專利名稱：巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病藥物或保健品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。尤其涉及巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病藥物或保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是嚴重危害人們身體健康的疾病，目前全球大約有10億人因神經(jīng)系統(tǒng)的損傷而患病。神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病包括多種疾病，如常見的老年性癡呆(alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(parkinson disease，PD)等。此類疾病大多呈進行性發(fā)展，是一類病因?qū)W和發(fā)病機制尚不清楚的疾病。其病理特點為具有特定功能的神經(jīng)核團發(fā)生萎縮和神經(jīng)元丟失。臨床上，對于這類疾病尚無有效控制病程進展的措施，患者最終將喪失生活能力甚至死亡。
目前，隨著社會的進步、老年人口的比例和數(shù)量不斷增加，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病已經(jīng)成為影響我國人口健康水平和生活質(zhì)量的重大社會問題。對于神經(jīng)退行性疾病治療目前國內(nèi)外主要集中在三個方面(1)在實驗室里將未分化的神經(jīng)干細胞(NSC)培養(yǎng)為適合移植到病人體內(nèi)的已分化細胞?；蛘咧苯訉SC移植到體內(nèi)，由體內(nèi)的信號引導(dǎo)分化為成熟的合適的腦細胞。(2)發(fā)現(xiàn)生長激素、營養(yǎng)因子和藥物，激活病人自身的干細胞和體內(nèi)的修復(fù)機制來修復(fù)由疾病或損傷引起的損害。(3)利用去分化現(xiàn)象對神經(jīng)損傷和退行性疾病進行治療。
目前，用于神經(jīng)退行性疾病的防治藥物包括中樞興奮劑、改善膽堿能的物質(zhì)、腦血液循環(huán)改善劑、中草藥及吡咯烷酮類化合物等，但是它們多存在療效差、特異性不強，和毒副作用大等缺點。臨床治療和保健領(lǐng)域急需安全有效的針對神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物和功能性產(chǎn)品。
巖藻聚糖硫酸酯，英文名稱Fucoidan，也稱為褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖膠、巖藻聚糖等，是一種水溶性雜聚糖，其主要組分是α-L-巖藻糖-4-硫酸酯，其次還伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)等。研究表明，巖藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抗慢性腎衰、抗腫瘤、抗病毒、促進組織再生、抑制胃潰瘍、增強機體免疫機能等多種生理活性。
日本、美國、挪威等國家從我國傳統(tǒng)中藥昆布受到啟發(fā)，特別是從我國沿海居民食用海藻后能軟化血管、抗腫瘤，增強人體免疫功能等方面受到啟示，開展了海藻抗病治病有效成分的分離制備，從褐藻中提取分離得到了巖藻多糖硫酸酯，研究了從海藻中單一提取褐藻多糖酯的制備工藝以及褐藻多糖酯抗凝血、降血脂、抗腫瘤和抗HIV的實驗室動物實驗，取得了很好的結(jié)果。
我國的科研人員和相關(guān)企業(yè)也在巖藻聚糖硫酸酯的研究、生產(chǎn)及應(yīng)用方面做了大量的工作。但是，經(jīng)文獻檢索，目前國內(nèi)外有關(guān)巖藻聚糖硫酸酯在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的研究及應(yīng)用還罕有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病藥物或保健品中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的應(yīng)用是依據(jù)巖藻聚糖硫酸酯具有促進神經(jīng)前體細胞去分化，促進神經(jīng)干細胞增殖和促進神經(jīng)細胞損傷修復(fù)及保護神經(jīng)細胞免受損傷的研究結(jié)果。
巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷藥物中的應(yīng)用。
以巖藻聚糖硫酸酯為活性成分制成的組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷藥物中的應(yīng)用。
巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病和預(yù)防認知損傷的保健品中的應(yīng)用。
以巖藻聚糖硫酸酯為活性成分制成的組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病和預(yù)防認知損傷的保健品中的應(yīng)用。
上述巖藻聚糖硫酸酯是以α-L-巖藻糖-4-硫酸酯為主要組分的高分子雜多糖，根據(jù)不同來源伴有含量不等的少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)等。
本發(fā)明所述的巖藻聚糖硫酸酯的主要來源是從海帶、巨藻、馬尾藻、羊棲菜、墨角藻等褐藻和海參等海洋無脊椎動物中分離提取，以及從市場上購買獲得。分離純化方法的主要步驟包括酶解、水提，濃縮、醇沉、柱層析、冷凍干燥等。
上述神經(jīng)退行性疾病是指以神經(jīng)元凋亡為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
其中上述神經(jīng)退行性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茲海默癥、帕金森氏綜合癥、享廷頓氏癥、脊-小腦共濟失調(diào)III病的一種或多種。
上述認知損傷是指由遺傳、疾病、衰老、藥物、醫(yī)療、外傷、社會和心理的一種或多種因素造成的心理和生理損傷。
上述藥物是指通過多種途徑和方式給藥的制劑。
其中上述制劑是注射劑、口服制劑、外用制劑、噴霧劑、透皮制劑之一。
其中所述制劑優(yōu)選是片劑、膠囊劑、注射劑之一。
上述保健品是食品、飲品、化妝品之一。
本發(fā)明所述的巖藻聚糖硫酸酯可以根據(jù)不同制劑的具體要求，以一定量的純品或一定純度的制品作為活性成分制備成各種藥物組合物，輔以藥學上可接受的各種載體，這些藥學可接受的載體可以是在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛用于藥物中的各種載體。所述的藥物組合物可以按現(xiàn)有技術(shù)已知的方法如混合、制粒、壓片來制備。所述的藥物組合物還可以包括各種藥學使用的任選輔助組分，如香味劑、著色劑、甜味劑等。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)及本發(fā)明所述巖藻聚糖硫酸酯的作用效果，申請人利用巖藻聚糖硫酸酯進行了細胞和動物藥理實驗。實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述的巖藻聚糖硫酸酯對于神經(jīng)前體細胞具有顯著的去分化作用，對正常神經(jīng)干細胞及具有顯著神經(jīng)干細胞特征的神經(jīng)細胞有明顯的增殖作用，并有利于神經(jīng)元細胞間突觸的聯(lián)結(jié)和建立及修復(fù)；對缺氧、谷氨酸等外界因素導(dǎo)致的神經(jīng)細胞損傷具有良好的保護和修復(fù)作用。
上述發(fā)現(xiàn)從機理上表明，巖藻聚糖硫酸酯對于老年癡呆、帕金森病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的病理、病理生理變化具有良好的改善作用，對各類神經(jīng)細胞的損傷具有良好的保護和修復(fù)作用。預(yù)示巖藻聚糖硫酸酯在制備治療和預(yù)防神經(jīng)退行性疾病及認知損傷的藥物或保健品中有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。
具體實施例方式
實施例1以新鮮刺參為原料制備巖藻聚糖硫酸酯。
新鮮刺參，去除內(nèi)臟，洗凈，破碎成1cm3的左右的小塊，加入5-15倍水勻漿。
勻漿液分別經(jīng)胃蛋白酶(酶量為海參濕重的0.4％，pH2.0-2.5，溫度50℃，時間5h)、胰蛋白酶(酶量為海參濕重的0.45％，pH8.0-8.5，溫度50℃，時間5h)酶解，酶解完后，煮沸滅酶活，離心(10000r/min，10min)取上清液。
上清液醇沉，離心(6000r/min，15min)得沉淀物，再用蒸餾水溶解，經(jīng)DEAE纖維素柱分離，210nm檢測吸收峰，收集活性組分(以對神經(jīng)細胞的活性為指標)，并凍干。
將凍干的巖藻聚糖及其硫酸酯再用蒸餾水溶解，經(jīng)凝膠柱分離，210nm檢測吸收峰，收集活性組分(以對神經(jīng)細胞的活性為指標)。
活性物質(zhì)經(jīng)sephadexG-25脫鹽后凍干，得純巖藻聚糖硫酸酯。
實施例2以海帶為原料制備巖藻聚糖硫酸酯淡干海帶清洗、干燥、粉碎。稱取一定重量的粉末(50g)，加入5倍體積(250ml)無水乙醇回流提取兩次，每次2小時，離心后將沉淀置于表面皿上揮干乙醇。
用5倍體積丙酮(250ml)將海帶粉回流提取兩次，每次2小時，離心取沉淀并揮干丙酮。加入40倍的水(2000ml)70℃水浴條件下浸提5小時，紗布過濾得浸提液。加入20倍的鹽酸，pH＝6，60℃條件下浸提6小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。30％乙醇醇沉過夜，離心保留上清液。60％乙醇醇沉過夜離心保留沉淀。冷凍干燥得褐藻糖膠粗品。乙醇洗滌或重結(jié)晶的精制品，柱層析法得純品。
實施例3巖藻聚糖硫酸酯對神經(jīng)前體細胞的去分化作用。
取孕13.5～14天的Wistar大鼠，頸椎脫臼處死。
無菌條件下分離、取出胚胎，在無菌培養(yǎng)皿中，于解剖顯微鏡下分離，獲取神經(jīng)細胞。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)48h后進行分組實驗。
神經(jīng)細胞在96孔板中培養(yǎng)48小時后，分別加入5mg/ml實施例1制備的巖藻聚糖硫酸酯，使巖藻聚糖硫酸酯的終濃度分別為100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，設(shè)陰性對照組(空白)，和神經(jīng)生長因子陽性對照組。37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)48小時。
分析結(jié)果表明，巖藻聚糖硫酸酯對神經(jīng)細胞具有明顯的去分化作用。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，加入巖藻聚糖硫酸酯的神經(jīng)細胞，神經(jīng)突觸逐漸消失，有大量神經(jīng)球出現(xiàn)，而且各個神經(jīng)球之間有明顯的神經(jīng)纖維連接建立。神經(jīng)球細胞nestin染色強陽性，未加入巖藻聚糖硫酸酯的對照樣本和加入神經(jīng)生長因子的樣本nestin染色弱陽性。
實施例4巖藻聚糖硫酸酯對神經(jīng)前體細胞的增殖作用。
取孕13.5～14天的Wistar大鼠，頸椎脫臼處死。
無菌條件下分離、取出胚胎，在無菌培養(yǎng)皿中，于解剖顯微鏡下分離，獲取神經(jīng)細胞。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)48h后進行分組實驗。
神經(jīng)細胞在96孔板中培養(yǎng)48小時后，分別加入5mg/ml實施例1制備的巖藻聚糖硫酸酯，使巖藻聚糖硫酸酯的終濃度分別為100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，設(shè)陰性對照組(空白)，和神經(jīng)生長因子陽性對照組。37℃，5％二氧化碳飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
分析結(jié)果表明，巖藻聚糖硫酸酯對在對神經(jīng)前體細胞產(chǎn)生去分化作用的過程中，也表現(xiàn)出了明顯的促進增殖作用。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，加入巖藻聚糖硫酸酯的神經(jīng)前體細胞發(fā)生聚團現(xiàn)象，細胞團隨巖藻聚糖硫酸酯的濃度增加和培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大，變得致密。神經(jīng)球細胞nestin染色強陽性，未加入巖藻聚糖硫酸酯的對照樣本和加入神經(jīng)生長因子的樣本nestin染色弱陽性。
實施例5巖藻聚糖硫酸酯對神經(jīng)細胞氧化性損傷的保護作用。
取孕13.5-14天的Wistar大鼠，頸椎脫臼處死。
無菌條件下分離、取出胚胎，在無菌培養(yǎng)皿中，于解剖顯微鏡下分離，獲取神經(jīng)細胞。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)48h后進行分組實驗。
神經(jīng)細胞在96孔板中培養(yǎng)48小時后，分別加入5mg/ml實施例1制備的巖藻聚糖硫酸酯，使巖藻聚糖硫酸酯的終濃度分別為100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，設(shè)正常對照組。
培養(yǎng)12小時后，每孔加入谷氨酸培養(yǎng)液，使谷氨酸的終濃度為2mmol/ml，37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)36小時后，進行測定。
結(jié)果表明，巖藻聚糖硫酸酯對神經(jīng)細胞谷氨酸氧化性損傷有明顯保護作用，其保護作用隨作用濃度的增大而增大，200μg/ml以上可以拮抗谷氨酸對神經(jīng)細胞的損傷作用。谷氨酸損傷在多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮著重要作用，巖藻聚糖硫酸酯對這種損傷的保護作用表明，巖藻聚糖硫酸酯可以有效用于神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療。
實施例6巖藻聚糖硫酸酯注射劑的制備。
處方以重量百分比計，巖藻聚糖硫酸酯40％，甘露醇60％。
制備方法(1)安瓿洗滌干凈，干燥滅菌；(2)稱取巖藻聚糖硫酸酯40克，甘露醇60克，攪拌溶解；(3)補加注射用水至處方量，用0.22μm微孔濾膜過濾；(4)中間品檢驗；(5)灌裝，每支2ml，熔封；(6)100℃流通蒸汽滅菌30分鐘；(7)安全性檢查。
實施例7巖藻聚糖硫酸酯口服片劑制備。
上述片劑主要有巖藻聚糖硫酸酯及輔料組成，其中輔料可以是填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑中的部分或全部，輔料的用量不超過巖藻聚糖及其硫酸酯總重量的8倍。
優(yōu)選的制片處方以重量份計，巖藻聚糖硫酸酯100份填充劑100份速崩劑90份粘合劑80份潤滑劑6份其中填充劑可以是磷酸氫鈣、糊精或乳糖；速崩劑可以是L-HPC或干淀粉；粘合劑可以是PVP溶液或淀粉漿；潤滑劑是硬脂酸鎂。
片劑的生產(chǎn)工藝是按處方量，稱取巖藻聚糖硫酸酯，加入填充劑、速崩劑，混合均勻，然后加入處方量的粘合劑混合制成濕粒，低溫40-65℃干燥，再加入潤滑劑混合均勻，壓片，最后用高分子衣料(如HPMC、EC、MC)包薄膜衣。
實施例8巖藻聚糖硫酸酯膠囊劑制備。
上述膠囊劑主要有巖藻聚糖硫酸酯及輔料組成，其中輔料可以是填充劑、崩解劑、粘合劑中的部分或全部，輔料的用量不超過巖藻聚糖硫酸酯總重量的5倍。
優(yōu)選的制片處方以重量份計，巖藻聚糖硫酸酯100份填充劑80份速崩劑80份粘合劑60份其中填充劑可以是磷酸氫鈣、糊精或乳糖；速崩劑可以是L-HPC或干淀粉；粘合劑可以是PVP溶液或淀粉漿。
上述膠囊劑的生產(chǎn)工藝是按處方量，稱取巖藻聚糖硫酸酯，加入填充劑、速崩劑，混合均勻，然后加入處方量的粘合劑混合制成濕粒，低溫40-65℃干燥，粉碎后，以處方量用膠囊裝料，得巖藻聚糖硫酸酯膠囊劑。
實施例9巖藻聚糖及其硫酸酯飲料制備。
處方以重量百分比計，巖藻聚糖及其硫酸酯40％，蒸餾水60％。
制備方法以常規(guī)飲料制備工藝，將上述重量百分比的巖藻聚糖及其硫酸酯與蒸餾水混合，以市場供應(yīng)對象不同，分別添加常規(guī)量的香味劑、著色劑、甜味劑，制成500ml、1250ml、2000ml包裝的飲料。
權(quán)利要求
1.巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷藥物中的應(yīng)用。
2.以巖藻聚糖硫酸酯為活性成分制成的組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷藥物中的應(yīng)用。
3.巖藻聚糖硫酸酯在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷保健品中的應(yīng)用。
4.以巖藻聚糖硫酸酯為活性成分制成的組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷保健品中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的應(yīng)用，其特征是所述神經(jīng)退行性疾病是指以神經(jīng)元凋亡為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾??；所述認知損傷是指由遺傳、疾病、衰老、藥物、醫(yī)療、外傷、社會和心理的一種或多種因素造成的心理和生理損傷。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是所述神經(jīng)退行性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茲海默癥、帕金森氏癥、享廷頓氏癥、脊-小腦共濟失調(diào)III病的一種或多種。
7.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是所述藥物是指通過多種途徑和方式給藥的制劑。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是所述制劑是注射劑、口服制劑、外用制劑、噴霧劑、透皮制劑之一。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是所述制劑是片劑、膠囊劑、注射劑之一。
10.如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征是所述保健品是食品、飲品、化妝品之一。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巖藻聚糖硫酸酯或以巖藻聚糖硫酸酯為活性成分制成的組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷藥物中的應(yīng)用。同時還公開了巖藻聚糖硫酸酯或以巖藻聚糖硫酸酯為活性成分制成的組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病和認知損傷保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明所述巖藻聚糖硫酸酯的來源主要是海帶等褐藻、海參等海洋無脊椎動物，原料來源廣泛，易于產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化生產(chǎn)，有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A61K9/08GK101040867SQ20071001458
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者吉愛國, 宋淑亮, 宋迪 申請人:山東大學