陣發(fā)性室性心動過速，其他動物顯示孤立的暫時心律不齊；心律不齊可歸因于為了血壓測量而在左心室中植入的導(dǎo)管，而不是由測試品引起的。沒有觀察到與治療相關(guān)的收縮壓、平均動脈壓或+dP/d^ax的變化。與對照組相比，接受了聯(lián)合給藥或接受了檸檬酸西地那非單獨給藥的動物的舒張壓在所有的時間點都顯著降低。單獨施用6R-BH4后沒有觀察到該效果。在單獨施用擰檬酸西地那非的效果和將其與6R-BH4聯(lián)合施用的效果間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，表明這主要是由檸檬酸西地那非引起的。將6R-BH4與擰檬酸西地那非一起施用并不增大或抑制該效果。在所有的時間點，接受了檸檬酸西地那非單獨給藥或接受了檸檬酸西地那非與6R-BH4聯(lián)合給藥的動物的心率都顯著增加。在單獨施用擰檬酸西地那非和將其與6R-BH4聯(lián)合施用之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，表明這主要是由檸檬酸西地那非引起的；6R-BH4并不增大或削弱該效果。在給藥后的2小時、4小時和8小時，接受了檸檬酸西地那非單獨給藥的動物的動脈脈壓顯著增加。聯(lián)合施用檸檬酸西地那非和6R-BH4之后的2小時和4小時，動脈脈壓顯著增加。認(rèn)為這些變化繼發(fā)于這些治療后所發(fā)現(xiàn)的舒張壓降低。與單獨施用檸檬酸西地那非相比，在2小時和8小時的時間點，接受了檸檬酸西地那非和6R-BH4聯(lián)合給藥的動物的動脈脈壓顯著降低，表明6R-BH4可能對由檸檬酸西地那非導(dǎo)致的脈壓增加有削弱作用。研究結(jié)果表明檸檬酸西地那非和與6R-BH4聯(lián)用的檸檬酸西地那非使得狗的舒張壓降低。這種血壓的降低伴隨有心率的增加和動脈脈壓的增加。血壓降低和心率增加是文獻(xiàn)中記錄的檸檬酸西地那非在狗中的效果。其結(jié)論為，心率增加和脈壓增加繼發(fā)于血壓降低。沒有提到單獨施用6R-BH4對所測量的任何心血管參數(shù)的效果。如同所指出的，該結(jié)果表明這樣一個意想不到的效果PED5抑制劑與6R-BH4的聯(lián)用削弱了在這些狗中觀察到的擰檬酸西地那非誘導(dǎo)的脈壓增加，而單獨施用西地那非時會觀察到這種脈壓增加。將100mg/kg的6R-BH4添加到30mg/kg的檸檬酸西地那非中對檸檬酸西地那非在這些狗中的心血管效果沒有不利的影響。此處所披露和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法都可根據(jù)本公開內(nèi)容進(jìn)行制備和實施，無需過多的實驗。雖然已經(jīng)采用優(yōu)選實施方式對本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可在不背離本發(fā)明的理念、主旨和范圍的情況下，對此處所述的組合物和/或方法和所述方法的步驟或步驟的順序進(jìn)行改變。更具體而言，顯然某些既是化學(xué)相關(guān)又是生理學(xué)相關(guān)的藥劑可代替此處所述的藥劑且得到相同或相似的結(jié)果。所有這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的相似的替代和修改都視為在如所附的權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的主旨、范圍和理念之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種治療內(nèi)皮功能障礙的方法，所述方法包括以可治療所述內(nèi)皮功能障礙的有效量對需要該治療的人施用(6R)-四氫生物蝶呤的步驟。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述內(nèi)皮功能障礙是高血壓。3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的人患有II型糖尿病。4.如權(quán)利要求13中任一項所述的方法，其中，所述施用是以口服的方式進(jìn)行的。5.如權(quán)利要求14中任一項所述的方法，其中，所述治療的有效量是每天大于3mg/kg每天約15mg/kg。6.如權(quán)利要求14中任一項所述的方法，其中，所述治療的有效量是每天大于3mg/kg每天約10mg/kg。7.如權(quán)利要求13中任一項所述的方法，其中，以每天約5mg/kg的總劑量口服施用所述(6R》四氫生物蝶呤。8.如權(quán)利要求13中任一項所述的方法，其中，以每天約10mg/kg的總劑量口服施用所述(6R)-四氫生物蝶呤。9.如權(quán)利要求13中任一項所述的方法，其中，以每天約400mg的總劑量口服施用所述(6R)-四氫生物蝶呤。10.如權(quán)利要求19中任一項所述的方法，其中，所述(6R)-四氫生物蝶呤每天施用兩次。11.如權(quán)利要求110中任一項所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括對所述的人施用除(6R)-四氫生物蝶呤之外的治療藥物。12.如權(quán)利要求ll所述的方法，其中，所述治療藥物包括磷酸二酯酶5抑制劑。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述磷酸二酯酶5抑制劑選自由西地那非、西地那非的藥用鹽、西地那非的溶劑化物、他達(dá)拉非、他達(dá)拉非的藥用鹽、他達(dá)拉非的溶劑化物、伐地那非、伐地那非的藥用鹽、伐地那非的溶劑化物、尤地那非、尤地那非的藥用鹽、尤地那非的溶劑化物以及它們的混合物組成的組。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述磷酸二酯酶5抑制劑為西地那非或西地那非的藥用鹽或西地那非的溶劑化物。15.—種治療鐮狀細(xì)胞病的方法，所述方法包括以可治療所述鐮狀細(xì)胞病的有效量對需要該治療的人施用(6R)-四氫生物蝶呤的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及用于與糖尿病、高脂血癥和各種心血管紊亂有關(guān)的血管并發(fā)癥的治療干預(yù)的新方法和組合物，所述各種心血管紊亂包括但不局限于頑固性高血壓、冠心病、肺動脈高壓癥、充血性心力衰竭和溶血性貧血。更具體而言，本申請的說明書描述了用包含BH4及其衍生物的組合物治療這樣的血管紊亂的方法和組合物。本發(fā)明旨在提供BH4與其他治療方案的聯(lián)合療法。文檔編號A61P9/12GK101365452SQ200680051781公開日2009年2月11日申請日期2006年12月5日優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日發(fā)明者丹尼爾·I·奧本海默,亞歷杭德羅·多勒恩鮑姆,艾米爾·D·卡基斯申請人:生物馬林藥物股份有限公司