專利名稱：自然殺傷性t細胞在角膜移植中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，更具體地涉及自然殺傷性T細胞(NKT)用于治療角膜移植免疫排斥反應的用途。
背景技術：
角膜盲目前仍是我國主要的致盲眼病之一，對于其中絕大多數(shù)患者，穿透性角膜移植是唯一有效的復明手段。由于角膜本身沒有血管，加之存在前房相關免疫偏離(Anterior Chamber Associated ImmuneDeviation，ACAID)，使角膜處于相對免疫赦免狀態(tài)，因此在圓錐角膜、大泡性角膜病變、角膜營養(yǎng)不良等植床上進行的穿透性角膜移植，術后免疫排斥反應發(fā)生率低，約為10％。而對于角膜新生血管化、粘連性角膜白斑、二次或多次角膜移植、角膜化學燒傷、單純皰疹病毒感染等情況下，角膜和前房的屏障功能被破壞，術后排斥率高達65％，稱為高危角膜移植，是嚴重影響手術成功的關鍵因素，是臨床治療的棘手問題。而在我國，約有超過200萬例角膜盲患者需要進行角膜移植，其中有相當多的屬于高危角膜移植范疇。例如，北京同仁醫(yī)院眼科(1992年-2001年)進行的1789例穿透性角膜移植患者中，有35.2％的患者屬于高危角膜移植患者(high-risk keratoplasty patients)范疇，其中包括角膜新生血管化、粘連性角膜白斑、角膜移植術后植片混濁、角膜化學燒傷、年幼患者、眼前節(jié)手術、聯(lián)合玻璃體切除術、單純皰病毒感染等。因此，在我國供體材料十分匱乏的情況下，大量等待手術復明的高危角膜移植患者和術后高排斥率之間的矛盾表現(xiàn)更加突出，需要有更加有效的抗排斥反應的藥物來控制。免疫抑制劑主要用于器官移植和一些具有T細胞亢進的自身免疫病的患者如依賴性糖尿病、類風濕關節(jié)炎、丙型肝炎等，以防止移植后器官被機體排斥和緩解自身免疫病。到目前為止，接受過器官移植的患者通常需要終身使用免疫抑制劑，而長期用藥會帶來對免疫系統(tǒng)抗感染和抗腫瘤作用的損傷。
目前，角膜移植免疫排斥反應的治療主要依靠術后使用免疫抑制劑，糖皮質激素是臨床上廣泛應用的藥物，雖然價格相對低廉，但長期應用會引起青光眼、白內(nèi)障等更加嚴重的后果；新型免疫抑制劑的研究已經(jīng)將CsA、FK506等推向臨床，但長期應用除費用昂貴外，所引起的肝腎損傷、感染以及腫瘤等副作用仍是不容忽視的問題。因此，尋找有效、應用方便、副作用小的免疫治療方法仍是亟待解決的問題。
在器官移植中，移植物要在受體中長期存活，最終需要達到免疫耐受狀態(tài)。多種免疫調節(jié)細胞在其中發(fā)揮重要作用，目前自然殺傷性T細胞(nature killer T cell，NKT)的功能已引起人們的極大關注。NKT細胞是新發(fā)現(xiàn)的第四類淋巴細胞，與T細胞、B細胞和NK細胞具有不同的細胞表型和功能，其最顯著的特征是同時表達T細胞表面受體(TCR)和NK細胞表面標志。NKT細胞的另一重要特征是CD1限制性。CD1是與MHC-I類分子結構相似，而抗原提呈功能卻類似MHC-II類分子的第三類抗原提呈分子，NKT細胞只識別由CD1d分子遞呈的脂類抗原，人工合成的α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-galactosylceramide，α-GalCer)及其類似物OCH等能以CD1d限制的和TCR介導的方式激活NKT細胞。
NKT細胞可以在肝臟、脾臟以及外周血中檢測到，但在不同部位分布極不均衡。目前對人類NKT細胞的研究大部分局限于外周血，Kadowaki等已經(jīng)從臍帶血和成年人血中成功誘導培養(yǎng)出NKT細胞。
NKT細胞具有多種生物學功能，既產(chǎn)生Th1型的細胞因子如IL-2和IFN-γ，也產(chǎn)生Th2型細胞因子如IL-4和IL-10，還可產(chǎn)生CD8+T細胞分泌的細胞因子如穿孔素，顆粒酶等。因此，目前多數(shù)學者認為，NKT細胞是具有雙重作用的細胞，其調節(jié)作用主要依賴于它在免疫起始階段所接受的刺激。
然而，在本申請之前，還沒有將NKT細胞直接用于治療角膜移植免疫排斥反應。發(fā)明人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，將NKT細胞用于治療角膜移植免疫排斥反應，可明顯延長角膜植片的存活時間，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是提供自然殺傷性T細胞(NKT)在制備治療哺乳動物器官移植免疫排斥反應藥物中的用途，其中，所述的器官移植包括角膜移植、心臟移植、腎移植、胰島移植、皮膚移植等，優(yōu)選地是角膜移植，更優(yōu)選地是高危角膜移植；其中，該抗排斥反應藥物可用于哺乳動物，其中哺乳動物選自人、猴、狗、貓、大鼠、小鼠等，更優(yōu)選地，所述的哺乳動物是人。
本發(fā)明的另一個方面是提供含有NKT細胞的藥物組合物，其含有有效量的NKT細胞和藥學上可接受的載體，例如緩沖液、培養(yǎng)液、防腐劑等。NKT細胞可從哺乳動物的脾臟、肝臟、外周血中分離，并經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增獲得，或者從臍帶血和外周血中分離并經(jīng)培養(yǎng)擴增獲得。
本領域技術人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如靜脈內(nèi)給藥、結膜下給藥等。若有特殊治療要求，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，例如抗生素等，這種相伴使用有利于治療。
在本發(fā)明的藥物組合物中。NKT細胞的用量可以在一個較大范圍內(nèi)變動，本領域技術人員可以根據(jù)一些已知的因素，諸如病人體重、年齡、給藥途徑等很容易地加以確定。
與其它免疫抑制劑相比，本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)點是具有有效、應用次數(shù)少，副作用小的特點，從而減少了長期用藥的副作用，長期應用不會引起青光眼、白內(nèi)障等更加嚴重的后果，不會引起的肝腎損傷、感染以及腫瘤等副作用；另外NKT細胞存在于多種器官和組織中，如可在肝臟、脾臟、外周血中檢測到，可便于分離獲得，并且也可從臍帶血和血液中誘導培養(yǎng)出NKT細胞，為臨床治療高危角膜移植提供了新的方法。


圖1、體外培養(yǎng)3周后的大鼠脾臟淋巴細胞(濃度1×106/ml)。
圖2、流式細胞儀分選NKT細胞亞群的結果。圖2A淋巴細胞群(濃度1×106/ml)；圖2BNKT細胞群(濃度5×105/ml)。
圖3、術后第10天角膜植片外眼像。圖3A對照組角膜植片混濁，發(fā)生免疫排斥反應圖；3B試驗組角膜植片清亮，沒有發(fā)生免疫排斥反應。
圖4、術后第10天角膜植片組織病理學檢查(×200)的結果。圖4A對照組角膜植片水腫增厚，大量免疫細胞浸潤；圖4B試驗組角膜植片輕水腫，少量炎性細胞浸潤。
具體實施例方式
實施例1NKT細胞的制備在無菌條件下，將2只Lewis純系大鼠(雌性，8～10周齡，體重160～200克，購自中國醫(yī)學科學院動物研究所)的脾臟取出，置于含有10ml RPMI-1640培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司)的無菌培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒研磨，使脾臟破裂，并用250目無菌不銹鋼網(wǎng)(購自河北鉆石金屬網(wǎng)業(yè)有限公司)過濾，使淋巴細胞通過并形成細胞懸液。將該懸液通過25號的細注射器針頭形成單細胞懸液。按照每只脾臟加入2ml 8.7g/L NH4Cl的方法，分別加入經(jīng)高壓滅菌的紅細胞裂解液(139.6mmol/L NH4Cl、16.96mmol/L Tris，用1mol/L HCl調pH至7.2)裂解紅細胞。室溫下作用5分鐘后，加入經(jīng)高壓滅菌的GNK緩沖液(8g/L NaCl、0.4g/L KCl、1.77g/L Na2HPO4.2H2O、0.6g/LNaH2PO4.H2O、0.2g/L葡萄糖、0.01g/L酚紅)終止紅細胞裂解。1500轉/分鐘，離心5分鐘后，去除上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞反復洗2次，然后將脾臟淋巴細胞接種于96孔培養(yǎng)板(每孔加入100μL濃度為1×105/mL的大鼠脾臟淋巴細胞)，于RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每孔加入10μL IL-7(50ng/mL)和10μL IL-15(50ng/mL)(美國RnD公司)后在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，刺激其增殖活化。3周后，獲得1×106/mL濃度的淋巴細胞(圖1)。在培養(yǎng)液中加入抗大鼠NK單克隆熒光抗體(R-PE標記的抗大鼠CD161抗體)和抗大鼠TCRα單克隆抗體(FITC標記的抗大鼠TCR-α抗體)(上述兩種抗體均購自美國RnD公司)，4℃孵育30分鐘后，用磷酸鹽緩沖液—牛血清白蛋白溶液(北京中山生物試劑公司)洗滌2次，去除多余抗體，使用FACSVantage流式細胞儀(Becton Dickinson)分選出TCR-α+/CD161+雙陽性細胞，即所要的NKT細胞。經(jīng)過流式細胞儀分選后，獲得濃度為5×105/mL的TCR-α+/CD161+雙陽性NKT細胞(圖2A，B)實施例2用NKT細胞治療大鼠角膜移植排斥反應(1)建立大鼠正位穿透性角膜移植的模型參照Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneatransplantation in the inbred rata new model.Invest ophthalmolVis Sci，1985；26(1)23-30，制備大鼠正位穿透性角膜移植模型8只Fisher344純系大鼠作為供體，16只Lewis純系大鼠作為受體。供體和受體均為雌性，8～10周齡，160～200克。所有實驗動物均購自中國醫(yī)學科學院動物研究所(中國北京)。所有實驗動物的處置遵照ARVO聲明中有關眼科和視覺科學研究中動物使用的規(guī)定。
受體術眼術前15分鐘以1％阿托品滴眼液和復方托品酰胺滴眼液充分散瞳，每只大鼠肌肉注射30mg鹽酸氯胺酮和1mg地西泮進行麻醉。手術在顯微鏡下進行，常規(guī)無菌操作。首先以3.0mm環(huán)鉆在供體角膜中央劃痕，用寶石前房穿刺刀切穿角膜全層后，用角膜剪沿劃痕剪下供體角膜植片，置于Optisol液(購自北京同仁眼庫)中備用。于受體右眼行穿透性角膜移植，用直徑2.5mm的環(huán)鉆鉆取中央?yún)^(qū)角膜，方法同前，將植片置于植床，以10-0尼龍線間斷縫合8針，線結暴露不埋藏。前房內(nèi)注入小氣泡，恢復前房。術畢散瞳，結膜下注射硫酸妥布霉素2000U，結膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏后瞼緣縫合。24小時后剪開眼瞼縫線用藥。手術后出現(xiàn)并發(fā)癥者(如前房出血，感染，虹膜前粘連，或前房消失)，不計入統(tǒng)計之列。所有動物術后均每日用0.25％氯霉素及復方托品酰胺滴眼液點眼，2次/日，共一周。角膜植片縫線在整個觀察期內(nèi)保留，不去除。
(2)分組與治療受體大鼠被隨機分為治療組和對照組，每組8只大鼠。治療組每只大鼠在角膜移植手術結束時結膜下注射0.1ml濃度為5×105/ml NKT細胞，對照組用同樣的方法結膜下注射0.1ml生理鹽水。
(3)角膜植片排斥反應的觀察術后每日在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜植片情況直到排斥反應發(fā)生，之后隔日觀察。根據(jù)植片的混濁情況對植片進行評分，評分標準如下(參照Holland EJ，Chan CC，Wetzig RP，et al.Clinical andimmuno-histologic studies of corneal rejection in the ratpenetrating keratoplasty model.Cornea，1991，10(5)374-380.)0植片清亮，無混濁；
1植片輕度淺層非基質層混濁，虹膜紋理清晰可見；2植片輕度深基質層混濁，虹膜紋理模糊可見；3植片中度基質層混濁，虹膜紋理看不清；4植片重度基質混濁，只可見瞳孔；5植片完全混濁，前房看不入；評分在2分或以上者被判定為發(fā)生了免疫排斥反應。
(4)角膜植片組織病理學染色檢查角膜移植后第10天，每組處死3只大鼠，取其眼球，固定在10％的福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切片，每張切片5μm厚。染色時將石蠟切片在二甲苯中脫蠟5-10分鐘后換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。之后依次放入無水乙醇5分鐘，90％乙醇2分鐘，70％乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。然后將切片放入蘇木素染色液(北京中山生物試劑公司)中作用5-10分鐘后，浸入自來水中沖洗去多余的染色液，約10分鐘。用蒸餾水再洗滌5秒鐘后，放入95％乙醇中5秒，之后放入伊紅染色液(北京中山生物試劑公司)中染色30秒后，用95％乙醇脫水2分鐘，換用新鮮的95％乙醇再脫水2分鐘，二甲苯透明5分鐘，換用新鮮的二甲苯，再透明5分鐘。用中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。
(5)結果見表1不同組別之間角膜植片的存活時間采用單因素方差分析進行比較。
表1.植片存活時間的比較

接受供體角膜植片的所有受體均符合觀察條件。除了每組3只大鼠用于取材外，其余每組5只大鼠均完成了整個觀察。對照組角膜植片平均存活時間為8.00±1.58天，而NKT細胞治療組植片平均存活時間為26.00±1.34天，遠遠高于對照組(表1)。
角膜移植術后第10天，對照組所有植片均發(fā)生免疫排斥反應，表現(xiàn)為植片重度混濁水腫，新生血管長入角膜植片。而在NKT細胞治療組，所有植片均未發(fā)生排斥反應，植片清亮，虹膜新生血管清晰可見(圖3A、B)。
組織病理學檢查也證明對照組所有植片均發(fā)生排斥反應，角膜植片明顯水腫，大量炎性細胞浸潤，新生血管長入；而在NKT細胞治療組，所有角膜植片均未發(fā)生排斥反應，僅僅前部基質輕度水腫，可見少量炎性細胞，未見新生血管長入(圖4A、B)。
由上述結果可知NKT細胞結膜下注射，明顯延長了大鼠角膜植片的存活時間，可治療高危角膜移植免疫排斥反應。
通過上述具體的實施例，更容易理解本發(fā)明。上述實施例只是舉例描述，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.自然殺傷性T細胞在制備治療哺乳動物器官移植免疫排斥反應藥物中的用途。
2.根據(jù)權利要求1的用途，其中所述的器官移植是角膜移植。
3.根據(jù)權利要求2的用途，其中所述的角膜移植是高危角膜移植。
4.根據(jù)權利要求1-3中任何一項的用途，其中所述的哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明公開了自然殺傷性T(nature killer T cell，NKT)細胞在制備治療哺乳動物器官移植免疫排斥反應藥物中的用途，其中器官移植包括角膜移植、心臟移植、腎移植、胰島移植、皮膚移植等，優(yōu)選地是角膜移植，更優(yōu)選地是高危角膜移植；其中該藥物可用于哺乳動物，其中哺乳動物選自人、猴、狗、貓、大鼠、小鼠等，更優(yōu)選地哺乳動物是人。與其它免疫抑制劑相比，本發(fā)明的藥物具有應用次數(shù)少，局部使用副作用小、療效確切等特點，從而減少了長期應用免疫抑制劑如糖皮質激素引起青光眼、白內(nèi)障、肝腎損傷、感染以及腫瘤等副作用，而且該藥物容易獲得，使用方便，為臨床治療高危角膜移植提供了新的方法。
文檔編號A61P37/06GK101028285SQ20071000102
公開日2007年9月5日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權日2007年1月19日
發(fā)明者潘志強, 接英 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院, 北京市眼科研究所