專利名稱：一種用于治療惡性腫瘤的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，尤其是指一種用于惡性腫瘤治療的中藥組合物，本發(fā)明還涉及該中藥組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率及死亡率逐年上升，癌癥患者中約70％～80％是中晚期，大多數(shù)失去早期手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，多以放療或化療為主，雖有一定的近期療效，但常因不良反應(yīng)大，且緩解期短，生存質(zhì)量差，不能明顯延長患者的生存期。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤，在改善癥狀，提高生活質(zhì)量，穩(wěn)定縮小癌灶，延長生存期等方面的優(yōu)勢得到國內(nèi)和國際同仁的廣泛認(rèn)可。
中醫(yī)藥是中華民族文化瑰寶之一，在當(dāng)今腫瘤治療中也仍然具有獨(dú)特的地位和作用，如中醫(yī)的陰陽平衡理論對(duì)于理解與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的癌基因和抑癌基因、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期的調(diào)控，具有一定的理論指導(dǎo)意義。有效抗癌藥如喜樹堿、砒霜等已成為抗癌新藥開發(fā)的原料。中醫(yī)的一些扶正祛邪方劑在配合西醫(yī)的抗癌治療中，也起著一定的輔助作用。中醫(yī)藥關(guān)于固本、祛邪攻毒、軟堅(jiān)化積的理論和療法在癌癥防治中顯示其特色及顯著的療效。同傳統(tǒng)癌癥療法相比，中醫(yī)藥具有不良作用小的優(yōu)點(diǎn)(有些藥物除外)。另外，中醫(yī)藥在癌癥治療上更注重整體與局部的關(guān)系，其中，對(duì)于提高晚期病人生活質(zhì)量猶為中醫(yī)之所長。已有研究表明癌癥的療法如放療、化療，甚至某些生物治療，由于其非特異毒性作用無可避免地?fù)p害了機(jī)體的正常功能。為了減少放療或化療等對(duì)機(jī)體的影響，提高機(jī)體對(duì)腫瘤的防御能力，改善病人生活質(zhì)量，采用中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤也許是理想的方法之一。
隨著中醫(yī)藥及中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤研究的傳承問題日益被關(guān)注，有關(guān)臨床及實(shí)驗(yàn)研究也取得較大的進(jìn)展，開發(fā)抗癌或抗癌輔助治療的中藥勢在必行。經(jīng)資料檢索和臨床觀察，本發(fā)明人所采用的復(fù)方中藥的抗癌作用國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道，我們的臨床觀察初步顯示其具有抗癌潛能。為了開拓惡性腫瘤治療的中藥研發(fā)，本發(fā)明的發(fā)明人按照抗腫瘤藥物藥效學(xué)研究指導(dǎo)原則，對(duì)一種新的中藥復(fù)方的抗腫瘤作用進(jìn)行系列研究，通過體外抗腫瘤活性試驗(yàn)和體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)研究該中藥復(fù)方的抗腫瘤作用，并對(duì)其抗腫瘤作用的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，該新復(fù)方中藥的抗腫瘤作用研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決技術(shù)問題是提供一種治療效果好、適用面廣的用于惡性腫瘤治療的中藥組合物。
本發(fā)明要的另一技術(shù)問題是提供一種上述中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明的前一技術(shù)方案是這樣的一種用于治療惡性腫瘤的中藥組合物，是由下述重量份的原料藥制成，莪術(shù)15份、半枝蓮30份、柴胡10份、黃芩10份、法夏15份、黨參30份、甘草5份、大棗10份、生姜6份。
上述的用于治療惡性腫瘤的中藥組合物中所述的中藥組合物為口服液、片劑、膠囊、散劑等中藥常用劑型。
本發(fā)明的后一技術(shù)方案是一種用于治療惡性腫瘤的中藥組合物的制備方法，包括下述步驟(1)原料藥加8倍量的水，用水蒸汽蒸餾提取揮發(fā)油2次，每次提取時(shí)間為2h；(2)藥渣與揮發(fā)油合并共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，濾過，濾液濃縮成1g生藥/ml的濃縮液或?qū)饪s液干燥成清膏后，加常用藥用輔料壓片或裝填膠囊或裝袋。
本發(fā)明的復(fù)方中藥中半枝蓮清熱解毒活血為君藥，莪術(shù)行氣祛痰，法夏化痰散結(jié)，共為臣藥，黨參、大棗健脾益氣扶中，柴胡疏肝理氣，黃芩清熱解毒，共為佐藥；甘草和藥為使。諸藥合用，具有理氣活血、解毒散結(jié)、健脾益氣之功，臨床應(yīng)用表明本發(fā)明的中藥組合物對(duì)肝癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤具有輔助治療效果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1按下述重量配比稱取原料莪術(shù)15g、半枝蓮30g、柴胡10g、黃芩10g、法夏15g、黨參30g、甘草5g、大棗10g、生姜6g。
制備方法加8倍量的水，水蒸汽蒸餾提取揮發(fā)油2次，每次提取時(shí)間為2h；藥渣與揮發(fā)油合并共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，濾過，濾液濃縮成1g生藥/ml的濃縮液。
本發(fā)明的中藥組合物還可以進(jìn)一步將濃縮液干燥成清膏，然后加常用藥用輔料壓制成片或填裝膠囊或直接裝袋成散劑。
上述配方的本發(fā)明中藥組合物，也是人體每日的常用劑量，可采用水煎服兩次，早、晚各服用一次。
實(shí)驗(yàn)例1 復(fù)方中藥急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組三組藥物處理組(1g生藥/ml復(fù)方中藥)，PBS對(duì)照組，非處理組。每組10只昆明小鼠。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)采用小鼠口服灌胃給藥。(2)經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，用最高濃度和最大容積的復(fù)方中藥給予小鼠灌胃，小鼠無一死亡，表明復(fù)方中藥急性毒性低，未能測得LD50；故本品僅進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。(3)取SPF級(jí)昆明小鼠30只，體重18～22g，如上述分三組，雌雄各半，給藥前禁食12h，然后給予上述復(fù)方中藥(1g生藥/ml)及PBS 0.8ml/只灌胃，每日3次，連續(xù)給藥7d，空白對(duì)照組不給藥，觀察比較并記錄小鼠的毒性反應(yīng)及死亡數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥后30min小鼠出現(xiàn)輕微活動(dòng)減少，2h左右恢復(fù)正常，實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)觀察7d，其全身狀況、攝食、飲水、大小便和體重增長均正常。無一動(dòng)物死亡。7d后處死動(dòng)物，剖解肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，未發(fā)現(xiàn)異常改變。
實(shí)驗(yàn)例2 復(fù)方中藥對(duì)體外培養(yǎng)多種腫瘤細(xì)胞活性的影響(SRB法)磺基羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合，在一定波長的OD值與細(xì)胞數(shù)呈良好的線形關(guān)系，可用作細(xì)胞數(shù)的定量。用胰酶消化對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，用含10％小牛血清的RPMI1640或DMEM懸浮細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/ml。接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μl，置37℃，5％CO2和100％濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后，分為加藥組和對(duì)照組進(jìn)行處理。對(duì)照組每孔加入200μl全培養(yǎng)液，加藥組每孔加入含有各濃度藥的全培養(yǎng)液200μl，所加藥物濃度為每ml含的生藥量不同，分別為20mg/ml，10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml，1.25mg/ml，0.625mg/ml，0.3125mg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)分別于24h、48h或72h終止實(shí)驗(yàn)，首先每孔加入200μl 10％遇冷的TCA固定1h，離心后去上清，再用水洗5遍，晾干，然后每孔加入100μl的SRB染色15min后，用1％醋酸洗5遍，晾干，最后每孔加入10mmol/lTris液150μl，振蕩器振蕩10分鐘，待完全溶解后于酶標(biāo)儀λ570nm處檢測OD值。SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方中藥處理多種腫瘤細(xì)胞活性均有不同程度的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，抑制作用更為明顯，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果表明該復(fù)方中藥在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞的活性，且抑制作用呈時(shí)效和量效關(guān)系，參閱表1A-1J。
表1A 復(fù)方中藥對(duì)CNE-1細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd)
表1B 復(fù)方中藥對(duì)CNE-2細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1C 復(fù)方中藥對(duì)ARO細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1D 復(fù)方中藥對(duì)KAT-4細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1E 復(fù)方中藥對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd)
表1F 復(fù)方中藥對(duì)Her-18細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1G 復(fù)方中藥對(duì)A-549細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1H 復(fù)方中藥對(duì)H-1299細(xì)胞的抑制率(％)(x±sd) 表1I 復(fù)方中藥對(duì)HCT116-14-3-3sigma+/+細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd)
表1J 復(fù)方中藥對(duì)HCT116-14-3-3sigma-/-細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 實(shí)驗(yàn)例3 復(fù)方中藥的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)1.復(fù)方中藥對(duì)S180和EAC荷瘤鼠的抑瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組S180和EAC荷瘤鼠各分五組，包括PBS陰性對(duì)照組，CTX陽性組，復(fù)方中藥治療的高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度組。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)藥液的配制用水將復(fù)方中藥原藥(1g生藥/ml)分別配成每毫升含0.5g、0.25g和0.125g生藥的高、中和低三個(gè)劑量的藥液，4℃冰箱保存，用時(shí)搖勻。(2)造模在超凈工作臺(tái)中無菌抽取小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)傳代的S180、EAC細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞為2×107·ml-1，小鼠右背后皮下接種，每只0.2ml。(3)動(dòng)物隨機(jī)分組與處理造模后隨機(jī)分為五組，每組10或12只，接種次日復(fù)方中藥分高、中、低3個(gè)劑量灌胃給藥(0.2ml/10g)，隱性對(duì)照組用等量的水灌胃，陽性對(duì)照組采用環(huán)磷酰胺(CTX)腹腔注射給藥，20mg/(kg·d)。連續(xù)給藥12d后停藥脫頸處死小鼠，取其腫瘤組織，濾紙吸干后稱重，以抑瘤率代表治療作用。同時(shí)并取出小鼠脾臟、胸腺和肝臟，用濾紙吸干后稱重。(4)計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)＝(1-給藥組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重)×100％。(5)計(jì)算脾系數(shù)、胸腺系數(shù)和肝系數(shù)脾系數(shù)＝脾臟重量(mg)/體重(g)，胸腺系數(shù)＝胸腺重量(mg)/體重(g)，肝系數(shù)＝肝臟重量(mg)/體重(g)。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，高、中、低濃度以及陽性對(duì)照組的腫瘤均小于陰性對(duì)照組(p＜0.05)，表明高、中和低濃度復(fù)方中藥對(duì)S180和EAC小鼠移植瘤均具有明顯抑制作用(P＜0.05)，各濃度XCHT用藥組抑瘤作用亦有差異(P＜0.05)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)3種不同濃度復(fù)方中藥用藥后均可不同程度地增加荷瘤小鼠的體重(P＜0.05)。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)各細(xì)胞株分別重復(fù)了三次，確保了其結(jié)果的可重復(fù)性與穩(wěn)定性，見表2A-2B。復(fù)方中藥對(duì)S180和EAC荷瘤小鼠脾、胸腺和肝系數(shù)的影響結(jié)果表明低、中和高濃度復(fù)方中藥用藥后均可使荷瘤鼠脾、胸腺系數(shù)有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中高或中濃度組療效較好，優(yōu)于低濃度組(P＜0.05)；而各組的肝系數(shù)變化差異不顯著(P＞0.05)，見表3A-3B。
表2A 復(fù)方中藥對(duì)S180荷瘤鼠移植瘤的抑瘤作用

注The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
表2B 復(fù)方中藥對(duì)EAC荷瘤鼠移植瘤的抑瘤作用


注The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
表3A 復(fù)方中藥對(duì)S180荷瘤小鼠脾、胸腺和肝系數(shù)的影響(x±sd)


注The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
表3B 復(fù)方中藥對(duì)EAC荷瘤小鼠脾、胸腺和肝系數(shù)的影響

注The mean difference versus controlis significant at the 0.05 level.
2.復(fù)方中藥對(duì)EAC荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)分組陰性對(duì)照組水；陽性對(duì)照組CTX；復(fù)方中藥處理組分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度處理組。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)收集淋巴細(xì)胞無菌條件下取出經(jīng)治療的荷瘤鼠脾臟，將脾臟研成細(xì)胞懸液，過200目不誘鋼篩，經(jīng)計(jì)細(xì)胞數(shù)后，用培養(yǎng)液稀釋并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml的脾細(xì)胞懸液。(2)接種取脾細(xì)胞懸液50μl(5×105細(xì)胞)加入96孔平板中，加ConA 2μg/孔，平行樣3份置于37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)72h。(3)用MTT法[4]測定小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，即用加ConA孔的光密度值減去不加ConA的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，高、中和低濃度組以及陽性對(duì)照組較空白對(duì)照組高，提示小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖能力提高(P＜0.01)，陰性對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較空白組低(P＜0.05)，見表4。
3.復(fù)方中藥對(duì)EAC荷瘤鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)活性的影響實(shí)驗(yàn)分組參照2。
實(shí)驗(yàn)步驟各組經(jīng)處理的小鼠常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液5×109/l，加到24孔板中，每孔1ml，再加ConA(終濃度為5mg/l)，置于37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)48h后，離心吸上清，即獲得IL-2粗制劑，-20℃凍存待測。測定時(shí)取C57BL/6小鼠，無菌摘取胸腺，制備5×109/l的細(xì)胞懸液，加到96孔板中，使ConA終濃度為3mg/l，然后加入不同稀釋度的IL2上清，培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h加入185×104Bq/孔3HTdR。收集細(xì)胞，液閃儀計(jì)數(shù)每min脈沖數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與空白對(duì)照組相比，高、中、低濃度組以及陽性對(duì)小鼠脾細(xì)胞IL-2分泌有促進(jìn)作用(P＜0.05)，以中濃度和陽性對(duì)照組最為明顯；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。
4.復(fù)方中藥對(duì)EAC荷瘤鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的影響實(shí)驗(yàn)分組參照2。
實(shí)驗(yàn)步驟摘小鼠眼球取血標(biāo)本，取20μl抗凝血，加入20μl的抗CD4或抗CD8熒光抗體，作用15分鐘后加入200μl紅細(xì)胞裂解液，5分鐘后加入1ml PBS，3000r/min 2分鐘，沉淀用400μl PBS重懸后，在Facscalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson Inc)上檢測CD4+及CD8+T細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與陰性對(duì)照組比較，高、中濃度組以及陽性對(duì)照組荷瘤小鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值均升高(P＜0.01)，其中以中濃度最為明顯；而陰性對(duì)照組CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值較空白組低(P＜0.01)，見表4。
表4 對(duì)EAC荷瘤小鼠免疫的影響(x±sd，n＝6)

*P＜0.01，**P＜0.05vs control group△P＜0.01，▲P＜0.05vs negative group，5.電鏡觀察實(shí)驗(yàn)分組S180荷瘤鼠陰性對(duì)照組水；陽性對(duì)照組CTX；復(fù)方中藥處理組分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度處理組。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用頸椎脫臼法殺死小鼠后，在無菌條件下取出腫瘤組織及小鼠脾臟、胸腺和肝臟置于培養(yǎng)皿中，用刀片切取約1×1mm3大小放入預(yù)冷的2.5％戊二醛中固定；(2)2％餓酸后固定，酒精、丙酮梯度脫水，Epon812滲透包埋，LKBTV型超薄切片機(jī)切片，鈾鉛雙重染色；(3)CM10透射電鏡觀察和照像。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中藥高中濃度治療組S180荷瘤鼠腫瘤組織中細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)改變。電鏡下可見，凋亡細(xì)胞皺縮，核膜完整，染色質(zhì)濃縮、聚集，邊移至核膜內(nèi)側(cè)，呈新月形或馬蹄型的塊狀。而CTX用藥組亦出現(xiàn)凋亡，但主要以細(xì)胞壞死為主。可以判定復(fù)方中藥在上述濃度條件下可以誘S180荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡。此外電鏡觀察肝臟未見明顯損傷，電鏡檢測荷瘤小鼠脾和胸腺發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞增殖的表現(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)例4 復(fù)方中藥治療鼻咽癌的體內(nèi)外研究1.復(fù)方中藥對(duì)體外培養(yǎng)的CNE-1和CNE-2細(xì)胞形態(tài)的影響實(shí)驗(yàn)分組藥物處理組復(fù)方中藥終濃度分別為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml；對(duì)照組無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)步驟(1)藥物配制用RPMI-1640配制濃度分別為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml的復(fù)方中藥備用；(2)接種細(xì)胞培養(yǎng)CNE-1和CNE-2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)0.25％胰酶消化細(xì)胞，1000rpm離心3min，棄上清后用含10％胎牛血清的RPMI-1640重懸；(3)分別接種等量的細(xì)胞于12孔板上，每組2個(gè)平行孔，每株細(xì)胞5個(gè)孔，置CO2培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2，以下同)培養(yǎng)12h，細(xì)胞貼壁；(4)藥物處理細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，加入預(yù)制的含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液，每孔2ml，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(5)觀察結(jié)果分別在藥物處理后24h，，48h取出，在顯微鏡下拍照。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的CNE-1和CNE-2細(xì)胞均存在腫瘤細(xì)胞的生長特性，表現(xiàn)為增殖快，分裂相多。而受復(fù)方中藥藥物作用的影響，細(xì)胞增殖的速度發(fā)生明顯變化，隨著藥物濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的壞死，5mg/ml以上濃度處理組幾乎無貼壁細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞間間隙增大，細(xì)胞變圓并從瓶底脫落。
2.復(fù)方中藥對(duì)體外培養(yǎng)的CNE-1和CNE2細(xì)胞活性的影響(MTT法)實(shí)驗(yàn)分組藥物處理組復(fù)方中藥終濃度分別為20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml和0.3125mg/ml；對(duì)照組無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)步驟(1)藥物配制無血清RPMI-1640培養(yǎng)液配制320mg/ml的復(fù)方中藥備用，使用時(shí)用培養(yǎng)液等倍稀釋成上述藥物處理組各濃度。用PBS配制5mg/mlMTT，過濾消毒備用；(2)收集細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后，離心，用含10％胎牛血清的RPMI-1640配成5×104/ml細(xì)胞懸液；(3)接種細(xì)胞將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏?5000個(gè)/孔)接種于用96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)12h，細(xì)胞貼壁；(4)藥物處理細(xì)胞按藥物處理組與對(duì)照組加入不同濃度的復(fù)方中藥以及無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每組6個(gè)平行孔，共3塊培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(5)加入MTT在24h、48h和72h后分別取出一塊板，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)約4h；(6)加入DMSO溶解結(jié)晶吸出培養(yǎng)液后，加入150μL/孔DMSO，室溫下振蕩10min，待紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔的570nm處的吸光值(A570)；(7)復(fù)方中藥抑制率的計(jì)算按以下公式計(jì)算每孔的抑制率，繪制劑量—效應(yīng)曲線
(8)IC50計(jì)算SPSS做抑制率對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)回歸，獲得回歸方程后，以抑制率為50％代入方程，算出半數(shù)抑制濃度(IC50)，進(jìn)行比較；(9)統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS12.0單因素方差分析，使用SNKq法(方差齊性時(shí))及Dunnet′s T3法(方差不齊時(shí))驗(yàn)后比較，相關(guān)分析采用Spearman′sρ相關(guān)系數(shù)表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果此實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的藥物復(fù)方中藥分別作用于CNE-1和CNE-2細(xì)胞24h，48h和72h，用MTT法檢測藥物作用后CNE-1和CNE-2細(xì)胞的存活情況，發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥對(duì)兩株細(xì)胞均存在不同程度的抑制作用，其藥效隨藥物濃度的增加而明顯增強(qiáng)，見表5A，表5B。
表5A 復(fù)方中藥對(duì)CNE-1細(xì)胞的抑制作用(％)(x±sd) 表5B 復(fù)方中藥對(duì)CNE-2細(xì)胞的抑制率(％)(x±sd) 3.復(fù)方中藥對(duì)體外培養(yǎng)的CNE-1和CNE2細(xì)胞活性的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組復(fù)方中藥終濃度分別為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml；對(duì)照組2倍的RPMI-1640培養(yǎng)液；
平板克隆實(shí)驗(yàn)步驟(1)取指數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細(xì)胞，0.25％胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞；(2)接種到直徑6em的平皿中(100個(gè)/平皿)，培養(yǎng)箱中過夜，細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，換不同濃度藥物或無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，全部換新鮮培養(yǎng)液。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行孔；(3)37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)10～14d，每三d換新鮮培液一次，至肉眼可見集落形成；(4)棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醛固定15min，姬姆薩應(yīng)用液染色20min；(5)流水沖洗染色液，空氣干燥；(6)燈箱下計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)孔中的集落數(shù)，以＞50個(gè)細(xì)胞數(shù)作為一個(gè)集落，計(jì)算每組均值；(7)計(jì)算每孔的克隆形成率，按以下公式克隆形成率(％)＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％；(8)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS12.0單因素方差分析，使用SNKq檢驗(yàn)(方差齊)及Dunnet’s T3法(方差不齊)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝0.05。
軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)步驟(1)瓊脂糖配制制備1.4％和0.7％的瓊脂糖溶液稱取0.7g和0.35g瓊脂糖，分別加入50ml三蒸水，高壓蒸汽滅菌。溶解后即為1.4％和0.7％的瓊脂糖溶液。置于45℃烤箱中待用；(2)藥物配制制備2倍的RPMI-1640培養(yǎng)液(含20％新生牛血清以及2倍雙抗)，并用其對(duì)倍稀釋配制10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml濃度的復(fù)方中藥。對(duì)照組為2倍的RPMI-1640培養(yǎng)液；(3)制備下層瓊脂糖取6支離心管，每管中加入500μL含有上述濃度的藥物或培養(yǎng)液。每管中再加入500μL1.4％瓊脂糖溶液，迅速混勻后加入24孔板中，每孔500μL，每組兩孔；(4)制備上層瓊脂糖a)再取6支離心管，各管中加入440μL含有上述濃度的藥物或培養(yǎng)液；b)取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞，離心，用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液重懸至1×105/ml，在上述離心管中加入60μL/管(3000個(gè)/孔)；c)取出0.7％的瓊脂糖溶液，在超凈工作臺(tái)中放置片刻，等冷至40℃時(shí)，加入離心管，500μL/管，吹打均勻，迅速加入24孔板，500μL/孔；(5)放置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-14d；(6)染色并觀察用1mg/mL的iodonitrotetrazolium chloride進(jìn)行染色，每孔加入0.1ml染色液，置培養(yǎng)箱中放置過夜；(7)計(jì)數(shù)集落形成數(shù)低倍鏡(4×物鏡)視野下在每孔的四角和中心隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)直徑大于10μm的集落數(shù)量；(8)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS12.0采用單因素方差分析(ANOVA)，驗(yàn)后比較采用SNKq(方差齊性)和Dunett′s T3(方差不齊)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板克隆試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度復(fù)方中藥作用細(xì)胞24h后，觀察細(xì)胞克隆形成情況，與對(duì)照組比較，處理組細(xì)胞克隆數(shù)減少，并隨著藥物劑量的增加而減少，說明復(fù)方中藥對(duì)細(xì)胞的增殖能力也有抑制作用。各個(gè)藥物濃度組的細(xì)胞擊落形成率見表6；表6 復(fù)方中藥對(duì)CNE-1和CNE-2細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響(x±sd)(平板克隆實(shí)驗(yàn))

The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
軟瓊脂克隆試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，通過低倍鏡(4×物鏡)觀察，處理組的集落形成的數(shù)目隨著劑量的增加而減少，高濃度實(shí)驗(yàn)組的集落形成的數(shù)目明顯減少(P＜0.01)。低濃度處理組雖在形成集落的數(shù)量上與對(duì)照相仿，但可見其集落略小于對(duì)照組的平均水平，見表7。
表7 復(fù)方中藥對(duì)CNE-1和CNE-2細(xì)胞的克隆形成數(shù)的影響(個(gè)/10×4視野，4×物鏡)(x±sd)(軟瓊脂克隆試驗(yàn))

The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
4.復(fù)方中藥對(duì)CNE-2裸鼠移植瘤模型的半體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組藥物處理組復(fù)方中藥的終濃度分別為10mg/ml、5mg/ml和2.5mg/ml的各5只；對(duì)照組PBS對(duì)照組，5只。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)處理細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后，離心，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成5×105/ml細(xì)胞懸液，以每瓶2mL接種于底面積為75cm2培養(yǎng)瓶上(共接種40瓶)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入等量預(yù)制的含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，消化細(xì)胞，離心，配成1×106/ml細(xì)胞懸液；(2)荷人鼻咽癌裸鼠模型的復(fù)制和分組取20只裸鼠稱重后完全隨機(jī)分為4組，即PBS對(duì)照組、ELXCH低(2.5mg/ml)、中(5mg/ml)、高(10mg/ml)濃度組。無菌條件下，在裸鼠左臀部和右頸前皮下接種CNE2細(xì)胞懸液0.2ml/只復(fù)制荷人鼻咽癌裸鼠模型，接種腫瘤細(xì)胞后不作任何處理。每3d稱裸鼠體重(g)以及測量腫瘤的長徑(L)和寬徑(D)一次，按照公式如下公式計(jì)算腫瘤體積V=π6×L·D2]]>(3)收集標(biāo)本接種CNE-2細(xì)胞16d，頸椎脫臼處死裸鼠，將腫瘤取出拍照、稱重；(4)統(tǒng)計(jì)處理腫瘤體積和剝離腫瘤重量的差異運(yùn)用SPSS12.0作單因素方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果飼養(yǎng)的BALB/c裸小鼠在背部皮下種植了CNE-2細(xì)胞后的第3d，對(duì)照組即可在種植局部觸摸到新生的腫瘤組織。質(zhì)硬、與周圍組織有粘連而不易推動(dòng)。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長、短徑來估計(jì)腫瘤的體積，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腫瘤增殖明顯快于復(fù)方中藥處理組，腫瘤的體積與處理組比即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表8A。
表8A 復(fù)方中藥對(duì)CNE-2移植瘤體積的影響(mm3)(x±sd)

*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
種植腫瘤16d后，將腫瘤組織剝離，切取部分組織做HE染色，證實(shí)所切取的是NPC組織。對(duì)照組各只裸鼠均有腫瘤生長；低濃度處理組的5只裸鼠也均有腫瘤生長；中、高濃度處理組未見明顯的腫瘤組織。將剝離的腫瘤組織稱重，發(fā)現(xiàn)低濃度處理組與對(duì)照組相比腫瘤重量有差異(P＜0.05)，見表8B。
表8B CNE-2接種裸鼠16d后剝離出腫瘤的重量

*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
5.復(fù)方中藥對(duì)CNE-2裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組分五組，包括PBS陰性對(duì)照組，CTX陽性組，復(fù)方中藥藥物治療組分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度組。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)藥液的配制用蒸餾水將復(fù)方中藥原藥(1g生藥/ml)分別配成每毫升含0.5g、0.25g和0.125g生藥的高、中和低三個(gè)劑量藥液，4℃冰箱保存，用時(shí)搖勻。(2)造模取對(duì)數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后，離心，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成5×105/ml細(xì)胞懸液，小鼠右背后皮下接種，接種體積0.2ml/只。(3)動(dòng)物隨機(jī)分組與給藥造模成功后隨機(jī)分為五組，每組8只，接種次日復(fù)方中藥分高、中、低3個(gè)劑量灌胃給藥(0.2ml/10g)，模型對(duì)照組用同等量經(jīng)消毒的水灌胃，陽性藥物組采用環(huán)磷酰胺(CTX)腹腔注射，20mg/(kg·次)，2次/周，連續(xù)給藥15d。(4)每3d測量腫瘤的長徑(L)和寬徑(D)一次，按照公式如下公式計(jì)算腫瘤體積V=π6×L·D2]]>(5)收集標(biāo)本接種CNE-2細(xì)胞16d，頸椎脫臼處死裸鼠，將腫瘤取出拍照、稱重。(6)統(tǒng)計(jì)處理腫瘤體積和剝離腫瘤重量的差異運(yùn)用SPSS12.0作單因素方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果飼養(yǎng)的BALB/c裸小鼠在背部皮下種植了CNE-2細(xì)胞后的第3d，對(duì)照組即可在種植局部觸摸到新生的腫瘤組織。質(zhì)硬、與周圍組織有粘連而不易推動(dòng)。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長、短徑來估計(jì)腫瘤的體積，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腫瘤增殖明顯快于復(fù)方中藥和環(huán)磷酰胺治療組，腫瘤的體積與中、高濃度復(fù)方中藥治療組及環(huán)磷酰胺治療組比即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見表9，與低濃度治療組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
表9A 復(fù)方中藥對(duì)CNE-2裸鼠移植瘤體積的影響(mm3)(x±sd) *The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
種植腫瘤15d后，將腫瘤組織剝離，切取部分組織做HE染色，證實(shí)所切取的是NPC組織。除CTX組一只未長腫瘤，其它均可見大小不等的腫瘤生長。將剝離的腫瘤組織稱重，發(fā)現(xiàn)中、高濃度、CTX處理組與對(duì)照組相比腫瘤重量有差異(P＜0.05)，低濃度組與對(duì)照組比腫瘤腫瘤無差異(p＞0.04)，見表9B。
表9B CNE-2接種裸鼠15d后剝離出腫瘤的重量

*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
6.激酶試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組藥物處理組復(fù)方中藥終濃度分別為5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml；對(duì)照組PBS。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)收集細(xì)胞棄去舊液，用2ml PBS洗滌，棄去PBS后，置于冰上。添加1.5ml無菌PBS液。收集細(xì)胞，放入1.5ml的離心管內(nèi)離心，5000rpm 5分鐘后棄去PBS液；(2)加入400ul NP40-RIPA+1x pepstatin+1xPMSF+coctail蛋白酶抑制劑+1xNaF+1x NaVO4溶解細(xì)胞，將細(xì)胞溶解產(chǎn)物離心，14K，15min，4℃，移上清液于新的微量離心管；(3)用Bradford法檢測蛋白沉淀物；(4)使每份樣本的總蛋白量一致，并加溶解緩沖液致每份樣品總?cè)萘繛?00ul；(5)在微量管中加入8ulαCdK2，于4℃孵育1h，適時(shí)振蕩，加入70ul Protein A懸濁液，孵育30min，將免疫沉淀復(fù)合物離心，4000rpm，5min，4℃；(6)用1ml NP40-RIPA(無NaF，NaVO4)洗滌，重復(fù)3次，用1ml 1x激酶緩沖液洗滌一次；(7)將免疫沉淀復(fù)合物離心，4000rpm，5min，4℃，加入同位素標(biāo)記的ATP；(8)加50ul/Rx Histone H1 mix入復(fù)合物，室溫下孵育15min，加入10ul 5x上樣緩沖液，煮沸變性5min；(9)行SDS-PAGE電泳，180V，1h；(10)去除凝膠的兩端，置于干膠器上30min，依據(jù)phosphor-imaging說明顯影。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果激酶分析試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥可引起CNE-1和CNE-2細(xì)胞CDK-2激酶水平改變，其中5mg/ml復(fù)方中藥引起CNE-1激酶水平降低最為明顯而1.25mg/ml復(fù)方中藥引起CNE-2激酶水平降低最明顯。
7.miRNA表達(dá)譜芯片檢測復(fù)方中藥對(duì)CNE-2細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組CNE-2；復(fù)方中藥(10mg/ml)處理48h的CNE-2。
實(shí)驗(yàn)步驟(1)樣品RNA抽提，取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，吸去PBS后用TRIZOL試劑抽提RNA；(2)RNA質(zhì)量檢測a.紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計(jì)260NM和280NM的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度；b.用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性；(3)制備熒光標(biāo)記探針采用miRCURYARRAY標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將CY3或CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記microRNA，可以得到用于與芯片雜交的熒光探針。(4)芯片雜交在標(biāo)準(zhǔn)條件下將標(biāo)記好的探針和miRCURY的microRNA芯片雜交；(5)圖像采集和數(shù)據(jù)分析使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用配套軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果CNE-2經(jīng)10mg/mL的復(fù)方中藥處理48h后，經(jīng)miRNA表達(dá)譜芯片檢測，從Cy3和Cy5信號(hào)圖像可以直接讀出miRNA表達(dá)譜，從Cy3/Cy5比的信號(hào)圖像可以得到兩個(gè)樣本之間的差異表達(dá)；經(jīng)miRNA芯片檢查發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥處理的CNE-2與正常CNE-2間miRNA表達(dá)差異如下表所示，見表10；我們選出log2(Sample B/Sample A)>2的miRNA進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)hsa-miR-450存在7個(gè)可能的靶基因，但進(jìn)一步的驗(yàn)證工作需要深入探討。
表10 復(fù)方中藥對(duì)CNE-2細(xì)胞的miRNA的影響


權(quán)利要求
1.一種用于治療惡性腫瘤的中藥組合物，其特征是由下述重量份的原料藥制成，莪術(shù)15份、半枝蓮30份、柴胡10份、黃芩10份、法夏15份、黨參30份、甘草5份、大棗10份、生姜6份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療惡性腫瘤的中藥組合物，其特征是所述的中藥組合物為口服液、片劑、膠囊、散劑。
3.權(quán)利要求2所述的用于治療惡性腫瘤的中藥組合物的制備方法，其特征是包括下述步驟(1)原料藥加8倍量的水，用水蒸汽蒸餾提取揮發(fā)油2次，每次提取時(shí)間為2h；(2)藥渣與揮發(fā)油合并共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，濾過，濾液濃縮成1g生藥/ml的濃縮液或?qū)饪s液干燥成清膏后，加常用藥用輔料壓片或裝填膠囊或裝袋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療惡性腫瘤的中藥組合物，屬抗腫瘤藥物領(lǐng)域，其技術(shù)要點(diǎn)是由下述重量份的原料藥制成，莪術(shù)15份、半枝蓮30份、柴胡10份、黃芩10份、法夏15份、黨參30份、甘草5份、大棗10份、生姜6份；本發(fā)明的中藥組合物可將原料藥按常規(guī)煎熬、濃縮或醇提、濃縮等加工制成口服液、片劑、膠囊、散劑等；本發(fā)明的新復(fù)方中藥在臨床應(yīng)用已經(jīng)顯示較好的抗腫瘤和改善病人狀態(tài)功效，組份中的原料藥資源豐富，可用于輔助治療肝癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤。
文檔編號(hào)A61K9/08GK101073663SQ20071002697
公開日2007年11月21日 申請日期2007年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日
發(fā)明者楊惠玲, 陳澤雄, 夏洪平 申請人:中山大學(xué)