專利名稱：基于細(xì)胞核形態(tài)鑒定并靶向腫瘤干細(xì)胞的方法
基于細(xì)胞核形態(tài)鑒定并靶向腫瘤干細(xì)胞的方法
相關(guān)申請
本申請要求2005年12月9日提交的美國臨時(shí)申請No.60/748，951 的利益，上述申請的全部教導(dǎo)引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
科學(xué)家已經(jīng)認(rèn)識到肺瘤細(xì)胞和病理學(xué)組織構(gòu)建(諸如畸胎瘤 (teratocarcinomas))與早期胚細(xì)胞和組織間的相似性。正常但未分化 的胚胎干細(xì)胞能通過不明確的過程產(chǎn)生器官，所述過程邏輯上包括器 官原基(anlage)上細(xì)胞數(shù)目和分化的快速增加及隨后的器官發(fā)生。惡性 腫瘤以類似于早期胚胎的速率生長并且包含生態(tài)位(niches),這些生態(tài) 位或者是組織未分化的或者是以正常組織的組織學(xué)形態(tài)構(gòu)造的。
除了細(xì)胞表面的葡糖胺聚糖抗原復(fù)合物外，在胎兒組織和腫瘤中 還表達(dá)"癌胚抗原"，癌胚抗原是涉及細(xì)胞粘附和組織重建的分子，例 如鈣粘著蛋白、連環(huán)蛋白、金屬蛋白酶。
在含氧量低條件下的早期胎兒組織中，腫瘤模擬線粒體利用氨基 酸以減少氧。
腫瘤發(fā)生樣個(gè)體發(fā)生(oncogenesis like ontogenesis)看來可能是通過 直系后裔通過干細(xì)胞群的擴(kuò)增來發(fā)展。僅僅一小部分的人類肺瘤細(xì)胞 具有形成新腫瘤的能力，如免疫抑制嚙齒類的異種移植。有限稀釋的 異種移植實(shí)驗(yàn)已表明推定胂瘤發(fā)生細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞顯示出類 干細(xì)胞性質(zhì)，表現(xiàn)在它們能夠產(chǎn)生包含額外干細(xì)胞的新腫瘤并且能夠 再生存在于原始腫瘤中的表現(xiàn)型混合群體細(xì)胞。
在二十世紀(jì)初期就建立了腫瘤單克隆性的概念，并且在二十世紀(jì) 確定了幾乎所有類型的晚發(fā)病癌都經(jīng)過腫瘤形成前的延長期，而且這 些腫瘤形成前的集落本身是單克隆，并且由一個(gè)以上的來自胚DNA的 稀少細(xì)胞遺傳突變引起。二十一世紀(jì)初期，在移植/稀釋實(shí)驗(yàn)中用"干" 細(xì)胞富集腫瘤細(xì)胞的直接嘗試已經(jīng)證明，不僅組織干細(xì)胞是腫瘤形成 前的可能的細(xì)胞來源，而且腫瘤本身也包含"干"細(xì)胞。該假說的現(xiàn)代重 申已經(jīng)提出胂瘤實(shí)際上是組織相當(dāng)良好的異形胎兒結(jié)構(gòu)(heterogeneousfetal structures)。"癌胚，，干細(xì)胞有望增加數(shù)目并且產(chǎn)生分化的細(xì)胞類 型，這些細(xì)胞類型會(huì)增加腫瘤塊內(nèi)高度的異形生態(tài)位。然而，在發(fā)育 的器官和腫瘤中還沒有實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞如干細(xì)胞的識別。
應(yīng)用于整個(gè)干細(xì)胞領(lǐng)域的各種抗原標(biāo)記已經(jīng)在很大程度上用來富 集能夠再生組織或肺瘤的細(xì)胞。然而，在這些富集的群體中沒有細(xì)胞 已經(jīng)證明任何標(biāo)明它們是干細(xì)胞的顯微形態(tài)細(xì)胞性質(zhì)。如果腫瘤由單 個(gè)干細(xì)胞產(chǎn)生是正確的，則需要鑒定它們并收集它們的方法，它們?yōu)?足以分析分子和生化分析物的均一的干細(xì)胞群(p叩ulation of stem cells) 形式。只有那時(shí)才可以集中大分子陣列技術(shù)(基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、 糖組學(xué)等)的能力及強(qiáng)大的生化分析形式諸如魔角核磁共振波譜法 (magic angle nuclear magnetic resonance spectrometry)。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及鑒定腫瘤干細(xì)胞并在其封閉環(huán)境中不損害或最小限度 損害正常干細(xì)胞或維持干細(xì)胞(maintenance stem cells)的情況下有選擇 地并特異地破壞肺瘤干細(xì)胞的方法。本文公開的是意料之外的發(fā)現(xiàn) 腫瘤干細(xì)胞包含細(xì)胞核，在核分裂時(shí)，其中的基因組在相當(dāng)長并且可 利用的一段時(shí)間內(nèi)基本上是單鏈DNA(ssDNA)。通過利用靶向并改變 ssDNA的諸如化學(xué)或酶學(xué)試劑等的試劑(例如烷基化試劑、單鏈特異 核酶、靶向復(fù)制機(jī)器的試劑、靶向分離(segregation)的試劑及靶向一個(gè) 或多個(gè)干細(xì)胞特異分子的試劑)，腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)被粑向破 壞，因?yàn)楦淖兊膕sDNA將不能進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)制恢復(fù)成為雙鏈 DNA(dsDNA)。腫瘤干細(xì)胞特異分子是存在于腫瘤干細(xì)胞優(yōu)選存在于細(xì) 胞核的分子，而不存在于周圍細(xì)胞的細(xì)胞中。具體的胂瘤細(xì)胞特異分 子是可被靶向的，藉此，所述腫瘤干細(xì)胞特異性分子的功能或活性的 耙向和破壞可阻止或抑制腫瘤細(xì)胞增長。例如，任何阻止ssDNA復(fù)制 的試劑例如雜交到DNA卻不能被延伸的分子，例如經(jīng)修飾的寡核普酸 或核酸衍生物，例如沒有肽核酸延伸所必需的y J舞酸酯的核酸。遞送 試劑到患者細(xì)胞或腫瘤組織的方法為本領(lǐng)域所知，其中這樣的試劑將 阻止ssDNA基因組的復(fù)制，并^v而阻止肺瘤干細(xì)^^々增殖。
在一個(gè)實(shí)施方案中，方法涉及選擇性阻止或抑制肺瘤干細(xì)胞的生 長(例如細(xì)胞核或細(xì)胞分裂)，同時(shí)基本上不阻止或抑制周圍細(xì)胞(例如維持干細(xì)胞)的生長。特別地，當(dāng)粑向的干細(xì)胞進(jìn)行核分裂時(shí)，該 方法包括將細(xì)胞與能夠進(jìn)入該細(xì)胞的細(xì)胞核并改變或修飾細(xì)胞核
ssDNA的試劑接觸，從而阻止或抑制耙向細(xì)l包的進(jìn)一步細(xì)月包核和細(xì)月包 的分裂。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法涉及抑制患者腫瘤生長的方法，包括 利用改變或修飾腫瘤干細(xì)胞特異分子(例如ssDNA)的試劑或處理(agent ortreatment)來把向患者的腫瘤干細(xì)胞，從而阻止或抑制ssDNA的復(fù)制 并最終阻止或抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，試劑 靶向在細(xì)胞內(nèi)合成的腫瘤干細(xì)胞特異分子并分離入子代鐘形細(xì)胞核 (segregated into daughter bell國shaped nuclei)。 在一個(gè)實(shí)施方案中,腫瘤 干細(xì)胞特異分子是單鏈DNA(ssDNA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑是 化學(xué)試劑、放射性試劑、酶、或放射療法，藉此靶向胂瘤細(xì)胞特異分 子。
附圖簡述


圖1是主要圖像的概要。A)人類胎兒腸管、正常結(jié)腸粘膜、腺瘤 和腺癌的分裂間期和早前期(E.P.)細(xì)胞中觀察的細(xì)胞核形態(tài)型的實(shí)例。 B)胎兒腸管的鐘形細(xì)胞核的高分辨率圖像(xl400)。凝聚的DNA看起來 形成維持向中空鐘形結(jié)構(gòu)開口的環(huán)。比例尺，5jum。
圖2A和B是5-7周胚胎腸管的圖像。圖2A:相差圖像(左圖)、 染色的細(xì)胞核圖像(中圖)和合并圖像(右圖)示出直徑~50微米的管 狀合胞體內(nèi)線性排列的細(xì)胞核。圖2B:細(xì)胞核的高分辨率圖像顯示中 空的鐘形結(jié)構(gòu)。所有觀察的胚管都維持鐘形的"從頭到腳"方向，但 是該胚管前后迂回前進(jìn)，從而使得平行的胚管具有局部反平行反向的 鐘形細(xì)胞核方向。低放大倍數(shù)時(shí)，比例尺為50inm,高放大倍數(shù)時(shí)，比 例尺為5pm。
圖3A-D顯示胎兒胚管中的鐘形細(xì)胞核的核分裂圖像。圖3A和B: ,,#^核分裂。鐘形細(xì)胞核由具有相似形狀的鐘形細(xì)胞核產(chǎn)生。圖3C 和D:不乂i/^》^核分裂。由鐘形細(xì)胞核產(chǎn)生的球形細(xì)胞核和"雪茄" 形細(xì)月包核。比例尺，5 pm。
圖4A-C顯示正常成體結(jié)腸隱窩(crypt)的圖像。圖4A:約2000個(gè) 球狀體、球形或盤狀細(xì)胞核的隱窩，偶而(<1/100)包含可識別的位于隱窩底部的鐘形細(xì)胞核(箭頭處)。圖4B:示出另一個(gè)鐘形細(xì)胞核的隱窩 基部。圖4C:良好展片的隱窩中壁和腔表面分裂間期和有絲分裂的細(xì) 胞核的形態(tài)型。放大的圖像顯示(i)間期的球形和橢圓形細(xì)胞核；(iUii) 早前期的球形和橢圓形細(xì)胞核；和(iv)前末期細(xì)胞核。低放大圖像的比 例尺為100pm,高放大圖像的比例尺為5nm。
圖5A-E顯示腺瘤的圖像。圖5A:腺瘤特征性大分支隱窩。圖5B: 整個(gè)腺瘤都發(fā)現(xiàn)不規(guī)則的隱窩樣結(jié)構(gòu)。這些大的(>4000個(gè)細(xì)胞)不規(guī) 則隱窩樣結(jié)構(gòu)的基底通常出現(xiàn)2個(gè)，但有時(shí)1個(gè)、4個(gè)乃至8個(gè)鐘形細(xì) 胞核(插入物)。圖5C:具有相似細(xì)胞核形態(tài)型、包含一個(gè)鐘形細(xì)胞核 的細(xì)胞簇。這些簇形式總共包含正好16、 32、 64和128個(gè)細(xì)胞。左圖， Feulgen-Giemsa染色。右圖，相差自動(dòng)熒光圖像。圖5D:腺瘤中出現(xiàn) 鐘形細(xì)胞核的情境(Context): (i)具有31個(gè)橢圓形細(xì)胞核和一個(gè)鐘形細(xì) 胞核的簇；(ii)肩并肩排列的多個(gè)鐘形細(xì)胞核；(iii)并排模式排列的鐘形 細(xì)胞核(箭頭)(iii)。具有幾個(gè)鐘形細(xì)胞核的~250個(gè)細(xì)胞核的不規(guī)則 混合物暗示新生的隱窩基底。圖5E:不規(guī)則的隱窩樣結(jié)構(gòu)，包含具有 5種不同細(xì)胞核形態(tài)型、明顯為同種細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，且在基底處具有一 個(gè)鐘形細(xì)胞核(箭頭)。在'a,b，中比例尺為100 pm在'e，中比例尺為5pm。
圖6A-E顯示腺癌的圖像。圖6A:非常大的隱窩樣結(jié)構(gòu)(>8000 個(gè)細(xì)胞)，具有較多折點(diǎn)的分支。箭頭指示主要在腫瘤表面附近發(fā)現(xiàn) 的~250個(gè)細(xì)胞的隱窩樣結(jié)構(gòu)的實(shí)例。圖6B:內(nèi)部胂瘤塊具有多個(gè)鐘 形細(xì)胞核(所有細(xì)胞核形態(tài)型的~3°/。)。圖6C:圖6B中的鐘形細(xì)胞 核定向?yàn)閺念^到腳的合胞體和非合胞體的橫列式布局。圖6D:腺癌中 對稱的核分裂。圖6E:腺癌中鐘形物不對稱的核分裂形成雪茄形的細(xì) 胞核。已經(jīng)在結(jié)腸到肝臟的轉(zhuǎn)移性病灶中觀察到相似的結(jié)構(gòu)。比例尺， 5 )Lim。
圖7A-D是在人組織和細(xì)胞中研究的定量圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)各階段的 說明。圖7A:準(zhǔn)備用于固定的外科手術(shù)廢棄的新鮮結(jié)腸。圖7B:顯 微鏡載玻片標(biāo)本顯示穿過息肉的lmm切片的鋪片結(jié)果(息肉的位置， 畫出"從頂?shù)降?的輪廓)。圖7C:整個(gè)隱窩中可觀察到的細(xì)胞核排列 (絳紅色)。與上文所示5ju切片(BrdU染色和H&M染色)相比，所 有隱窩細(xì)胞核得以保存。圖7D:電動(dòng)Axioscop顯微鏡-AxioCam彩色 CCD相機(jī)-KS 400軟件圖像分析工作站。圖8A和B應(yīng)用FISH來探測腫瘤中未分裂和分裂的鐘形細(xì)胞核中 的"目的靶標(biāo)"的圖示。圖8A:染色質(zhì)(因?yàn)槊縥umM交高的DNA含 量被染為深色)形成獨(dú)特的類似前期染色體、排列成兩個(gè)平行圏的結(jié) 構(gòu)。附圖中的這些圈說明在鐘形細(xì)胞核的這個(gè)特異位點(diǎn)可發(fā)現(xiàn)特異的 染色體這一預(yù)測。圖8B:染色質(zhì)分布和隨想象的轉(zhuǎn)變而發(fā)生的特異染 色體位置變化(此處細(xì)胞核"從鐘形轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形")在整個(gè)鐘形細(xì)胞 核的不對稱的分裂過程中發(fā)生。
圖9A-D為顯示TK-6人細(xì)胞球形細(xì)胞核中11號染色體的焚光原位 雜交結(jié)果的圖像。圖9A:前期染色體鋪片的兩對染色體。圖9B:球形 細(xì)胞核的DAPI核染色。圖9C:與FITC熒光探針雜交的相同的染色體 對。圖9D:間期染色體DAPI和FITC染色的合并圖像。比例尺5微 米。
圖10顯示排布在合胞體中的鐘形細(xì)胞核的對稱核分裂圖像。 圖11為顯示進(jìn)行細(xì)胞核分裂的鐘形細(xì)胞核中DNA定位的圖像。 圖12顯示在鐘形細(xì)胞核核分裂期間細(xì)胞核物質(zhì)的排列和組成 (ssDNA或者dsDNA)。
圖13A-D顯示來自人類胎兒標(biāo)本、示出一系列以前未識別的細(xì)胞 核形式的圖像。這些形式產(chǎn)生最初的鐘形細(xì)胞核。圖13A顯示具有由~ 10%總DNA含量凝聚成圍繞球形或者略微為橢圓形細(xì)胞核的長軸的 "帶"的細(xì)胞核。圖13B顯示其中兩條凝聚的細(xì)胞核"帶"看起來已 經(jīng)分離但仍然為單個(gè)細(xì)胞核一部分的細(xì)胞核。圖13C顯示看來像是由 圖13B的雙帶細(xì)胞核分裂產(chǎn)生的一對細(xì)胞核。圖13D顯示每個(gè)合胞體 包含一組鐘形物，在其線性中點(diǎn)處有單對鐘形物，且如在圖13C那樣， 開口相對。這些圖像顯示一 系列對稱分裂形成自中心對推開的細(xì)胞核。 圖14A和B顯示結(jié)腸腺瘤(圖14A)和腺癌(圖14B)中的細(xì)胞核形 態(tài)型。癌發(fā)生的形態(tài)型顯示圍繞橢圓形細(xì)胞核長軸的 一條或兩條相似 的帶。
圖15A-C顯示人類著絲粒的FISH染色。圖15顯示人類12周胎 兒結(jié)腸組織的球形(圖15A)、"雪茄，，形(圖15B)和鐘形(圖15C)細(xì)胞 核的著絲粒(明亮的)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及意料之外的發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞例如分裂形成腫瘤的細(xì) 胞會(huì)進(jìn)行不對稱的核分裂。未在除胂瘤組織之外的成體組織中發(fā)現(xiàn)的 鐘形細(xì)胞核會(huì)經(jīng)歷基因組以單鏈DNA (ssDNA)為代表的時(shí)期。鐘形細(xì) 胞核不對稱分裂的特點(diǎn)允許專門耙向待鑒定和破壞、包含這種細(xì)胞核 的細(xì)胞例如胂瘤干細(xì)胞。人類肺瘤中，具有鐘形細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)具備類 干細(xì)胞性質(zhì)(stem cell-like qualities)。
本文描述的是基于這一意料之外的發(fā)現(xiàn)所建立的方法在人類結(jié) 腸和胰腺胂瘤中，鐘形細(xì)胞核通過非有絲分裂分裂過程進(jìn)行對稱和不 對稱分裂(Gostjeva " a/., 2005， C朋cer Gewe"cs C,gewe"cs, in press )。在5-7周胚胎后腸和腫瘤組織中出現(xiàn)大量這樣的鐘形細(xì)胞核， 其中在5-7周胚胎后腸中，鐘形細(xì)胞核被管狀合胞體包圍并占總細(xì)胞核 的30%,而在腫瘤組織中，鐘形細(xì)胞核在"未分化的"生態(tài)位中有很 多。它們具有一些類干細(xì)胞性質(zhì)，尤其不對稱分裂的"口令"和核分 裂頻率，該核分裂頻率與人結(jié)腸腫瘤形成前及腫瘤性組織的生長速率 一致(Herrero-JimenezeM/., 1998, 2000)。這些以前未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核 形式均是腫瘤生成和分化的來源，因而是癌癥治療策略的靶標(biāo)。
包含鐘形細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)(例如細(xì)胞、類細(xì)胞結(jié)構(gòu)或合胞體)代表 腫瘤干細(xì)胞。它們核分裂的無絲分裂方式需要分子機(jī)制，所述分子機(jī) 制對不在似乎通過有絲分裂而分裂的胚胎(嚢胚球)和成體維持干細(xì) 胞中表達(dá)的分子靶標(biāo)進(jìn)行了限定。例如，這些鐘形細(xì)胞核會(huì)經(jīng)歷基因 組以ssDNA為代表的階段這一觀察結(jié)果將允許其耙向并破壞。對于鐘 形細(xì)胞核空間組織如何、染色質(zhì)怎樣分散在細(xì)胞核中、特定染色體是 否在整個(gè)核纖層內(nèi)部占有特定區(qū)域的探討，將暗示更多的特異性治療 靶標(biāo)研究并提供對其他關(guān)于細(xì)胞核形態(tài)型(形狀)和基因表達(dá)間關(guān)系 的了解。
本文公開的是，在胎兒后腸、結(jié)腸腺瘤和腺癌中發(fā)現(xiàn)的一系列特 殊的閉合細(xì)胞核形式，其看來似乎開始由鐘形細(xì)胞核的不對稱核分裂 產(chǎn)生但是隨后通過有絲分裂分裂并死于細(xì)胞凋亡。胚胎和不存在于成 體組織的腫瘤中共有的細(xì)胞核形式支持了十九世紀(jì)腫瘤是成體器官中 的胚胎生長的假說(Cohnheim， J.， F^c/zov^」rc/z., 65: p.64， 1875; Sell, S., Owe. , 51: 1-28, 2004)。
本文描述的方法使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于現(xiàn)有技術(shù)的高分辨率顯微術(shù)和定量圖像分析技術(shù)對具有不同形態(tài)的細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞生成終 點(diǎn)的體內(nèi)分析，特別強(qiáng)調(diào)結(jié)腸、胰腺、腎、卵巢及其他腫瘤中的鐘形 細(xì)月包核。
細(xì)胞和合胞體的鐘形細(xì)胞核中的核結(jié)構(gòu)、DNA含量和染色體的空 間分布可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法表征，例如通過定量圖像細(xì) 胞計(jì)數(shù)和共聚焦顯微鏡檢術(shù)。例如，這樣的技術(shù)使得本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以確定總的DNA含量，可以使用特定試劑例如吖咬橙或鏈特異的 DNA雜交探針來區(qū)分ssDNA和雙鏈DNA (dsDNA)。這些信息可用于 區(qū)分腫瘤中具有不同形態(tài)、肺瘤型(結(jié)腸vs.胰腺)和生態(tài)位的鐘形細(xì) 胞核。這樣的技術(shù)還可以用來表征DNA合成進(jìn)程并檢測相關(guān)蛋白質(zhì)的 存在情況，例如，與在鐘形細(xì)胞核對稱和一些不對稱核分裂形式過程 中的DNA合成和分離相關(guān)的蛋白質(zhì)。
分離具有鐘形細(xì)胞核的細(xì)胞和合胞體為均質(zhì)樣本
本文和其他地方(PCT/US2005/021504, 2005年6月17日提交；和 美國申請No.11/156，251, 2005年6月17日提交；本文引用其全部內(nèi) 容全文作為參考)描述的腫瘤組織制備的方法可適合于"彈射"壓力 激活激光顯微解剖的要求，以產(chǎn)生細(xì)胞核形態(tài)均質(zhì)的細(xì)胞樣本，該細(xì) 胞樣本可應(yīng)用于代謝物和大分子分析。這樣的方法使得本領(lǐng)域技術(shù)人
員可鑒定在人類腫瘤中減緩分裂或者破壞包含鐘形細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)的合 理耙標(biāo)。
本發(fā)明的方法部分基于在不固定的腫瘤標(biāo)本中識別細(xì)胞核形態(tài)的 方法，因此可在體外研究具有鐘形細(xì)胞核的活細(xì)胞和合胞體的均質(zhì)標(biāo) 本。研究活的鐘形細(xì)胞核以更好地了解它們的特殊DNA合成和分離機(jī) 制，并提出在癌癥治療中干擾這些過程的方法。
癌癥治療中的"干細(xì)胞靶標(biāo)"
現(xiàn)有癌癥治療方法的主要靶標(biāo)是通過細(xì)胞周期的細(xì)胞 (Gomez-Vidal, J. A., C匿7bp.她t/. C/ze附.，4: 175-202, 2004;
Fischer, P.和Gianella-Borradori, A., ExpeW /wveW/g. ZVwgs, 14: 457-477, 2005 )。在成體維持干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞間的轉(zhuǎn)換細(xì)胞間沒有 區(qū)別，所述成體維持干細(xì)胞分裂來提供過渡細(xì)胞以替換細(xì)胞程序死亡導(dǎo)致的末端細(xì)胞損失。治療目的在于窄的用藥窗，所述用藥窗會(huì)殺死 全部的肺瘤干細(xì)胞而不殺死患者。但是，預(yù)計(jì)成體維持干細(xì)胞在邏輯 上具有零細(xì)胞生長的性質(zhì)，然而肺瘤干細(xì)胞如胎兒干細(xì)胞很明顯涉及 快速的凈細(xì)胞生長。成體維持干細(xì)胞分裂似乎在本質(zhì)上必然是不對稱 的，這產(chǎn)生新的維持干細(xì)胞和一個(gè)最初分化的過渡細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞 需要連續(xù)的對稱的核分裂以支持腫瘤凈生長。正是在腫瘤中的鐘形細(xì)
胞核會(huì)經(jīng)歷對稱的"c叩-from-cup"核分裂這一發(fā)現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞生長 的或者殺細(xì)胞的療法的特異靶標(biāo)。
與這些化學(xué)療法的殺細(xì)胞策略無關(guān)的假說是可通過阻止血管生成 寸吏腫瘤窒息，例如Folkman和Ingber Omcw^o/., 3: 88-96，
1992)。其他人提出通過阻斷細(xì)胞分化的癌癥治療方法。但是所產(chǎn)生的 缺氧就所涉及的干細(xì)胞來說重新形成早期胚胎發(fā)生的條件，并可解釋 抗血管生成策略的減輕效果而不是治療效果(Warburg， O., S;oc/^m. Zetoc/zn/" 152: 479, 1924)。阻斷腫瘤分化可阻斷伴有不良后果的正 常組織分化。由于在較短一段時(shí)間內(nèi)干細(xì)胞會(huì)重新集中于腫瘤中，因 此現(xiàn)有的癌癥療法有效性有限，這一理解已經(jīng)成為尋找腫瘤干細(xì)胞而 非成體維持干細(xì)胞所特有的分子和生物化學(xué)特征的有力刺激(Otto， W.,人尸W/zo/., 197: 527-535, 2002; Sperr, W.等人，￡wr. /"veW.，
34 (增子'J 2》31-40, 2004; Venezia, T.爭乂，尸Z^S編.,2: e301, 2004)。 腫瘤干細(xì)胞這樣的分子和/或生物化學(xué)特性，可作為癌癥治療中的耙標(biāo)。 在結(jié)腸腫瘤而不是成體結(jié)腸上皮中的鐘形細(xì)胞核會(huì)經(jīng)歷對稱和不對稱
纟田胞(Gostjeva， E.爭乂， C匿w C聲爐".，164: 16-24, 2006)。
胚胎、干細(xì)月包系和肺瘤中干細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)
新和分化的不對稱分裂。s而:在胚胎和肺瘤的干、細(xì)胞中^括核分裂
時(shí)DNA合成和分離的細(xì)胞周期發(fā)展機(jī)制仍基本上未探究過的。這些成 果的缺乏是可以理解的，原因在于在人類或者組織范圍內(nèi)一直沒有直 接的鑒定干細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。已對鼠科動(dòng)物結(jié)腸和細(xì)胞株的成體干 細(xì)胞中的不對稱分裂進(jìn)行了探討，所述不對稱分裂極其重要的證據(jù)在 于假定的干細(xì)胞中親代DNA鏈的選擇性泛子(pangenomic)分離(potten, C.爭乂， Ce〃Sc/., 115: 2381-2388, 2002; Merok， J.爭 乂， C騰wto.， 62: 6791-6795， 2002)。這種干細(xì)胞特異性的染色體 基因轉(zhuǎn)移模式非隨機(jī)方式的識別領(lǐng)先于現(xiàn)有的似乎是干細(xì)胞特異性細(xì) 胞核形態(tài)和分裂才莫式的識別幾十年(Cairns， J., A^wm, 255: 197-200, 1975 )。
實(shí)施例
實(shí)施例1. 確定組織和胂瘤的來源。
由和來自麻薩諸塞族綜合醫(yī)院病理科合作者的外科手術(shù)廢棄物獲 得成人組織和腫瘤樣品(Gostjeva， E.等人，C朋cer Q^ogewe/.,
164: 16-24， 2006)。由W. G. Thilly教授的實(shí)驗(yàn)室利用匿名的廢棄腫瘤 和組織切片已經(jīng)通過利用人類作為實(shí)驗(yàn)對象的MIT委員會(huì)批準(zhǔn)。
開發(fā)用于組織切除、固定、展片和DNA染色的方法。
以下方法容許組織和腫瘤樣品細(xì)胞核的可—見化，使染色體和細(xì)胞 核的結(jié)構(gòu)和定量觀察結(jié)果達(dá)到所希望的清晰度。關(guān)鍵因素是利用外科 手術(shù)30分鐘內(nèi)固定的新鮮腫瘤樣本，并避免標(biāo)準(zhǔn)的薄切片過程。顯然 鐘形細(xì)胞核是組織和腫瘤樣本中自溶作用(autolysis)的早期犧牲品，并 在切除大約45分鐘后不再可辨別。標(biāo)準(zhǔn)5微米切片僅通過所發(fā)現(xiàn)的幾 種細(xì)胞核形式進(jìn)行切片，幾乎所有的細(xì)胞核具有大于5微米的最小直 徑。設(shè)計(jì)的具體技術(shù)是重要進(jìn)程的證明
切除后30分鐘內(nèi)將薄片(~ 1 cm勺諸如條帶狀的結(jié)腸粘膜，或者腺 瘤、腺癌或者轉(zhuǎn)移性病灶~ lmm厚的切片置于至少三倍體積的新近配 制的4。C卡諾固定液(甲醇:冰醋酸=3:1 )。用新鮮的固定液更換三次(每 45分鐘一次)然后更換為4。C的700/。甲醇將樣本貯存在-20。C。在蒸餾 水中漂洗固定的切片，并為了部分水解大分子和DNA脫噪呤將其置于 2mL60 。C的1NHC1中8分鐘。在冷的蒸餾水中漂洗以終止水解反應(yīng)。 將漂洗后的樣本浸漬于45%乙酸中(室溫)達(dá)15到30分鐘進(jìn)行"組 織浸漬"，這使得可通過對顯微鏡用蓋玻片施加較小的壓力，從而將植 物和動(dòng)物組織切片進(jìn)行展片并觀察。將每個(gè)浸漬后的切片平分為~ 0.5x1 mm的碎片，并利用5 ju 1乙酸轉(zhuǎn)移到載玻片上的蓋玻片下。為了組織展片，將5層濾紙置于蓋玻片上。利用輕的均衡的壓力沿著濾 紙的一個(gè)方向穩(wěn)穩(wěn)地移動(dòng)鑷子柄。在良好展片的結(jié)腸組織中，沒有受 到損壞的細(xì)胞核，而隱窩基本上被壓成單層。在干水冷凍后移去蓋玻 片，并干燥載玻片1小時(shí)。在室溫下將載玻片置于裝滿Schiff試劑的 科普林缸一小時(shí)來對去嘌呤DNA進(jìn)行部分染色(福爾根染色)，在同 一科普林缸中利用2xSSC (檸檬酸三鈉8.8 g/ L、氯化鈉17.5 g/L )漂 洗兩次， 一次漂洗30秒， 一次快速漂洗。然后用蒸餾水漂洗載玻片， 漂洗后的載玻片適于核的圖像分析(Gostjeva, E., C^o/. 32: 13-16, 1998)。為了達(dá)到更好的分辨率，可進(jìn)一步將載玻片利用吉姆薩 試劑染色。在2xSSC漂洗后立即將載玻片置于1。/。吉姆薩溶液(Giemsa， Art. 9204, Merck)5分鐘，然后快速漂洗，第一次用SOrenssen緩沖液 (二水合磷酸氪二鈉物U.87 g/L、磷酸二氫鉀9.07 g/L)，然后用蒸餾 水漂洗。將載玻片于室溫干燥一小時(shí)，然后將其放入裝滿二曱苯的科 普林缸中至少3小時(shí)以除去脂肪。在高分辨率掃描前，利用DePex封 固劑將蓋玻片膠著在載玻片上并干燥3小時(shí)。
做為選擇，可通過暴露于蛋白水解酶例如膠原酶II實(shí)現(xiàn)浸漬，從 而實(shí)現(xiàn)具有確定細(xì)胞核形態(tài)的活細(xì)胞的分離。
顯微鏡和圖像處理系統(tǒng)。
本文所使用的定量圖像分析軟件利用由早期衛(wèi)星監(jiān)視系統(tǒng)改造而 來的背景抑制方法。該技術(shù)由德國Kontron公司獲得此后其本身由Zeiss 公司獲得。利用專用的KS-400圖象分析系統(tǒng)TM3.0版本(Zeiss,德國) 采集所有圖像，該系統(tǒng)由連接到個(gè)人電腦的電動(dòng)光學(xué)顯微鏡、 AxioscopeTM、彩色CCD照相機(jī)、AxioCamTM(Zeiss,德國)組成。當(dāng)僅 使用福爾根染色時(shí)，利用可見光和560 nm (綠色)濾光片，由1.4/100 放大倍數(shù)的平面消多色差物鏡從顯微鏡傳輸圖像。當(dāng)使用福爾根-吉姆 薩染色時(shí)，不利用濾光片。在每次掃描前，調(diào)整幀接收器和最佳曝光 量。以像素大小0.0223x0.0223微米記錄細(xì)胞核圖像。
胚胎腸管
在整個(gè)胎兒腸管樣品中發(fā)現(xiàn)七種不同的細(xì)胞核形態(tài)型(大的球形、 凝聚的球形、橢圓形、菜豆形、雪茄形、香腸形和鐘形)(圖1A)。鐘形細(xì)胞核看來是由類似凝聚染色體的凝聚的染色質(zhì)形成開口的(圖
1B)。鐘形細(xì)胞核在~ 20-50微米管或者合胞體內(nèi)部以線形"從頭到腳" 排列方向組織(圖2)。鐘形細(xì)胞核的"從頭到腳，，模式存在于所有被 觀察的胚管中，但是胚管前后迂回前進(jìn)，從而使得平行的胚管具有局 部反平行方向的鐘形細(xì)胞核。
觀察到鐘形細(xì)胞核僅僅在合胞體內(nèi)部經(jīng)歷對稱和不對稱無絲分裂 (圖3)。鐘形細(xì)胞核的對稱無絲分裂類似兩個(gè)堆疊紙杯的簡單分離。 在最高分辨率下，類似成對染色體的凝聚染色質(zhì)看起來形成將鐘"口" 維持在開啟狀態(tài)的環(huán)。在管狀合胞體之外，經(jīng)常觀察到幾種"閉合的" 細(xì)胞核形態(tài)型的每一種的有絲分裂。特定的"閉合的"細(xì)胞核形態(tài)存 在于早前期，如圖1所示。
正常的結(jié)腸上皮
從隱窩基底到腔表面均可觀察到隱窩中幾乎全部的細(xì)胞核(圖 4A)。許多隱窩都以個(gè)體細(xì)胞核形狀可辨別這樣的方式展開。具有橢圓 形或者球形細(xì)胞核的細(xì)胞沿基底正上方到延伸到腔內(nèi)的上皮排列成為
隱窩。(圖4C)。在隱窩基底的笫一個(gè)~25個(gè)細(xì)胞中， 一種可能不同、 占九分之一細(xì)胞核形態(tài)型的特征在于為盤形，厚~2-3微米且直徑為~ IO微米(圖4B)。在不足1%其中細(xì)胞被良好分離的所有隱窩基底中， 從明顯為盤形的細(xì)胞核中辨認(rèn)出唯一的鐘形細(xì)胞核(圖4A和4B)。已 在成體肝臟標(biāo)本中觀察到類似低頻率的鐘形細(xì)胞核。在沒有任何腫瘤 形成或腫瘤形成前的病理征兆的成體結(jié)腸中，對超過一千個(gè)良好展片 的隱窩的細(xì)胞-細(xì)胞掃描中沒有觀察到其他細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變體。
腺瘤
腺瘤包含許多隱窩，這些隱窩與各具有~2000個(gè)細(xì)胞的正常結(jié)腸 隱窩沒有區(qū)別。常常發(fā)現(xiàn)這些隱窩是如圖5A所示的分支形式。隱窩壁 與正常結(jié)腸隱窩有著相同的球形和橢圓形細(xì)胞核，但是比正常結(jié)腸中 更常見的是，在隱窩基底存在一個(gè)或兩個(gè)鐘形細(xì)胞核。也觀察到含最 高達(dá)~ 8000個(gè)細(xì)胞的不規(guī)則的小葉結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞更容易通過組織浸 漬展開。在幾乎所有不規(guī)則結(jié)構(gòu)中，有兩個(gè)或更多個(gè)鐘形細(xì)胞核，其 鐘形開口在結(jié)構(gòu)主體方向上(圖5B)。另外，許多不同的細(xì)胞和群體分散于隱窩和不規(guī)則結(jié)構(gòu)中(圖5C)。 一些規(guī)則結(jié)構(gòu)仿佛朝著完整尺寸 的正常隱窩生長，這些隱窩包含~ 250個(gè)、~ 500個(gè)或者~ 1000個(gè)細(xì)胞。 許多細(xì)胞群體看起來是剛好8個(gè)、16個(gè)、32個(gè)、64個(gè)和128個(gè)細(xì)胞的 "環(huán)"，其中每個(gè)細(xì)胞具有一個(gè)鐘形細(xì)胞核(圖5D)。
較高放大倍數(shù)的檢查顯示大部分隱窩樣結(jié)構(gòu)的壁的細(xì)胞具有與正 常成體結(jié)腸隱窩 一樣的球形或者橢圓形細(xì)胞核。在不規(guī)則的小葉結(jié)構(gòu) 中出現(xiàn)的具有橢圓形、雪茄形或者子彈形細(xì)胞核的細(xì)胞群體表明幾個(gè) 不同群體的融合。已經(jīng)在胚胎后腸中觀察到具有橢圓形和雪癡形細(xì)胞 核的群體，但是僅僅在腺瘤和腺癌中發(fā)現(xiàn)子彈形細(xì)胞核形態(tài)型(圖5E)。
鐘形細(xì)胞核產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)具有子彈形細(xì)胞核的小群細(xì)胞，這些群體包含 進(jìn)行普通有絲分裂的細(xì)胞，除了從前期到后末期(anatelophase)在某 種程度上保持特有的細(xì)胞核形態(tài)這一有趣的事實(shí)。
鐘形細(xì)胞核雖然在正常成體結(jié)腸中很少，但經(jīng)常出現(xiàn)在多個(gè)腺瘤 中。發(fā)現(xiàn)有一些鐘形細(xì)胞核在隱窩樣結(jié)構(gòu)之間的空間為 一個(gè)到十個(gè)或 更多個(gè)的"鐘"(圖5D)。發(fā)現(xiàn)其他鐘形細(xì)胞核在多細(xì)胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)中為 一個(gè)"鐘"，其中經(jīng)常在具有球形或其它形態(tài)型的(2n-l)個(gè)細(xì)胞的環(huán) 中觀察到一個(gè)鐘形細(xì)胞核(圖5C和5D)。
在隱窩樣結(jié)構(gòu)基底杯內(nèi)鐘形細(xì)胞核表現(xiàn)為單個(gè)鐘，更通常為 一對 鐘或者偶而為4個(gè)或者8個(gè)鐘。在大得多的不規(guī)則小葉結(jié)構(gòu)中，在解 剖學(xué)上鐘形細(xì)胞核整合至與具有其它細(xì)胞核形態(tài)的細(xì)胞混合的異常結(jié) 構(gòu)的壁中。好像這些大的不規(guī)則的隱窩樣結(jié)構(gòu)是多個(gè)各種各自具有自 己細(xì)胞核形態(tài)型的群體的鑲嵌物。估計(jì)大的腺瘤(~1厘米)包含約 1000個(gè)鐘形細(xì)胞核。在每個(gè)多發(fā)腺瘤中都已經(jīng)觀察到數(shù)百個(gè)鐘形細(xì)胞 核，但在通常存在于胚胎切片的對稱形式細(xì)胞核分裂的任一腺瘤中觀 察到單個(gè)鐘形細(xì)胞核；然而已經(jīng)在腺瘤中觀察到幾個(gè)不對稱細(xì)胞核分 裂的實(shí)例。
腺癌
同腺瘤 一 樣腺癌也包含隱窩、大的不規(guī)則結(jié)構(gòu)和隱窩內(nèi) (inter-cryptal)的16個(gè)、32個(gè)、64個(gè)和128個(gè)細(xì)胞群的混合物。還 在隱窩的基底杯中發(fā)現(xiàn)鐘形細(xì)胞核為單一、成對或者數(shù)量較多，且這些鐘形細(xì)胞核嵌入大的不規(guī)則小葉結(jié)構(gòu)的壁中的復(fù)雜斗形紋中(圖6 )。 腺癌中的 一 系列細(xì)胞核形態(tài)型與在腺瘤中發(fā)現(xiàn)的系列 一樣，包括子彈 形的形態(tài)型。
腺瘤和腺癌間可辨別的差異是隱窩樣結(jié)構(gòu)隨機(jī)定位于腫瘤表面。 在瘤內(nèi)部也不經(jīng)常發(fā)現(xiàn)隱窩和不規(guī)則結(jié)構(gòu)，這被更好地表征為較小的 局部組織的結(jié)構(gòu)折中而非混亂的的集合。
腺癌不同于腺瘤最顯著的差異是多于數(shù)百個(gè)鐘形細(xì)胞核明顯有組 織的群體的頻繁出現(xiàn)，其中有許多經(jīng)常(~ 1%)涉及對稱的核分裂。后 來確定這些對稱分裂包括凝聚的細(xì)胞核物質(zhì)。鐘形細(xì)胞核具有正常單 倍體細(xì)胞一樣的DNA量。當(dāng)鐘形細(xì)胞核開始經(jīng)歷"cupfrom cup"的對稱 分裂時(shí)，DNA含量增加到單倍體基因組所含DNA量的1.05倍(若著 絲粒復(fù)制預(yù)期增加約一倍)。DNA含量維持在該水平， 一直到"cupfrom cup"過程晚得多的時(shí)間，此時(shí)這兩個(gè)細(xì)胞核包含2倍量的DNA物質(zhì)。 正是在可能僅有著絲粒被復(fù)制且基因組的鏈被分開的階段，基因組基 本上被組織為ssDNA。直到該過程復(fù)制后，基因組才又變成dsDNA。
低放大倍數(shù)時(shí)，這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在隱窩樣結(jié)構(gòu)間的空間，并且看來 像蜘蛛網(wǎng)或者葉脈骨架。較高放大倍數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該薄葉脈是具有鐘形 細(xì)胞核的細(xì)胞的部分有序排列鏈，這些鐘形細(xì)胞核具有開口朝向同一 方向(自葉脈軸90° )這一不尋常的特征(圖6C)。在胚胎的腸管而 不在腺瘤觀察的局部有邊界的合胞體中也發(fā)現(xiàn)"從頭到腳"方向的鐘 形細(xì)胞核(圖6C)。估計(jì)腺癌塊中有數(shù)百萬的鐘形細(xì)胞核，且具有頻繁 的對稱和不對稱的無絲分裂(圖6D和6E)。結(jié)腸直腸瘤至肝臟的轉(zhuǎn)移 重新形成了細(xì)胞核形態(tài)型的模式，隱窩和不規(guī)則結(jié)構(gòu)似乎與在腺癌中 觀察到的那些沒有區(qū)別。
對3D保存的單個(gè)鐘形細(xì)胞核和成對對稱分裂的鐘形細(xì)胞核進(jìn)行共聚焦
顯微木
為了對3D保存的單個(gè)鐘形細(xì)胞核和成對對稱分裂的鐘形細(xì)胞核 執(zhí)行共聚焦顯微術(shù)，使用Delta Vision RT Restoration Imaging System at Imaging Center, Whitehead Institute。該系統(tǒng)提供用于細(xì)胞核成4象恢復(fù) 的實(shí)時(shí)2D重疊合法和3DZ投影法。
應(yīng)用細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)(FITC-毒傘素)和細(xì)胞核(DAPI)復(fù)染來研究鐘形細(xì)胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。按照與福爾根染色相同的方法通過"水解" 浸漬將細(xì)胞鋪在載玻片上。區(qū)別是應(yīng)用兩種不同的固定液固定以比4交 結(jié)果卡諾固定液(4。C)和3.7%的曱醛固定15分鐘，在含2% BSA(2g)、 0,20/。脫脂奶粉(0.2g)、 0.4Q/otritonX畫100 (400juL)的lOOmLPBS封閉液 中封閉2小時(shí)(室溫)，后者推薦用于活組織細(xì)胞的固定。在將其上鋪 有組織的顯微鏡用載玻片用PBS沖洗兩次之后，將該載玻片轉(zhuǎn)入濕度 試驗(yàn)容器，將100 mL利用封閉液適當(dāng)稀釋的第一抗體液滴滴到載玻片 并覆蓋整個(gè)鋪片區(qū)域，利用橡膠膠水密封蓋玻片頂部，置于貼箔的容 器中并放入冷房間中的濕度試驗(yàn)容器過夜。然后將未密封的載玻片在 PBS中洗滌三次。取出載玻片，將lOOiiL利用封閉液適當(dāng)稀釋的第二 抗體和/或細(xì)胞染色劑(例如，F(xiàn)ITC-毒傘素、DAPI)液滴滴到載玻片 并覆蓋含有細(xì)胞展開物的區(qū)域，并轉(zhuǎn)入容器中的濕度試驗(yàn)容器。密封 容器/濕度試驗(yàn)容器，用鋁箔包裹并置于室溫2小時(shí)。載玻片在PBS中 洗滌五次并以每個(gè)有2-5 juL封固劑(抗脫色57owFa&、 recto幼"7d 或者液滴的方式制備。蓋玻片被封片以確定過量PBS被除 去(在紙巾上輕敲蓋玻片的角)。通過在將蓋玻片完全降下前將其邊緣 放入封固劑以減少封固時(shí)形成的氣泡數(shù)目。利用指曱油用蓋玻片封閉 載玻片并將該載玻片在4'C避光保存(或者-2(TC更長時(shí)間)。利用 Delta Vision RT復(fù)原成像系統(tǒng)觀察該栽玻片。
利用Feulgen-Schiff方法的方案測量細(xì)胞核DNA含量，已證明該 方法可對于DNA的細(xì)胞化學(xué)定位和化學(xué)計(jì)算是精確的。通過測量 Feulgen-DNA (染料-配體)復(fù)合體分子的吸光度來測量單個(gè)細(xì)胞核中 的DNA含量(Kjellstrand， P., /. A^cm co;^, 119: 391-396, 1980; Andersson, G.和Kj ell strand, P., ///W0c/2謹(jǐn)'e, 27: 165-200， 1971)。 利用由^S400成像分析系統(tǒng)(ZeissInc，德國)所改進(jìn)的軟件，通過測量 每個(gè)細(xì)胞核個(gè)體的全部區(qū)域的光密度積分(IOD )來測量不分裂(間期) 和分裂的鐘形細(xì)胞核。
這些特殊成像分析工作站(參見圖9D)由耦聯(lián)有與電腦連接的 AxioCam彩色CCD相機(jī)(Zeiss)的顯微鏡Axioscop 2 MOT(Zeiss)組成， 由Carl Zeiss公司的工程師裝配，是能獲得高分辨率的細(xì)胞核和細(xì)胞結(jié) 構(gòu)圖像的顯微術(shù)，也就是說在早前期染色體測量中每個(gè)像素有1000 bp 的DNA。所以，能精確測量間期細(xì)胞核中~ 1 Mb的凝集染色質(zhì)區(qū)域。在常值參數(shù)的放大率、曝光量和定閾值(作等值線)下利用560 nm綠 色濾光片掃描細(xì)胞核圖像。選擇這樣的DNA含量測量方法有望得到最 精確的結(jié)果(Biesterfeld.S.等人，爿朋/. 0^抓Q^ /. ///Wo/.,23: 123-128, 2001; Hardie， D.等人，J.歷W Cy r/^肌，50: 735 — 749, 2002;
Gregory和Hebert, 2002; Gregory, 2005 )。
熒光原位雜交以確定間期和細(xì)胞核分裂期間鐘形細(xì)胞核中全部24條人 染色體的空間分布。
利用FISH確定看起來像是鐘形細(xì)胞核頂部的"環(huán)"、參與凝聚 的全部染色體。本質(zhì)上，"環(huán)"中的染色體標(biāo)記被預(yù)測為分析鐘形細(xì)胞 核產(chǎn)生具有不同形態(tài)的細(xì)胞核(如圖10B所示)時(shí)轉(zhuǎn)換的工具，以及 開發(fā)通過除細(xì)胞核形態(tài)之外的其他方式識別這些細(xì)胞核的焚光標(biāo)記的 工具。
將每張載玻片不多于1-5乂107個(gè)細(xì)胞的胂瘤細(xì)胞鋪在載玻片上。通 過兩種不同的細(xì)胞鋪片方式固定載玻片 一種用于福爾根反應(yīng)DNA圖 像細(xì)胞計(jì)數(shù)，另一種由Gibson提出，用于分離來自結(jié)腸鏡檢查活檢標(biāo) 本的上皮細(xì)胞(Gibson, P.等人，G贈(zèng)固詢/ogy, 96: 283-291, 1989)。 后者基本在外科手術(shù)30分鐘內(nèi)取胂瘤組織并立即將其置于50 mL冷的 Hank's平衡鹽溶液中，然后洗滌。然后用解剖刀刀刃切碎樣品并在4 mL 膠原酶-分散酶培養(yǎng)基中消化1.5小時(shí)(培養(yǎng)基包含1.2 U/ml的分散酶 1(5oe/ n'/ ger A/"wwAez'/ 7 5/oc/ze附/ca/s, /"<^/"""/70// ， /"t/.)和50 U/ml月交
原酶IV型(Worthington, Biochemical Corp., Freehold, N丄)。通過在 蓋玻片上施加溫和的滑動(dòng)壓將沉淀鋪在顯微用載玻片的表面。對于細(xì) 胞鋪片，"水解"浸漬鋪片作為陽性對照以檢測鐘形細(xì)胞核形態(tài)是否在 施加膠原酶-分散酶處理之后有任何變形。使制備得到的載玻片干透并 置于37%過夜。然后，將載玻片順次置于水冷的70%、 80%、室溫的 100%乙醇中脫水，每次2分鐘并完全干燥，在72 。C的70%甲酰胺/2xSSC 中變性2分鐘并立即以相同的次序脫水及完全干燥。制備得到的雜交 混合物包含7juL雜交緩沖液、2mL無菌水和1 juL探針。將混合物在 72。C變性8到12分鐘并立即添加到載玻片，隨后將該載玻片蓋上蓋玻 片，用橡膠膠水密封，并置于37。C的黑暗濕潤箱中過夜。
然后，將載玻片在冷的70%乙醇、冷的80%乙醇，室溫的100%乙醇中脫水，每次2分鐘；在72。C的70。/。甲酰胺/2xssc中變性50-60秒， 取決于乙酸的變性程度。將載玻片在冷的70%乙醇、冷的80%乙醇及 室溫的100%乙醇中再一次脫水，每次2分鐘。雜交混合物包括包含7 HL雜交緩沖液、2juL無菌水和1.5juL。應(yīng)用具有橙色光譜或者綠色 光譜熒光染料的整個(gè)染色體顏料探針(^w力。雜交混合物在72X:變性 5-10分鐘并隨后完全干燥。將雜交混合物添加到載玻片，蓋上蓋玻片 并用橡膠膠水密封。然后將載玻片置于37。C濕潤箱中孵育過夜。第二 天，將載玻片于42。C的50%甲酰胺、2xSSC中洗滌兩次，每次8分鐘。 然后將載玻片在37。C的2xSSC中洗滌8分鐘，再在室溫下的 lxPBD(0.05。/oTween、4xSSC)中洗滌三次，每次1分鐘。然后添加10jaL 的DAPIII抗褪色劑，125ng/mL (Vysis)并蓋上蓋玻片。吸去過量的DAPI II抗褪色劑并利用橡膠膠水密封載玻片。在圖象掃描操作前將載玻片 在-2(TC保存于黑暗中。
在鐘形細(xì)胞核核分裂之前、期間、之后利用定量DNA細(xì)胞計(jì)數(shù)追蹤DNA 合成
本文描述的技術(shù)可檢測人類細(xì)胞培養(yǎng)物中差異低到2%的任何兩 個(gè)細(xì)胞核或者有絲分裂時(shí)后末期的姐妹細(xì)胞核。利用這些技術(shù)來確定 包含鐘形細(xì)胞核的細(xì)胞或者合胞體中何時(shí)合成DNA。這涉及掃描好象 處于核分裂過程的細(xì)胞核。注意到通常，與在同一染色載玻片上的人 類淋巴細(xì)胞DNA含量相比，胎兒鐘形細(xì)胞核包含預(yù)計(jì)的人類二倍體細(xì) 胞的DNA量。另外，注意到人類腫瘤發(fā)生前的病變和腫瘤的鐘形細(xì)胞 核中的DNA量表現(xiàn)出圍繞一平均值有較大變化，該平均值平均大于二 倍體DNA量。測定結(jié)果已揭示了另一個(gè)完全意外的發(fā)現(xiàn)對于涉及鐘 形細(xì)胞核的對稱和不對稱核分裂，DNA合成同步于而不是先于核分裂 過程。在明顯檢測到單個(gè)細(xì)胞核數(shù)量中總DNA含量增加前，細(xì)胞核在 "cup-from-cup"分離過程中似乎很好。DNA總量在細(xì)胞核明顯開始分 裂中從接近單個(gè)腫瘤細(xì)胞核的平均值這一低值開始增加，并在細(xì)胞核 似乎剛剛完成分裂約達(dá)到平均細(xì)胞核含量的兩倍。
實(shí)施例2.胎兒器官發(fā)生中合胞體的鐘形細(xì)胞核
在產(chǎn)生鐘形細(xì)胞核的人類胎兒標(biāo)本中鑒定出 一 系列以前未被識別的細(xì)胞核形式。這些形式發(fā)現(xiàn)于第五周，為第一個(gè)管狀合胞體，含有
鐘形細(xì)胞核。圖13A-D顯示這些實(shí)例。這作為一項(xiàng)重要發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著 形態(tài)從早期胚胎發(fā)生的有絲分裂球形細(xì)胞核過渡到后來的無絲分裂鐘 形細(xì)胞核，該鐘形細(xì)胞核代表凈生長和分化的有生殖力的"干"細(xì)胞 譜系。
這些發(fā)現(xiàn)在組織類型間是一致的，因?yàn)橐呀?jīng)在一系列組織標(biāo)本中 觀察到該發(fā)現(xiàn)，組織標(biāo)本包括例如肌肉、發(fā)育中的肢體、神經(jīng)組織和 內(nèi)臟器官(包括胃、胰腺、膀胱、肺和肝臟)。所發(fā)現(xiàn)的合胞體為在發(fā) 育中的器官塊內(nèi)部規(guī)則分布的~ 16-24個(gè)合胞體的簇，每個(gè)合胞體都具 有~16個(gè)鐘形細(xì)胞核。合胞體在可得到的最少發(fā)育的人類材料中是明 顯的(~5周)并在第十三周消失。笫十二周后，鐘形細(xì)胞核以各器官 所特有的方式在三維空間中規(guī)則分布。
圖13A顯示由~ 10。/o總DNA含量凝聚成圍繞在球形或略橢圓形細(xì) 胞核的長軸的"帶"。圖13B顯示這樣的細(xì)胞核其中兩條濃縮細(xì)胞核 "帶"看起來是分離的但仍是單一細(xì)胞核的一部分。圖13C顯示看來 像是由圖13B的兩條帶細(xì)胞核分裂產(chǎn)生的一對細(xì)胞核。圖13D顯示每 個(gè)合胞體包含一組鐘形物，同圖13C —樣，單對鐘形物在其線性中點(diǎn) 處，且開口相對。這些圖像表明一系列對稱分裂形成自中心對推開的 細(xì)胞核。在各組中4全測到的合胞體結(jié)構(gòu)與四個(gè)鐘形細(xì)胞核大小相當(dāng)。
在癌發(fā)生的細(xì)胞核形態(tài)型的研究中，在結(jié)腸腺瘤(圖14A)和腺 癌(圖14B)中有少數(shù)細(xì)胞核顯示相似的帶_ 一條或者兩條圍繞橢圓形 細(xì)胞核的長軸。該發(fā)現(xiàn)證實(shí)并進(jìn)一步支持了一般假說，該一般假說為 腫瘤形成同樣具有所存在的個(gè)體發(fā)育的很多關(guān)鍵表型轉(zhuǎn)換步驟，不過， 出現(xiàn)的順序相反。
人類著絲粒的特異FISH染色
事實(shí)上合胞體外的鐘形細(xì)胞核包含人類DNA。胎兒樣本中，大多 數(shù)的著絲粒與鐘形細(xì)胞核開口處的凝聚DNA區(qū)域相關(guān)。有趣地，標(biāo)準(zhǔn) 的FISH方法不能對合胞體內(nèi)的鐘形或者其他形狀的細(xì)胞核染色，這表 明含有收縮元件的合胞體鞘膜可阻止FISH試劑的進(jìn)入。圖15顯示人 12周胎兒結(jié)腸組織的球形(圖15A)、"雪茄"形(圖15B)和鐘形(圖15C) 細(xì)胞核的著絲粒(綠色)。也觀察到姐妹細(xì)胞核的DNA含量等同于胎兒無絲分裂的鐘形細(xì)胞 核，但是在多組織來源的人類胂瘤鐘形細(xì)胞核的無絲分裂中，它們表 現(xiàn)出顯著程度的不相等DNA分離。雖然沒有在結(jié)腸胂瘤發(fā)生前的息肉 的中性細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)無絲分裂的實(shí)例，但注意到每個(gè)息肉中發(fā)現(xiàn)的幾 十個(gè)鐘形細(xì)胞核中DNA含量的明顯分散，表明不相等的DNA分離是 在胂瘤前期和瘤形成中而不在胎兒的鐘形細(xì)胞核分裂中起作用的現(xiàn) 象。這些觀察結(jié)果支持了 Virchow和Cohnheim的肺瘤組織和胚胎組織 具有相似的組織學(xué)特點(diǎn)這一觀察結(jié)果，同時(shí)還支持Boveri的有絲分裂 中的胂瘤細(xì)胞顯示出大部分所有胂瘤細(xì)胞所共有的畸變?nèi)旧w這一觀 察結(jié)果-表明在不穩(wěn)定的染色體形成或者分離中有較早的共有來源。
小鼠中的細(xì)胞核形態(tài)
尤其包括鐘形細(xì)胞核在內(nèi)的所有不同形式的細(xì)胞核，在形態(tài)上幾 乎與圖13A-D相同的前合胞體和合胞體形式發(fā)現(xiàn)于小鼠胎兒組織中， 且前合胞體形式最初發(fā)現(xiàn)于12.5天，然后發(fā)現(xiàn)于與小鼠胎兒中器官確 定期相密切對應(yīng)的14.5-16.5天?？紤]到在人中的觀察結(jié)果，在小鼠中 的這些發(fā)現(xiàn)并不令人吃驚，但是它們?yōu)樵诜侨祟愇锓N器官發(fā)生研究的 可能性開辟了一個(gè)廣闊領(lǐng)域，而該器官發(fā)生研究在人類中不是倫理或 合理的。
在高質(zhì)量固定的第五到第十六周妊娠的胎兒丟棄樣本中，合胞體 已不明顯但是鐘形細(xì)胞核卻在全部發(fā)育的器官中以規(guī)律的模式分布。
實(shí)施例3
對原始消化管的大量合胞體和鐘形細(xì)胞核應(yīng)用 一 系列組織化學(xué)方 法，包括用來確定染色體及染色體元件、各種收縮分子(例如肌動(dòng)蛋 白)及其他包括通常被稱為"干細(xì)胞標(biāo)記"在內(nèi)的可鑒定標(biāo)記的位置 的FISH。本文描述的技術(shù)用來利用ZEISS-P.A丄.M.顯微解剖儀器完成 收集合胞體和個(gè)體細(xì)胞核的工作。成功的標(biāo)準(zhǔn)在于收集到一系列在合 月包體形式和細(xì)力包核形態(tài)型方面均一、數(shù)目等于或大于10,000個(gè)細(xì)胞核 等同物的樣本，該數(shù)目足以對細(xì)胞mRNA、最常見的蛋白質(zhì)和糖胺聚 糖進(jìn)行掃描。
盡管本發(fā)明已經(jīng)參照其優(yōu)選的實(shí)施方案特別示出并得到描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不背離本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍下，可在形式和細(xì)節(jié)方面作出各種改變。
權(quán)利要求
1. 抑制腫瘤干細(xì)胞的方法，包括利用對腫瘤干細(xì)胞特異分子進(jìn)行化學(xué)修飾的試劑或處理來靶向所述腫瘤干細(xì)胞，從而阻止腫瘤干細(xì)胞的增殖。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤干細(xì)胞特異分子被合成并分 離入子代鐘形細(xì)胞核。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤干細(xì)胞特異分子是單鏈 DNA(ssDNA)。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述試劑是化學(xué)試劑。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是酶。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述處理是輻射。
7. 抑制患者腫瘤生長的方法，包括利用對腫瘤干細(xì)胞特異分子進(jìn) 行化學(xué)修飾的試劑或處理來耙向所述患者的腫瘤干細(xì)胞，從而阻止腫 瘤干細(xì)胞的增殖。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述腫瘤干細(xì)胞特異分子被合成并分 離入子代鐘形細(xì)胞核。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述腫瘤干細(xì)胞特異分子是單鏈 DNA(ssDNA)。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述試劑是化學(xué)試劑。
11. 權(quán)利要求7的方法，其中所述試劑是酶。
12. 權(quán)利要求7的方法，其中所迷處理為輻射。
全文摘要
本文描述的是抑制腫瘤生長的方法，包括利用在化學(xué)性質(zhì)上改變腫瘤干細(xì)胞特異分子的試劑或處理來靶向患者的腫瘤干細(xì)胞，從而阻止腫瘤干細(xì)胞的增殖。
文檔編號A61K45/06GK101426903SQ200680052588
公開日2009年5月6日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者E·V·戈斯特杰瓦, W·G·蒂利 申請人:麻省理工學(xué)院