專利名稱：一種預(yù)防和治療cea陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是人類健康的最大殺手。腫瘤的手術(shù)治療，雖能有效去除肉眼可見的腫瘤，但對術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移尚無有效的治療方法。放療和化療除具有嚴(yán)重的毒副作用外，由于許多腫瘤細(xì)胞對其不敏感，其療效也不理想。腫瘤的免疫生物治療是腫瘤防治的新模式，主要是通過特定的技術(shù)方法增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤特異性的殺傷細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，以殺傷腫瘤細(xì)胞。
癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)是一種重要的腫瘤相關(guān)抗原。在人體上皮細(xì)胞惡性腫瘤、90％的胃腸道腫瘤、胰腺癌、80％以上的非小細(xì)胞肺癌和50％左右的乳腺癌中，都有CEA的高表達(dá)，即上述腫瘤呈CEA陽性。但由于CEA的抗原性很弱，不能有效地激活機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫殺傷，導(dǎo)致這類腫瘤患者的死亡率較高。
為解決CEA抗原性很弱導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫殺傷的問題，現(xiàn)有技術(shù)中將CEA基因與痘苗病毒基因重組，得到CEA重組基因痘苗(CEA-recombinant Vaccinia Virus，CEA-rV)，它既有CEA抗原的高表達(dá)，又可刺激機(jī)體產(chǎn)生CEA抗體，對實(shí)驗(yàn)性CEA陽性腫瘤有一定的預(yù)防和治療作用，但臨床應(yīng)用顯示，單純地注射CEA-rV，其療效還不夠理想。
樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，它能顯著刺激初始T細(xì)胞的繁殖，在腫瘤的生物治療中起著重要作用。現(xiàn)有技術(shù)中有將CEA-rV負(fù)載用臍帶血制備的DC細(xì)胞，再用CEA-rV+DC去誘導(dǎo)從臍帶血制備的CD3AK細(xì)胞，制備出CEA-rV+DC+CD3AK效應(yīng)細(xì)胞，即荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CD3AK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)理論研究表明它對CEA陽性腫瘤有明顯的殺傷效果，但尚未用于臨床應(yīng)用。而且，由于DC細(xì)胞以及CD3AK細(xì)胞都是由臍帶血制備，而臍帶血是異體來源，臨床應(yīng)用必須檢測各種傳染病，如艾滋病、梅毒、肝炎等。另外，異體細(xì)胞臨床用于病人，還要HLA配型，否則可能會(huì)產(chǎn)生移植物抗宿主排異反應(yīng)，故其臨床推廣應(yīng)用尚不成熟，還有很大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述效應(yīng)細(xì)胞的制備方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供所述預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞在制備預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞是荷有CEA-rV的DC所誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞(CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞)。優(yōu)選地，所述CIK細(xì)胞是在LAK細(xì)胞的基礎(chǔ)上，用IL-2、CD3單克隆抗體、IL-1和IFN-γ四種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)而制備的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述DC和CIK細(xì)胞是從外周血制備而來的。
本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明的效應(yīng)細(xì)胞的方法，包括如下步驟(1)提供CEA-rV；(2)DC的制備無菌條件下采集外周靜脈血，常規(guī)分離出單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)后，收集懸浮細(xì)胞備用；重懸貼壁細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，制得DC；(3)CIK細(xì)胞的制備將步驟(2)中所收集的懸浮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，制得CIK細(xì)胞；(4)荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞制備在DC中加入CEA-rV，常規(guī)培養(yǎng)制備荷有CEA-rV的DC(CEA-rV+DC)；荷有CEA-rV的DC和CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)制得CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞。
上述預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞的制備方法，荷有CEA-rV的DC和CIK細(xì)胞是按1∶10的比例混合培養(yǎng)制得CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞的。
本發(fā)明還提供荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞在制備治療和預(yù)防CEA陽性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
CIK細(xì)胞是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine Induced Killer Cells)的簡稱。LAK細(xì)胞是淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(Limphokine Activated Killer Cells)的簡稱。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備出了對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的特異殺傷活性明顯提高的效應(yīng)細(xì)胞，為臨床CEA陽性腫瘤的特異免疫治療提供了一個(gè)更新的技術(shù)方法，克服了單用CEA-rV臨床療效不理想的弊端。
用CEA-rV作為特異抗原解決了抗原難得的問題。本發(fā)明用CEA-rV做為特異抗原負(fù)荷DC解決了大部分CEA陽性腫瘤病人無法得到自體腫瘤抗原的困難，使該類患者增加了一個(gè)預(yù)防和治療方法，增加了一個(gè)戰(zhàn)勝腫瘤的希望。又因CEA-rV可在實(shí)驗(yàn)室大量制備，使用安全，故有推廣應(yīng)用的優(yōu)越條件。
采用患者自身外周血細(xì)胞制備DC和CIK，克服了臍血的傳染病和“移植物抗宿主”反應(yīng)的隱患，確保了臨床使用的安全性，又提高了治療CEA陽性腫瘤的有效性，更有利于該項(xiàng)目的臨床推廣應(yīng)用。
本發(fā)明用CIK細(xì)胞制備CEA-rV+DC+CIK效應(yīng)細(xì)胞與用CD3AK細(xì)胞制備CEA-rV+DC+CD3AK相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)CIK細(xì)胞是T細(xì)胞在IL-2、IL-1、IFN-Y和CD3單克隆抗體4種因子誘導(dǎo)下產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞，具有明顯的CD3+CD56+雙陽性標(biāo)記。CD3AK細(xì)胞是T細(xì)胞在IL-2和CD3單克隆抗體兩種因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生，沒有明顯的CD3+CD56+雙陽性標(biāo)志。
CIK細(xì)胞比CD3AK和LAK細(xì)胞增殖速度更快，大約快100倍。
CIK細(xì)胞比CD3AK和LAK細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)，大約強(qiáng)10倍。
CIK細(xì)胞的殺瘤譜比CD3AK和LAK細(xì)胞的更廣，而且對多藥耐藥的腫瘤殺傷作用更強(qiáng).
CIK細(xì)胞和CD3AK和LAK細(xì)胞相比，受免疫抑制影響較小。
也就是說，我們利用CIK細(xì)胞制備的CEA-rV+DC+CIK效應(yīng)細(xì)胞和用CD3AK細(xì)胞制備的CEA-rV+DC+CD3AK效應(yīng)細(xì)胞相比，在本質(zhì)上有明顯差別；在功能上有更明顯的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一、CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞制備。
1、逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PLXSN-CEA的構(gòu)建及CEA-rV及W-VV(野生型痘苗病毒)的制備逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PLXSN-CEA的構(gòu)建，參照文獻(xiàn)[生物化學(xué)雜志，1997，第八次全國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議?？?57-259]進(jìn)行，CEA-rV及W-VV的大量制備及滴度測定參照文獻(xiàn)[中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)，1999，15(1)54-58]進(jìn)行。
2、自體外周血DC的制備和鑒定無菌條件下采集外周靜脈血50-100ml。常規(guī)分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入24孔板，每孔2ml，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)3h，收集懸浮細(xì)胞制備CIK細(xì)胞。重懸貼壁細(xì)胞制備DC用含GM-CSF(50ng/ml)，IL-4(10ng/ml)，TNF-α(50ng/ml)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×105/ml，每孔1ml接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)3d，以后隔天半量換液。在光鏡下連續(xù)觀察DC發(fā)育過程中的形態(tài)變化，透射電鏡觀察DC細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞表型。
3.自體外周血CIK細(xì)胞的制備用含IL-2(1000u/ml)，CD3Ab(5ug/ml)，IL-1(100u/ml)，IFN-γ(1000u/ml)和人AB血清(5％)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基或含有IL-2(1000u/ml)，CD3Ab(5ug/ml)，IL-1(100u/ml)，IFN-γ(1000u/ml)的RPMI-1640無血清培養(yǎng)基調(diào)上法收集的懸浮PBMC濃度到5×106/ml。常規(guī)培養(yǎng)制備CIK細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀分別測定PBMC和CIK細(xì)胞的CD3，CD4等分子表型。
4.CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞制備在上法制備的DC培養(yǎng)3d時(shí)，加入CEA-rV 104PFU/ml，常規(guī)培養(yǎng)制備CEA-rV+DC。在上法制備的CIK細(xì)胞培養(yǎng)8d時(shí)，把CEA-rV+DC和CIK細(xì)胞按1∶10的比例混合培養(yǎng)得CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞。
實(shí)施例二、CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞的應(yīng)用方法當(dāng)CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增到1×109-1010時(shí)，開始收集細(xì)胞，靜脈回輸病人。CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞懸液的使用方法和正常輸血相同，回輸速度為50-60滴/分鐘?；剌斶^程中每5-10分鐘輕輕振搖細(xì)胞懸液一次?；剌敽罄^續(xù)輸入50mL的生理鹽水沖洗回輸管。每逢3-5天一次，6次一療程。
實(shí)施例三、CEA-rV+DC+CD3AK和CEA-rV+DC+CIK對腫瘤細(xì)胞的特異殺傷作用比較1.實(shí)驗(yàn)材料靶細(xì)胞分4組紅白血病細(xì)胞株K562，由廣州醫(yī)學(xué)院臨床腫瘤研究中心提供，為CEA陰性細(xì)胞株；肝癌細(xì)胞株細(xì)胞株BeL-7402，由廣州醫(yī)學(xué)院臨床腫瘤研究中心提供，為CEA陰性細(xì)胞株；結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO，由中山大學(xué)提供，為CEA陽性細(xì)胞株；肺癌細(xì)胞株A549，由中山大學(xué)提供，為CEA陽性細(xì)胞株。
效應(yīng)細(xì)胞分3組CIK細(xì)胞組、CEA-rV+DC+CD3AK細(xì)胞組和CEA-rV+DC+CIK細(xì)胞組，自制，濃度都為10×109PFU/ml。
2.實(shí)驗(yàn)方法用MTT法測定各組效應(yīng)細(xì)胞對4種靶細(xì)胞的殺傷活性。
用SPP11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。各效應(yīng)細(xì)胞的殺傷率用單因素方差分析法。
3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示，各組數(shù)據(jù)均為10次實(shí)驗(yàn)平均值。
表1各種效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率(X±S) 4.結(jié)果與討論從表中可以看出3種效應(yīng)細(xì)胞CIK、CEA-rV+DC+CD3AK和CEA-rV+DC+CIK對4種靶細(xì)胞均有明顯殺傷力。CEA-rV+DC+CD3AK和CIK組比較，雖然CEA-rV+DC+CD3AK對各靶細(xì)胞的殺傷率較CIK組有所提高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明CEA-rV和DC無明顯提高CD3AK殺傷活性的作用。
CEA-rV+DC+CIK和CEA-rV+DC+CD3AK相比，對CEA陰性腫瘤細(xì)胞K562和BEL-7402的殺傷作用沒有明顯變化(P＞0.05)，但是對CEA陽性腫瘤細(xì)胞LOVO和A549的特異殺傷作用確有明顯提高(P＜0.01)。說明CEA-rV+DC+CIK對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的特異殺傷作用比CEA-rV+DC+-CD3AK更為明顯，效果更優(yōu)越。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞，其特征在于，所述效應(yīng)細(xì)胞是荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的效應(yīng)細(xì)胞，其特征在于所述CIK細(xì)胞是在LAK細(xì)胞的基礎(chǔ)上，用IL-2、CD3單克隆抗體、IL-1和IFN-Y四種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)制備而成的。
3.如權(quán)利要求1所述的效應(yīng)細(xì)胞，其特征在于所述DC和CIK細(xì)胞是從外周血中提取制備而來的。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞方法，包括如下步驟(1)提供CEA-rV；(2)DC的制備無菌條件下采集外周靜脈血，常規(guī)分離出單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)后，收集懸浮細(xì)胞備用；重懸貼壁細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，制得DC；(3)CIK細(xì)胞的制備將步驟(2)中所收集的懸浮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，制得CIK細(xì)胞；(4)荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞制備在DC中加入CEA-rV，常規(guī)培養(yǎng)制備荷CEA-rV的DC；荷有CEA-rV的DC和CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)制得荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞的制備方法，荷有CEA-rV的DC和CIK細(xì)胞是按1∶10的比例混合培養(yǎng)制得荷有CEA-rV的DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞的。
6.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求4所述的預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞在制備預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療CEA陽性腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞以及該效應(yīng)細(xì)胞的制備方法和應(yīng)用。該效應(yīng)細(xì)胞是荷有CEA－rV的DC來誘導(dǎo)共培養(yǎng)CIK細(xì)胞制備而成的。本發(fā)明用CEA－rV做為特異抗原負(fù)荷DC解決了大部分CEA陽性腫瘤病人無法得到自體腫瘤抗原的困難，又因CEA－rV可在實(shí)驗(yàn)室大量制備，使用安全，故有推廣應(yīng)用的優(yōu)越條件；采用患者自身外周血細(xì)胞制備DC和CIK，克服了臍血的傳染病和“移植物抗宿主”反應(yīng)的隱患，確保了臨床使用的安全性，又提高了治療CEA陽性腫瘤的有效性；本發(fā)明的CIK細(xì)胞增殖速度更快，殺傷作用更強(qiáng)，受免疫抑制影響較小，所以本發(fā)明的效應(yīng)細(xì)胞效果更好。
文檔編號A61K35/12GK101037670SQ20071002686
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者祁巖超, 羅超權(quán) 申請人:祁巖超