專利名稱：：優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微生物是與人類關(guān)系密切的一類微小生物體，具有種類的多樣性和功能的復(fù)雜性.在藥物的研發(fā)中某些微生物發(fā)揮了十分重要的作用，微生物藥物研發(fā)的主要環(huán)節(jié)包括菌種的選育，發(fā)酵工藝優(yōu)化，提取與精制工藝的研咒等。早在十九世紀(jì)人們就發(fā)現(xiàn)被溶血性鏈球菌感染的癌癥患者腫塊自然消退的現(xiàn)象，人們先后發(fā)現(xiàn)很多微生物及其制劑有一定的藥理活性。腸球菌屬在1984年從鏈球菌屬中分離出來成為獨(dú)立的新菌屬，現(xiàn)根據(jù)DNA同源性，發(fā)現(xiàn)過去被劃分為D群鏈球菌的腸球菌與鏈球菌屬同源程度低，故將其列為腸球菌屬，仍屬鏈球菌科。依據(jù)Facklam和Collins的分類，腸球菌屬內(nèi)包括十二個(gè)種及一個(gè)變異抹，它們是糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium)、鳥腸球菌(E.avium)、酪黃腸球菌(E.casseliflavus)、堅(jiān)忍腸J求菌(E.durans)、雞腸球菌(E.galinarum)、芒地腸球菌(E.,ndii)、惡臭腸球菌(E,maladoratum)、希拉腸球菌(E.hirae)、孤立腸球菌(E.solitarius)、棉子糖腸-求菌(E.raffinosus)、假鳥腸球菌(E.pseudoavium)、糞腸球變異林(E.faecalisvar)。糞腸球菌為腸球菌屬中最常見的即為代表種，糞腸球菌又叫糞鏈球菌菌形圓或橢圓，可順鏈的方向延長，直徑O.5-1.0微米，大多數(shù)成雙或短鏈狀排列，通常不運(yùn)動(dòng)。在豐富培養(yǎng)基上菌落大而光滑，直徑l-2mm,全緣，罕見色素。其營養(yǎng)要求低，在普通營養(yǎng)瓊脂上也可生長。能在1(TC或45。CpH9.6或含6.5。/。NaCl肉湯培養(yǎng)基中生長，并能耐65。C30分鐘。它可利用精氨酸為能源，發(fā)酵山梨醇，不發(fā)酵阿拉伯糖。在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基上生長不需葉酸。糞腸球菌生活在人體腸道里，通常對(duì)人體不僅無害而且有益。但它有時(shí)也會(huì)引發(fā)嚴(yán)重感染，并對(duì)抗生素有抵抗力。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道糞腸球菌代謝產(chǎn)物具有一定的藥理作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種采用優(yōu)良糞腸球菌的發(fā)酵液在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法，其特殊之處在于所述的優(yōu)良糞腸球菌的篩選方法如下在健康人腸道中采集標(biāo)本，涂布在血平板上，37。C靜置培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑菌落周圍無溶血圈的菌落，顯微鏡觀察確認(rèn)為糞腸球菌后，采用單菌落分離純化；將分離得到的一系列糞腸球菌培養(yǎng)在下列培養(yǎng)基中葡萄糖0.5%,胰胨0.4°/。，蛋白胨0.6%,酵母膏0.3%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,水100mi,pH7.2。37。C靜置培養(yǎng)三日后，離心，將上清液或其稀釋液疊加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定時(shí)間內(nèi)觀察沉淀環(huán)的出現(xiàn)及環(huán)的厚薄，以判斷菌林產(chǎn)生多肽的能力，選擇產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)的菌林；再將產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)的菌抹的菌液lml注射于健康家兔皮內(nèi)，觀察紅腫、潰瘍的出現(xiàn)，判斷菌抹毒性大??；最終選擇產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毒性低，細(xì)菌及菌落形態(tài)較典型的糞腸球菌作為生產(chǎn)菌抹；該菌種已于2007年10月19日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.2220;所述的優(yōu)良糞腸球菌的發(fā)酵制備工藝如下(一)發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8%,酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.9%,氯化鈉0.2-0.6%;經(jīng)滅菌溫度105-125°C，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用。(1).一級(jí)發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10%接種量接入滅菌后的一級(jí)發(fā)酵罐。罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢?，?5-40。C恒溫培養(yǎng)10-50小時(shí)；(2).二級(jí)發(fā)酵罐將一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20%接種量接入滅菌后的二級(jí)發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢?；?5-35。C恒溫培養(yǎng)50-100小時(shí)。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到70-120°C，保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐。(二)提純過程(1).發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1:15-25，控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液。(2).濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0%及活性炭2-4.0%加入進(jìn)行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液。(3).濃縮液加入80-99%乙醇，體積量比控制在1:1.5-1:5.5或酌情而定。充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準(zhǔn)確量取清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢?，靜置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH,離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測(cè)合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時(shí)，即得到糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。優(yōu)良糞腸球菌的應(yīng)用，其特殊之處在于根據(jù)優(yōu)良糞腸球菌發(fā)酵制備的發(fā)酵液，是將糞腸球菌進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)，篩選出生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的菌抹作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵，將發(fā)酵液精制提純得到的；所述的發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗腫瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干細(xì)胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善記憶功能、緩解視疲勞功能、促進(jìn)排鉛功能、清咽功能、降血壓功能、改善睡眠功能、促進(jìn)泌乳功能、緩解體力疲勞功能、提高缺氧耐受力功能、對(duì)輻射危害有保護(hù)功能、減肥功能、改善生長發(fā)育功能、增加骨密度功能、改善營養(yǎng)性貧血功能、對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)功能、祛痤瘡功能、祛黃褐斑功能、改善皮膚水分功能、改善皮膚油份功能、調(diào)節(jié)腸道菌群功能、促進(jìn)消化功能、通便功能、對(duì)胃粘膜損傷有保護(hù)功能等多方面的作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將糞腸球菌進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)和篩選，通過研究其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、遺傳穩(wěn)定性、中試生產(chǎn)指標(biāo)等內(nèi)容，優(yōu)選出其中生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的菌抹作為生產(chǎn)菌種，并形成規(guī)模化生產(chǎn)。附件材料1:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏菌種保藏受理通知書復(fù)印件。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2007年10月19日，保藏編號(hào)2"0，分類命名糞腸球菌Enterococcusfaecalis。附件材料2:糞腸球菌的檢測(cè)鑒定報(bào)告。具體實(shí)施方案一、菌種選育在健康人腸道中采集標(biāo)本，涂布在血平板上，37。C靜置培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑菌落周圍無溶血圈的菌落，顯微鏡觀察確認(rèn)為糞腸球菌后，采用單菌落分離純化。將分離得到的一系列糞腸球菌培養(yǎng)在下列培養(yǎng)基中葡萄糖0.5%,胰胨O.4%,蛋白胨O.6%，酵母膏O.3%，牛肉膏O.5%,氯化鈉O.5°/,水100ml,pH7.2。37。C靜置培養(yǎng)三日后，離心，將上清液或其稀釋液疊加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定時(shí)間內(nèi)觀察沉淀環(huán)的出現(xiàn)及環(huán)的厚薄，以判斷菌林產(chǎn)生多肽的能力，選擇產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)的菌株。再將產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)的菌林的菌液lml注射于健康家兔皮內(nèi)，觀察紅腫、潰瘍的出現(xiàn)，判斷菌抹毒性大小。最終選擇產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毒性低，細(xì)菌及菌落形態(tài)較典型的糞腸球菌作為生產(chǎn)菌株。該菌種已于2007年10月19曰由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.2220。篩選出的糞腸球菌的特征是l.革蘭氏染色革蘭氏染色呈陽性"G"，2.形態(tài)特征菌株細(xì)胞呈球形或卵圓形，細(xì)胞大小為0.6~0.7|amxl.6~1.8pm，細(xì)胞生長中度，不太飽滿。3.培養(yǎng)特征菌抹在血平板或有機(jī)物平板上菌落有圓形，也有小顆粒狀，有突起，有光澤，略有粘性，半透明，生長中度，菌膜較薄，乳脂色，無色素產(chǎn)生。4.生理生化特征見表l、2表l、菌株的生理生化特征_^_溶血現(xiàn)象l(TC生長45'C生長3%NaCL生長5%NaCL生長6.5%NaCL生長接觸酶反應(yīng)牛奶凝固牛奶胨化明膠液化膽鹽V-P反應(yīng)-引噪反應(yīng)七葉靈反應(yīng)精氨酸水解酶產(chǎn)生B-葡萄糖酸苷酸酶產(chǎn)生萌林_無溶血現(xiàn)象表2、菌株的糖利用試驗(yàn)菌株_糖類產(chǎn)酸纖維二糖苦杏仁鼠李糖棉子糖密二糖松三糖木糖乳糖水楊苷阿拉伯糖+++++++++糖醇糖糖露露芽甘甘麥果10本發(fā)明優(yōu)選出其中生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的菌抹作為生產(chǎn)菌種，并形成規(guī)模化生產(chǎn)(表3)。表3糞腸球菌菌抹發(fā)酵周期及多肽含量情況<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>二、具體制備工藝(一)菌種制備以經(jīng)過精心選育的糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種。糖醇糖糖糖藻梨乳海山核菊半1.斜面種子制備按配比配制斜面培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%，葡萄糖0.1-0.8%,氯化鈉0.2-0.6%,瓊脂1-5%,綿羊血5-10%;pH7.0-7.4;斜面培養(yǎng)基經(jīng)在溫度105-125。C,時(shí)間20-30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后待用；啟封菌種冷凍管，在無菌條件下接入血斜面，接種后置25-40。C恒溫培養(yǎng)24-30小時(shí)。2.搖瓶種子液制備按配比配制搖瓶培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%,蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖O.l-O.8%,氯化鈉O.2-0.6%;pH7.0-7.4;搖瓶培養(yǎng)基經(jīng)在溫度105-125°C,時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后待用；將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下按1-9%接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基內(nèi)，25-40。C恒溫培養(yǎng)10-30小時(shí)。(二)發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8%,酵母膏0.2-0.8°/。，蛋白胨0.3-0.8%，葡萄糖0.l-O.9%，氯化鈉0.2-0.6%;經(jīng)滅菌溫度105-125。C,時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用。1.一級(jí)發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10%接種量接入滅菌后的一級(jí)發(fā)酵罐。罐壓不超過0.02Mpa,通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢?，?5-40。C恒溫培養(yǎng)10-50小時(shí)；2.二級(jí)發(fā)酵罐將一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20%接種量接入滅菌后的二級(jí)發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢瑁辉?5-35。C恒溫培養(yǎng)50-100小時(shí)。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到70-120°C,保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐。(三)提純過程1.發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在l:15-25,控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液。2.濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0%及活性炭2-4.0%加入進(jìn)行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液。3.濃縮液加入80-99%乙醇，體積量比控制在l:1.5-1:5.5或酌情而定。充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0,得到溶解液并將溶解液靜置。再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準(zhǔn)確量取清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢瑁o置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH,離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測(cè)合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時(shí)，即得到糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。三、上述方法得到的糞腸球菌發(fā)酵物的檢驗(yàn)[性狀]本品為白色或微黃色無定形粉末；無臭、無味。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。比旋度取本品，精密稱定，加水溶解并稀釋成每lml中約含10mg的溶液，依法測(cè)定(中國藥典2000年版二部附錄vIE),比旋度為+7(TC至十80。C。[鑒別]1、取本品10mg，加水O.5ml使溶解，加a—萘酚乙醇溶液(5-100)lml，搖勻，沿管壁緩緩加硫酸O.5ml，數(shù)分鐘后，界面呈紫紅色。2、取本品，加水制成每lml中含lmg的溶液，取約10ul點(diǎn)于濾紙上，晾干，用無水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸鈉溶液1.5ml與乙醇100ml,混勻即得。置暗處保存，可使用數(shù)月)中浸泡5分鐘，取出，用70%乙醇溶液沖洗，置還原液(取硪化鉀5g，硫代硫酸鈉5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L鹽酸液2.5ml,隨加隨攪拌，臨用時(shí)配)中浸泡5分鐘，取出，用70%乙醇溶液沖洗，置品紅亞硫酸試液中浸泡約30分鐘，取出，用焦亞硫酸鈉溶液(取焦亞石危酸鈉0.4g,加鹽酸ltnl,加水溶解^f吏成100ml，即得)，沖洗，晾干，在濾紙片點(diǎn)樣處應(yīng)呈紫紅色。3、取供試品和對(duì)照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每lml中含lmg的溶液作為供試品溶液和對(duì)照品溶液，按免疫原性測(cè)定法試驗(yàn)，供試品和對(duì)照品管應(yīng)均無溶血發(fā)生。[檢查]1、酸度取本品，加水制成每lml中含IOmg的溶液，依法測(cè)定(中國藥典2000年版二部附錄VIH),pH值應(yīng)為3.0-5.0。2、吸收度取本品，加水制成每lml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VIA),在260nm的波長處，其吸收度不得大于O.25，在280nm的波長處，其吸收度不得大于0.20。3、總氮量取本品，照氮測(cè)定法(中國藥典2000年版二部附錄VHD第二法)測(cè)定.按干燥品計(jì)算，含總氮量應(yīng)為O.8-2.0%。4、免疫原性取供試品和對(duì)照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每lml中含10mg的溶液，再分別用磷酸鹽緩沖液制成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的稀釋液作為供試品溶液和對(duì)照品溶液，依法檢查(附免疫原性測(cè)定法)，供試品不溶血管的最低濃度應(yīng)不得高于對(duì)照品相應(yīng)濃度的一倍以上。5、干燥失重取本品，在105。C干燥至恒重，減失重量不得過5.0%(中國藥典2000年版二部附錄VIHL)。6、重金屬取本品，在1.0g,依法檢查(中國藥典2000年版V111H)含重金屬不得過百萬分之二十。7、異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每lml中含0.5mg的溶液，依法檢查(中國藥典2000年版附錄XIC).按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定(供注射用)。四、發(fā)酵物中有效成分含量測(cè)定1.對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105T千燥至恒重的D—甘露糖對(duì)照品0.lg置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度.搖勻；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，搖勻.每lml中含甘露糖50ug。2.供試品溶液的制備取本品適量，精密稱定，加水溶解制成每lml中含40ug的溶液。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對(duì)照品溶液O、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml,分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再加3%苯酚溶液1.Oml,搖勻，沖入石危酸4.5ml,搖勻，放置于室溫，以O(shè)管為空白.照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA)在490nm的波長處測(cè)定吸收度。以甘露糖ug數(shù)對(duì)相應(yīng)的吸收度，計(jì)算回歸方程。4.測(cè)定法精密量取供試品溶液1.Oml,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下自"再加3%苯酚溶液1.0ml"起，依法操作，測(cè)定吸收度，由回歸方程計(jì)算甘露糖的含量。五、免疫原性測(cè)定法(補(bǔ)體結(jié)合法)；1、試液A.酸鹽緩沖液(pH7.2)取氯化鈉8.5g、磷酸氬二鈉0.565g及磷酸二氬鉀0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10%硫酸鎂溶液lml,搖勻。B.1%羊紅細(xì)胞懸液羊血紅細(xì)胞的制備由綿羊頸靜脈無菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸鈉8.0g、氯化鈉4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，10(TC滅菌30分鐘)的無菌容器中，4'C保存。1%羊血紅細(xì)胞懸液的制備取上述羊血紅細(xì)胞適量，用氯化鈉注射液洗滌三次，每次離心5分鐘(2000轉(zhuǎn)/分)，取壓積羊血紅細(xì)胞，用氯化鈉注射液制成1%羊血紅細(xì)胞懸液。取懸液，用氯化鈉注射液稀釋20倍制成供試品溶液，另取等量懸液加水稀釋20倍作為空白溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA),在541nm的波長處測(cè)定，其吸收度應(yīng)為0.65-0.70，如超出限度應(yīng)調(diào)節(jié)1%羊紅細(xì)胞懸液的濃度。C.溶血素及致敏羊血紅細(xì)胞溶血素的制備取上述壓積羊血紅細(xì)胞，用氯化鈉注射液制成25°/。羊血紅細(xì)胞懸液.取家兔l只，靜脈注射上述羊血紅細(xì)胞懸液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分離血清，56°C.30分鐘滅活，分裝，0。C以下保存。溶血素單位的測(cè)定取溶血素適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000的稀釋液，各取0.lml置試管中，力卩1%羊血細(xì)胞懸液0.lml,搖勻，加稀釋度為1:30的豚鼠血清(補(bǔ)體)O.2ml及磷酸鹽緩沖液0.2ml，搖勻，37。C保溫30分鐘，完全溶血管的最高稀釋度為1單位溶血素。致敏羊血紅細(xì)胞的制備臨用前，將2%的羊血紅細(xì)胞懸液與2單位溶血索等體積混合，37。C保溫15分鐘即得。補(bǔ)體取三只以上的豚鼠，心臟采血，離心分離血清，(TC以下保存。補(bǔ)體單位的測(cè)定取補(bǔ)體適量，加磷酸鹽緩沖液，分別制成1:40、1:60、1:80、1:100、1:120、1:140、1:160、1:180的稀釋液，各取0.2ml置試管中，加0.2ml磷酸鹽緩沖液，搖勻，37。C保溫30分鐘后，分別加致敏羊血紅細(xì)胞0.2ml,搖勻，37。C再保溫30分鐘.完全溶血管的最高稀釋度為l單位的補(bǔ)體?？贵w取對(duì)照品適量，加氯化鈉注射液制成每lml中含10mg的對(duì)照品溶液免疫家兔，隔日采用耳靜脈注射對(duì)照品溶液一次。第一次注射0.2ml,第二次至第五次各注射0.5ml,第六次至第十次各注射1.Oml，第十一次至第十五次各注射2.0ml,末次注射后三日采血，離心分離血清，56。C下30分鐘滅活，分裝，(TC以下保存(臨用前，需56。C30分鐘再次滅活)。抗體單位的測(cè)定取抗體適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32.1:64、1:128的稀釋液，各取0.lml置試管中，加對(duì)照品溶液0.lml及2單位補(bǔ)體0.2m]，搖勻，于4-8'C放置4小時(shí)以上，置37。C保溫30分鐘，不溶血管的最高稀釋度為1單位抗體。同時(shí)設(shè)抗原(不加抗體，以0.lml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.lml磷酸鹽緩沖液代替)、補(bǔ)體(不加抗原，抗體，以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管，以上三種對(duì)照管應(yīng)全溶血；另設(shè)的致敏羊血紅細(xì)胞(不加抗原、抗體和補(bǔ)體，以O(shè).4ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管應(yīng)不溶血。2、免疫原性測(cè)定法取對(duì)照品與供試品適量，照藥品項(xiàng)下的規(guī)定制成不同濃度的對(duì)照品溶液和供試品溶液，各取0.lml置試管中，加入2單位抗體0.lml及2單位補(bǔ)體0.2ml.搖勻，于4-8"C放置4小時(shí)以上，置37。C保溫30分鐘，加入致敏羊血紅細(xì)胞0.2ml，搖勻，37。C再保溫30分鐘。觀察各管的溶血情況，不溶血管的最低濃度代表對(duì)照品的免疫原性。同時(shí)設(shè)抗原(不加抗體，以0.lml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.lml磷酸鹽緩沖液代替)、補(bǔ)體(不加抗原、抗體、以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管，以上三種對(duì)照管應(yīng)全溶血另設(shè)的致敏羊血紅細(xì)胞(不加抗原、抗體和補(bǔ)體，以0.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管應(yīng)不溶血。優(yōu)良糞腸球菌在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，根據(jù)優(yōu)良糞腸球菌發(fā)酵制備的發(fā)酵液，是將糞腸球菌進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)，篩選出生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的菌株作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵，將發(fā)酵液精制提純得到的；所述的發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗肺瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干細(xì)胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善記憶功能、緩解視疲勞功能、促進(jìn)排鉛功能、清咽功能、降血壓功能、改善睡眠功能、促進(jìn)泌乳功能、緩解體力疲勞功能、提高缺氧耐受力功能、對(duì)輻射危害有保護(hù)功能、減肥功能、改善生長發(fā)育功能、增加骨密度功能、改善營養(yǎng)性貧血功能、對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)功能、祛痤瘙功能、祛黃褐斑功能、改善皮膚水分功能、改善皮膚油份功能、調(diào)節(jié)腸道菌群功能、促進(jìn)消化功能、通便功能、對(duì)胃粘膜損傷有保護(hù)功能等多方面的作用。權(quán)利要求1、優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法，其特征在于所述的優(yōu)良糞腸球菌的篩選方法如下在健康人腸道中采集標(biāo)本，涂布在血平板上，37℃靜置培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑菌落周圍無溶血圈的菌落，顯微鏡觀察確認(rèn)為糞腸球菌后，采用單菌落分離純化；將分離得到的一系列糞腸球菌培養(yǎng)在下列培養(yǎng)基中葡萄糖0.5％，胰胨0.4％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.5％，水100ml，pH7.2；37℃靜置培養(yǎng)三日后，離心，將上清液或其稀釋液疊加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定時(shí)間內(nèi)觀察沉淀環(huán)的出現(xiàn)及環(huán)的厚薄，以判斷菌株產(chǎn)生多肽的能力，選擇產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)的菌株；再將產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)的菌株的菌液1ml注射于健康家兔皮內(nèi)，觀察紅腫、潰瘍的出現(xiàn)，判斷菌株毒性大??；最終選擇產(chǎn)生多肽能力強(qiáng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毒性低，細(xì)菌及菌落形態(tài)較典型的糞腸球菌作為生產(chǎn)菌株；該菌種已于2007年10月19日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.2220；所述的優(yōu)良糞腸球菌的發(fā)酵制備工藝如下(一)發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化鈉0.2-0.6％；經(jīng)滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用；(1).一級(jí)發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10％接種量接入滅菌后的一級(jí)發(fā)酵罐。罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢?，?5-40℃恒溫培養(yǎng)10-50小時(shí)；(2).二級(jí)發(fā)酵罐將一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20％接種量接入滅菌后的二級(jí)發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢?；?5-35℃恒溫培養(yǎng)50-100小時(shí)。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到70-120℃，保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐；(二)提純過程(1).發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1∶15-25，控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液；(2).濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0％及活性炭2-4.0％加入進(jìn)行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液；(3).濃縮液加入80-99％乙醇，體積量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置；再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準(zhǔn)確量取清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢瑁o置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心，上清液再加乙醇沉淀；這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測(cè)合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時(shí)，即得到糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。2、優(yōu)良糞腸球菌的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)優(yōu)良糞腸球菌發(fā)酵制備的發(fā)酵液，是將糞腸球菌進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)，篩選出生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的菌抹作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵，將發(fā)酵液精制提純得到的；所述的發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗腫瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干細(xì)胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善記憶功能、緩解視疲勞功能、促進(jìn)排鉛功能、清咽功能、降血壓功能、改善睡眠功能、促進(jìn)泌乳功能、緩解體力疲勞功能、提高缺氧耐受力功能、對(duì)輻射危害有保護(hù)功能、減肥功能、改善生長發(fā)育功能、增加骨密度功能、改善營養(yǎng)性貧血功能、對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)功能、祛痤瘙功能、祛黃褐斑功能、改善皮膚水分功能、改善皮膚油份功能、調(diào)節(jié)腸道菌群功能、促進(jìn)消化功能、通便功能、對(duì)胃粘膜損傷有保護(hù)功能等多方面的作用。全文摘要本發(fā)明涉及一種優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用。糞腸球菌為腸球菌屬中最常見的即為代表種，糞腸球菌生活在人體腸道里，通常對(duì)人體不僅無害而且有益。但它有時(shí)也會(huì)引發(fā)嚴(yán)重感染，并對(duì)抗生素有抵抗力。本發(fā)明將糞腸球菌進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)和篩選，通過研究其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、遺傳穩(wěn)定性、中試生產(chǎn)指標(biāo)等內(nèi)容，優(yōu)選出其中生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強(qiáng)的菌株作為生產(chǎn)菌種，并形成規(guī)?；a(chǎn)。其發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗腫瘤等功能。文檔編號(hào)A61P11/04GK101275158SQ20071001899公開日2008年10月1日申請(qǐng)日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者衛(wèi)孫申請(qǐng)人:衛(wèi)孫