專利名稱：從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物中提取藥用活性成分的綠色化學(xué)生產(chǎn)方法，更具體涉及從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法。
背景技術(shù)：
中國(guó)是世界上最主要的枇杷生產(chǎn)國(guó)，枇杷栽培面積和產(chǎn)量約占全球的2/3以上，其主產(chǎn)區(qū)為福建莆田、浙江塘棲和江蘇洞庭山。福建莆田現(xiàn)有枇杷種植面積16萬(wàn)畝，約占全球的1/6、全國(guó)的1/4和福建省的1/2。
枇杷全身皆寶，枇杷葉、花、果、核等部位富含三萜酸(可高達(dá)1.5％)、揮發(fā)油、苦杏仁苷、皂苷、黃酮、水溶性多糖和有機(jī)酸等活性成分。目前，枇杷是以鮮果供應(yīng)為主，尚未進(jìn)行其它部位的深度開發(fā)和綜合利用。
枇杷葉系薔薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]的葉子，富含熊果酸(Ursolic acid，UA)和齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)等三萜酸，性微寒，味苦辛，止咳平喘，清肺和胃，降氣化痰，收載于歷版中國(guó)藥典。傳統(tǒng)中醫(yī)臨床常以蜜炙枇杷葉或枇杷葉與其它中藥配伍成復(fù)方藥入藥，取得了一定的化痰止咳、消炎平喘等臨床療效。
熊果酸和齊墩果酸為兩個(gè)同分異構(gòu)體，為五環(huán)三萜類化合物，分子式為C30H48O3，性質(zhì)極為相似，在植物中常常共存，給分離測(cè)定帶來一定難度。紅外光譜根據(jù)區(qū)域A(1355～1392cm-1)和區(qū)域B(1245～1330cm-1)的碳?xì)湮諄韰^(qū)別骨架類型，齊墩果酸在A區(qū)有兩個(gè)峰，B區(qū)有三個(gè)峰，熊果酸在A區(qū)和B區(qū)各有三個(gè)峰，以此可區(qū)分兩者。
由于熊果酸和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成困難，國(guó)內(nèi)外均自中草藥或植物中提取。熊果酸和齊墩果酸均為白色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)310℃，無(wú)臭，無(wú)味，易溶于二氧六環(huán)吡啶，可溶于甲醇、乙醇等極性有機(jī)溶劑，微溶于氯仿、乙醚等脂溶性溶劑，不溶于石油醚和水。
熊果酸以游離形式或糖苷形式廣泛分布于約27個(gè)科62種植物，如山楂、熊果、烏梅、陸英、白花蛇舌草、枇杷葉、車前草、女貞子等植物中；齊墩果酸以游離形式或糖苷形式廣泛存在于約60個(gè)科190種植物，如遼東惚木、青葉膽、女貞子、枇杷葉、雪膽等植物中?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，熊果酸和齊墩果酸均具有消炎、增強(qiáng)免疫、抑制血小板凝集、降糖、抗癌等臨床藥理作用，是治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想藥物，且毒性低副作用少。
在枇杷產(chǎn)區(qū)，枇杷葉、花、核這些具有較高附加值的部分基本上被浪費(fèi)掉，沒有得到應(yīng)有的應(yīng)用。通常在不影響枇杷果生產(chǎn)的前提下，全國(guó)可年采收枇杷葉干品5萬(wàn)噸。因此，對(duì)枇杷葉進(jìn)行深度開發(fā)利用，有利于促進(jìn)枇杷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，對(duì)綜合利用枇杷資源，提高枇杷的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開發(fā)新產(chǎn)品，具有十分重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法。該制備方法采用親水性有機(jī)溶劑提取、除雜、活性炭脫色、沉淀分離，大孔吸附樹脂富集、純化，親水性有機(jī)溶劑萃取、結(jié)晶和重結(jié)晶處理等一系列分離純化集成技術(shù)，從枇杷葉中制備高純度熊果酸晶體，不僅制備工藝簡(jiǎn)單、分離純化效率高、容易工業(yè)化生產(chǎn)，而且制備的熊果酸純度高、生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法步驟為(1)枇杷葉總?cè)扑岬娜軇┨崛∫澡凌巳~為原料，采用5～20倍枇杷葉干重(W/W)的含水量不超過30％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑水溶液，于50～80℃條件下提取1～3次，每次1～3小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?2)枇杷葉總?cè)扑岬某s處理50～80℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉貌坏陀?倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑，水溶液充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱進(jìn)行活性炭脫色；(3)枇杷葉總?cè)扑岬某恋矸蛛x脫色后的濾液趁熱加入三萜酸溶解度調(diào)節(jié)劑，控制體系中親水性有機(jī)溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制罚?4)熊果酸的樹脂富集枇杷葉總?cè)扑岽制酚貌坏陀?倍量(W/W)的20～40％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑水溶液溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到0.5～5g/L；濾液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量(W/W)的水洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用不少于3倍樹脂量(W/W)的20～40％的親水性有機(jī)溶劑水溶液洗去中等極性雜質(zhì)，最后用不低于3倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑水溶液洗脫熊果酸；(5)熊果酸的沉淀分離熊果酸洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入熊果酸溶解度調(diào)節(jié)劑，控制洗脫液體系中親水性有機(jī)溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得熊果酸粗品；(6)熊果酸的結(jié)晶純化50～80℃條件下，熊果酸粗品用不低于3倍量(W/W)的親水性有機(jī)溶劑充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、室溫條件下水洗，得熊果酸結(jié)晶。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是
一本發(fā)明采用甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或異丙醇中的一種或幾種混合溶劑作為親水性有機(jī)溶劑從枇杷葉中提取熊果酸，優(yōu)點(diǎn)1甲醇、乙醇等親水性有機(jī)溶劑的溶解性能好，對(duì)枇杷葉細(xì)胞的穿透能力強(qiáng)，更容易滲透到枇杷葉內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)中，大大提高了枇杷葉中熊果酸的溶出速率和提取效率；優(yōu)點(diǎn)2熱的甲醇、乙醇等親水性有機(jī)溶劑對(duì)枇杷葉中熊果酸的溶解度很大，而對(duì)蛋白質(zhì)、多糖、精油、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)的溶解度較小，更利于后續(xù)進(jìn)一步的分離純化獲得高純度熊果酸。
二本發(fā)明優(yōu)先選用甲醇或丙酮作為親水性溶劑的優(yōu)點(diǎn)為雖然甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或異丙醇等親水性有機(jī)溶劑的分離效果相當(dāng)，但相對(duì)于其它親水性有機(jī)溶劑而言，甲醇或丙酮的沸點(diǎn)更低、溶劑回收時(shí)能耗更小、回收率更高，能顯著降低產(chǎn)品的制備成本。
三本發(fā)明充分利用大孔吸附樹脂對(duì)熊果酸的吸附力與對(duì)蛋白質(zhì)、多糖、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)的吸附力的不同，以及在親水性有機(jī)溶劑水溶液中，以熊果酸為主要成分的枇杷葉總?cè)扑崤c蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)的溶解度差異，真正達(dá)到熊果酸與雜質(zhì)的高效分離。
四與已有的文獻(xiàn)相比，本發(fā)明充分利用熊果酸可溶于甲醇和乙醇等極性有機(jī)溶劑、微溶于氯仿和乙醚等脂溶性溶劑、不溶于石油醚和水的特點(diǎn)，不采用硅膠柱層析技術(shù)，而直接采用親水性有機(jī)溶劑萃取、結(jié)晶和重結(jié)晶處理等方式去除雜質(zhì)，獲得高純度熊果酸，具有較大的推廣性。
五本發(fā)明組合采用采用親水性有機(jī)溶劑提取、除雜、活性炭脫色、沉淀分離，大孔吸附樹脂富集、純化，親水性有機(jī)溶劑萃取、結(jié)晶和重結(jié)晶處理等一系列分離純化集成技術(shù)，從枇杷葉中制備高純度熊果酸晶體，具有理論新穎、技術(shù)合理、操作安全、工藝簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)可行、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
按照本發(fā)明內(nèi)容所述的方法步驟實(shí)施從枇杷葉中分離純化熊果酸。
其中，步驟(6)中的熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用親水性有機(jī)溶劑重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。
所用的親水性有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或異丙醇中的一種或幾種混合溶劑，優(yōu)先選用甲醇或丙酮。
所用的大孔吸附樹脂的骨架的化學(xué)組成可以是聚苯乙烯和聚丙烯酸中的一種或兩種。
所用的三萜酸溶解度調(diào)節(jié)劑為無(wú)機(jī)酸水溶液、有機(jī)酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種，優(yōu)先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液；熊果酸溶解度調(diào)節(jié)劑為無(wú)機(jī)酸水溶液、有機(jī)酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種，優(yōu)先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液。
上述枇杷葉總?cè)扑崾切芄犷惢衔锘螨R墩果酸類化合物中的一種或幾種化合物。
經(jīng)測(cè)定，枇杷葉總?cè)扑岽制分行芄岬募兌取?5％；熊果酸粗品的純度≥80％；熊果酸結(jié)晶的純度≥95％；最終分離純化獲得的高純度熊果酸晶體的純度≥99％。
本發(fā)明理化參數(shù)測(cè)定方法如下枇杷葉總?cè)扑?、熊果酸和齊墩果酸的含量采用高效液相色譜儀測(cè)定。測(cè)定條件Agilent1100型高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測(cè)器)，Waters Nova-Pak C18色譜柱(Φ3.9×150mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸水溶液(92∶8)(V/V)，流速1.0mL/min，柱溫34℃，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220nm。熊果酸和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。
經(jīng)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)所用福建省莆田市出產(chǎn)的枇杷葉(含水量4.2％)中枇杷葉熊果酸含量為7.8～11.3g/kg。
本發(fā)明制備方法的實(shí)施例陳述如下實(shí)施例1以福建莆田產(chǎn)枇杷葉為原料，將鮮枇杷葉水洗、干燥(風(fēng)干、烘干或曬干均可)、粉碎、過20～30目篩得枇杷葉粉末，將2.6kg枇杷葉粉末放入提取罐中，用12倍枇杷葉粉末干重(W/W)的85％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液，于72℃條件下回流提取2小時(shí)，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?2℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?倍量(W/W)的pH值為10.9的90％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加1.3％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入35％鹽酸水溶液，控制體系中甲醇-丙酮(1∶1)水溶液終濃度達(dá)40％(W/W)和pH值為1.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制?。?jīng)測(cè)定，枇杷葉總?cè)扑岽制分行芄岬募兌?5.8％。
枇杷葉總?cè)扑岽制酚?倍量(W/W)的pH值為12.0的20％甲醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到0.5g/L；濾液采用HZ816大孔吸附樹脂，以0.96倍樹脂量/小時(shí)的上柱流速(V/V)，動(dòng)態(tài)吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用8倍樹脂量的30％乙醇水溶液(V/V)分成2次，在76r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下洗去中等極性雜質(zhì)，最后用3倍樹脂量的無(wú)水甲醇，以0.56倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗脫熊果酸，洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入30％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇終濃度達(dá)20％(W/W)和pH值為1.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。經(jīng)測(cè)定，熊果酸粗品的純度80.2％。
50℃條件下，米黃色熊果酸粗品用6倍量(W/W)的甲醇-丙酮(1∶1)溶劑充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、12℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶。經(jīng)測(cè)定，熊果酸結(jié)晶的純度95.6％。熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用甲醇重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.2％，枇杷葉中熊果酸回收率50.2％。
實(shí)施例2將20～30目經(jīng)過石油醚脫脂的枇杷葉粉末2.8kg放入提取罐中，用20倍枇杷葉粉末干重(W/W)的pH值為3.2的70％甲醇水溶液，于50℃條件下提取2次，每次3小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?5倍量(W/W)pH值為8.0的92％甲醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑幔o置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加0.5％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入50％硫酸水溶液，控制體系中甲醇終濃度達(dá)20％(W/W)和pH值為4.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰＝?jīng)測(cè)定，枇杷葉總?cè)扑岽制分行芄岬募兌?7.9％。
枇杷葉總?cè)扑岽制酚?倍量(W/W)的pH值為8.0的40％甲醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到5g/L；濾液在68r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，直接采用HZ801大孔吸附樹脂對(duì)浸膏進(jìn)行富集吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用6倍樹脂量的35％的甲醇水溶液(V/V)以1.0倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗去中等極性雜質(zhì)，最后用6倍樹脂量的80％甲醇水溶液(V/V)分成2次，在100r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入40％鹽酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇終濃度達(dá)40％(W/W)和pH值為4.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。經(jīng)測(cè)定，熊果酸粗品的純度82.5％。
80℃條件下，米黃色熊果酸粗品用3倍量(W/W)的甲醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、31℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；經(jīng)測(cè)定，熊果酸結(jié)晶的純度95.8％。熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用甲醇重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.1％，枇杷葉中熊果酸回收率52.3％。
實(shí)施例3將20～30目經(jīng)過二氧化碳超臨界萃取脫油處理的枇杷葉粉末2.9kg放入提取罐中，用5倍枇杷葉粉末干重(W/W)的無(wú)水甲醇，于80℃條件下回流提取2小時(shí)，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?0倍量(W/W)的pH值為8.9的80％甲醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加2.5％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入飽和檸檬酸水溶液，控制體系中甲醇終濃度達(dá)25％(W/W)和pH值為5.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制?。?jīng)測(cè)定，枇杷葉總?cè)扑岽制分行芄岬募兌?9.6％。
枇杷葉總?cè)扑岽制酚?0倍量(W/W)的pH值為9.3的20％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到0.5g/L；濾液采用HZ802大孔吸附樹脂，以0.59倍樹脂量/小時(shí)的上柱流速(V/V)，動(dòng)態(tài)吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用3倍樹脂量的40％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(V/V)以0.5倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗去中等極性雜質(zhì)，最后用9倍樹脂量的90％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(V/V)以1.05倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入飽和檸檬酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇-丙酮(1∶1)終濃度達(dá)20％(W/W)和pH值為5.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。經(jīng)測(cè)定，熊果酸粗品的純度84.2％。
72℃條件下，米黃色熊果酸粗品用8倍量(W/W)的甲醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、25℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；經(jīng)測(cè)定，熊果酸結(jié)晶的純度96.3％。熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用甲醇重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.0％，枇杷葉中熊果酸回收率52.6％。
實(shí)施例4將20～30目經(jīng)過6#溶劑脫脂處理過的枇杷葉粉末2.9kg放入提取罐中，用5倍枇杷葉粉末干重(W/W)的pH值為6.1的95％乙醇水溶液，于80℃條件下提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?倍量(W/W)的pH值為10.5的95％乙醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加2.5％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入20％酸性磷酸鹽緩沖溶液，控制體系中乙醇終濃度達(dá)20％(W/W)和pH值為3.8，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰?br> 枇杷葉總?cè)扑岽制酚?5倍量(W/W)的pH值為10.0的20％乙醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到4.3g/L；濾液采用D101大孔吸附樹脂，在75r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未以被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用7倍樹脂量的40％的乙醇水溶液(V/V)以1.03倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗去中等極性雜質(zhì)，最后用9倍樹脂量的80％乙醇水溶液(V/V)分成3次，在89r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，洗脫熊果酸，洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入20％酸性磷酸鹽緩沖溶液，控制洗脫液體系中乙醇終濃度達(dá)20％(W/W)和pH值為3.8，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
65℃條件下，米黃色熊果酸粗品用4倍量(W/W)的乙醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、20℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用乙醇重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.3％，枇杷葉中熊果酸回收率50.1％。
實(shí)施例5將20～30目枇杷葉粉末2.7kg放入提取罐中，用18倍枇杷葉粉末干重(W/W)的78％乙醇-異丙醇(2∶1)水溶液，于76℃條件下提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?6℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?倍量(W/W)的pH值為11.8的80％乙醇-異丙醇(2∶1)水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加0.9％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入28％鹽酸水溶液，控制體系中乙醇-異丙醇(2∶1)終濃度達(dá)32％(W/W)和pH值為3.3，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰?br> 枇杷葉總?cè)扑岽制酚?倍量(W/W)的pH值為10.8的28％乙醇-異丙醇(2∶1)水溶液溶(W/W)解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到1.8g/L；濾液采用DK110大孔吸附樹脂，以1.5倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)，動(dòng)態(tài)吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用12倍樹脂量的20％的乙醇水溶液(V/V)分成4次，在68r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下洗去中等極性雜質(zhì)，最后用15倍樹脂量的84％乙醇-異丙醇(1∶1)水溶液(V/V)分成3次，在90r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入28％鹽酸水溶液，控制洗脫液體系中乙醇-異丙醇(1∶1)終濃度達(dá)28％(W/W)和pH值為3.3，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
78℃條件下，米黃色熊果酸粗品用9倍量(W/W)的乙醇-丙酮(1∶2)充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、28℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用乙醇-丙酮(1∶1)重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.4％，枇杷葉中熊果酸回收率52.0％。
實(shí)施例6將20～30目枇杷葉粉末2.7kg放入提取罐中，用20倍枇杷葉粉末干重(W/W)的pH值為11.2的70％乙醇水溶液，于50℃條件下提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?倍量(W/W)的無(wú)水乙醇充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加0.5％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入32％鹽酸水溶液，控制體系中乙醇終濃度達(dá)40％(W/W)和pH值為2.6，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰?br> 枇杷葉總?cè)扑岽制酚?倍量(W/W)的pH值為11.5的40％乙醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到5.0g/L；濾液在50r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，直接采用大孔吸附樹脂HZ801∶HZ802(2∶1)對(duì)浸膏進(jìn)行富集吸附熊果酸至飽和，吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用5倍樹脂量的28％的乙醇水溶液(V/V)以0.65倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗去中等極性雜質(zhì)，最后用3倍樹脂量的無(wú)水乙醇以1.0倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入32％鹽酸水溶液，控制洗脫液體系中乙醇終濃度達(dá)40％(W/W)和pH值為2.6，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
50℃條件下，米黃色熊果酸粗品用15倍量(W/W)的乙醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、14℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用乙醇重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.3％，枇杷葉中熊果酸回收率51.8％。
實(shí)施例7以福建莆田產(chǎn)枇杷葉為原料，將鮮枇杷葉水洗、粉碎、過10～16目篩得枇杷葉漿料，將2.6kg(以干重計(jì))枇杷葉漿料放入提取罐中，用20倍枇杷葉干重(W/W)的pH值為6.5的70％丙酮水溶液，于50℃條件下提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?5倍量(W/W)的pH值為9.3的85％丙酮水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加2.5％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入40％硫酸水溶液，控制體系中丙酮終濃度達(dá)25％(W/W)和pH值為4.2，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰?br> 枇杷葉總?cè)扑岽制酚?2倍量(W/W)的pH值為9.0的35％丙酮水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到3.2g/L；濾液采用Amberlite XAD-4大孔吸附樹脂，以0.98倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)，動(dòng)態(tài)吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用12倍樹脂量的20％的丙酮水溶液(V/V)分成3次，在82r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下洗去中等極性雜質(zhì)，最后用6倍樹脂量的85％丙酮水溶液(V/V)分成3次，在85r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入40％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中丙酮終濃度達(dá)35％(W/W)和pH值為4.2，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
70℃條件下，米黃色熊果酸粗品用5倍量(W/W)的丙酮充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、20℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用丙酮重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，熊果酸白色晶體純度99.5％，枇杷葉中熊果酸回收率53.6％。
實(shí)施例8將20～30目枇杷葉粉末2.8kg放入提取罐中，用5倍枇杷葉粉干重(W/W)的無(wú)水丙酮，于80℃條件下回流提取2小時(shí)，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?倍量(W/W)的無(wú)水丙酮充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加1.1％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入50％硫酸水溶液，控制體系中親丙酮終濃度達(dá)38％(W/W)和pH值為2.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰?br> 枇杷葉總?cè)扑岽制酚?倍量(W/W)的pH值為9.8的40％丙酮水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到4.9g/L；濾液在100r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，直接采用HZ806大孔吸附樹脂對(duì)浸膏進(jìn)行富集吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用6倍樹脂量的40％的丙酮水溶液(V/V)分成2次，在75r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下洗去中等極性雜質(zhì)，最后用12倍樹脂量的80％丙酮水溶液(V/V)分成3次，在90r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入50％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中丙酮終濃度達(dá)40％(W/W)和pH值為2.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
80℃條件下，米黃色熊果酸粗品用3倍量(W/W)的丙酮充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、26℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用丙酮重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.4％，枇杷葉中熊果酸回收率52.9％。
實(shí)施例9將20～30目已脫脂處理的枇杷葉粉末2.6kg放入提取罐中，用15倍枇杷葉粉末干重(W/W)的84％甲醇-乙醇(5∶3)水溶液，于80℃條件下回流提取2小時(shí)，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?0℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉?倍量(W/W)的pH值為10.5的82％甲醇-乙醇(5∶3)水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加1.8％(W/V)活性炭進(jìn)行脫色；脫色后的濾液趁熱加入50％硫酸水溶液，控制體系中甲醇-乙醇(5∶3)終濃度達(dá)40％(W/W)和pH值為3.1，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制贰?br> 枇杷葉總?cè)扑岽制酚?倍量(W/W)的pH值為10.5的32％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到2.1g/L；濾液采用HZ803大孔吸附樹脂，以1.0倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)，動(dòng)態(tài)吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用4倍樹脂量的26％的甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(V/V)以0.75倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)洗去中等極性雜質(zhì)，最后用5倍樹脂量的95％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(V/V)以0.75倍樹脂量/小時(shí)的流速(V/V)，動(dòng)態(tài)洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入50％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇-乙醇(2∶5)終濃度達(dá)32％(W/W)和pH值為3.1，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
50℃條件下，米黃色熊果酸粗品用12倍量(W/W)的甲醇-乙醇(5∶3)充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、15℃條件下水洗，得白色熊果酸結(jié)晶；熊果酸結(jié)晶還可以進(jìn)一步在室溫條件下，用甲醇-乙醇(1∶1)重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，高純度熊果酸晶體純度99.8％，枇杷葉中熊果酸回收率53.8％。
以上實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。
本發(fā)明的一種從枇杷葉中分離純化高純度熊果酸的方法，工藝簡(jiǎn)單、分離純化效果好、產(chǎn)品收率高、生產(chǎn)成本低，對(duì)我國(guó)枇杷植物資源的合理利用和傳統(tǒng)中藥產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，解決“三農(nóng)”問題，均具有重要的社會(huì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
權(quán)利要求
1.一種從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述方法的步驟為(1)枇杷葉總?cè)扑岬娜軇┨崛∫澡凌巳~為原料，采用5～20倍枇杷葉干重(W/W)的含水量不超過30％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑水溶液，于50～80℃條件下提取1～3次，每次1～3小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铮?2)枇杷葉總?cè)扑岬某s處理50～80℃條件下，枇杷葉總?cè)扑崽崛∥镉貌坏陀?倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑，水溶液充分萃取枇杷葉總?cè)扑?，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱進(jìn)行活性炭脫色；(3)枇杷葉總?cè)扑岬某恋矸蛛x脫色后的濾液趁熱加入三萜酸溶解度調(diào)節(jié)劑，控制體系中親水性有機(jī)溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總?cè)扑岢恋怼?～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總?cè)扑岽制罚?4)熊果酸的樹脂富集枇杷葉總?cè)扑岽制酚貌坏陀?倍量(W/W)的20～40％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑水溶液溶解充分，過濾去除不溶物，調(diào)整濾液體系中熊果酸終濃度達(dá)到0.5～5g/L；濾液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附熊果酸至飽和，先用不少于3倍樹脂量(W/W)的水洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質(zhì)，再用不少于3倍樹脂量(W/W)的20～40％的親水性有機(jī)溶劑水溶液洗去中等極性雜質(zhì)，最后用不低于3倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機(jī)溶劑水溶液洗脫熊果酸；(5)熊果酸的沉淀分離熊果酸洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經(jīng)減壓回收部分溶劑后，加入熊果酸溶解度調(diào)節(jié)劑，控制洗脫液體系中親水性有機(jī)溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結(jié)晶、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾，得熊果酸粗品；(6)熊果酸的結(jié)晶純化50～80℃條件下，熊果酸粗品用不低于3倍量(W/W)的親水性有機(jī)溶劑充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養(yǎng)晶、過濾、室溫條件下水洗，得熊果酸結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述步驟(6)中的熊果酸結(jié)晶進(jìn)一步在室溫條件下，用親水性有機(jī)溶劑重結(jié)晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述親水性溶劑是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或異丙醇中的一種或幾種混合溶劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述親水性溶劑優(yōu)先選用甲醇或丙酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述三萜酸溶解度調(diào)節(jié)劑為無(wú)機(jī)酸水溶液、有機(jī)酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述三萜酸溶解度調(diào)節(jié)劑優(yōu)先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述熊果酸溶解度調(diào)節(jié)劑為無(wú)機(jī)酸水溶液、有機(jī)酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述熊果酸溶解度調(diào)節(jié)劑優(yōu)先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于大孔吸附樹脂骨架的化學(xué)組成是聚苯乙烯或聚丙烯酸中的一種或兩種。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特征在于所述高純度熊果酸晶體的純度≥99％。
全文摘要
本發(fā)明提供從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法。該制備方法的特征在于以枇杷葉為原料，采用親水性有機(jī)溶劑水溶液提取、減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總?cè)扑崽崛∥?；三萜酸提取物?jīng)過溶劑除雜、活性炭脫色、沉淀分離，制得熊果酸純度≥25％的枇杷葉總?cè)扑岽制?；三萜酸粗品?jīng)樹脂富集純化、沉淀分離，制得熊果酸純度≥80％的米黃色熊果酸粗品；熊果酸粗品經(jīng)親水性有機(jī)溶劑萃取、結(jié)晶純化和重結(jié)晶處理，最后制得高純度熊果酸晶體。經(jīng)測(cè)定，白色熊果酸晶體的純度≥99％。本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單、分離純化效率高、容易工業(yè)化生產(chǎn)、制備的熊果酸純度高、生產(chǎn)成本低，具有現(xiàn)代中成藥的“三高”、“三小”和“三便”等優(yōu)點(diǎn)，具有較大推廣性。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101037467SQ200710008809
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者陳劍鋒, 陳浩 申請(qǐng)人:福州大學(xué)