專利名稱:一種重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,特別涉及一種重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途。
背景技術(shù):
現(xiàn)有技術(shù)戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是引起東南亞、中亞以及非洲等地急性傳染性肝炎的主要病原體。HEV主要經(jīng)過(guò)糞-口途徑傳播,通常是飲用受污染的水源引起,HEV引起的戊肝流行方式主要有暴發(fā)流行和散發(fā)兩種。HEV的感染可以累及不同年齡的患者,但感染多見(jiàn)于成年人。一般來(lái)說(shuō),戊肝和甲肝的臨床癥狀相似,目前的研究認(rèn)為,在一些發(fā)展中國(guó)家HEV的感染率已經(jīng)超過(guò)甲肝的感染率,而且病情也更為嚴(yán)重,研究顯示在各類肝炎中,戊肝的病死率最高,尤其是在孕婦患者中,死亡率甚至超過(guò)20%。
作為發(fā)展中國(guó)家,我國(guó)HEV的感染情況同樣值得重視。1986~1988年我國(guó)新疆南部地區(qū)曾發(fā)生HEV水型流行,共計(jì)發(fā)病119280例,死亡707例,是迄今為止世界上最大的一次戊肝流行。有學(xué)者對(duì)我國(guó)17個(gè)城市2548例急性散發(fā)型病毒性肝炎的血清學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),戊肝占3.4~26.3%,平均為9.7%。而我們近來(lái)對(duì)全國(guó)10個(gè)省市及華東部分地區(qū)大規(guī)模人群的的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),HEV IgG抗體的陽(yáng)性率分別約為18%和17%。此外,衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)報(bào)告也表明,我國(guó)HEV的流行方式主要呈散發(fā)和小規(guī)模暴發(fā)兩種形式,每年均有十?dāng)?shù)起小規(guī)模HEV的暴發(fā)流行,而且發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)。其中2004年我國(guó)戊肝的發(fā)病人數(shù)幾乎為2003年的兩倍。由于目前尚缺乏特異性的治療方法,因此控制HEV的傳播和流行的手段主要是通過(guò)研制特異性的戊肝疫苗加以預(yù)防。
由于HEV缺乏有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),無(wú)法制備減毒疫苗或滅活疫苗,國(guó)內(nèi)外研究多集中于基因工程重組戊肝疫苗的研制,因此采用合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含有HEV中和抗原表位的重組HEV蛋白,對(duì)于研制有效的戊肝疫苗極為重要。盡管目前已有學(xué)者采用真核和原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備了一些重組HEV蛋白,但是,由于采用真核表達(dá)系統(tǒng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢,采用原核表達(dá)系統(tǒng)時(shí)產(chǎn)物均以包涵體形式存在,需要經(jīng)歷變性和復(fù)性的過(guò)程,容易影響重組蛋白的天然構(gòu)象,并造成產(chǎn)量的降低。因此,眾多學(xué)者一直致力于采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)天然可溶的重組HEV蛋白。然而,迄今為止仍無(wú)成功研制的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題,提供一種方便易行、低成本并具有良好的抗原性和免疫原性的重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案為提供一種分離的重組戊型肝炎病毒多肽,它選自下組a.具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽;b.將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入或取代形成的,且具有能夠誘導(dǎo)高滴度的、特異性的HEV中和抗體產(chǎn)生的由a衍生的多肽。提供一種多肽,該多肽是具有具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。提供一種分離的多核苷酸,選自下組a.編碼上述氨基酸序列多肽的多核苷酸;b.與多核苷酸a完全互補(bǔ)的多核苷酸。提供一種多核苷酸,該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。提供上述多核苷酸的載體。一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞,其含有上述載體。一種重組戊型肝炎病毒多肽的制備方法,該方法包括a.在適合表達(dá)重組戊型肝炎病毒多肽的條件下,培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞;b.從培養(yǎng)物中分離出重組戊型肝炎病毒多肽。一種診斷試劑或疫苗,它含有安全有效劑量的所述的多肽或所述的多核苷酸或所述的載體,以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
本發(fā)明所述的一種新型重組HEV蛋白,含有179個(gè)氨基酸(HEVp179)。其氨基末端位于開(kāi)放閱讀框架2編碼衣殼蛋白的380位至480位氨基酸之間,羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此蛋白片段產(chǎn)生的衍生物,優(yōu)選片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株開(kāi)放讀碼框架2中編碼中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。該重組HEV蛋白的特征在于含有戊型肝炎病毒的中和抗原表位,其編碼的基因片段能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效、可溶性表達(dá),經(jīng)過(guò)純化后可以形成戊型肝炎病毒樣顆粒(Hepatitis E viruslike paticles,HEV p179-VLPs)。
本發(fā)明所述重組HEV蛋白的制備方法方法將編碼HEV中和抗原表位的優(yōu)選基因片段與質(zhì)粒pET-28a(+)或經(jīng)改造的質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行重組,再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。上述優(yōu)選基因片段的核苷酸序列為
GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT本發(fā)明所述重組HEV蛋白HEV p179具有良好的抗原性和免疫原性。體外研究表明,在20~80ng劑量范圍內(nèi),HEV p179-VLPs可以作為抗原用來(lái)檢測(cè)HEV的特異性IgM和IgG抗體,上述檢測(cè)方法中HEV p179-VLPs優(yōu)選的劑量是50ng。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在2.5~80μg的劑量范圍內(nèi),HEV p179-VLPs均能夠誘導(dǎo)高滴度的、特異性的HEV中和抗體的產(chǎn)生,上述用于HEV疫苗研究的HEV p179-VLPs優(yōu)選的劑量是20μg。因此HEV p179可以用于新型診斷試劑和疫苗的研制。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)目前用于制備重組戊肝疫苗的HEV毒株均為第1基因型,而HEV p179是基于我國(guó)目前廣泛流行的第4基因型HEV毒株制備,因此具有更強(qiáng)的針對(duì)性和實(shí)用價(jià)值;(2)目前原核系統(tǒng)表達(dá)的重組HEV ORF2編碼蛋白均以包涵體形式存在,而HEV p179在原核系統(tǒng)中不僅能夠得到高效表達(dá),且90%的目的蛋白天然可溶;(3)與目前真核系統(tǒng)、原核系統(tǒng)表達(dá)的HEV VLPs相比,直徑約20nm的HEVp179-VLPs僅由179aa(HEV ORF2編碼的439~617aa)組成,肽鏈長(zhǎng)度更短,是目前能夠形成HEV VLPs的最小的重組HEV蛋白。
(4)眾所周知,與一般的重組蛋白相比,VLPs具有更好的抗原性和免疫原性,此外,HEV p179-VLPs是由天然可溶的重組蛋白HEV p179形成,因此最大限度地保存了HEV中和抗原表位的天然構(gòu)象,具有更高的研究?jī)r(jià)值。
四
圖1為重組質(zhì)粒pET-28a(+)-179 PCR擴(kuò)增及酶切鑒定圖1.DNA marker;2.HEV p179 PCR產(chǎn)物;3.pET-28a(+)/p179雙酶切產(chǎn)物;圖2為克隆測(cè)序報(bào)告圖(上游測(cè)序);圖3為重組蛋白HEV p179表達(dá)產(chǎn)物裂解的SDS-PAGE分析圖譜1.重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179 IPTG誘導(dǎo)前菌體裂解液;2.重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179 IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解液;3.重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179 IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解液上清;4和5.重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179IPTG誘導(dǎo)前菌體裂解液沉淀;6.蛋白分子量Marker;圖4為p179蛋白與4種不同基因型抗HEV單克隆抗體的Western-blot分析結(jié)果1.陰性對(duì)照;2.3G1(第I基因型);3.E5E12(第II基因型);4.4D3(第III基因型);5.1G10(第IV基因型);圖5為重組p179蛋白與戊肝病人血清標(biāo)本的Western-blot分析結(jié)果;圖6為重組蛋白HEV p179表達(dá)產(chǎn)物純化后SDS-PAGE分析圖譜1.重組菌BL21(DE3)/pET28a(+)/p179 IPTG誘導(dǎo)前菌體裂解液;2.重組菌BL21(DE3)/pET28a(+)/p179 IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解液上清;3.重組蛋白HEVp179高效液相純化產(chǎn)物;4.蛋白分子量Marker;圖7為HEV p179-VLPs與戊肝病人血清標(biāo)本的Western-blot分析結(jié)果;圖8為HEV p179重組蛋白形成病毒樣顆粒的電鏡照片(箭頭所示)(×20000);圖9為HEV攻擊獼猴系列血清抗-HEVIgM抗體和IgG抗體檢測(cè)結(jié)果;圖10為HEV攻擊獼猴系列血清抗-HEVIgM抗體和IgG抗體檢測(cè)結(jié)果;圖11為13份門診血清標(biāo)本RT-nPCR產(chǎn)物部分電泳圖譜1.陰性對(duì)照;2.陽(yáng)性對(duì)照;3.154號(hào)門診血清標(biāo)本;4.131號(hào)門診血清標(biāo)本;5.Markers;6.10號(hào)門診血清標(biāo)本;圖12為鋁佐劑、HEV p179-VLPs免疫小鼠血清中HEV抗體水平隨時(shí)間的變化圖釋各劑量組隨著免疫次數(shù)的增加,血清HEV IgG抗體抗體反應(yīng)逐漸增強(qiáng);而且在2.5~80mg/L大范圍劑量?jī)?nèi),所誘導(dǎo)的血清HEV IgG抗體水平確無(wú)明顯差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)(d)中。
五具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如Joe Sambrook、David Russell等人,《Molecular CloningALaboratory Manual》3rd ed(Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明中,“重組戊型肝炎病毒多肽”、“重組戊型肝炎病毒蛋白”可互換使用,都指具有能夠誘導(dǎo)高滴度的、特異性的HEV中和抗體的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì),原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的,但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其它物質(zhì)中分開(kāi),則為分離純化的。
“分離的重組戊型肝炎病毒蛋白或多肽”是指重組戊型肝炎病毒多肽基本上不含有天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)純化重組戊型肝炎病毒蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽,優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物,或是化學(xué)合成的產(chǎn)物,或使用重組技術(shù)從原核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主,本發(fā)明的多肽可以是糖基化的,或是非糖基化的。
本發(fā)明還包括重組戊型肝炎病毒蛋白的片斷、衍生物和類似物。上述“片斷”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然戊型肝炎病毒蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。根據(jù)本文的教導(dǎo),這些片斷、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的范圍。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ NO1所示的編碼區(qū)序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。如上述“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQNO2的蛋白質(zhì),但與SEQ NO2所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列;成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列;成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸,也可以是還包括附加編碼和、或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明的重組戊型肝炎病毒蛋白核苷酸全長(zhǎng)序列或其片斷通常采用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物,并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作模板,擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí),通常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增,然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接再一起。一旦獲得了有關(guān)序列,就可以用重組法來(lái)大批量的獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
本發(fā)明選用編碼HEV第4基因型毒株ORF2中的編碼HEV中和抗原表位的基因片段,位于453至631位共179個(gè)氨基酸,簡(jiǎn)稱p179。通過(guò)分子克隆的方法,將其插入質(zhì)粒pET-28a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-179,經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定準(zhǔn)確無(wú)誤后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)。應(yīng)用SDS-PAGE和Western-blot對(duì)重組菌所表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行分析,其結(jié)果顯示該重組菌能夠高效、可溶性的表達(dá)目的蛋白,并且目的蛋白可以與戊肝病人血清和不同基因型HEV單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。此外,體外研究表明,HEV p179-VLPs可以作為抗原用來(lái)檢測(cè)HEV的特異性抗體;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在2.5~80μg的劑量范圍內(nèi),HEV p179-VLPs均能夠誘導(dǎo)高滴度的、特異性的HEV中和抗體的產(chǎn)生。因此HEV p179可以用于新型診斷試劑和疫苗的研制。
實(shí)施例1本實(shí)施描述了重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179的構(gòu)建方法(a)目的基因的獲得以HEV第4基因型中國(guó)株序列為模板,用引物1(5’-CCCCCCATGGTTATCCAGGACTATGATAATC-3’)和引物2(5’-CCCCTCGAGTCAAGGGTAATCAACAGTGTCCTCCA-3’)擴(kuò)增ORF2編碼多肽453-631(p179)的基因片段。PCR條件為94℃-45秒,52℃-45秒,72℃-50秒,35個(gè)循環(huán)。其中引物1和引物2分別含有NcoI和XhoI的酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化。
上述第453位至631位氨基酸序列(p179),其所述的氨基酸序列如下VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLS
FWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP。
上述第453位至631位氨基酸序列(p179),其所述的核苷酸序列如下GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。
(b)重組質(zhì)粒和重組菌的構(gòu)建本實(shí)施例中,瓊脂糖凝膠回收純化均是使用上海申能博彩生物科技有限公司的“3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit”產(chǎn)品,按照說(shuō)明書操作即可。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化,用NcoI和XhoI雙酶切后再經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化。同時(shí)質(zhì)粒pET-28a(+)用NcoI和XhoI雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化。然后,將酶切純化過(guò)的PCR片段和質(zhì)粒pET-28a(+)按摩爾比3∶1混勻,在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接,最后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),pET-28a(+)含有卡那霉素的抗藥基因,因此在卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆。
轉(zhuǎn)化過(guò)程如下將連接反應(yīng)液5μl和50μl E.coli BL21(DE3)新鮮感受態(tài)細(xì)菌混勻,冰浴30min;42℃水浴100s,立即冰浴2min;加600μl LB,37℃1h后,取100μl涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。篩選過(guò)程如下首先挑取平皿上若干個(gè)單克隆,首先用引物1和引物2進(jìn)行PCR篩選,PCR條件為94℃預(yù)變性3min,然后94℃變性1.5min,52℃退火2min,72℃延伸3min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7min。然后,篩出的PCR陽(yáng)性的克隆,抽取質(zhì)粒,并用NcoI和XhoI雙酶切鑒定(見(jiàn)圖1)。最后,雙酶切鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序(見(jiàn)圖2)。測(cè)序完全正確的克隆即為含有重組質(zhì)粒pET-28a(+)-179的E.coli BL21(DE3)。
(c)重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179蛋白表達(dá)分析(如圖3-圖5所示)重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179和含空質(zhì)粒菌BL21(DE3)-pET-28a(+)在37℃,IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白,4℃5000g離心15分鐘收集菌體并將菌體重懸于bufier A(20mM Tris-HCl,pH 7.4),采用超聲方法裂解菌體,提取全菌體蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行Western-blot分析,結(jié)果顯示重組菌在20KD左右有一條新生的蛋白條帶,位置與p179預(yù)期分子量大小一致,而對(duì)照空載體菌在相對(duì)應(yīng)的位置無(wú)該條蛋白帶;結(jié)果還顯示重組菌所表達(dá)的重組p179蛋白能與I、II、III、IV型HEV單抗發(fā)生免疫印跡反應(yīng),呈單一清晰條帶;同時(shí)重組菌表達(dá)的重組p179蛋白也可與戊型肝炎病人血清發(fā)生反應(yīng);而含空質(zhì)粒菌BL21(DE3)-pET-28a(+)免疫印跡分析無(wú)陽(yáng)性免疫條帶出現(xiàn)。說(shuō)明重組菌所表達(dá)重組p179蛋白與各型抗HEV的單抗和病人血清標(biāo)本均有較好的免疫反應(yīng)性。
實(shí)施例2本實(shí)施描述了重組p179蛋白的純化方法及其電鏡分析結(jié)果(圖6-圖8)重組p179蛋白的純化采用下述方法進(jìn)行重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179在37℃,IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白。4℃5000g離心15分鐘收集菌體并將菌體重懸于buffer A(20mM Tris-HCl,pH 7.4),采用超聲方法裂解菌體。然后,4℃20000g離心30分鐘去除沉淀,需要說(shuō)明的是HEV p179為非融合蛋白且大多以可溶性形式存在于裂解液的上清中。HEV p179的純化采用Biologic LP System(Bio-Red,England)。首先,將裂解所獲的上清加入已預(yù)先用buffer A平衡的陰離子交換層析柱(SOURCE 30Q,10ml bed volume),然后用含有0-1mol/L NaClbuffer A進(jìn)行線性梯度洗脫,流速1ml/min。收集目的蛋白組分,并進(jìn)一步用已預(yù)先用buffer A平衡的凝膠層析柱(Sephadex G75,100ml bed volum)純化,用buffer A作為洗脫液,流速0.5ml/min,收集含有HEV p179的組分并用SDS-PAGE和Western blot方法進(jìn)行鑒定和分析,并進(jìn)行超濾濃縮。濃縮后的HEV p179重組蛋白的濃度用BCA方法確定。
將經(jīng)過(guò)高效液相純化的重組蛋白HEV p179經(jīng)5~50%蔗糖密度梯度離心,進(jìn)一步進(jìn)行純化,并將純化后的重組蛋白HEV p179經(jīng)10g/L磷鎢酸(pH 7.0)負(fù)染,透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),重組蛋白HEV p179可以形成球形空殼樣顆粒,直徑約20nm,為經(jīng)過(guò)純化后重組蛋白HEV p179自身裝配而形成的HEV VLPs(HEVp179-VLPs)。
實(shí)施例3
本實(shí)施描述了重組p179蛋白作為抗原用于檢測(cè)HEV IgG抗體的間接法ELISA的評(píng)價(jià),其中重組p179蛋白的包被劑量范圍是20~80ng/孔,優(yōu)選濃度是50ng/孔。
(a)檢測(cè)步驟預(yù)先將重組p179蛋白作為抗原包被聚苯乙烯微孔條(50ng/孔),4℃過(guò)夜;次日1×PBST洗液洗板3次,扣干;用封閉液封閉預(yù)包被微孔板,37℃1h;PBST洗滌2次,扣干;密封,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>
加樣每孔加95μl樣本稀釋液,依次加入5μl血清標(biāo)本,設(shè)立空白對(duì)照孔、陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和待檢樣本,輕拍混勻;溫育置37℃溫育30min;洗滌棄去孔中液體,PBST洗滌5次,扣干;加酶除空白對(duì)照孔外,每孔加入工作濃度的HRP標(biāo)記羊抗人IgG,每孔100μl;溫育置37℃溫育30min;洗滌棄去孔中液體,PBST洗滌5次,扣干;顯色包括空白對(duì)照孔,每孔加入底物A液、B液各50μl,輕拍混勻,置37℃避光顯色10min;終止每孔加入終止液50μl終止反應(yīng),輕拍混勻;測(cè)定20min內(nèi)用Bio-Rad 550酶標(biāo)儀測(cè)A450。酶標(biāo)儀以空白對(duì)照孔調(diào)零,在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定各孔OD值,打印檢測(cè)結(jié)果;結(jié)果判定待檢標(biāo)本的OD值如低于臨界值,則判定為陰性結(jié)果;如果標(biāo)本的OD值大于或等于臨界值則判定為陽(yáng)性結(jié)果。
cut-off值的確定檢測(cè)2000份南京高校入學(xué)新生血清標(biāo)本,陰性平均OD值為0.058,標(biāo)準(zhǔn)誤差s為0.020,標(biāo)準(zhǔn)cut-off值=陰性均值+3×s=0.118,檢測(cè)180份陽(yáng)性血清標(biāo)本確定矯正cut-off值為0.13×陽(yáng)性對(duì)照均值+陰性平均值=0.13×1.06+0.058=0.196。
(b)敏感性和特異性評(píng)價(jià)(1)本方法檢測(cè)19份HEV RT-nPCR陽(yáng)性的戊型肝炎病人血清,結(jié)果全部抗-HEV IgG抗體陽(yáng)性,檢出率100%。這些病人均經(jīng)臨床確診為HEV感染的病人,沒(méi)有一例漏診。
(2)檢測(cè)52份收集自美國(guó)、巴西、墨西哥、印度、越南、俄羅斯、索馬里及中國(guó)等世界不同國(guó)家血清標(biāo)本,于美國(guó)CDC用多種方法檢測(cè)陽(yáng)性48份,陰性4份;本方法也檢測(cè)出48份陽(yáng)性,4份陰性,總檢出符合率為100%(表1),說(shuō)明本方法能檢測(cè)出來(lái)源于世界不同國(guó)家的HEV血清標(biāo)本,具有較廣泛的血清反應(yīng)性。
表1采集自不同國(guó)家的52份血清標(biāo)本抗-HEV IgG抗體檢測(cè)結(jié)果
(3)采用本方法檢測(cè)5份HAV陽(yáng)性、8份HBV陽(yáng)性和12份HCV陽(yáng)性血清標(biāo)本,結(jié)果全部陰性,說(shuō)明本方法與甲型、乙型和丙型肝炎病人血清無(wú)交叉反應(yīng),具有較好的特異性。
(4)檢測(cè)180份中國(guó)健康人血清標(biāo)本和30份美國(guó)健康獻(xiàn)血者血清標(biāo)本,結(jié)果均為陰性,與CDC檢測(cè)結(jié)果完全一致,符合率為100%。
(c)重復(fù)性評(píng)價(jià)將3份陽(yáng)性血清標(biāo)本在同一時(shí)間段測(cè)定10次,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù);將同樣的3份陽(yáng)性血清連續(xù)測(cè)定5次,每天一次,計(jì)算批間變異系數(shù);結(jié)果變異系數(shù)均小于10%,顯示本方法的重復(fù)性較好(如表2所示)。
表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(CV)
(d)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)將試劑盒(包括預(yù)包被微孔板標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物底物液A和B、終止液)于37℃溫箱放置4天,與放置在4℃冰箱的試劑盒平行檢測(cè)3份陽(yáng)性和1份陰性血清標(biāo)本,進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)(如表3所示)。經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)分析,P值=0.12,顯示兩種狀態(tài)下OD值的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按37℃放置1天相當(dāng)于4℃放置1.6個(gè)月計(jì)算,該試劑至少可以穩(wěn)定6個(gè)月。
表337℃和4℃放置結(jié)果比較(OD值)
實(shí)施例4本實(shí)施描述了重組p179蛋白作為抗原用于檢測(cè)HEV IgM抗體的捕獲法ELISA的評(píng)價(jià)。其中酶標(biāo)抗原(重組p179蛋白)的劑量范圍是20~100ng/孔,優(yōu)選濃度是50ng/孔。
首先制備了抗人IgM單克隆抗體作包被抗體,專一地捕獲血清中的IgM,再表達(dá)重組p179蛋白,并用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記制備酶標(biāo)抗原,建立HEV IgM抗體捕獲法。
(a)特異性捕獲HEV IgM抗體的證據(jù)(1)5份HEV IgG陽(yáng)性但I(xiàn)gM陰性的血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陰性,5份HEVIgG陰性但I(xiàn)gM陽(yáng)性的血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,說(shuō)明所選擇的包被抗體只能特異性捕獲血清中的IgM抗體,不與IgG抗體結(jié)合。
(2)中國(guó)株HEV攻擊2只獼猴前和攻擊后第1、3、5、6、7、8、10、11、14周收集血清,本方法檢測(cè)HEV IgM抗體,ELISA一步法檢測(cè)HEV IgG抗體。一只獼猴病毒攻擊后5周檢測(cè)到IgM和IgG抗體均陽(yáng)轉(zhuǎn),6周時(shí)IgM抗體滴度達(dá)高峰,之后滴度逐漸下降,11周轉(zhuǎn)陰,而IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)后滴度逐漸升高,11周時(shí)仍維持較高滴度(圖9)。另一只獼猴病毒攻擊后8周IgM抗體陽(yáng)轉(zhuǎn),10周達(dá)高峰,之后抗體滴度逐漸降低,14周轉(zhuǎn)陰,IgG抗體于病毒攻擊后10周陽(yáng)轉(zhuǎn),抗體滴度不斷升高,14周時(shí)仍維持在較高水平(圖10)。說(shuō)明本檢測(cè)方法能與中國(guó)株HEV實(shí)驗(yàn)感染的獼猴血清反應(yīng),并具有較高的靈敏度。病毒攻擊后第14周本方法檢測(cè)結(jié)果為陰性,而此時(shí)IgG抗體滴度較高,提示本方法選擇的包被抗體M3只能特異性地捕獲血清中的IgM抗體,不與IgG抗體結(jié)合。
(3)檢測(cè)墨西哥株HEV攻擊黑猩猩系列血清,病毒攻擊后4周IgM抗體陽(yáng)轉(zhuǎn),之后滴度逐漸降低,10周時(shí)轉(zhuǎn)陰;IgG抗體也于病毒攻擊后4周陽(yáng)轉(zhuǎn),之后滴度逐漸升高,并持續(xù)到3個(gè)月,仍維持較高滴度(表4)。
表4 墨西哥株HEV攻擊黑猩猩系列血清抗體檢測(cè)結(jié)果
(4)DTT破壞試驗(yàn)10份抗HEV-IgM陽(yáng)性血清與0.2mol/L DTT混合,37℃作用1小時(shí),檢測(cè)結(jié)果全部陰性,DTT破壞試驗(yàn)陽(yáng)性;同一10份陽(yáng)性血清不經(jīng)DTT處理,檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性。說(shuō)明包被抗體捕獲血清中的免疫球蛋白能被DTT完全破壞,故均為IgM類。
(b)敏感性和特異性(1)本方法檢測(cè)37份HEV RT-nPCR陽(yáng)性的肝炎病人血清,結(jié)果全部抗-HEVIgM抗體陽(yáng)性,檢出率100%。這些病人均為確診的中國(guó)戊型肝炎病人,沒(méi)有一例漏診。
(2)采集自美國(guó)、印度、墨西哥、俄羅斯、索馬里、越南、中國(guó)的52份血清標(biāo)本,美國(guó)CDC用多種方法檢測(cè),陽(yáng)性48份,陰性4份,本方法也檢測(cè)出48份陽(yáng)性,4份陰性,總檢出符合率為100%(表5),說(shuō)明本方法能檢測(cè)出來(lái)源于不同國(guó)家的HEV血清標(biāo)本,具有較為廣泛的血清反應(yīng)性。
表5 采集自不同國(guó)家的47份血清標(biāo)本抗-HEV IgM抗體檢測(cè)結(jié)果
(3)48份血清標(biāo)本用ELISA IgM抗體捕獲法與IgM抗體一步法都檢測(cè)出24份陽(yáng)性標(biāo)本和24份陰性標(biāo)本,檢出率相同,其中有22份陽(yáng)性血清捕獲法測(cè)OD450值明顯高于一步法,20份陰性血清捕獲法測(cè)OD450值低于一步法(表6),說(shuō)明兩種方法相比,IgM抗體捕獲法具有陰性本底低、陽(yáng)性標(biāo)本OD值高的特點(diǎn),便于結(jié)果判斷,大大避免了ELISA一步法中常遇到的本底較高,結(jié)果判斷模糊的情況。
表6 本方法與ELISA一步法檢測(cè)48份血清標(biāo)本OD值比較
(4)HEV抗原中和實(shí)驗(yàn)10份HEV陽(yáng)性血清分別加入重組HEV p179抗原,37℃溫育1小時(shí),檢測(cè)結(jié)果全部陰性,中和實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性;對(duì)照組此10份血清未加入重組抗原,37℃溫育1小時(shí),檢測(cè)結(jié)果全部陽(yáng)性。
(5)檢測(cè)5份HAV陽(yáng)性、8份HBV陽(yáng)性和12份HCV陽(yáng)性血清標(biāo)本,結(jié)果全部陰性,說(shuō)明本方法與甲型、乙型、丙型肝炎病人血清無(wú)交叉反應(yīng),具有較好的特異性。
(6)186份健康人血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果全部陰性。
(c)與Genelabs試劑盒比較(1)291份門診血清標(biāo)本中,14份標(biāo)本Genelabs公司試劑盒和本方法都能檢測(cè)出IgM抗體陽(yáng)性,261份標(biāo)本均檢測(cè)為陰性,符合率為94.5%(14/30),另外有3份標(biāo)本Genelabs公司試劑盒檢測(cè)IgM抗體陽(yáng)性,本方法檢側(cè)為陰性,13份標(biāo)本本方法檢測(cè)為IgM抗體陽(yáng)性,Genelabs公司試劑盒檢測(cè)為陰性(表7),對(duì)這13份標(biāo)本進(jìn)行HEV RT-nPCR檢測(cè),得到2份陽(yáng)性(圖11),說(shuō)明至少此2份血清標(biāo)本確實(shí)曾感染HEV,完全排除假陽(yáng)性的可能,這13份標(biāo)本HEV抗原中和實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性,也可以排除這13份標(biāo)本假陽(yáng)性的可能。說(shuō)明本方法具有更好的血清反應(yīng)性,靈敏度較高。
表7 門診血清標(biāo)本本方法和Genelabs試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較
(2)Genelabs公司試劑盒檢測(cè)2只中國(guó)株HEV攻擊獼猴系列血清,結(jié)果都沒(méi)有檢出抗體陽(yáng)轉(zhuǎn),而本方法檢測(cè)2只獼猴系列血清均陽(yáng)轉(zhuǎn),兩種方法檢測(cè)結(jié)果有較大差異,為了進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果,我們用國(guó)產(chǎn)萬(wàn)泰抗-HEV IgM抗體診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè),一只獼猴系列血清檢測(cè)到3份陽(yáng)性,另一只檢測(cè)到一份弱陽(yáng)性。說(shuō)明中國(guó)株HEV攻擊獼猴,產(chǎn)生抗-HEV IgM抗體,但Genelabs公司試劑盒漏檢。
(d)穩(wěn)定性將試劑盒(預(yù)包被酶標(biāo)板標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物顯色液A和B終止液)于37℃溫箱放置4天,與放置4℃的試劑盒平行檢測(cè)4份血清標(biāo)本,進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)(表8)。經(jīng)配對(duì)設(shè)計(jì)T檢驗(yàn)分析,P=0.12,表明兩者OD值的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按37℃放置1天相當(dāng)于4℃放置1.6個(gè)月計(jì)算
,該試劑在4℃至少穩(wěn)定6個(gè)月。
表8 37℃放置4天穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
(e)重復(fù)性3份陽(yáng)性標(biāo)本同時(shí)測(cè)定10次,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù),連續(xù)測(cè)定5天,每天測(cè)定一次,計(jì)算批間變異系數(shù)(表9),均小于10%,重復(fù)性較好。
表9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例5本實(shí)施描述了重組p179蛋白作為候選HEV疫苗的免疫原性研究。
(a)候選HEV疫苗的制備將純化后的HEV重組蛋白HEV p179-VLPs以生理鹽水稀釋至5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L和160mg/L,然后加入等體積鋁佐劑(1g/L)吸附過(guò)夜,即為制備的候選HEV疫苗。其中HEV p179的濃度分別位2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L。
(b)動(dòng)物分組及免疫方案將70只BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組,每組10只,包括6個(gè)實(shí)驗(yàn)組、1個(gè)鋁佐劑對(duì)照組,6個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別命名為E2.5、E5、E10、E20、E40和E80,并分別予以0.1mL/只皮下多點(diǎn)注射小鼠候選HEV疫苗2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L,然后于首次免疫后4、6周以0.05mL/只腹腔注射相同濃度的抗原加強(qiáng)免疫。鋁佐劑對(duì)照組組則在相同時(shí)間注射相同劑量的鋁佐劑(1g/L)作為對(duì)照。
(c)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清采集所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于免疫前和免疫后2、4、6、8、10、12、14周經(jīng)眼眶靜脈取血,離心后收集血清,將所有血清均貯存于-20℃。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)HEV特異性抗體的產(chǎn)生情況。
(d)免疫動(dòng)物血清HEV IgG抗體的檢測(cè)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖12),HEV p179-VLPs 2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L組動(dòng)物血清中HEV抗體的A450值于初次免疫2周后開(kāi)始逐漸增高,顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠HEV IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn);第3次免疫后,全部免疫動(dòng)物出現(xiàn)HEV IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn),其HEV IgG抗體滴度提高,并至少持續(xù)至免疫后3個(gè)月。與Al(OH)3對(duì)照組相比,第4周后實(shí)驗(yàn)組A450值明顯高于對(duì)照組,差異具有顯著性意義(P<0.01)。比較不同時(shí)間點(diǎn)的各實(shí)驗(yàn)組吸光度A450值發(fā)現(xiàn),HEV p179-VLPs各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物HEV IgG抗體反應(yīng)A450值在第12周達(dá)到最高水平。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),與第4周相比,第6、8、10、12、14周HEV IgG抗體反應(yīng)A450值水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),同第6周相比,第8、10、12、14周HEV IgG抗體反應(yīng)A450值水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示隨著免疫次數(shù)的增加,抗體反應(yīng)逐漸增強(qiáng)。鋁佐劑對(duì)照組未檢測(cè)出抗體應(yīng)答。此外,研究結(jié)果同樣顯示,該新型HEVp179-VLPs在2.5~80mg/L大范圍劑量?jī)?nèi),所誘導(dǎo)的血清HEV IgG抗體水平確無(wú)明顯差異,提示HEV p179-VLPs具有良好的免疫原性。
實(shí)施例6中和抗體在一定程度上反映了疫苗的保護(hù)性效果,由于缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)體系,本研究中我們采用基于RT-nPCR的體外中和試驗(yàn)檢測(cè)HEV p179-VLPs誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HEV中和抗體的能力。為進(jìn)一步病毒攻擊保護(hù)試驗(yàn)提供依據(jù)。
將Al(OH)3、E2.5、E5、E10、E20、E40和E80實(shí)驗(yàn)組免疫小鼠14周采集的、每組10只動(dòng)物血清分別進(jìn)行等量混合,1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋后與定量HEV混合,按材料與方法中所述方法檢測(cè)HEV中和抗體。結(jié)果如表10所示,1∶10、1∶20和1∶40稀釋的不同劑量組的免疫動(dòng)物血清均可有效中和HEV。提示基于新型HEV p179-VLPs制備的候選HEV疫苗能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性的、具有中和作用的HEV抗體。
表10 Al(OH)3、HEV p179-VLPs免疫小鼠第14周血清體外中和試驗(yàn)結(jié)果
NegativeHEV IgG抗體陰性病人血清;PositiveHEV IgG抗體陽(yáng)性病人血清;+中和試驗(yàn)結(jié)果表明能夠中和HEV;-中和試驗(yàn)結(jié)果表明不能中和HEV.
實(shí)施例7本實(shí)施例描述了HEV p179-VLPs免疫恒河猴后免疫效果的評(píng)價(jià)。
本實(shí)驗(yàn)中,我們選用劑量為20μg的HEV p179-VLPs制備的候選戊肝疫苗免疫恒河猴,以Al(OH)3佐劑為對(duì)照,每組5只。采用ELISA法檢測(cè)HEV IgG抗體的產(chǎn)生水平,并計(jì)算其幾何平均滴度(GMTs)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),首次接種后4周候選戊肝疫苗組動(dòng)物HEV IgG抗體全部轉(zhuǎn)陽(yáng),并維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
表3-8 不同劑量的實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HEV IgG抗體的水平比較(GMTs)
“-”1∶100的免疫血清檢測(cè)結(jié)果為陰性。
進(jìn)一步的病毒攻擊試驗(yàn)結(jié)果表明,候選戊肝疫苗組動(dòng)物在病毒攻擊后均無(wú)戊肝癥狀的出現(xiàn),未出現(xiàn)糞便排毒和病毒血癥;而對(duì)照組動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的戊肝癥狀,并伴有糞便排毒和病毒血癥。
序列表<110>東南大學(xué)<120>一種重組戊型肝炎病毒蛋白、其制備方法及用途<160>4<210>1<211>537<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)…(537)<400>11GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCT1ValIleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaPro61 TCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCC21 SerArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAla121 GAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTA41 GluTyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMETTyrValSerAspThrVal181 ACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAG61 ThrPheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnGlyValSerArgSerLeuAspTrpSerLys241 GTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTT81 ValThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrVal301 CTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCA101 LeuProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrPro361 TACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGG121 TyrAsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArg
421 GTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTC141 ValCysIleSerThrTyrThrThrAsnLeuGlySerGlyProValSerIleSerAlaVal481 GGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT161 GlyValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrValAspTyrPro<210>2<211>179<212>PRT<213>人工序列<400>2ValIleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSerArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGluTyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMETTyrValSerAspThrValThrPheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnGlyValSerArgSerLeuAspTrpSerLysValThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeuProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyrAsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgValCysIleSerThrTyrThrThrAsnLeuGlySerGlyProValSerIleSerAlaValGlyValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrValAspTyrPro<210>3<211>31<212>DNA<213>合成引物<400>3CCCCCCATGG TTATCCAGGA CTATGATAAT C<210>4
<211>35<212>DNA<213>合成引物<400>4CCCCTCGAGT CAAGGGTAAT CAACAGTGTC CTCCA
權(quán)利要求
1.一種分離的重組戊型肝炎病毒多肽,其特征在于,它選自下組a.具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽;b.將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入或取代形成的,且具有能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度、特異性的HEV中和抗體的由a衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽,其特征在于,該多肽是具有具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸,其特征在于,選自下組a.編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的多核苷酸;b.與多核苷酸a完全互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,該多核苷酸編碼具有SEQID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一種載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞,其特征在于,其含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種權(quán)利要求1所述的重組戊型肝炎病毒多肽的制備方法,其特征在于,該方法包括a.將編碼重組戊型肝炎病毒蛋白的基因片段與原核系統(tǒng)表達(dá)載體進(jìn)行重組,再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),上述優(yōu)選的原核系統(tǒng)表達(dá)載體為質(zhì)粒pET-28a(+)或經(jīng)改造的質(zhì)粒pET-28a(+);優(yōu)選宿主菌是大腸桿菌BL21(DE3)。b.從培養(yǎng)物中分離出重組戊型肝炎病毒多肽。
8.一種診斷試劑或疫苗,其特征在于,它含有安全有效劑量的權(quán)利要求1所述的多肽或權(quán)利要求3所述的多核苷酸或權(quán)利要求5所述的載體,以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種方便易行、低成本并具有良好的抗原性和免疫原性的重組戊型肝炎病毒蛋白、其編碼序列及用途。目前用于制備重組戊肝疫苗的HEV毒株均為第1基因型,而HEV p179是基于我國(guó)目前廣泛流行的第4基因型HEV毒株制備,因此具有更強(qiáng)的針對(duì)性和實(shí)用價(jià)值;目前原核系統(tǒng)表達(dá)的重組HEV ORF2編碼蛋白均以包涵體形式存在,而HEV p179在原核系統(tǒng)中不僅能夠得到高效表達(dá),且90%的目的蛋白天然可溶性;與目前真核系統(tǒng)、原核系統(tǒng)表達(dá)的HEV VLPs相比,直徑約20nm的HEV p179-VLPs僅由179aa組成,肽鏈長(zhǎng)度更短,是目前能夠形成HEV VLPs的最小的重組HEV蛋白。
文檔編號(hào)A61K39/29GK101062941SQ20071002174
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者孟繼鴻, 戴星, 董晨 申請(qǐng)人:東南大學(xué)