專利名稱：：使用產(chǎn)后衍生細(xì)胞治療外周血管疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：干細(xì)胞技術(shù)治療潛力的實(shí)現(xiàn)的一個(gè)阻礙一直是獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞有困難。胚胎組織或胎兒組織是干細(xì)胞的一個(gè)來(lái)源。已從多種哺乳動(dòng)物物種(包括人類)分離了胚胎干細(xì)胞和祖細(xì)胞，有幾種這種細(xì)胞類型已被證實(shí)能夠自我更新和擴(kuò)展以及分化成多種不同的細(xì)胞譜系。但從胚胎或胎兒來(lái)源衍生千細(xì)胞已引起了許多倫理和道德問(wèn)題，這些問(wèn)題需要通過(guò)鑒定其它來(lái)源的多能(multipotent)或多潛能(pluripotent)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行避免。產(chǎn)后組織如臍帶和胎盤作為千細(xì)胞的另選來(lái)源已引起人們興趣。例如，已描述了通過(guò)胎盤的灌注或從臍帶血或組織進(jìn)行的收集來(lái)回收干細(xì)胞的方法。從這些方法獲取干細(xì)胞的限制因素一直是所獲得的臍帶血體積或細(xì)胞數(shù)量不足，還有從這些來(lái)源獲得的細(xì)胞群體存在異質(zhì)性或缺乏表征。具有分化成一批(anarrayof)骨骼肌鐠系、周細(xì)胞譜系或血管譜系的能力的基本上均質(zhì)的這種細(xì)胞群體，如能得到可靠的、良好表征的和充裕的供應(yīng)，在以下各種診斷性和治療性應(yīng)用中將會(huì)是有利的骨骼肌修復(fù)、再生和改善，血管發(fā)生的刺激和/或支持，和外周缺血事件后血流的改善，特別是在PVD患者中。發(fā)明概述在所述方法的一些實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞與至少一種其他細(xì)胞類型一起給予，該其他細(xì)胞類型可包括骨骼肌細(xì)胞、骨骼肌祖細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌祖細(xì)胞、周細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞或者其他多潛能(multipotent)或多能(pluripotent)干細(xì)胞。該其他細(xì)胞類型可以在給予產(chǎn)后衍生細(xì)胞的同時(shí)或之前或之后給予。0015]其他實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞與至少一種其他藥物一起給予，該其他藥物可以是例如抗血栓形成劑、抗炎劑、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、促生血管劑或抗細(xì)胞凋亡劑。該其他藥物可以在給予產(chǎn)后衍生細(xì)胞的同時(shí)或之前或之后給予。為。敏^是由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一次或多次亞培養(yǎng)形成的細(xì)胞群體。每輪亞培養(yǎng)稱為傳/七。當(dāng),細(xì)胞被亞培養(yǎng)時(shí)，它們被稱為已被傳A。細(xì)胞的具體群體或細(xì)胞系有時(shí)由它們被傳代的次數(shù)來(lái)指稱或表征。例如，已被傳代十次的培養(yǎng)的細(xì)胞群體可稱為P川培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即細(xì)胞從組織分離后的第一次培養(yǎng)物，指定為P0。在第一次亞培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為二代培養(yǎng)物(P1或傳代1)。第二次亞培養(yǎng)后，細(xì)胞變成三代培養(yǎng)物(P2或傳代2)，依此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在傳代期間可能有許多次群體倍增；因此培養(yǎng)物的群體倍增次數(shù)大于傳代次數(shù)。細(xì)胞在各次傳代之間的期間的擴(kuò)展(即群體倍增的次數(shù))取決于多個(gè)因素，包括但不限于接種密度、底物、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件和各次傳代之間的時(shí)間。務(wù)伴潛券差是特定的細(xì)胞或細(xì)胞群體已在其中進(jìn)行了培養(yǎng)且然后細(xì)胞被除去的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)基指培養(yǎng)時(shí)，它們會(huì)分泌出能給其他細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持的細(xì)胞因子(cellularfactor)。這種營(yíng)養(yǎng)因子包括但不限于激素、細(xì)胞因子(cytokine)、胞外基質(zhì)(ECM)、蛋白質(zhì)、嚢泡、抗體和顆粒體。含有細(xì)胞因子(cellularfactor)的培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。通常，營(yíng)#茵7定義為能促進(jìn)細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、增殖和/或成熟或者刺激細(xì)胞活性增加的物質(zhì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常指足夠用于培養(yǎng)產(chǎn)后衍生細(xì)胞的培養(yǎng)基。具體的說(shuō)，一種目前優(yōu)選的用于培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)胞的培養(yǎng)基包括Dulbecco改進(jìn)的必需培養(yǎng)基(DMEM)。特別優(yōu)選的是低葡萄糖DMEM(DMEM-LG)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。DMEM-LG優(yōu)選補(bǔ)充有血清，最優(yōu)選補(bǔ)充有胎牛血清或人血清。通常，力。入15。/。(v/v)胎牛血清(例如確定成分的(defined)胎牛血清，Hyclone，LoganUT)，以及抗生素/抗真菌素((優(yōu)選100單位/毫升青霉素、100毫克/毫升鏈霉素和0.25微克/毫升兩性霉素B;Invitrogen，Carlsbad,CA))和0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.LouisMO)。在一些情況中，使用不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或者提供不同的補(bǔ)充物，這些補(bǔ)充物通常在教科書中被指出為生長(zhǎng)培養(yǎng)基的補(bǔ)充物。在某些化學(xué)上確定成分的培養(yǎng)基(chemically-definedmedia)中，細(xì)胞可在完全不存在血清下生長(zhǎng)。在這種情況下，細(xì)胞可能需要某些生長(zhǎng)因子，可將這些生長(zhǎng)因子加到培養(yǎng)基中來(lái)支持和維持細(xì)胞。目前優(yōu)選的為在無(wú)血清培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而加入的因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一個(gè)或多個(gè)。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，向無(wú)血清或化學(xué)上確定成分的培養(yǎng)基加入其中兩種、三種或所有四種因子。在其他實(shí)施方案中，向無(wú)血清培養(yǎng)基加入LIF以支持或改善細(xì)胞的生長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)省—放#是指能有效實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)結(jié)果的本文所述化合物、材料或組合物的濃度或數(shù)量。這種結(jié)果包括但不限于骨骼組織的再生、修復(fù)或改善，血流的改善和/或外周缺血患者中的血管發(fā)生的刺激和/或支持。這種有效活性可例如通過(guò)將本發(fā)明的細(xì)胞和/或組合物給予外周缺血患者來(lái)達(dá)到。對(duì)于體內(nèi)給予患者的PPDCs，有效量可從少至幾百個(gè)或更少到多至幾百萬(wàn)個(gè)或更多。在具體的實(shí)施方案中，有效量可為103-10"個(gè)，更具體的說(shuō)至少約104個(gè)細(xì)胞。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，待給予的細(xì)胞數(shù)量要根據(jù)待治療的疾病的具體情況而變，這些具體情況包括但不限于待治療的大小或總體積/表面積、給藥部位與待治療區(qū)域的位置的接近程度，以及醫(yī)學(xué)生物技術(shù)人員熟知的其他因素。術(shù)語(yǔ)治#(名詞或動(dòng)詞)是指損傷、病理或病癥的減輕或改善上的任何成功或成功標(biāo)志，包括任何客觀或主觀的參數(shù)如癥狀的消除、免除、減少，或者使損傷、病理或病癥更可被患者耐受，減慢衰退或衰落的速度，使衰退的終點(diǎn)沒(méi)那么使人虛弱，改善受試者的身體或精神康樂(lè)或者延長(zhǎng)存活時(shí)間長(zhǎng)度。癥狀的治療或改善可基于客觀或主觀的參數(shù)；包括身體檢查、神經(jīng)學(xué)檢查和/或精神病學(xué)評(píng)估的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)l效癤(^戈#/切和省—妓^斧是指某藥物或藥物組合物實(shí)現(xiàn)其預(yù)定結(jié)果所必需或優(yōu)選的時(shí)間長(zhǎng)度或其他可控制條件(例如對(duì)于體外方法來(lái)說(shuō)溫度、濕度)。；0046術(shù)語(yǔ),悉^^或^試4^在本文中可互用，指的是用本文描述的藥物或治療性組合物或者按照本文描述的方法治療的動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人類。0047^^^A是指由血管系統(tǒng)的任何收縮或梗阻引起的向任何身體器官、組織或部分的血液供應(yīng)的任何下降或停止。^命凝j&發(fā)/汽ischemicepisode)或局命凝J^^^(ischemicevent)在本文沖旨可互用，指的是短暫時(shí)間或持久時(shí)間的局部缺血?！﹙^局率凝A是指由血管系統(tǒng)的任何收縮或梗阻引起的向心臟除外的任何身體器官、組織或部分的血液供應(yīng)的任何下降或停止。f疾4是指心臟和大腦外部的血管的疾病。它通常涉及到將血液攜帶到末端的血管的窄化，是由兩種類型的循環(huán)疾病產(chǎn)生，即(l)功能性外周血管疾病，它涉及到能使血管窄化的短期痙攣；和(2)器官性外周血管疾病，它涉及到血管中的例如由炎癥或脂肪堵塞引起的結(jié)構(gòu)變化。0048術(shù)語(yǔ)秀務(wù)了凝^的4'傳減^h^T與術(shù)語(yǔ)^參一《容的戎伴減介v^互用，是指這樣的試劑、細(xì)胞、化合物、材料、組合物和/或劑型，它們不僅與待治療性給予的細(xì)胞和其他藥物相容，而且在可靠的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)還適合用于與人或動(dòng)物的組織相接觸而又沒(méi)有過(guò)度的毒性、刺激、過(guò)壽文反應(yīng)或與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的其他并發(fā)癥。適用于本發(fā)明的藥物可接受的載體包括液體、半固體(例如凝膠)和固體材料(例如細(xì)胞支架和基質(zhì)、管材片材和本領(lǐng)域所公知的和本文所更詳細(xì)描述的其他這種材料)，這在本文會(huì)更詳細(xì)描述到。這些半固體和固體材料可設(shè)計(jì)成能在身體當(dāng)中抵杭降解(#^參^^"席^),或者它們可設(shè)計(jì)成在能身體當(dāng)中降解(i^T舉席W、^參T侵^W)。生物可降解材料還可以是蘭參了岸^炎錄或j游了效嫂即它可以溶解和吸收到體液中(水溶性植入物是一個(gè)實(shí)例)，或者通過(guò)轉(zhuǎn)化成其他材料或分解并經(jīng)由天然途徑排除而發(fā)生降解并最終從身體排除。一旦植入到身體中，生物降解速度可根據(jù)所需的釋放速度來(lái)改變。基質(zhì)如有需要還可充當(dāng)臨時(shí)支架，直到被新生長(zhǎng)的骨骼肌、周細(xì)胞、血管平滑肌或血管內(nèi)皮組織代替。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)能提供與產(chǎn)后衍生細(xì)胞一起使用的其他藥物的緩釋，且可為患者的發(fā)育中的組織生長(zhǎng)提供結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，基質(zhì)僅僅是為發(fā)育中的組織提供臨時(shí)支架。基質(zhì)可以為顆粒形式(直徑大于1(^鼓米的大顆粒和直徑小于IO微米的小顆粒)，或者可以為結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定的三維植入物(例如支架)的形式。植入物可以是例如立方體、圓柱體、管體、塊體、膜體、片體或適當(dāng)?shù)慕馄蕦W(xué)形式。0049本文使用到幾個(gè)涉及細(xì)胞或組織移植的術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)々傳源移(W。/ogOWS加"S，」、々糸源移孩巾Mto/ogOWSfra"^/""toto^、^7傳移孩^^ogra々」等是指其中移植供體也是移植受體的移植。術(shù)語(yǔ)^7神謬差西脊移fa〃oge"e/cfrara/e小^并并差^移楦fa〃oge"dcframp/a"to〃cw」、/^^V^謬移控(^〃ogra々」等是指其中移植供體與移植受體同物種但不是該受體的移植。其中供體細(xì)胞已與受體進(jìn)ra"s，)。術(shù)語(yǔ)；^神脊移"e"oge"g/c的my^"」、T^神移茲(3ce"oge"dcfra"^/朋to"o"j、力s移孩(^"ogra力等是指其中移植供體與移植受體不同物種的移植。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將產(chǎn)后組織分離成包含組織的各個(gè)方面(aspect)的切片，所述各個(gè)方面例如是胎盤的新生兒方面、新生兒/母體方面和母體方面。分離到的切片然后按照本文描述的方法通過(guò)機(jī)械和/或酶解離法進(jìn)行解離。新生兒或母體譜系的細(xì)胞可通過(guò)任何本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行鑒定，例如通過(guò)針對(duì)Y染色體的核型分析或原位雜交來(lái)鑒定。PPDCs從中衍生的分離的細(xì)胞或者產(chǎn)后組織可用來(lái)引發(fā)或接種細(xì)胞培養(yǎng)物。將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌組織培養(yǎng)容器中，該容器沒(méi)有包被或包被有胞外基質(zhì)或配體如層粘連蛋白、膠原(天然的、變性的或交聯(lián)的)、明膠、纖連蛋白和其他胞外基質(zhì)蛋白。將PPDCs在任何能夠維持細(xì)胞的生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基例如但不限于DMEM(高葡萄糖或的葡萄糖)、高級(jí)DMEM、DMEM/MCDB201、Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Ham，sF10培養(yǎng)基(F10)、Ham，sF-12培養(yǎng)基(F12)、Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基、間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI1640和以商標(biāo)CELL-GRO-FREE(Mediatch,Inc.,Herndon,VA)出售的無(wú)血清/介質(zhì)培養(yǎng)基(serum/mediafreemedium)。培養(yǎng)基可補(bǔ)充有一種或多種成分，包括例如胎牛血清(FBS),優(yōu)選約2-15%(v/v);馬血清(ES);人血清(HS);(3-巰基乙醇(BME或2-ME),優(yōu)選約0.001%(v/v);—種或多種生長(zhǎng)因子，例如血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO);氨基酸，包括L-纈氨酸；和一種或多種抗生素和/或抗真菌劑以控制微生物污染，如青霉素G、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素和制霉菌素，這些成分可單獨(dú)或組合補(bǔ)充。培養(yǎng)基優(yōu)選包含下文實(shí)施例中所定義的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。0056將細(xì)胞以能讓細(xì)胞生長(zhǎng)的密度接種在培養(yǎng)容器中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞在空氣中約0至約5%(體積)C02下進(jìn)行培養(yǎng)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞在空氣中約2至約25%(體積)02下進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選在空氣中約5至約20%(體積)02下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞優(yōu)選在約25至約40°C的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，更優(yōu)選在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞優(yōu)選在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基可以是靜止的或攪動(dòng)的，或者例如用生物反應(yīng)器進(jìn)行攪動(dòng)。PPDCs優(yōu)選在低氧化應(yīng)激(例如添加有谷胱甘肽、維生素C、過(guò)氧化氫酶、維生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生長(zhǎng)。本文所用的"低氧化應(yīng)激"是指沒(méi)有對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞的自由基損害或損害極小的條件。PPDCs可進(jìn)行冷藏。因此，在下文更詳細(xì)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中，可在孩子出生后從適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)后組織得到自體同源轉(zhuǎn)移用的PPDCs(供母親或孩子用)，然后冷藏；以便在以后需要它們進(jìn)行移植時(shí)可以進(jìn)行使用。在各個(gè)實(shí)施方案中，PPDCs具有以下生長(zhǎng)特征中的一個(gè)或多個(gè)(l)它們需要L-纈氨酸用于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)；(2)它們能夠在含有約5%到至少約20%的氧的氣氛中生長(zhǎng)；(3)它們具有在達(dá)到衰老之前在培養(yǎng)中倍增至少約40次的潛力:；，和(4)它們能在包被或未包被的組織培養(yǎng)容器上貼壁和擴(kuò)展，其中包被的組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、聚鳥(niǎo)氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的包被層。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，PPDCs可通過(guò)基因表達(dá)來(lái)表征，即相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，編碼以下物質(zhì)中的至少一個(gè)的基因的基因表達(dá)減少矮身材同源框2;熱激27kDa蛋白2;趨化因子(C-X-C模體)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l);彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄、Williams-Beure綜合征)；人類mRNA;cDNADKFZp586M2022(來(lái)自克隆DKFZp586M2022);間充質(zhì)同源框2(生長(zhǎng)停滯特異性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蠅)；晶狀體蛋白，aB;形態(tài)發(fā)生2的凌亂締合激活劑(disheveledassociatedactivator);DKFZP586B2420蛋白；類似于neuralin1;四連蛋白(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；膽固醇25-羥化酶；矮子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-3;白細(xì)胞介素ll受體，a;前膠原C肽鏈內(nèi)切酶增強(qiáng)子；巻曲同源物7(果蠅)；假擬基因BC008967;膠原，VIII型，a1;生腱蛋白C(結(jié)合腕蛋白)；易洛魁族人同源框蛋白5;hephaestin;整聯(lián)蛋白，(38;突觸小泡糖蛋白2;成神經(jīng)細(xì)胞瘤，致瘤性1的抑制；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2，36kDa;人類cDNAFLJ12280fis,克隆MAMMA1001744;細(xì)月包因子受體樣因子1;鉀中等/小電導(dǎo)率釣激活通道，亞家族N,成員4;整聯(lián)蛋白，(37;帶PDZ結(jié)合才莫體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);sineoculis同源框同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白；小泡相關(guān)膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF纖蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1;早期生長(zhǎng)應(yīng)答3;distal-less同源框5;假擬蛋白FLJ20373;醛-酮還原酶家族1,成員C3(3-a羥基類固醇脫氫酶，II型)；雙糖鏈蛋白聚糖；帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);纖連蛋白1;腦啡肽原；整聯(lián)蛋白，卩樣l(帶EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；人類mRNA全長(zhǎng)插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422;EphA3;KIAA0367蛋白；鈉尿肽受體C/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C(心房鈉尿肽受體C);假擬蛋白FLJ14054;人類mRNA;cDNADKFZp564B222(來(lái)自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣；AE結(jié)合蛋白1;細(xì)胞色素c氧化酶亞單位VIIa多肽l(肌肉)。在其他實(shí)施方案中，PPDCs可由MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB國(guó)EGF、BDNF、TPO、MIPla、RANTES、andTIMP1中的至少一個(gè)的分泌來(lái)表征。在一些實(shí)施方案中，PPDCs可由TGF-(32、ANG2、PDGFbb、MIPlb、1309、MDC和VEGF中的至少一個(gè)的分泌的缺乏(通過(guò)ELISA^r測(cè))來(lái)表征。某些具有沿著譜系分化而導(dǎo)致產(chǎn)生各種表現(xiàn)型的潛力的細(xì)胞是不穩(wěn)定的，因此會(huì)自發(fā)分化。目前優(yōu)選用于本發(fā)明的是不會(huì)例如沿著成肌細(xì)胞、骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞、成血管細(xì)胞系、生血管纟田月包系(angiogeniclines)、生血管纟田月包系(vasculogeniclines)或血管內(nèi)皮細(xì)胞系自發(fā)分化的細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞當(dāng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，就其表面上產(chǎn)生的細(xì)胞標(biāo)志而言和就各種基因的表達(dá)模式而言基本上是穩(wěn)定的，這些例如是使用以商標(biāo)GENECHIP(Affymetrix，Inc.,SantaClara，CA)出售的醫(yī)療診斷試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定的。經(jīng)過(guò)多次群體倍增，細(xì)胞例如在傳代過(guò)程中其表面標(biāo)志特性方面仍保持基本恒定。本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了上述的PPDCs群體的用途。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群體是異質(zhì)的(heterogeneous)。本發(fā)明的異質(zhì)細(xì)胞群體可包含至少約5%、10°/。、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的本發(fā)明PPDCs。本發(fā)明的異質(zhì)細(xì)胞群體還可包含干細(xì)胞或其他祖細(xì)胞，如成肌細(xì)胞或其他肌肉祖細(xì)胞、成血管細(xì)胞或血管前體細(xì)胞，或者它還可包含完全分化的骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，群體基本上是同質(zhì)的(homogeneous),也就是說(shuō)基本上只包含PPDCs(優(yōu)選至少約96%、97%、98°/o、99%或更多的PPDCs)。本發(fā)明的同質(zhì)細(xì)胞群體可包含臍帶或胎盤衍生的細(xì)胞。臍帶衍生細(xì)胞的同質(zhì)群體優(yōu)選沒(méi)有母體譜系的細(xì)胞。胎盤衍生細(xì)胞的同質(zhì)群體可為新生兒譜系或母體譜系。細(xì)胞群體的同質(zhì)性可通過(guò)任何本領(lǐng)域公知的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)細(xì)胞分選(例如流式細(xì)胞術(shù))或者通過(guò)按已知方法進(jìn)行克隆擴(kuò)展實(shí)現(xiàn)。因此，優(yōu)選的同質(zhì)PPDC群體可包含產(chǎn)后衍生細(xì)胞的克隆細(xì)胞系。當(dāng)分離到具有高度適需的功能性的細(xì)胞克隆時(shí)，這種群體特別有用。在引入了外來(lái)DNA后，可讓工程改造過(guò)的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)到選擇性培養(yǎng)基。外來(lái)DNA中的選擇性標(biāo)志賦予對(duì)選擇的抗性，能讓細(xì)胞將例如在質(zhì)粒上的外來(lái)DNA穩(wěn)定整合到它們的染色體中并生長(zhǎng)形成灶(foci)，而后者可進(jìn)行克隆和擴(kuò)展成細(xì)胞系。這個(gè)方法可有利地用來(lái)對(duì)能表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞系進(jìn)行工程改造。在其他方面，本發(fā)明利用到從PPDCs制備的細(xì)胞裂解物和細(xì)胞可溶性級(jí)份，或者包含PPDCs的異質(zhì)或同質(zhì)細(xì)胞群體，以及已進(jìn)行遺傳修飾或已進(jìn)行刺激以沿著骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮途徑分化的PPDCs或其群體。這種裂解物及其級(jí)份具有許多用途。PPDC裂解物可溶性級(jí)份(即基本上沒(méi)有膜)在體內(nèi)的使用，例如能讓有益的胞內(nèi)環(huán)境以同種異基因方式(allogeneically)在患者中得到使用，而不會(huì)引入明顯數(shù)量的很可能會(huì)引發(fā)排斥或其他不利免疫應(yīng)答的細(xì)胞表面蛋白。裂解細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，包括各種方式的機(jī)械破壞、酶破壞或化學(xué)破壞或它們的組合。這種細(xì)胞裂解物可從直接在其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞制備，因此含有分泌的生長(zhǎng)因子等，或者可從在例如PBS或其他溶液中洗滌而沒(méi)有了培養(yǎng)基的細(xì)胞制備。洗滌過(guò)的細(xì)胞可以大于原始群體密度的濃度進(jìn)行再懸浮，如果這優(yōu)選的話。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如通過(guò)破壞細(xì)胞而又不隨后將細(xì)胞級(jí)份分離來(lái)制備完全細(xì)胞裂解物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法例如離心、過(guò)濾或類似的方法，使細(xì)胞膜級(jí)份與細(xì)胞的可溶性級(jí)份相分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將通過(guò)在液體、固體或半固體基材上培養(yǎng)PPDCs產(chǎn)生的胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行制備、收集，并作為對(duì)將活細(xì)胞植入到需要組織修復(fù)或置換的受試者中的替代進(jìn)行使用。將PPDCs在本文別處描述的三維骨架(framework)上在能使得所需量的ECM被分泌到骨架上的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。將構(gòu)成新組織的細(xì)胞除去，ECM加工成例如可注射制品供往后使用。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將骨架上的細(xì)胞殺死，從支架除去任何細(xì)胞碎片。這個(gè)方法可按多種不同方式進(jìn)行。例如，可將活組織在沒(méi)有冷凍保護(hù)劑下在液氮中快速冷凍，或者可將組織浸入無(wú)菌蒸餾水中，使得因滲透壓破裂。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供利用PPDCs、PPDC群體、成分和PPDCs的產(chǎn)物的藥物組合物于治療由外周局部缺血發(fā)作引起的損失或損害的各種方法中。某些實(shí)施方案涵蓋包含活細(xì)胞(單獨(dú)的PPDCs或與其他細(xì)胞類型混合)的藥物組合物。其他的實(shí)施方案涵蓋包含PPDC細(xì)胞成分(例如細(xì)胞裂解物、可溶性細(xì)胞級(jí)份、條件培養(yǎng)基、ECM或任何前述者的成分)或產(chǎn)物(例如由PPDCs天然產(chǎn)生或通過(guò)遺傳修飾產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子和其他生物因子、PPDC培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基)的藥物組合物。在任一情況中，藥物組合物都可還包含本領(lǐng)域公知的其他活性物質(zhì)，如抗炎劑、抗細(xì)胞凋亡劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子、肌肉營(yíng)養(yǎng)因子或肌肉再生或肌肉保護(hù)藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將不同種類的可降解凝膠和網(wǎng)絡(luò)(network)用于本發(fā)明的藥物組合物。例如，特別適合于緩釋制劑的可降解材料包括生物相容性聚合物，如聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、曱基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原等?？山到饩酆衔锏慕Y(jié)構(gòu)、選擇和在藥物遞送介質(zhì)中的用途在幾個(gè)出版物中已有綜述，包括A.DombWa/.,1992，戶o/戸eray^y^rawcedZ"ec/^o/og/es3:279。在其他的實(shí)施方案中，可能需要或適宜將細(xì)胞在生物可降或基質(zhì)中進(jìn)行遞送。這些通常三維的生物材料含有貼附到支架、M在支架當(dāng)中或者摻入到包埋在支架中的胞外基質(zhì)中的活細(xì)胞。這些植入物一旦植入到身體的靶區(qū)域，就變得與宿主組織成為一體，其中移植細(xì)胞逐漸建立起來(lái)(參見(jiàn)例如Tresco,PA,"a/.(2000)出處同上；令參見(jiàn)Hutmacher,DW(2001)5W.尸oiywer12:107-174)。PPDCs、PPDCs的部分、或者包含PPDCs的細(xì)胞群體、或者PPDCs的成分或PPDCs產(chǎn)生的產(chǎn)物可按多種方式進(jìn)行使用，以支持和促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞和組織的修飾、再生和改善，改善血流，和刺激和/或支持血管發(fā)生，特別是在外周血管疾病患者中。這種用途涵蓋體夕卜(/wv"ra)、先體夕卜后體內(nèi)(exWvo)和體內(nèi)v/vo)方法。可與PPDCs—起給予的其他成分的實(shí)例包括但不限于(l)其他生血管因子、生血管藥物或者肌肉再生或肌肉保護(hù)因子或藥物；(2)挑選的胞外基質(zhì)成分，如一種或多種類型的本領(lǐng)域公知膠原，和/或生長(zhǎng)因子、富含血小板的血漿和藥物(或者，PPDCs可進(jìn)行遺傳工程改造以表達(dá)和產(chǎn)生生長(zhǎng)因子)；(3)抗細(xì)胞凋亡劑(例如促紅細(xì)胞生產(chǎn)素(EPO)、EPO模擬抗體、血小板生成素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-I、IGF-II、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胱冬酶抑制劑)；(4)抗炎化合物(例如p38MAP激酶抑制劑、TGF-(3抑制劑、抑制素、IL-6和IL-1抑制劑、吡嘧司特、曲尼司特、Remicade(Centocor，Inc.,Malvern，PA)、西羅莫司和非甾體抗炎藥(NSAIDS)(如替泊沙林、托美丁和Suprafen);(5)免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑，如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、mTOR抑制劑、抗增殖劑、皮質(zhì)類固醇和各種抗體；(6)抗氧化劑如普羅布考、維生素C和E、輔酶Q-IO、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸和(6)局部麻醉劑，Y義舉l丈例。本發(fā)明的細(xì)胞可進(jìn)行外科手術(shù)植入、注射、遞送(例如通過(guò)導(dǎo)管、注射器、分流器(shunt)、固定模(stent)、微導(dǎo)管或泵)，或者以別的方式直接或間接給予局部缺血損傷、損害或損壞部位。本發(fā)明細(xì)胞或其組合物的給予途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、鞘內(nèi)、池內(nèi)途徑，或者通過(guò)帶針頭的注射器或者帶或不帶泵裝置的導(dǎo)管。其他實(shí)施方案涵蓋通過(guò)給予這樣的治療用組合物來(lái)治療外周局部缺血損傷或損害的方法，威治療用組合物包含藥物可接受的載體和PPDC細(xì)胞成分(例如細(xì)胞裂解物或其成分)或產(chǎn)物(例如由PPDCs天然產(chǎn)生或通過(guò)遺傳修飾產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子或其他生物因子、來(lái)自PPDC培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基)或者PPDC生長(zhǎng)培養(yǎng)基或從生長(zhǎng)培養(yǎng)基純化的產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物因子是FGF和HGF。這些方法還可包括給予本領(lǐng)域公知的其他活性藥物，如生長(zhǎng)因子、生血管因子或者肌肉再生或肌肉保護(hù)藥物。用以給予PPDCs和本文描述的任何其他治療用組合物或藥物組合物的劑型和方案，是按照良好醫(yī)療規(guī)范來(lái)進(jìn)行開(kāi)發(fā)，開(kāi)發(fā)時(shí)要考慮個(gè)體患者的情況，例如外周局部缺血事件所致?lián)p傷或損害的性質(zhì)和程度、年齡、性別、體重和一般醫(yī)學(xué)狀況，以及執(zhí)業(yè)醫(yī)生公知的其他因素。因此，要給予患者的藥,組合物的有效量是由本領(lǐng)域公知的這些考慮因素來(lái)確定。已證實(shí)PPDCs在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中不能刺激異基因PBMCs。因此，在一些情況中用異基因乃至異種PPDCs進(jìn)行的移植是可以容忍的。在一些實(shí)施方案中，PPDCs本身能提供免疫抑制作用，從而防止宿主對(duì)移植的PPDCs的排斥。在這種情況中，可能不需要在細(xì)胞治療過(guò)程中進(jìn)行藥理學(xué)免疫抑制。以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明而不是限制本文描述的本發(fā)明各個(gè)方面。實(shí)施例1臍帶衍生的產(chǎn)后細(xì)胞在鼠后肢外周局部缺血模型中的功效材料和方法排除標(biāo)準(zhǔn)在注射前，將在外科手術(shù)后1天顯示嚴(yán)重的腳趾壞死的小鼠排除出研究。小鼠在研究中的任何時(shí)間如出現(xiàn)嚴(yán)重壞死(例如足部全部壞死)或者經(jīng)歷嚴(yán)重的體重減少或另外顯示極端痛苦的跡象，也都被排除掉。結(jié)果這些實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是測(cè)定UDCs在嚙齒動(dòng)物后肢局部缺血模型中是否能保護(hù)組織免受損傷。這個(gè)模型是通過(guò)在股動(dòng)脈血流中造成損傷和在損傷后大約24小時(shí)在該區(qū)域注射細(xì)胞進(jìn)行的。結(jié)果是通過(guò)估計(jì)這些動(dòng)物的肢體的灌注情況并將這一情況與沒(méi)有注射的對(duì)側(cè)肢體進(jìn)行比豐支來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在研究結(jié)束時(shí)還從這些動(dòng)物收集組織，以評(píng)估動(dòng)物的血管系統(tǒng)和損傷情況。這個(gè)研究也是用人細(xì)胞在棵鼠中進(jìn)行，以避免植入的細(xì)胞的異種排斥。圖l給出的結(jié)果顯示UDCs給小鼠賦予了好處，因?yàn)樵诘?天和第8天用培養(yǎng)的細(xì)胞處理的動(dòng)物中灌注情況有改善，而在第8天用臨注射前解凍的120304細(xì)胞處理的動(dòng)物中血流也有改善。細(xì)胞072804A在任何時(shí)間點(diǎn)都不顯示益處，這提示這兩批細(xì)胞存在差異。一般地，動(dòng)物隨著時(shí)間的推移顯示出改善，這表明這個(gè)品系的動(dòng)物具有一定程度的天然修復(fù)能力。這些動(dòng)物也相對(duì)較年輕，這可能是它們天生再生能力方面的一個(gè)因素。將生長(zhǎng)活躍的產(chǎn)后細(xì)胞用胰蛋白酶處理，計(jì)數(shù)，接種到COSTARTRANSWELL6.5毫米直徑組織培養(yǎng)嵌塊(Coming，Coming,NY)上，每嵌塊15,000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在嵌塊上在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)條件下37。C培養(yǎng)48-72小時(shí)。0147人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)hMSCs購(gòu)自Cambrex(Walkersville，MD),在MSCGM(Cambrex)中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)物是在標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行溫育。0148]將生長(zhǎng)活躍的MSCs用胰蛋白酶處理，計(jì)數(shù)，接種到COSTARTRANSWELL6.5毫米直徑組織培養(yǎng)嵌塊(Corning，Coming,NY)上，每嵌塊15,000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在嵌塊上在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)。人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)HCAEC購(gòu)自CambrexIncorporated(Walkersville,MD)。這些細(xì)胞也是在EBM或EGM培養(yǎng)基配方中分別進(jìn)行培養(yǎng)保持。細(xì)胞是在標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)塑料上在標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行生長(zhǎng)。用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞處在第4次傳代到第8次傳代之間。0151內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)形成(MATRIGEL)測(cè)定按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書將培養(yǎng)板包被上MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford,MA)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將MATRIGEL(BDDiscoveryLabware,Bedford,MA)在4。C下解凍，分成大約250^t升的等分試樣，均勻分配到冷凍的24孔培養(yǎng)板(Corning)的每個(gè)孔上。然后將板在37。C下溫育30分鐘，以讓材料固化。將生長(zhǎng)活躍的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物用胰蛋白酶處理并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞通過(guò)離心、重懸和抽吸上清液在含2°/。FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中洗滌兩次。將細(xì)胞接種到包被的孔上，每孔20,000個(gè)細(xì)胞，在大約0.5毫升的含2%(v/v)FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然后讓細(xì)胞溫育大約30分鐘，以讓細(xì)胞定植下來(lái)。0152然后用10納摩爾的人bFGF(P印rotech，RockyHill,NJ)或10納摩爾的人VEGF(Peprotech,RockyHill,NJ)處理內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，用作內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答的陽(yáng)性對(duì)照。將接種有產(chǎn)后衍生細(xì)胞的轉(zhuǎn)孔(Transwell)嵌塊加到適當(dāng)?shù)目字?，嵌塊室(insertchamber)中有含2%FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在5%C02、37。C下溫育大約24小時(shí)。將孔板從培養(yǎng)箱取出，用Olympus倒置顯微鏡(Olympus,Melville,NY)收集內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的影像。趙表2-1顯示了生長(zhǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)后衍生細(xì)胞釋放的已知生血管因子的水平。產(chǎn)后衍生細(xì)胞如上所述接種到嵌塊上。細(xì)胞在嵌塊上在大氣氧中37。C培養(yǎng)48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)換到2%FBS培養(yǎng)基并返回37°C保持24小時(shí)。移取培養(yǎng)基，立即在-80。C冷凍保藏，通過(guò)SearchLightmultiplexELISA測(cè)定(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)進(jìn)4亍分析。顯示的結(jié)果是兩次重復(fù)測(cè)定的平均值。結(jié)果顯示產(chǎn)后衍生細(xì)胞沒(méi)有釋放出可檢測(cè)水平的血小板衍生生長(zhǎng)因子-bb(PDGF-bb)或肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HBEGF)。細(xì)胞的確釋放出金屬蛋白酶-1(TIMP-l)、促血管生成素2(ANG2)、血小板生成素(TPO)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的可測(cè)量數(shù)量的組織抑制劑。表2-1.從產(chǎn)后衍生細(xì)胞釋放的潛在生血管因子TIMP1(pg/ml)ANG2(pg/ml)PDGFBB(pg/ml)TPO(pg/mJ)KGF(pg/ml)HGF(pg/ml)FGF(pg/ml)VEGF(pg/ml)HBEGF(pg/ml)Plac(P4)91655.3175.5<2.0275.53.058.37.5644.6<1.2Plac(Pll)1592832.428.1<2.01273.1193.35960.334.812361.11.7Umbcord(P4)81831.7<9.8<2.0365.914.1200.25.8<4.0<1.2僅培養(yǎng)基<9.825.1<2.0<6.4<2.0<3.2<5.4<4.0<1.2產(chǎn)后衍生細(xì)胞在大氣氧中在含2。/。FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。移取培養(yǎng)基，通過(guò)SearchlightmultiplexELISA測(cè)定(Pierce)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果是兩次重復(fù)分析的平均值。數(shù)值為培養(yǎng)基中的濃度，以皮克/毫升培養(yǎng)基記錄。Plac:胎盤衍生細(xì)胞；Umbcord:臍帶衍生細(xì)胞。表2-2顯示了產(chǎn)后衍生細(xì)胞釋放的已知生血管因子的水平。產(chǎn)后衍生細(xì)胞如上所述接種到嵌塊上。細(xì)胞在嵌塊上在培養(yǎng)基中在5%氧下培養(yǎng)48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)換到2。/。FBS培養(yǎng)基并返回5%02溫育24小時(shí)。移取培養(yǎng)基，立即在-80。C冷凍保藏，通過(guò)SearchlightmultiplexELISA觀'J定(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)進(jìn)行分析。顯示的結(jié)果是兩次重復(fù)測(cè)定的平均值。結(jié)果顯示產(chǎn)后衍生細(xì)胞沒(méi)有釋放出可檢測(cè)水平的血小板衍生生長(zhǎng)因子-bb(PDGF-BB)或肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HBEGF)。細(xì)胞的確釋放出金屬蛋白酶-1(TIMP-1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板生成素(TPO)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的可測(cè)量數(shù)量的組織抑制劑。表2-2.從產(chǎn)后衍生細(xì)胞釋放的潛在生血管因子<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>產(chǎn)后衍生細(xì)胞在5。/。氧中在含2。/oFBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。移取培養(yǎng)基，通過(guò)SearchlightmultiplexELISA測(cè)定(Pierce)進(jìn)4亍測(cè)定。結(jié)果是兩次重復(fù)分析的平均值。數(shù)值為培養(yǎng)基中的濃度，以皮克/毫升培養(yǎng)基記錄。Plac:胎盤衍生細(xì)胞；Umbcord:臍帶衍生細(xì)胞。,惑潛進(jìn)行了研究，以確定人臍帶組織衍生的細(xì)胞(hUTCs)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖和遷移的作用。這些作用是通過(guò)將hUTCs與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)和通過(guò)將人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的培養(yǎng)物與hUTC裂解物進(jìn)行溫育來(lái)進(jìn)行研究的。這里給,出的結(jié)果顯示，hUTCs能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移的增加。此外，數(shù)據(jù)還提示這些作用部分上是由成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)介導(dǎo)的。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)將批號(hào)為120304的冷藏人臍帶組織衍生細(xì)胞(hUTCs)在傳代8-9之間解凍，接種到包被明膠的瓶子，在Hayflick生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM-低葡萄糖[Gibco，目錄號(hào)11885-084]、15%v/v胎牛血清[FBS，Hyclone,目錄號(hào)SH30070.03]、0.001%v/v卩畫巰基乙醇[Sigma,目錄號(hào)M7154]及50U/ml青霉素和50微克/ml鏈霉素[Gibco,目錄號(hào)3810-74-0])中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于這里風(fēng)詳迷的研究，所用的細(xì)胞是在第10或U次傳代。人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs,目錄號(hào)C2517A)、人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAECs，目錄號(hào)CC2585)和人髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HIAECs,目錄號(hào)CC2545)獲自Cambrex,在內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EGM-2MV，目錄號(hào)3202)中按照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行培養(yǎng)。人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs,目錄號(hào)PT-2501)也購(gòu)自Cambrex,在間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSCGM，目錄號(hào)PT-3001)中按照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行保持。人真皮成纖維細(xì)胞(CCD9)獲自ATCC,在含有10%FBS和1U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行保持。對(duì)于關(guān)于hUTC介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖增加的潛在機(jī)制的研究，將抗FGF(7(ig/ml)、HGF(1^g/ml)和VEGF(lng/ml)的中和性抗體包括在HUVECs和HCAECs與hUTCs的共培養(yǎng)中?？贵w在細(xì)胞開(kāi)始接種時(shí)加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)7天后，收獲細(xì)胞，用Guava儀器計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移的評(píng)估為測(cè)量細(xì)胞遷移，使用6孔轉(zhuǎn)孔(Corning目錄號(hào)3428)裝置(set-up)。將細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/cn^的密度直接接種到指定的培養(yǎng)基配方中。內(nèi)皮細(xì)胞接種在轉(zhuǎn)孔嵌塊內(nèi)部(23,000個(gè)細(xì)胞/轉(zhuǎn)孔嵌塊)，hUTC批次120304或MSCs接種到孔的底部(48,000個(gè)細(xì)胞/孔)。在共培養(yǎng)7天后通過(guò)計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)孔的底面上的細(xì)胞數(shù)量評(píng)估遷移情況。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將轉(zhuǎn)孔轉(zhuǎn)移到清潔的孔中，用PBS洗滌一次。向孔底部加入胰蛋白酶，來(lái)收集孔底面的細(xì)胞。加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基將胰蛋白酶抑制，離心收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸在25^培養(yǎng)基中，其中取20^用Guava儀器獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)。還將MSCs和成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行測(cè)試，以確定其他細(xì)胞類型是否具有影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的能力。如圖1A所細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVECs在增殖上沒(méi)有差異。HCAECs(圖1B)和HIAECs(圖1C)也同樣，其中與hUTC批次120304的共培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加，而在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(H50或H80)中的細(xì)胞和與MSCs共培養(yǎng)的細(xì)胞之間沒(méi)能觀察到差異。[0172為研究hUTC介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖增加的潛在機(jī)制，將抗FGF(7jug/ml)、HGF(1^ig/ml)和VEGF(ljag/ml)的中和性抗體包括在HUVECs和HCAECs與hUTCs的共培養(yǎng)中。圖2A和2B的結(jié)果顯示，在HUVECs和HCAECs中，抗FGF和HGF的中和性抗體的加入減少了hUTC批次120304誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量的增加。在用于這些研究的濃度下，這些中和性抗體阻斷了生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的HUVECs的增殖(圖2A)。值得指出的是，抗VEGF的中和性抗體對(duì)HUVECs(圖2A)和HCAECs(圖2B)與hUTC批次120304的共培養(yǎng)所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著的作用。在另外的研究中，hUTC批次120304的增殖不因抗FGF和VEGF的中和性抗體加入到培養(yǎng)基中而受到影響(數(shù)據(jù)未顯示)。hUTC批次120304細(xì)胞裂解物對(duì)HUVECs的增殖的作用10173還進(jìn)行了研究，以確定細(xì)胞裂解物對(duì)HUVECs的增殖的作用。將HUVECs以5000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到24孔板上的EGM-2MV培養(yǎng)基中，保持8小時(shí)。然后將細(xì)胞在0.5ml含0.5。/。胎牛血清(FBS)和不含生長(zhǎng)因子的EGM-2MV培養(yǎng)基中溫育過(guò)夜，進(jìn)行血清饑餓處理。溫育后，加入不同濃度的新鮮制備hUTC批次120304細(xì)胞裂解物。在一些情況中，F(xiàn)GF、HGF和中和性抗體也加入。培養(yǎng)4天后，收獲HUVECs,用Guava儀器計(jì)數(shù)。0174圖3顯示，細(xì)胞裂解物的加入導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞數(shù)量與保持在低血清(0.5%FBS)中的細(xì)胞相比有增加，且細(xì)胞數(shù)量的增加與所加入的細(xì)胞裂解物的量成比例。較低濃度的所用細(xì)胞裂解物(62.5pg/ml)其導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量可與在最佳培養(yǎng)基條件(10%FBS)下溫育的細(xì)胞相比。此外，抗FGF或HGF的中和性抗體的加入緩和了由該兩種不同濃度的細(xì)胞裂解物誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量的增加。這些結(jié)果和在HUVECs與hUTC批次120304的共培養(yǎng)中獲得的結(jié)果相一致。hUTCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用01751內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是通過(guò)測(cè)定已移動(dòng)穿過(guò)轉(zhuǎn)孔膜(孔徑-8微米)的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行評(píng)估。將應(yīng)答細(xì)胞即內(nèi)皮細(xì)胞接種到6孔轉(zhuǎn)孔嵌塊上，hUTCs接種在孔的底部上。一段時(shí)間的共培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)孔底面上的細(xì)胞收集并計(jì)數(shù)。圖4A顯示與hUTCs和MSCs共培養(yǎng)的HUVECs的遷移。hUTC批次120304誘導(dǎo)了HUVECs向轉(zhuǎn)孔的底面的移動(dòng)，而MSCs卻沒(méi)有(圖4A)。在HCAECs上觀察到相同的結(jié)果，其中與hUTC批次120304的共培養(yǎng)導(dǎo)致相對(duì)于培養(yǎng)基對(duì)照有更多的細(xì)胞遷移穿過(guò)轉(zhuǎn)孔(圖4B)。0176采用抗FGF和HGF的中和性抗體，進(jìn)一步測(cè)試hUTC批次120304對(duì)HUVECs和HCAECs的遷移行為的作用。如圖5A所示，這些抗體減少了hUTC批次120304誘導(dǎo)的HUVECs遷移。在HCAECs與hUTC批次120304的共培養(yǎng)中，抗HGF的中和性抗體阻斷了hUTC批次120304介導(dǎo)的細(xì)胞遷移增加，而抗FGF的中和性抗體卻沒(méi)有阻斷(圖5B)。趙[0177這里概述的結(jié)果說(shuō)明了hUTCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖和遷移行為的作用。研究是用hUTC批次120304和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)或者內(nèi)皮細(xì)胞與從hUTC批次120304制備的細(xì)胞裂解物的直接溫育進(jìn)行的。71[0178對(duì)于增殖的研究，測(cè)試了hUTC批次120304的作用，來(lái)自不同血管床的三種內(nèi)皮細(xì)胞類型用作應(yīng)答細(xì)胞。與hUTCs的共培養(yǎng)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖得到增強(qiáng)。與MSCs或成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)所導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量與培養(yǎng)基對(duì)照相當(dāng)。HUVECs對(duì)hUTC批次120304的增殖應(yīng)答因抗FGF和HGF的抗體的加入而受到抑制，但不受抗VEGF的抗體的抑制。這暗示hUTC批次120304對(duì)增殖的誘導(dǎo)是由FGF和HGF介導(dǎo)的。值得指出的是，HUVECs與hUTC批次120304裂解物的溫育反映了在共培養(yǎng)物上所觀察到的作用。[0179遷移是通過(guò)計(jì)數(shù)在轉(zhuǎn)孔的底面上的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行定量的，HUVECs和HCAECs都用作應(yīng)答細(xì)胞。與增殖研究不同的是，這些細(xì)胞的遷移應(yīng)答稍有不同。HUTC批次120304誘導(dǎo)了HUVECs和HCAECs的遷移。MSCs不誘導(dǎo)^UVECs的遷移，這提示了這一對(duì)hUTCs的應(yīng)答的特異性?？笷GF和HGF抗體取消了hUTC批次120304對(duì)HUVECs的遷移的作用，而只有抗HGF抗體影響了HCAECs的遷移，這提示了兩種內(nèi)皮細(xì)胞類型之間的差異。0180總之，這些數(shù)據(jù)表明hUTCs能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖和遷移。中和性抗體的使用暗示FGF和HGF牽涉到這些觀察到的作用。但是，其他因素也可能涉及到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移行為。10181本發(fā)明并不限于以上描述和例示的實(shí)施方案。在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)能夠作出變化和修改。權(quán)利要求1.一種用于治療患有外周血管疾病的患者的方法，所述方法包括將產(chǎn)后衍生細(xì)胞以能有效治療外周血管疾病的量給予該患者，其中所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞衍自基本上沒(méi)有血液的人胎盤或臍帶組織；其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)展，和具有分化成至少骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮表型的細(xì)胞的潛力；其中所述細(xì)胞需要L-纈氨酸用于生長(zhǎng)并能在至少約5％氧中生長(zhǎng)；其中所述細(xì)胞還包含以下特征中的至少一個(gè)a)在培養(yǎng)中倍增至少約40次的潛力；b)在包被或未包被的組織培養(yǎng)容器上的貼壁和擴(kuò)展，其中包被組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、聚鳥(niǎo)氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的包被層；c)組織因子、波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；d)CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；e)CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ中的至少一個(gè)的產(chǎn)生的缺乏，這通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)；f)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)提高白細(xì)胞介素8；網(wǎng)硬蛋白1；趨化因子(C-X-C模體)配體1(黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性，α)；趨化因子(C-X-C模體)配體6(粒細(xì)胞趨化蛋白2)；趨化因子(C-X-C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α誘導(dǎo)蛋白3；C型凝集素超家族成員2；Wilms腫瘤1；醛脫氫酶1家族成員A2；腎素；氧化低密度脂蛋白受體1；人類克隆IMAGE4179671；蛋白激酶Cζ；假擬蛋白DKFZp564F013；在卵巢癌1中下調(diào)；和來(lái)自克隆DKFZp547k1113的人類基因；g)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)減少矮身材同源框2；熱激27kDa蛋白2；趨化因子(C-X-C模體)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1)；彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄、Williams-Beure綜合征)；人類mRNA；cDNADKFZp586M2022(來(lái)自克隆DKFZp586M2022)；間充質(zhì)同源框2(生長(zhǎng)停滯特異性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蠅)；晶狀體蛋白，αB；形態(tài)發(fā)生2的凌亂締合激活劑；DKFZP586B2420蛋白；類似于neuralin1；四連蛋白(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；膽固醇25-羥化酶；矮子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-3；白細(xì)胞介素11受體，α；前膠原C肽鏈內(nèi)切酶增強(qiáng)子；卷曲同源物7(果蠅)；假擬基因BC008967；膠原，VIII型，α1；生腱蛋白C(結(jié)合腕蛋白)；易洛魁族人同源框蛋白5；hephaestin；整聯(lián)蛋白，β8；突觸小泡糖蛋白2；成神經(jīng)細(xì)胞瘤，致瘤性1的抑制；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2，36kDa；人類cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；細(xì)胞因子受體樣因子1；鉀中等/小電導(dǎo)率鈣激活通道，亞家族N，成員4；整聯(lián)蛋白，β7；帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ)；sineoculis同源框同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白；小泡相關(guān)膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF纖蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1；早期生長(zhǎng)應(yīng)答3；distal-less同源框5；假擬蛋白FLJ20373；醛-酮還原酶家族1，成員C3(3-α羥基類固醇脫氫酶，II型)；雙糖鏈蛋白聚糖；帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ)；纖連蛋白1；腦啡肽原；整聯(lián)蛋白，β樣1(帶EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；人類mRNA全長(zhǎng)插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；鈉尿肽受體C/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C(心房鈉尿肽受體C)；假擬蛋白FLJ14054；人類mRNA；cDNADKFZp564B222(來(lái)自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣；AE結(jié)合蛋白1；細(xì)胞色素c氧化酶亞單位VIIa多肽1(肌肉)；類似于neuralin1；B細(xì)胞易位基因1；假擬蛋白FLJ23191和DKFZp586L151；h)MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中的至少一個(gè)的分泌；i)TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF中的至少一個(gè)的分泌的缺乏，這通過(guò)ELISA來(lái)檢測(cè)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述外周血管疾病是外周局部缺血。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化成骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮譜系細(xì)胞后再進(jìn)行給予。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造以產(chǎn)生能促進(jìn)外周血管疾病的治療的基因產(chǎn)物。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與至少一種其他細(xì)胞類型一起給予。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述其他細(xì)胞類型是骨骼肌細(xì)胞、骨骼肌祖細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌祖細(xì)胞、周細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞或者其他多潛能或多能干細(xì)胞。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述至少一種其他細(xì)胞類型在給予產(chǎn)后衍生細(xì)胞的同時(shí)或之前或之后給予。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與至少一種其他藥物一起給予。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述藥物是抗血栓形成劑、抗炎劑、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、促生血管劑或抗細(xì)胞凋亡劑。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述藥物在給予產(chǎn)后衍生細(xì)胞的同時(shí)或之前或之后給予。11.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞在外周局部缺血的部位給予。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞通過(guò)注射、輸注、植入患者體內(nèi)的裝置或者通過(guò)植入含有所述細(xì)胞的基質(zhì)或支架來(lái)給予。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞對(duì)患者的骨骼肌施加營(yíng)養(yǎng)作用。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞對(duì)患者的血管平滑肌施加營(yíng)養(yǎng)作用。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)作用是血管平滑肌細(xì)胞的增殖。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞對(duì)患者的血管內(nèi)皮施加營(yíng)養(yǎng)作用。17.權(quán)利要求16的方法,其中所述營(yíng)養(yǎng)作用是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管平滑肌祖細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。22.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)周細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。23.—種用于治療患有外周血管疾病的患者的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和其量能有效治療外周血管疾病的產(chǎn)后衍生細(xì)胞，其中所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞衍自基本上沒(méi)有血液的人胎盤或臍帶組織；其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)展，和具有分化成至少骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮表型的細(xì)胞的潛力；其中所述細(xì)胞需要L-纈氨酸用于生長(zhǎng)并能在至少約5°/。氧中生長(zhǎng)；其中所述細(xì)胞還包含以下特征中的至少一個(gè)a)在培養(yǎng)中倍增至少約40次的潛力；b)在包被或未包被的組織培養(yǎng)容器上的貼壁和擴(kuò)展，其中包被組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、聚鳥(niǎo)氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的包被層；c)組織因子、波形蛋白和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；d)CDIO、CD13、CD44、CD73、C，、PDGFr-a、PD-L2和HLA-A,B,C中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；e)CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP，DQ中的至少一個(gè)的產(chǎn)生的缺乏，這通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)^r測(cè)；f)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)提高白細(xì)胞介素8;網(wǎng)硬蛋白1;趨化因子(C-X-C模體)配體1(黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性，a);趨化因子(C-X-C模體)配體6(粒細(xì)胞趨化蛋白2);趨化因子(C-X-C模體)配體3;腫瘤壞死因子，a誘導(dǎo)蛋白3;C型凝集素超家族成員2;Wilms腫瘤l;醛脫氫酶1家族成員A2;腎素；氧化低密度脂蛋白受體l;人類克隆IMAGE:4179671;蛋白激酶C;;假擬蛋白DKFZp564F013;在卵巢癌1中下調(diào);和來(lái)自克隆DKFZp547kl113的人類基因；g)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)減少矮身材同源才匡2;熱激27kDa蛋白2;趨化因子(C-X-C模體)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l);彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄、Williams-Beure綜合征)；人類mRNA;cDNADKFZp586M2022(來(lái)自克隆DKFZp586M2022);間充質(zhì)同源框2(生長(zhǎng)停滯特異性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蠅)；晶狀體蛋白，aB;形態(tài)發(fā)生2的凌亂締合激活劑；DKFZP586B2420蛋白；類似于neuralinl;四連蛋白(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；膽固醇25-羥化酶；矮子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-3;白細(xì)胞介素11受體，a;前膠原C肽鏈內(nèi)切酶增強(qiáng)子；巻曲同源物7(果蠅)；假擬基因BC008967;膠原，VIII型，al;生腱蛋白C(結(jié)合腕蛋白)；易洛魁族人同源框蛋白5;hephaestin;整聯(lián)蛋白，(38;突觸小泡糖蛋白2;成神經(jīng)細(xì)胞瘤，致瘤性1的抑制；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2,36kDa;人類cDNAFLJ12280fis,克隆MAMMA1001744;細(xì)胞因子受體樣因子l;鐘中等/小電導(dǎo)率鈣激活通道，亞家族N，成員4;整聯(lián)蛋白，P7;帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);sineoculis同源框同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白；小泡相關(guān)膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF纖蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1;早期生長(zhǎng)應(yīng)答3;distal-less同源框5;假擬蛋白FLJ20373;醛-酮還原酶家族1，成員C3(3-a羥基類固醇脫氫酶，II型)；雙糖鏈蛋白聚糖；帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);纖連蛋白1;腦啡肽原；整聯(lián)蛋白，(3樣1(帶EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；人類mRNA全長(zhǎng)插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422;EphA3;KIAA0367蛋白；鈉尿肽受體C/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C(心房鈉尿肽受體C);假擬蛋白FLJ14054;人類mRNA;cDNADKFZp564B222(來(lái)自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣；AE結(jié)合蛋白1;細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Vila多肽1(肌肉)；類似于neuralin1;B細(xì)胞易位基因1;假擬蛋白FLJ23191和DKFZp586L151;h)MCP畫1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPla、RANTES和TIMP1中的至少一個(gè)的分泌；i)TGF-(32、ANG2、PDGFbb、MIPlb、1309、MDC和VEGF中的至少一個(gè)的分泌的缺乏，這通過(guò)ELISA來(lái)才全測(cè)。24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述外周血管疾病是外周局部缺血。25.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化成骨骼肌譜系后再進(jìn)行組合物的配制。26.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化成血管平滑肌i普系后再進(jìn)行組合物的配制。27.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化成血管內(nèi)皮譜系后再進(jìn)行組合物的配制。28.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程文造以產(chǎn)生能促進(jìn)外周血管疾病的治療的基因產(chǎn)物。29.權(quán)利要求23的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種其他細(xì)胞類型。30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述其他細(xì)胞類型是骨骼肌細(xì)胞、骨骼肌祖細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌祖細(xì)胞、周細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞或者其他多潛能或多能干細(xì)胞。31.權(quán)利要求23的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種其他藥物。32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述藥物是抗血栓形成劑、抗炎劑、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或抗細(xì)胞凋亡劑。33.權(quán)利要求23的藥物組合物，所述藥物組合物配制成供通過(guò)注射或輸注來(lái)給予。34.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞包嚢在可植入裝置當(dāng)中。35.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞包含在基質(zhì)或支架當(dāng)中。36.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞對(duì)患者的骨骼肌施加營(yíng)養(yǎng)作用。37.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞對(duì)患者的血管平滑肌施加營(yíng)養(yǎng)作用。38.權(quán)利要求37的藥物組合物，其中所述營(yíng)養(yǎng)作用是血管平滑月幾細(xì)胞的增殖。39.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞對(duì)患者的血管內(nèi)皮施加營(yíng)養(yǎng)作用。40.權(quán)利要求39的藥物組合物，其中所述營(yíng)養(yǎng)作用是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。41.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。42.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。43.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。44.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)血管平滑肌祖細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。45.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述細(xì)胞誘導(dǎo)周細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。46.—種用于治療患有外周血管疾病的患者的藥盒，所述藥盒包含藥物可接受的載體、產(chǎn)后衍生細(xì)胞群體和有關(guān)將該藥盒用在治療患者的方法中的說(shuō)明書，其中所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞衍自基本上沒(méi)有血液的人胎盤或臍帶組織；其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)展，和具有分化成至少骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮表型的細(xì)胞的潛力；其中所述細(xì)胞需要L-纈氨酸用于生長(zhǎng)并能在至少約5%氧中生長(zhǎng)；其中所述細(xì)胞還包含以下特征中的至少一個(gè)a)在培養(yǎng)中倍增至少約40次的潛力；b)在包被或未包被的組織培養(yǎng)容器上的貼壁和擴(kuò)展，其中包被組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、聚鳥(niǎo)氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的包被層；c)組織因子、波形蛋白和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；d)CDIO、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-a、PD-L2和HLA-A，B,C中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；e)CD31、CD34、CD45、CD80、C函、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP，DQ中的至少一個(gè)的產(chǎn)生的缺乏，這通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)4企測(cè)；f)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)提高白細(xì)胞介素8;網(wǎng)硬蛋白1;趨化因子(C-X-C模體)配體1(黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性，a);趨化因子(C-X-C模體)配體6(粒細(xì)胞趨化蛋白2);趨化因子(C-X-C模體)配體3;腫瘤壞死因子，a誘導(dǎo)蛋白3;C型凝集素超家族成員2;Wilms腫瘤l;醛脫氫酶1家族成員A2;腎素；氧化低密度脂蛋白受體l;人類克隆IMAGE:4179671;蛋白激酶C;;假擬蛋白DKFZp564F013;在卵巢癌1中下調(diào)；和來(lái)自克隆DKFZp547kl113的人類基因；g)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)月包而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)減少矮身材同源框2;熱激27kDa蛋白2;趨化因子(C-X-C模體)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l);彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄、Williams-Beure綜合征)；人類mRNA;cDNADKFZp586M2022(來(lái)自克隆DKFZp586M2022);間充質(zhì)同源框2(生長(zhǎng)停滯特異性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蠅)；晶狀體蛋白，aB;形態(tài)發(fā)生2的凌亂締合激活劑；DKFZP586B2420蛋白；類似于neuralinl;四連蛋白(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；膽固醇25-羥化酶；矮子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-3;白細(xì)胞介素11受體，a;前膠原C肽鏈內(nèi)切酶增強(qiáng)子；巻曲同源物7(果蠅)；假擬基因BC008967;膠原，VIII型，al;生腱蛋白C(結(jié)合腕蛋白)；易洛魁族人同源框蛋白5;hephaestin;整聯(lián)蛋白，P8;突觸小泡糖蛋白2;成神經(jīng)細(xì)胞瘤，致瘤性'l'的抑制；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2,36kDa;人類cDNAFLJ12280fis,克隆MAMMA1001744;細(xì)胞因子受體樣因子l;鉀中等/小電導(dǎo)率鈣激活通道，亞家族N，成員4;整聯(lián)蛋白，(37;帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);sineoculis同源框同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白；小泡相關(guān)膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF纖蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1;早期生長(zhǎng)應(yīng)答3;distal-less同源框5;^f艮擬蛋白FLJ20373;醛-酮還原酶家族1，成員C3(3-a羥基類固醇脫氫酶，II型)；雙糖鏈蛋白聚糖；帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);纖連蛋白1;腦啡肽原；整聯(lián)蛋白，P樣1(帶EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；人類mRNA全長(zhǎng)插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422;EphA3;KIAA0367蛋白；鈉尿肽受體C/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C(心房鈉尿肽受體C);假擬蛋白FU14054;人類mRNA;'cDNADKFZp564B222(來(lái)自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣；AE結(jié)合蛋白1;細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Vila多肽1(肌肉)；類似于neuralin1;B細(xì)胞易位基因1;假擬蛋白FLJ23191和DKFZp586L151;h)MCP-1、IL-6、IL畫8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPla、RANTES和TIMP1中的至少一個(gè)的分泌；i)TGF-|32、ANG2、PDGFbb、MIPlb、1309、MDC和VEGF中的至少一個(gè)的分泌的缺乏，這通過(guò)ELISA來(lái)4企測(cè)。47.權(quán)利要求46的藥盒，所述藥盒還包含至少一種試劑和關(guān)于培養(yǎng)產(chǎn)后衍生細(xì)胞的說(shuō)明書。48.權(quán)利要求46的藥盒，所述藥盒還包含至少一種其他細(xì)胞類型的群體。49.權(quán)利要求46的藥盒，所述藥盒還包含至少一種用于治療外周血管疾病的其他藥物。50.—種用于治療患有外周血管疾病的患者的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和從產(chǎn)后衍生細(xì)胞制得的制品，其中所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞衍自基本上沒(méi)有血液的人胎盤或臍帶組織，能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)展，和具有分化成至少骨骼肌、血管平滑肌、周細(xì)胞或血管內(nèi)皮表型的細(xì)胞的潛力，需要L-纈氨酸用于生長(zhǎng)，能在含有至少約5%氧的氣氛中生長(zhǎng)，且包含以下特征中的至少一個(gè)a)在培養(yǎng)中倍增至少約40次的潛力；b)在包被或未包被的組織培養(yǎng)容器上的貼壁和擴(kuò)展，其中包被組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、聚鳥(niǎo)氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的包被層；c)組織因子、波形蛋白和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；d)CDIO、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-a、PD-L2和HLA-A,B，C中的至少一個(gè)的產(chǎn)生；e)CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP，DQ中的至少一個(gè)的產(chǎn)生的缺乏，這通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)；f)至少以下之一的表達(dá)白細(xì)胞介素8;網(wǎng)硬蛋白1;趨化因子(C-X-C模體)配體1(黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性，a);趨化因子(C-X-C模體)配體6(粒細(xì)胞趨化蛋白2);趨化因子(C-X-C模體)配體3;和腫瘤壞死因子，a誘導(dǎo)蛋白3;g)至少以下之一的表達(dá)C型(鈣依賴性、碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域)凝集素，超家族成員2(激活誘導(dǎo)的)；Wilms腫瘤1;醛脫氫酶1家族，成員A2;腎素；氧化低密度脂蛋白(凝集素氧)受體1;人類克隆IMAGE:4179671,mRNA，部分cds;蛋白激酶C;;假擬蛋白DKFZp564F013;在卵巢癌1中下調(diào)；人類mRNA;和cDNADKFZp547Kl113(來(lái)自克隆DKFZp547kl113);h)相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞這些人細(xì)胞而言，至少一個(gè)編碼以下物質(zhì)的基因的基因表達(dá)減少矮身材同源框2;熱激27kDa蛋白2;趨化因子(C-X-C模體)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l);彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄、Williams-Beure綜合征)；人類mRNA;cDNADKFZp586M2022(來(lái)自克隆DKFZp586M2022);間充質(zhì)同源框2(生長(zhǎng)停滯特異性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蠅)；晶狀體蛋白，aB;形態(tài)發(fā)生2的凌亂締合激活劑；DKFZP586B2420蛋白；類似于neuralin1;四連蛋白(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；B細(xì)胞易位基因1,抗增殖；膽固醇25-羥化酶；矮子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-3;假擬蛋白FLJ23191;白細(xì)胞介素11受體，a;前膠原C肽鏈內(nèi)切酶增強(qiáng)子；巻曲同源物7(果蠅)；假擬基因BC008967;膠原，VIII型，al;生腱蛋白C(結(jié)合腕蛋白)；易洛魁族人同源框蛋白5;hephaestin;整聯(lián)蛋白，|38;突觸小泡糖蛋白2;人類cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744;細(xì)胞因子受體樣因子1;鉀中等/小電導(dǎo)率鈣激活通道，亞家族N，成員4;整聯(lián)蛋白，a7;DKFZP586L151蛋白；帶PDZ結(jié)合模體的轉(zhuǎn)錄共激活劑(TAZ);sineoculis同源框同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白；早期生長(zhǎng)應(yīng)答3;distal-less同源框5;假擬蛋白FLJ20373;醛-酮還原酶家族1,成員C3(3-a羥基類固醇脫氫酶，II型)；雙糖鏈蛋白聚糖；纖連蛋白1;腦啡肽原；整聯(lián)蛋白，(3樣1(帶EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；人類mRNA全長(zhǎng)插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422;EphA3;KIAA0367蛋白；鈉尿肽受體C/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C(心房鈉尿肽受體C);假擬蛋白FLJ14054;人類mRNA;cDNADKFZp564B222(來(lái)自克隆DKFZp564B222);小泡相關(guān)膜蛋白5(myobrevin);含EGF的纖蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1;BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣；AE結(jié)合蛋白1;細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Vila多肽1(肌肉)；成神經(jīng)細(xì)胞瘤，致瘤性1的抑制；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2，36kDa;i)MCP-1、IL畫6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPla、RANTES和TIMP1中的至少一個(gè)的分泌；j)TGF陽(yáng)P2、ANG2、PDGFbb、MIPlb、1309、MDC和VEGF中的至少一個(gè)的分泌的缺乏，這通過(guò)ELISA來(lái)4企測(cè)；且其中所述制品包含產(chǎn)后衍生細(xì)胞的細(xì)胞裂解物、產(chǎn)后衍生細(xì)胞的胞外基質(zhì)或其中生長(zhǎng)了產(chǎn)后衍生細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。51.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述從產(chǎn)后衍生細(xì)胞制得的制品對(duì)血管內(nèi)皮施加營(yíng)養(yǎng)作用。52.權(quán)利要求51的藥物組合物，其中所述所述營(yíng)養(yǎng)作用是血管內(nèi)皮細(xì)^^的增殖。53.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述從產(chǎn)后衍生細(xì)胞制得的制品誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。54.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述從產(chǎn)后衍生細(xì)胞制得的制品誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。55.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述從產(chǎn)后衍生細(xì)胞制得的制品誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。56.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述從產(chǎn)后衍生細(xì)胞制得的制品誘導(dǎo)血管平滑肌祖細(xì)胞遷移到外周血管疾病的部位。57.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述外周血管疾病是外周局部缺血。58.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述組合物包含F(xiàn)GF和HGF。59.—種用以治療患有外周血管疾病的患者的方法，所述方法包括將權(quán)利要求42的藥物組合物以能有效治療外周血管疾病的量給予該患者。60.—種用以治療患有外周血管疾病的患者的藥盒，所述藥盒包含藥物可接受載體、權(quán)利要求42的藥物制品、有關(guān)使用藥盒成分來(lái)治療外周血管疾病的說(shuō)明書。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了這樣的組合物和方法，它們使用衍自產(chǎn)后組織如臍帶和胎盤的細(xì)胞，以刺激和支持外周血管疾病患者的血管發(fā)生，改善其血流，再生、修復(fù)和改善其被外周局部缺血事件損害的骨骼肌，并保護(hù)其骨骼肌免受局部缺血損害。文檔編號(hào)A61P9/10GK101437576SQ200680053495公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2006年12月28日優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日發(fā)明者A·J·金申請(qǐng)人:伊西康公司