專利名稱：：一種白芷總香豆素組合物的制作方法一種白芷總香豆素組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)囌渉及一種單味中藥的提取物及其用途，具體的說，本發(fā)明涉及一種白芷總香豆素提取物及其翁l備方法、用途和藥物組合物。技術(shù)背景白癜風(fēng)是一種常見的色素癉礙性慢性皮膚病，可發(fā)生在身體任何部位，形成境界清楚、大小不等、形態(tài)不一的色素脫失斑。病變部位毛發(fā)也可變白，白斑周圍皮膚有時出現(xiàn)黑色素增多現(xiàn)象，雖然無明顯疼痛的癥狀，但嚴重影響容貌。有資料顯示，全世界人群發(fā)病率平均在1%2%,人口如按60億計，白癜風(fēng)的發(fā)病人數(shù)將高達80(多萬，且其中幼齡發(fā)病率有繼續(xù)上升的趨勢。對白賺風(fēng)的治療現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有三大療法，一是皮膚移植療法，二是紫外線治療，三是化學(xué)藥物治療。這些療法都有一定效果，但是又都有一定的局限性。直到現(xiàn)在，各國都尚未有確切有效的滄療白癧風(fēng)方法。中醫(yī)稱白癧風(fēng)為"白駁風(fēng)"，認為其發(fā)病機理是由肝腎虧損或七情內(nèi)傷，風(fēng)邪博于肌表，致氣血不和，氣滯血淤不能營養(yǎng)肌膚而出現(xiàn)皮膚白斑。世界各國的白癜風(fēng)分型不同，根據(jù)中國色素性皿病學(xué)組1994年制定的白癜風(fēng)臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，白癜風(fēng)分為二型、二類、二期。采用中藥治療白癱風(fēng)的臨床病例很多，也有相當(dāng)多處方取得了一定的效果，但總體治愈率仍較低，或者療效不穩(wěn)定，難以令人滿意。目前臨床上用于白癜風(fēng)治療的中藥制劑主要有-復(fù)方白苴酊、白癱風(fēng)片、白癜風(fēng)丸、復(fù)方補骨脂素凝膠、復(fù)方卡力孜然酊等。復(fù)方白芷酊的配方為防風(fēng)、補骨脂、白芷、蒺藜、馬齒莧、梔子、蛇床子、甘草、冰片和秦艽；復(fù)方補骨脂素凝膠是以補骨脂素及醋酸地塞米松為主藥。在中國，有關(guān)白癜風(fēng)治療的藥物專利已有一百多個，但大多為中藥驗方或復(fù)方，未見有單方中藥報道。如申請?zhí)枮镃N200610000788.1的"一種用于白癜風(fēng)的外搽白靈凝膠劑及其制備方法"中所述的外搽白靈提取物是由以下中藥"當(dāng)歸尾、紅花、紅花夾竹桃(葉)、蘇木、沒藥、白芷、馬齒莧和白礬"提取得到，申請?zhí)枮镃N200610001868.9的"一種治療白癜風(fēng)的藥鄉(xiāng)，，中所述的配方為補骨脂、防風(fēng)、刺蒺藜、白芷、蒼術(shù)、莪術(shù)、桃仁、紅花、干地黃、三梭、知母、牡蠣、黃柏、青蒿、三七、山藥、蟬蛻、苦參、白鮮皮和地骨皮。白芷為傘形科多年生草本植物白芷^^eh'cat/a/wrica(Fisch.exHoffra.)Benth.etHook,f-或杭白芷/1.(/aAuri.ea(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook,fvar.jfer斑cw朋a(Boiss)ShanetYit抑的干燥根，味辛，性溫，歸肺、胃、大腸經(jīng)。白芷具有祛風(fēng)解表、散寒除濕，通竅止痛、消鏇雄膽等功能，現(xiàn)代藥理研究證明，白芷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。白芷作為一種常用中藥，在臨床上廣泛運用。多年來國內(nèi)外學(xué)者的研究表明，白芷的主要化學(xué)成分為香豆素類成分、揮發(fā)油成分以及微量元素，其中，香豆素類成分的含量較高，可達1%左右。研究表明，白芷可通過增加黑素細胞黏附和/或遷移對白癜風(fēng)產(chǎn)生治療作用(現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜忐,2005,14(7)，p850)，白芷能夠治療白癜風(fēng)與其含有光毒活性有效成分有關(guān)，其中歐前胡素(imperatorin)的光毒活性較強(中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1988,8(5),p220)。將白芷生藥經(jīng)進一歩提取純化得到的白芷總香豆素提取物也可用于治療白癜風(fēng)(鐵道醫(yī)學(xué)，1980,3，p142)。劉紅梅等報道了以超臨界流體萃取白芷，得到白芷提取物，對其中的總香豆素和總香豆素中3種主要香豆素的含量進行了測定，主要成分氧化前胡素(oxypeucedanin)、歐前胡素(i鵬peratorin)、異歐前胡素(isoi鵬peratorin)的相對含量分別為42.40%,22.14%和12.12%(中國中藥雜志,2004,29('3)'p241)。不同的制備方法對白芷提取物中主要有效成分的含量影響很大，另外提取物中活性成分的含量對于療效具有很大影響。因此，控制活性成分在提取物中的含量，來摸索出適合制備成藥物的研究成為重點和難點。本發(fā)明正是在積累了多年使用生藥的基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥現(xiàn)代化提取純化方法，從中藥白芷中提取分離純化得到的以歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素為主要活性成分的總香豆素提取物，保證了主要活性成分在提取物中的含量可以用于治療白癜風(fēng)和提高免疫能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種白芷總香豆素提取物及其制備方法，藥物組合物和用途。本發(fā)嘴提供了一種白芷總香豆素提取物，其主要活性成分含量為歐前胡素占10%45%，優(yōu)選為歐前胡素占10%20%;異歐前胡素占5%40%，優(yōu)選為異歐前胡素占5%10%:氧化前胡素占10%40%,優(yōu)選為氧化前胡素占10%20%。以上均為重量百分含量。本發(fā)明提供的白芷總香豆素提取物，其制備方法包括以下步驟(1)提取取白芷藥材酌予碎斷，置提取罐中，加適當(dāng)溶劑提取，合并提取液，濾過。(2)分離純化上述濾液濃縮后，加適量溶劑溶解，濾過，濾液過層析柱，再用溶劑洗脫，收集含番豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含溶劑，得到白芷總香豆素提取物。步驟(1)中提取溶劑可以為水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或任意幾種的混合溶劑，，水和80%的乙醇溶液。在已有文獻搌道中，提取白芷所用的溶劑通常都為乙醇或甲醇，很少用水來進行，通常認為用醇攝取優(yōu)于水提(中國中藥雜志，2006，31(12),p1021)，而在實際工藝研究過程中，本發(fā)明人發(fā)il0用水對本品進行提取時，不但可以確保白芷中的香豆素類成分可以被充分提取出來，而且提取溶液中的雜質(zhì)少，便于分離純化。選用80%的乙醇進行提取時，提取效率最高，經(jīng)過兩次30分鐘的提取后，主要香豆素類成分就能基本夠提取完全，但提取液中相對雜質(zhì)較多。步驟(2)分離純化過程中，層析柱填料可以為硅膠、氧化鋁或大孔樹脂，優(yōu)選為氧化鋁柱或大孔樹脂柱。所用的^膠可以為100200目或2003(X)目；所用的大孔樹脂型號可以為AB-8、D101、HPD400、HPD100、D1300，優(yōu)選為HPD400、HPD100;所用氧化鋁最優(yōu)選為中性氧化鋁，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁不僅可以充分吸附上柱物中的非香豆素類成分雜質(zhì)及其它色素，對本品純化有著狨到的效果，而且成本相對較低，操作較硅膠柱層析簡易。溶解揚取物所用溶劑可以為水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚中的一種或任意幾種的混合溶劑，優(yōu)選為乙醇、乙酸乙酯，最優(yōu)選為乙醇一乙酸乙酯(]，V/V)混合溶劑。柱層析過程中所用的洗脫溶劑可以為水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚中的一種或任意幾種的混合溶劑，優(yōu)選為乙醇、丙兩、乙酸乙酯，最優(yōu)選為乙醇一乙酸乙酯(1:2,V/V)的混合溶劑。本發(fā)嘴還提供了一種白芷總香豆素提取物藥物組合物。它包含治療有效量的白芷總香豆素提取物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑。由于白癜風(fēng)疾病表現(xiàn)為體表癥狀，所以該藥物組合物應(yīng)該選用為外用制劑，優(yōu)選為凝膠、軟膏或乳膏，結(jié)合本品的溶解性等理化性質(zhì)特征，最優(yōu)選為將本品制成外用凝膠劑。采用本領(lǐng)域公知的方法來制備本發(fā)明的藥物組合物，如將上述白芷總香豆素提取物加入適量載體或陚型劑即可以得到軟膏、乳膏或凝膠等外用制劑。本發(fā)明所述及的載體或賦型劑包括本領(lǐng)域內(nèi)常用的所有輔料，如卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲纖維素、羧甲基纖維素鈉、明膠、硬脂酸、石蠟、液狀石蟮、凡士林、地蠟、蜂蠟、鯨蠟、膽固醇、羊毛脂、植物油、高級醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、失水山梨醇高級脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯縮合物、聚氧乙烯高級脂肪酸縮合物、聚氧乙烯高級脂肪醇縮合物、聚氧乙烯蓖麻油縮合物、聚氧乙烯氫化蓖麻油縮合物、十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉、聚甘油硬脂酸酯、硬脂酸聚烴氧脂、平平加O、月桂氮卓酮、油酸、磷脂、甘油、丙二醇、山梨醇、麥芽糖醇、乙酵、三氯叔丁醇、苯甲醇、山梨酸、山梨酸鉀、苯甲酸、苯甲酸鈉和蒸餾水等。本發(fā)明提供的白芷總香豆素提取物及其藥物組合物可有效治療白癜風(fēng)和具有增強免疫的功能。薄層德^檢湖香豆素類成分的方法是本領(lǐng)域公知的，在此不予詳述。主要活性成分歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素的含量測定采用本領(lǐng)域公知的高效液相色譜法測定，也不予詳述。本發(fā)明使用的白芷藥材為傘型科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth-etHook-f或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook,f,var.formosana(Boiss.)ShanetYuan的干燥根。本發(fā)明所稱的"香豆素類"(coumarins)是指本領(lǐng)域內(nèi)公知的以順式鄰羥基桂皮酸內(nèi)酯為母核的不同取代基化合物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下顯著的優(yōu)點(1)本發(fā)明人經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，白芷經(jīng)上述特定的提取純化后得到的白芷總香豆素提取物中保證了各有效成分相應(yīng)的含量，從而保證了經(jīng)過提取純化后的總香豆素提取物可以增加酪氨酸酶含量賴JBM酯酶活力，減少單胺氧化酶活力，同時減少代謝產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生；白芷總香豆素提取物可以明顯的增加大鼠血中T細胞亞群CD4/CD8比值，增加正常小鼠單核吞噬細胞吞噬功能，還能促進正常小鼠雞紅細胞溶血素的生成，具有增強免疫的功能。(2)本發(fā)明的提取和純化方法簡便易行，重現(xiàn)性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(3)以提取物為活性成分制成的藥物組合物對白癜風(fēng)的治療效果顯著，作用明確。下面通過本發(fā)明提供的中藥組合物的藥效學(xué)和安全性研究結(jié)果，采用國內(nèi)常用于治療白癜風(fēng)的中藥復(fù)方制劑一復(fù)方卡力孜然酊(商品名是維阿露)作為陽性對照藥比較，來進一步說明本發(fā)明的有益效果。復(fù)方卡力孜然酊主要成份為驅(qū)蟲斑鳩菊、補骨脂、何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)、蛇床子、白鮮皮、烏梅、白芥子、丁香。試酴錢的s通過對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠的酪氨酸酶、單胺氧化酶、膽堿酯酶、丙二醛、血流變和皮膚黑色素，以及對正常大、小鼠的免疫功能的影響等的實驗研究，驗證本發(fā)明所提供的白芷香豆素提取物制成的外用凝膠制劑(下面簡稱為"祛白凝膠")對實驗性白癜風(fēng)模型動物的治療作用以及對免疫功能的影響。祛白凝膠的制備-取白IE藥材20kg，酌予碎斷，置提取罐中，加80%乙醇提取3次，每次2h，合并乙醇提取液，濾過；濾液濃縮后，加乙醇2.0L溶解，濾過，濾液過硅膠層析柱，加混合有機溶劑乙酸乙酯一丙覿(8:1，V/V)洗脫，薄層監(jiān)測，收集含香豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含有機溶劑，得到白芷總香豆素提取物160g。經(jīng)含量測定，其中含主要活性成分歐前胡素15.漲、異歐前胡素10.6%、氧化前胡素15.5%，以上均為重量百分含量。取10g卡波姆，加丙二醇50g、水10ml使?jié)櫇窈?，再加入蒸餾水適量攪拌制成溶液，邊攪拌邊緩慢滴加三乙醇胺溶液適量調(diào)節(jié)pH至6.82，制成凝膠溶液，備用。將凝膠溶液與處方藥物溶液研勻，得到本品的外用制劑一祛白凝膠。下述試驗中，10%的祛白凝膠即取10g提取物溶于10ml的乙醇和2g吐溫80中，與90g的凝膠溶液研勻；20%的祛白凝膠即取20g提取物溶于20ml的乙醇和4g吐溫80中，與80g的凝膠溶液研勻；40%的祛白凝膠即取40g提取物溶于40ml的乙醇和8g吐溫80中，與60g的凝膠溶液研勻。l.試驗藥品1.l實驗藥品l.l.l祛白凝膠1.1.2復(fù)方卡力孜然酊(新疆新時代制藥有限責(zé)任公司提供)。1.2用法用量一日34次，擦藥30分鐘后，局部日光浴。1.3其他藥品及試劑1.3.1CD4、CD8試劑盒由英國serotec公司提供1.3.2CHE、MDA、MAO試劑盒由南京建成生物工程研究所提供1.3.3酪氨黢酶sigma公司生產(chǎn)1.3.4L-多巴由瑞士Fiuka公司生產(chǎn)1.3.5對苯二酚(氫醌)由廣東汕頭市西攏化工廠生產(chǎn)其余均為合肥市場購買。2.試驗動物豚鼠(黑色或黑花色)體重300350g，雌雄兼用，由南京安立默科技有限公司提供。昆明種小鼠和wistar大鼠均由南京安立默科技有限公司提供。3.試驗溶劑凝膠溶液4試驗條件溫度2025℃，濕度5565%，由空調(diào)控制。5.試驗儀器XL-Md型流式細胞計數(shù)儀、YDA-IV血液粘度計、754紫外可見分光光度計6.試驗內(nèi)容6.1對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠治療作用6.1.1對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠酪氨酸酶活力的影響6.1.2對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠MA0(單胺氧化酶)活力的影響6.1.3對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠CHE(膽堿酯酶)活力的影響6.1.4對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠MDA(丙二醛)含量的影響6.1.5對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素的影響6.1.6對實酴性白癜風(fēng)模型豚鼠血流變的影響6.2對正常大、小鼠免疫功能的影響6.2.1對正常大鼠外周血T細胞亞群的影響6.2.2對正常小鼠單核吞噬細胞吞噬功能的影響6-2.3對正常小鼠雞紅細胞溶血素生成的影響7.1對實駿性白癱風(fēng)模型豚鼠治療作用7.1.1對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠酪氨酸酶、MAO、CHE、MDA和皮膚黑色素的影響7.1.1.1動物模型的制備、分組及給藥方法取體重300350g黑色和黑花色豚鼠60只，雌雄各半，按體重隨機分為正常組、模型組、陽性藥物組(復(fù)方卡力孜然酊)、祛白凝膠小、中、大劑量組(祛白凝膠濃度分別為10%、20%、40%)，各剪去背部黑色皮膚區(qū)毛約4X4cm2，用8%的硫化鈉脫毛，每四天1次，除正常組涂自來水外，其余各組在脫毛區(qū)每天涂5%的氫醌0.5ml兩次，第10d開始各組分別每天在涂抹氫醌過后1小時按劑量分別涂藥，其中正常組、模型組涂賦形劑lg，陽性組(復(fù)方卡力孜然酊)涂l鵬l、祛白凝膠小、中、大劑量組祛白凝膠lg,每天一次，連續(xù)40d,共50d。末次藥后2h，以20X烏拉坦按照0.5ml/100g腹腔注射麻醉，于腹主動脈取血，分別放入抗凝和不抗凝試管中，取血清和血漿經(jīng)各試劑盒處理后，用754分光光度計比色測酪氨酸酶、MAO、CHE、MDA的含量，并在脫毛區(qū)中心取1X1綴2皮膚做病理切片，觀察皮膚黑色素的變化，結(jié)果如下。7.1.1.2對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠酪氨酸酶含量的影響7.1.1.2.1^M酸il:際準(zhǔn)回歸方程取試管5支，分別加入lmlL-多巴溶液(2mg/ml)和2.8ml0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，搖勻，放入25'C恒溫水浴箱中預(yù)熱lOmiti,再向上述試管中分別加入不同濃度的酪氨酸酶溶液l姐l,立即混勻，并準(zhǔn)確計時，25'C水浴反應(yīng)5min，迅速加入0.2ml硫脲一乙醇溶液，混勻，終止反應(yīng)。以0.1M磷酸鹽緩沖液為空白對照管，用754紫外可見分光光度計在波長475rnn處測吸收值，根據(jù)吸收值求回歸方程，結(jié)果見表1。表l標(biāo)準(zhǔn)濃度酪氨酸酶吸收度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)爽1數(shù)賴求回歸方程為尸O.3579x-0.0073相關(guān)系數(shù)r=0.99387.1.1.2.2血漿中酷氨酸酶含量的測定檢瀰方法同上，將測得吸收值代入回歸方程，求得酪氨酸酶含量，結(jié)果見表2。表2祛白凝膠對實驗性白瘢風(fēng)模型豚鼠酪氨酸酶含量的影響(;d:s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可見，用5%的氫醒后，豚鼠血漿中酪氨酸酶含量明顯減少，用藥后，陽性組和祛白凝膠各劑量組豚鼠血漿中酪氨酸酶含量明顯增加，與模型組比較，有顯著性差異。說明祛白凝膠能夠明顯增加實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠血漿中酪氨酸酶含量。7.1.1.3對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠MAO活力的影響取血清200ul，按鵬O試劑盒要求進行，用754紫外可見分光光度計在242咖處比色，測定血清中MAO的活力。結(jié)果見表3。MAO活力(u/h/ml)-測定管吸光度/0.01+反應(yīng)時間(h)+取樣量(ail)表3祛白,對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠MAO活力的影響(;c士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可見，用5%的氫醌后，豚鼠血漿中MAO活力明顯增加，與正常組比，有顯著性差異；用藥后，豚鼠血漿中MAO活力明顯減小，與模型組比較，祛白凝膠各劑量組均有顯著性差異。說明祛白凝膠能夠明顯減少實驗性白瘢風(fēng)模型豚鼠血清中船0活力。7.1.1.4對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠CHE活力的影響按上^^T法處理動物，取血漿50ul，按C服試劑盒要求迸行處理后，用754紫外可見分光光度計在520n趣處比色，測得血漿中CHE活力。結(jié)果見表4。CHE活力(D/m1)=(對照管(3D值—測定管OD值)/對照管OD值X標(biāo)準(zhǔn)品濃度(8umol/ml)+取樣量(ral)表4祛白凝跤對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠C服活力的影響(x土"<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與正常組比較卞<0.05"P<0.01與模型組比較aP<0.05"P<0.01由表4可見，用5%的氫醌后，豚鼠血漿中CHE活力明顯減小，與正常組比，有顯著性差異；用藥后，豚鼠血漿中C服活力明顯增加，與模型組比較，陽性組和祛白凝膠中、大劑量組有顯著性差異。說明祛白凝膠能夠明顯增加實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠血漿中CHE活力。7.1.1.5對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠MDA含量的影響按上述方法處理動物，取血清100ul，按MDA試劑盒要求進行處理后，用754紫外可見分光光度計在532n粗處比色，溯得血漿中MDA含量。結(jié)果見表5。MDA含量0>1/1111)=(測定管吸光度一測定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)X標(biāo)準(zhǔn)品濃度(lOrnnol/ml)X樣本測試前稀釋倍數(shù)(1)表5祛白凝膠對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠MDA含量的影響(義土.s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與正常組比較"P<0.01;與模型組比較"P〈0.01由表5可見，用5%的氫醌后，豚鼠血漿中MDA含量明顯增加，與正常組比，有顯著性差異；用藥后，豚鼠血漿中MDA含量明顯減少，與模型組比較，有顯著性差異。說明祛白凝膠能夠明篡,實驗性白癜,型豚鼠血清中MM含量。7.1.1.6對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素的影響將各組豚鼠在用藥部位中心取皮膚lXlcm2,用10W甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，用硫酸亞鐵Lillie法進行黑色素染色，觀察表皮基底細胞和棘細胞黑色素分布，和毛囊有黑色素的豚鼠個數(shù)，結(jié)果見表6。表6祛白凝膠對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素的影響(;c土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>觀察指標(biāo)程度分級-"一"表示表皮基底細胞和棘細胞無黑色素"±"表示表皮基底細胞和棘細胞偶見黑色素"+"表示表皮基底細胞和棘細胞3050%有黑色素"++"表示表皮基底細胞和棘細胞5185%有黑色素"+++"表示表皮基底細胞和棘細胞85%以上有黑色素由表6可見，正常對照組所有豚鼠表皮基底細胞和棘細胞黑色素達到85%以上，且都有黑色素毛囊,模型組豚鼠表皮基底細胞和棘細胞黑色素分布明顯減少，其中無黑色素有6例，偶見黑色素3例，黑色素達3050%有1例，說明涂5%的氫醌能明顯增加豚鼠黑色皮膚的黑色素分解，而用祛白凝膠后各組豚鼠皮膚表皮基底細胞和棘細胞黑色素明顯增多，說明祛白凝膠明顯增如皮膚的黑色素生成。7.1.2對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠血流變的影響取體重200250g黑色和黑花色豚鼠60只，雌雄各半，按體重隨機分為正常組、模型組、陽性組(復(fù)方卡力孜然酊)、祛白凝膠小、中、大劑量組(祛白凝膠濃度分別為10%、20%、40%),各剪去背部黑色皮膚區(qū)毛約4X4cffl2，除正常組外，其余各組在祛毛區(qū)每天涂5%的氫醌0.5ml兩次，正常組涂自來水，第10d開始各組分別每天在涂抹氫醌過后1小時正常組、模型組涂賦形劑lg、陽性組涂復(fù)方卡力孜然STIidI、祛白凝膠小、中、大劑量組涂祛白凝膠濃度分別為10%、20%、40%lg，每天一次。連續(xù)40d，共50d。末次藥后2h，以20%烏拉坦按照C5Bl/i00g腹腔注射麻醉，于腹主動脈取血，用血液流變儀檢測祛白凝膠對實驗性白癜風(fēng)模型豚鼠血流變的影響，結(jié)果表明，用5%的氫醌后，豚鼠血液低切、中切、高切、血漿粘度和纖維蛋白原明顯增加，與正常組比，有顯著性差異；用藥后，祛白凝膠各劑量組的豚鼠血液流變性明顯好轉(zhuǎn)，與模型組比較，有顯著性差異。說明祛白凝膠能夠明顯改善實驗性白癜自型豚鼠的血流變。7.2對正常大、小鼠免疫功能的影響7.2.1對正常大鼠外周血T細胞亞群的影響取體重l柳200g的大鼠50只，雌雄各半，按體重隨機均分為正常組、陽性組(復(fù)方卡力孜然酊)、祛白凝膠小、中、大劑量組(祛白凝膠10%、20%、40%濃度)。在各鼠背部用8W硫化鈉脫毛4X4cm2，24h后各組按表8劑量分別外涂給藥，l次/日，連續(xù)給藥30天，其中每隔7天用8%硫化鈉脫毛一次。于末次藥后30min，各組稱重，用20%烏拉坦按照0.5ml/100g腹腔注射，腹主動脈血管取血，分別用流式細胞計數(shù)儀測外周血CD4、CD8。結(jié)果見表7。表7祛白,對正常大鼠外周血T細胞亞群的影響(jc土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與正常組比較，*P〈0.05林P〈0.01由表7可見,用藥后，豚鼠外周血中CD4含量明顯增加，而CD8含量基本保持不變，CD4/CD8比值增加。與正常組比，祛白凝膠大劑量組外周血中CD4/CD8有顯著性差異；說明祛白凝膠對正常大鼠血中T細胞亞群CD4/CD8有明顯的增加作用。7.2.2對正常小鼠單核吞噬細胞吞噬功能的影響取^^重1822g小鼠50只，雌雄各半，按體重隨機均分為正常組、陽性組(復(fù)方卡力孜然酊)、祛白凝膠小、中、大劑量組(祛白凝膠10%、20%、40%濃度)。第一天在各鼠背部用8%硫化鈉鋭毛，暴露2X2cm2大小的皮膚，24h后各組按表9劑量外涂給藥0.4g/只，l次/日，連續(xù)7天，末次藥后40min,稱體重，然后各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁O.05ml/10g體重，分別于l、5fflin從眶后靜脈叢取血20ul，溶于2mlO.WNa2C()3溶液中搖勻，置754型紫外可見分光光度計在波長700咖處比色，測定光密度(OD)。最后將小鼠頸椎脫臼處死稱取肝、脾重量。按照公式求出吞噬(麻清)指數(shù)K，求出吞噬活性(校正廓清指數(shù))a，結(jié)果見表8。K-logOD「logOD2/t2-1,a=1TX體重/(肝重+脾重)表8祛白凝膠對小鼠單核吞噬細胞吞噬功能的影響(J±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表8中的敷據(jù)可見，祛白凝膠對正常小鼠的單核吞噬細胞的吞噬指數(shù)和吞噬活性明顯增加，祛白凝膠各劑量組吞噬指數(shù)與正常組比均有顯著性的差異，祛白凝膠大劑量組與正常組比有顯著性差異。說明祛白凝膠對正常小鼠的免疫功能有增強作用。7.2.3對正常小鼠雞紅細胞溶血素生成的影響取體重1822g小鼠50只，雌雄各半，按體重隨機均分為正常組、陽性組(復(fù)方卡力孜然酊)、祛白凝膠小、中、大劑量組(祛白凝膠10%、20%、40%濃度)。第一天在各鼠背部用8%硫化鈉脫毛，暴露2X2cW大小的皮膚，24h后每鼠腹腔注射5%生理鹽水雞紅細胞混懸液0.2粗1進行免疫，各組皮膚給藥0.4g/只，l次/日，連續(xù)給藥7天，末次藥后40min,摘眼球取血，離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍,取稀釋血清lml，與5W雞紅細胞懸液0.5ffll、10%補體0.511混合，在37。C恒溫箱中保溫40min后，0。C冰箱中止反應(yīng)。離心，取上清液與754分光光度計540nm出比色，檢測光密度(OD)，另設(shè)不加血清的空白對照組，取其上清液作為比色時調(diào)"0"的基準(zhǔn)。以光密度(OD)讀數(shù)作為判定血清溶血素的指標(biāo)，比較各組的差異，結(jié)果見表9。雞紅細鵰^液制備從雞翼下靜脈取血10ml，去纖維蛋白后，用生理鹽水洗滌三次，配成5%雞紅細驄潘^&液備用；補體鑭備取3只豚鼠血清混合，用生理鹽水配成10%即可。袞9祛白凝膠對雞紅細胞溶血素生成的影響(J±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與正常組比較，*P<0.05**P<0.01由表9可見，用藥后，雞紅細胞溶血素生成明顯增加,祛白凝膠大劑量組與正常組比有顯著性的差異。說明祛白凝膠對正常小鼠免疫功能有增強作用。s.藥效學(xué)w^小綣采用5%的毓醌使黑色皮膚豚鼠的黑色皮膚的黑色素減少，酪氨酸嗨含量減少，MA0活力增加，CHE活力減少，MM含量增加，血液的粘稠度增加，與臨床白癜風(fēng)患者病理狀況類似，說明采用5%的煞鵰可復(fù)制實驗性白癜風(fēng)模型動物。而模型動物每天應(yīng)用祛白凝膠，結(jié)果顯示..(D明顯增加實驗性白瘢風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素，明顯it加皮膚表皮基底細胞和棘細胞黑色素分布和皮膚毛囊中黑色素，血液中酪氨酸酶含量增加，MAO活力降低，CHE活力增加，代謝產(chǎn)物丙二醛的含量降低；還能顯著改善模型動物的血液流變性措標(biāo)；②對正常大、小鼠的免疫功能有一定的增強作用，明顯的增加大鼠血中T細胞亞群CM/CD8比值，增加正常小鼠單核吞噬細胞吞噬功能，還能促進正常小鼠雞紅細胞溶血素的生成，說明祛白凝膠能增加實驗性白癜風(fēng)模型動物皮膚黑色素生成，減少皮膚黑色素分解、改善血液流變性和減少代謝產(chǎn)物的生成，增強免疫功能等作用。此外，毒理試驗研究還表明，本發(fā)明所提供的中藥組合物給予家兔正常和破損皮膚小大劑量組每天應(yīng)用20%和40%祛白凝膠38/只，l天2次，連續(xù)用藥6個月，結(jié)果顯示，家兔行動、毛發(fā)、體重、食量等均正常；血象、血脂、血糖、肝腎功能，及臟器系數(shù)等與對照組比，均無明顯差別(除個別指標(biāo)外)，說明本品長期應(yīng)用很安全。具體實施方式通過下述實麄倒將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素等主要活性成分的含量測定采用本領(lǐng)域公知的高效液相色譜法瀕定，在此不予詳述。實施例一取白芷藥材20kg，酌予碎斷，置提取罐中，加80%乙醇提取3次，每次2h，合并乙醇提取液，濾過濾液濃縮后，加乙醇2.0L溶解，濾過，濾液過200300目硅膠層析柱，加混合有機溶鑭乙酸乙酯—丙翻(8:1，V/V)洗脫，薄層監(jiān)測，收集含香豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含有機溶劑，得到白芷總香豆素提取物160g。經(jīng)含量測定，其中含主:要活性成分歐前胡素15.8%、異歐前胡素10.6%、氧化前胡素15.5%，以上均為重量百分含鼂。取上述提取物100g,加入100ml乙醇，20g吐溫80溶解，備用另取卡波姆lOg，加內(nèi)二醇50g使;SS后，再加入蒸餾水適量攪拌制成溶液，邊攪拌邊緩慢滴加三乙醇胺溶液適量調(diào)節(jié)pH至6.82，制成凝膠溶液將凝膠溶液與處方藥物溶液研勻,補水至總重500g,攪拌均勻，得到漆品釣外用凝膠制劑。實施例二-取白芷藥材10kg，酌予碎斷，置提取罐中，加75%乙醇提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，濾過濾液濃縮后，加水10L使分散溶解，濾過，濾液過HPD-100大孔樹脂柱，水充分洗脫后，加郞％乙醇洗脫，薄層監(jiān)測，收集含香豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含溶劑，得到白芷總香豆素提取物97g;經(jīng)含量測定，其中含主要活性成分歐前胡素12.9%、異歐前胡素8.6%、氧化前胡素13.6%,以上均為重量百分含量。取PEG400、PEG4000各200g，置于蒸發(fā)皿中，水浴加熱熔融，另取月桂氮卓酮10ml，甘油20ml、磷脂10g、蒸餾水50ml混合攪拌至冷，加入上述白芷提取物50g，混合均勻，即得白色軟裔。實施例三取白ll藥樹50kg，酌予碎斷，置提取罐中，加50%乙醇提取3次，每次lh，合并乙醇提取液，濾過；濾液濃縮后，加乙醇乙酸乙酯U:1，V/V)4L溶解，濾過，濾液過中性氧化鋁層析柱，加混合有機溶劑乙醇一乙酸乙酯(1:2,V/V)洗脫，薄層監(jiān)測，收集含香豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含有機溶劑，得到白芷總香豆素提取物516g，經(jīng)含量測定，其中含主要活性成分歐前胡素11.4%、異歐前胡素7.1%、氧化前胡素11.2%,以上均為重量百分含量。取上遂提取物20g，加入30ml乙醇和3g吐溫80溶解，備用；將硬脂酸20g、凡士林10g、月桂氮卓醣2g水浴加,融，另將10g丙二醇、1.5g吐溫和20nil水混和，加熱至同溫，細流加入上述*&黻物中，攪拌至冷，加入白芷提取物溶液，攪勻，即得白色乳膏。實施例四取白芷藥材50kg，酌予碎斷，置提取罐中，加甲醇提取2次，每次1.5h，合并提取液，濾過；濾瀋濃縮后，加乙酸乙酯5.0L溶解，濾過，濾液過200300硅膠層析柱，加混合有機溶劑乙醆乙酯一丙酮(3:1，V/V)洗脫，薄層監(jiān)測，收集含香豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含有機溶劑，得到白芷總香豆素提取物388g。經(jīng)含量測定，其中含主要活性成分歐前胡素17.8%、異歐前胡素13.3%、氧化前胡素19.3%，以上均為重量百分含量。取上述提取物100g,加入150ml乙醇和10g吐溫80溶解，備用；另取卡波姆2.5g，加丙二醇100g使?jié)櫇窈?，再加入蒸餾水適量使充分溶脹，制成溶液，邊攪拌邊緩慢滴加三乙醇胺溶液適量調(diào)節(jié)pH至6.78，制成凝膠溶液；將凝膠溶液與處方藥物溶液研勻，再補水至總重500g,據(jù)拌均勻，得到本品的外用凝膠劑。權(quán)利要求1.一種用于治療白癜風(fēng)的白芷總香豆素提取物，其中按重量百分含量計，歐前胡素為10％～45％，異歐前胡素為5％～40％，氧化前胡素為10％～40％。2、權(quán)利要求l的白芷總香豆素提取物，歐前胡素為10%20%;異歐前胡素為5%10%;氧化前胡素為10%20%。3、權(quán)利要求1或2所述的白芷總香豆素提取物，其制備方法包括-U)提取取白芷藥材酌予碎斷，置提取罐中，加適當(dāng)溶劑提取，合并提取液，濾過；(2)分離純化上述濾液濃縮后，加適量溶劑溶解，濾過，濾液過層析柱，再用溶劑洗脫，收集含香豆素類成分的洗脫液，減壓回收洗脫液至不含溶劑，得到白芷總香豆素提取物。4、、權(quán)利要求3所述的制備方法，其中步驟(2)所述的層析柱填料可以為硅膠、氧化鋁或大孔樹脂。5、權(quán)利3I求3所述的制備方法，其中步驟(2)所述的層析柱的洗脫液為水、乙醇、甲醇、丙酮、乙醱乙酯、氯仿、石油醸中的一種或任意幾種的混合溶劑。6、一種藥物級合物，它包含治療有效量的權(quán)利要求1所述的總香豆素提取物和一種或多種藥學(xué)上可接受,體或賦型劑。7、權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述的組合物為外用制劑。8、權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于所述的外用制劑為凝膠、軟裔或乳膏。9、權(quán)利要求1所述的總香豆素提取物用于制備治療白癜風(fēng)的藥物的用途。10、一種用于增強免疫功能的白芷總香豆素提取物，其中按重量百分含量計，歐前胡素為10%45%,異歐前胡素為5%40%，氧化前胡素為10%40%。11、權(quán)利要求10的白芷總香豆素提取物，歐前胡素為10%20%;異歐前胡素為5%10氧化蕭稱素為10%20%。全文摘要本發(fā)明提供了一種白芷總香豆素的提取物及其制備方法、藥物組合物和用途。將白芷藥材經(jīng)過中藥現(xiàn)代化技術(shù)分離純化后，加入輔料制成適當(dāng)劑型使用。該發(fā)明的總香豆素提取物對白癜風(fēng)的療效顯著，且具有增強免疫的功能。提取物的制備方法重現(xiàn)性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號A61K36/185GK101234103SQ200710019809公開日2008年8月6日申請日期2007年1月30日優(yōu)先權(quán)日2007年1月30日發(fā)明者煦馮,楊永安,鳴王,鴦王,王年鶴,程艷菊,郭安軍申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所;江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司