專利名稱：：一種中藥組合物的新應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體地是涉及一種中藥組合物的新/左用。。
背景技術：
：一種中藥組合物，其有效成分的原料重量份組成為崗梅308份、山芝麻43份、五指相59份、淡竹葉18份、木蝴蝶1份、布渣葉18份、火炭母46份、金沙藤104份、廣金錢草27份、金櫻根106份)該中藥組合物通常制備成為涼茶的形式(又稱中藥組合物或王老吉涼茶)，其主要用于改善濕熱上火而產(chǎn)生的頭痛、發(fā)熱癥狀。其中約占該中藥組合物50%的崗梅根(/^^&7^&)為冬青科植物，在我國南方廣泛分布，其性味苦寒，主治功用為清熱解毒、生津活血，治熱病、燥渴、熱瀉、咳血、喉痛等。臨床報道崗梅根還可以防治各種感染和炎癥，常作為藥茶的原料，也常制成多種單方或復方制劑[3。黃賢華等人報道金櫻根(及OM丄加WgfltoMcte)具有耐缺氧作用，另外，據(jù)報道金沙藤(丄少godi-柳y'flpow'c柳)、五指柑(CWhwme血aL.松riSarcofifarc0^^oot))、火炭母(Pofygomwiij/Kwe/weL.)和淡竹葉(丄op/Krf/iCT""加graci7e5ra"gw)均有保肝護肝，治療肝炎的作用。該中藥組合物所涉及的十味中藥均為廣東民間常用中藥，近年來對其研究較為活躍，但是尚未有對于這十味中藥配合在一起用f治療和預防應激和氧化性疾病的研究報道。隨著科技的進步和生活節(jié)奏的加快,人們?yōu)榱诉m應社會的閂益強烈的競爭,需要承受來自不同方面的種種壓力,使人們常常處于應激狀態(tài)，由應激而引起的問題也隨之而來。當機體受到應激負荷引起精神緊張和焦慮不安的同時，血中ACTH濃度、皮質(zhì)激素含量都會相應增多。在這一反應中，也包括兒茶酚胺的分泌量的增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮，心跳加快，血壓升高，肝糖原分解的增加及血糖升高等生理反應以適應在應激情況下對能量的需求?？梢哉J為，應激引起機體內(nèi)環(huán)境失衡是一組復雜的臨床綜合癥狀，是很難將體內(nèi)某種串--癥狀作為治療或改善對象加以解決。盡管人們可以通過減少工作量，調(diào)整生活習慣與精神狀態(tài),改善生活環(huán)境及適當休息等方法加以改善，但單憑這些心理上的調(diào)整可能遠遠不夠。因此需要針對不同人群的各自的特殊癥狀予以相應的藥物治療,免疫治療及營養(yǎng)支持療法等方法來解決。最近的研究表明通過應激，尤其是拘束負荷誘發(fā)小鼠氧化應激的方式，可以導致動物的肝損傷以及導致動物的心理壓力；而且中醫(yī)理論認為各種刺激源所引起的氣機變化，主要由肝臟來調(diào)整。在心理方面對于情緒變化，尤其在調(diào)節(jié)情志因素引起的各種變化時，肝臟起著決定性的作用。這提示中醫(yī)學,的肝功能與兩醫(yī)學的神經(jīng)一內(nèi)分泌一免疫系統(tǒng)表示的機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)密切相關。Rosch等人的研究證明，長期的應激負荷不僅嚴重影響身心健康，而且會導致情緒和行為異常(SfrewMe^/卯7,7U-6)。應激是機體受到應激原負荷時出現(xiàn)的防御反應及適應過程，涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫等多方面生理功能。當然，應激反應直接影響機體的激素分泌、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的功能，嚴重時可導致急性器官功能衰竭等生理反應(歷ojcf.歷Wec/i"o/.歷oc/ie肌，20W，47&7-".)。我們的前期工作證明拘束應激降低血糖血脂利用率、影響機體新陳代謝水平，拘束負荷小鼠的血中胰島素水平及肝糖原合成能力明顯低下(Jowrna/o///ra/決Scze"ce，52",。人們知道生理過程需要血糖作為能源去維持腦、心臟和肌肉等的組織功能，因此改善能量的新陳代謝對抗應激反應非常重要的。慢性疲勞綜合癥(chronicfatiguesyndrom,CFS)，是現(xiàn)代醫(yī)學新認識的一種疾病，是亞健康狀態(tài)的一種特殊表現(xiàn)。該病主要癥狀表現(xiàn)為神疲乏力、失眠多夢、耳鳴健忘、腰酸背痛、頭發(fā)脫落及須發(fā)早白等。其特點是癥狀持續(xù)反復發(fā)作，持續(xù)時間六個月以上，充分休息也不能解除。長期工作緊張、競爭壓力大、情緒不穩(wěn)定和負性生活事件容易誘發(fā)慢性疲勞綜合征，它是威脅現(xiàn)代人健康的隱形殺手。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的需要解決的技術問題是提供一種中藥組合物的新J^用?！N中藥組合物的應用，其制成有效成分的原料重量份組成為，崗梅308份、山芝麻43份、五指柑59份、淡竹葉18份、木蝴蝶1份、布渣葉18份、火炭母46份、金沙藤104份、廣金錢草27份、金樓根106份，所述中藥組合物應用是指用于制備提高抗應激效果及治療或改善因應激負荷引起的免疫低下和/或糖脂代謝低下的藥物或健康食品或食品添加劑。所述的中藥組合物的應用，還包括在制備改善或和治療慢性疲勞綜合癥的藥物或健康食品或食品添加劑中的用途。所述的中藥組合物的應用，還包括所述涼茶在制備提高應激負荷下的NK細胞殺傷活性、改善因NK細胞活性低下起因的感染癥的藥物、働泰食品或食品添加劑的用途。本發(fā)明中藥組合物的應用，可以改善因NK細胞活性低下起因的病原感染而繼發(fā)感染癥，改善應激負荷起因的免疫功能低下和/或糖脂代謝低下還&了以用于制備治療或改善氧化應激負荷引起的各種臨床癥狀的藥物、健康食品、食品添加劑。從實驗可以證明口服途徑食用，所述中藥組合物以有效調(diào)節(jié)因應激導致的免疫器官萎縮；脾臟細胞數(shù)目減少淋巴細胞增殖能力下降；淋巴細胞中T細胞亞群的比例紊亂；增強NK細胞殺傷活性。本發(fā)明所述中藥組合物是一種安全性高，可通過提高機體免疫系統(tǒng)，從而達到預防、改善和治療應激、疲勞、感染、免疫低下用于制備可以長期服用的、安全無毒副作用的藥物、食品添加劑、健康食品。該中藥組合物在投藥劑量達到125mg/kg以上時，即顯示出有效的改善因應激負荷引起的各種免疫力低下癥狀。鑒于該中藥組合物是以藥劑、健康食品或食品添加劑作為最終產(chǎn)品開發(fā)，故從安全性角度考慮提取溶劑盡量選擇水或含水乙醇為宜。提取時該中藥組合物所包含的十味中藥與溶劑的比率沒有特定限制，但一般與溶劑的比例以1:1S0范圍為宜。本發(fā)明對提取溫度沒有特定限制，從室溫到溶劑沸點范圍都可適用。當然室溫、常壓及在溶劑沸點范圍內(nèi)提取最為理想。提取時間從10秒到24小時范圍都可以。在提取時，根據(jù)需要也可以在溶劑中添加碳酸氫鈉、抗壞血酸鈉鹽(sodiumascorbate)等物質(zhì)。這些提取方法不會影響該中藥組合物本來具有-的生物活性。本發(fā)明提供的該中藥組合物的使用量一般在0.001%至100%重量比，但通常飲料添加濃度一般在0.01^至50^(W/W)范圍較為適宜。在這個濃度范圍內(nèi)，該中藥組合物適于直接服用，容易被消費者接受。當然，作為添加物的該中藥組合物隨著加入量的增大，可能會出現(xiàn)苦澀感覺。其解決辦法可以根據(jù)市場需要及消費者的心理要求改換劑型，例如使用片劑、顆粒劑、膠囊劑等劑型。低濃度該中藥組合物溶液可以作為日常飲料提供給消費者。本發(fā)明提供的該中藥組合物，可以多種口服劑型投放市場，用于預防、改善和治療應激反應及應激負荷引起的各種臨床癥狀。當然，該中藥組合物也可以與常用的賦形劑等醫(yī)藥用載體結合而后制劑化。必要時也可以添加一些防腐劑、抗氧化劑(antioxidants著色劑、甜味劑等制劑添加物。比較適宜的該中藥組合物賦形劑，一般考慮有乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、結晶纖維素等。潤滑劑一般應采用硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉等。溶劑通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐劑一般采用氯丁醇、芐醇、二羥基乙酸等?？寡趸瘎┩ǔＲ詠喠蛩猁}、抗壞血酸等比較適宜。本發(fā)明提供的該中藥組合物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。該中藥組合物也可.作為食品添加劑與其它飲料原料結合制成一定的飲料制品，如該中藥組合物飲料、碳酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、運動飲料、豆乳等。該中藥組合物還可以考慮制成餅干、巧克力類、糖果類、口香糖類、快餐點心類、果凍點心類、面包、豆腐、酸奶酪等曰常食品。本發(fā)明中提供的該中藥組合物，也可以原型、水溶液稀釋后作為皮膚外用劑使用。當然也可以通過與醫(yī)藥用載體結合制成一定的制劑，如氣霧劑、液體制劑、提取物、混懸劑、乳劑、軟膏劑、半流體制劑、擦劑、洗劑等劑型提供化妝品、醫(yī)藥品市場的消費。本發(fā)明提供該中藥組合物作為抗應激、抗疲勞、減輕和預防各種原因引起的各種急性或慢性炎癥、各種并發(fā)癥等臨床癥狀藥物及飲料為下述實驗所證明。在使用改善拘束負荷動物模型的藥理實驗中，該中藥組合物在投藥劑量達到125mg/kg以上時，即顯示出有效的改善因應激負荷引起的各種下癥狀。本發(fā)明中該中藥組合物的投藥量，根據(jù)應用者的健康狀況、年齡、性別及體重等條件可以調(diào)節(jié)。成人平均體重如以60Kg計算，該中藥組合物日口服量一般可以考慮在lg至10g范圍內(nèi)，分次服用。具體實施例方式本發(fā)明可以通過以下實施例證明中藥組合物的新用途，但并不僅僅局限于以下實施例。實施例l:中藥組合物制備的藥物或健康食品配方崗梅308g、山芝麻43g、五指柑59g、淡竹葉18g、木蝴蝶lg、布渣葉18g、火炭母46g、金沙藤104g、廣金錢草27g、金櫻根106g。制備:十味藥，加水煎煮二次,每次1小時,濾過,合并濾液，濃縮至相對密度為1.03(45'C)，以轉速為15000rpm超高速離心分離至澄清，取分離液濃縮成稠膏。制備成藥物顆粒取稠膏，加適量蔗糖粉，制顆粒，千燥，制成含糖顆粒720g;或取稠膏，加適量淀粉，制顆粒，干燥，制成元蔗糖顆粒72g，即得。制備成健康食品4g上述浸膏，加天然礦泉水100ml，加適量蔗糖配制而成茶飲料；茶浸膏5g,優(yōu)質(zhì)白砂糖65g，甲級葡萄糖28g,加水適量制成草珊瑚硬糖10粒。實施例2:促進拘束應激起因的小鼠糖代謝低下的恢復作用實驗動物購入7周齡雄性BALB/C小鼠，飼養(yǎng)溫度23士2X:，800Lux照明強度照明12h/d(7:00-19:00),飼養(yǎng)一周后用于實驗，以下實施例3-7都是用此相同的實驗動物。試驗樣品實施例l所得中藥組合物干浸膏500mg溶于蒸餾水10ml，以下實施例都是用此相同的試驗樣品。應激模型拘束應激組小鼠固定在打有透氣孔的50mL圓錐管中進行拘束應激12h,以下實施例都是用此相同的應激模型。試驗方法實驗將小鼠隨機分成正常對照組、拘束對照組、125mg/kg人參皂苷陽性對照組、125及500mg/kg中藥組合物浸膏給藥組，共五組每組7只。陽性對照組及中藥組合物組以0.1ml710g灌胃給藥，正常對照組和拘束負荷模型組均灌胃等量水溶液，每天l次連續(xù)給藥5天，在末次灌胃30分鐘后進行拘束應激實驗。上述各組實驗動物在禁食和拘束結束30分鐘后口服葡萄糖2g/kg，分別測定口服葡萄糖20、40、60、80分鐘后的血糖濃度。試驗結果(表1):組別血糖半數(shù)消除時間(分鐘)(狄爾洲)正常對照0.08±0.01應激對照57.3±5.0厶厶0.05±0.01△△陽性對照44.9±4.0"0.11±0.01"125mg/kg45.6±4.4"0.11幼.02"500mg/kg47.9i4.5**0.10±0.01"注厶A與IH常對照組比P0.01,"與應aW照組相比戶O.Ol實驗結論小鼠拘束負荷20小時后血糖濃度半袞期由51.8分鐘延遲到57.3分鐘，表明拘束負荷降低小鼠對葡萄糖作為能源的利用能力。125及50Qmg/kg中藥組合物和人參tS汗給藥均促進拘束負荷小鼠的血糖消除速率，改善因應激負荷引起的血糖利用率低下，改機體的能量代謝水平，實旌例3:1S^拘束應激起因的小K血漿酮體水平升髙的恢復作用試驗方法實驗將小K隨機分成正常對照組、拘束對照組、125mg/kg人參皂苷陽性對照組、125及500mg/kg中藥組^M漫裔給藥組，共五組每組7只。陽性對照組及中藥組合物組以0.1mU10gff胃給藥，正常對照組和拘束負荷模型組均壤胃等量水溶液，每犬l次連續(xù)給藥5天，在末次鷹胃30洲后進糊束應激實驗.小K在乙瞎麻醉下心臟取血O.SmL于肝崈鈉小離心管中.5000轉5分鐘離心，取血漿，按丙酮酸試劑盒方法測定JliL^丙翻慶含1,試驗結果(表2):組別血漿丙酮酸(tw爾/毫升)lE常對照1.13±0.1應激對照1.84±0.3厶么陽性對照1.62±0.2*125mg/kg1.40±0.2**50Qmg/kg1-14±0.1"注與正常對照組相比厶厶尸O.Ol;與應激對照組相比"PO.Ol,*/<0.05)實驗結論當葡萄糖攝取不足時，機體會動員儲存的脂肪作為能源利用，嗣體是血榮脂肪酸代謝的不完全產(chǎn)物。我們的結果發(fā)現(xiàn)拘束負荷小鼠血獎酮體水平明顯l:升，表明拘束負荷増加小鼠血漿脂肪酸代謝的不宂全產(chǎn)物.125及50Qmg/kg中藥組合物和人多3苷給藥組均降低拘束負荷小鼠的翻體水平，改并因拘束負荷起因的能源代謝低下。實旌例4:促進拘束應激起因的小K肝糖原合成低F的恢復作用試驗方法實驗將小豕瞎機分成正常對照組、拘束對照組、125mg^kg人參皂苷陽性對照組、125及500mg/kg中藥組合物浸裔給藥組，共五組每組7只，陽性對照組及中藥組合物組以O.lmIVlOg灌胃給藥，正常對照組和拘束負荷模型組均潘胃等量水溶液，每天1^續(xù)給藥5天，在末次堠胃30洲后進行拘束應激錢.小鼠在乙鵬麻醉下取出肝臟，按肝糖原試劑盒方法測定肝糖原含量，試驗結果(表2):組別肝糖原(毫克/克肝組織)iE常對照31.19±6.0,順17.7&fc4.0*""^紐16網(wǎng).0*5紐20.03±3.0*注(與正常對照組相比^<0.05:與應激對照組相比*尸<0.05)實驗結論經(jīng)口給藥125啤kg'1及500mpkgf'中藥組合物和人參皂苷都顯示出可以在—定程度上減輕拘束應激弓l起的小鼠的肝糖原合成能力下降，證明中藥組合物能提離葡萄糖IgJEi的利用的同時加強能量的儲存，實jt例5:對拘束應激起因的小鼠脾臟脂代謝低下的恢復作用^t&方法實驗將小R瞎機分成正常對照組、拘束對照組、12Sm^kg人參t^陽性對照組、125及500mg^kg中藥組^W浸貴給藥組，共五組每組7只.陽性對照組及中藥組合物組以0.1mL/10gtt肖給藥，正常對照組和拘束負荷模型組均tt胃等量水溶液，每天l次連續(xù)給藥5天，在未次灌胃30分鐘后進行拘束應激實驗，上述各組實驗動物在禁食和拘束結束30她后尾靜脈注射脂肪乳劑(UniL/IOg,40洲后小鼠乙鵬麻醉心臟取血液，血液樣本加2%肝素鈉管500(hpin離心5賴取上淸雌，檢灑前所有樣品存放于-20度.用甘油的甘油-3曙麻酸激,氣化祛(GKPO)經(jīng)ll^分析儀確定三酸甘油睡含Jt,試驗結果(表3):組別血漿甘油三酶(塞彭分升)208.97±17.79393.73±46.62AA199.07*25.35**1鄰.52^39.30"130.75i22,22"注與正常對照組相比厶厶尸O.Ol:與應激對照組相比"尸<0.01實驗結論:小鼠拘束負荷20小時尾靜脈注射脂肪乳劑后TG消除速率明顯減慢(戶O.Ol)，表明拘束負荷可以彩響質(zhì)脂能源的利用.125及500mg/kg中藥組合物組均能使血漿甘油三酯消除速率明顯加快(尸O.Ol),可見中藥組^M能加速應激負荷小鼠脂能源的利用。實施例6:對拘朿應艦丙的小鼠腸系膜脂肪lt活性低下的恢復作W試驗方法實驗將小鼠隨機分成正常對照組、拘束對照組、125mg/kg人參皂苷陽性對照組、125及500nig/kg中藥組合物沒裔給藥組，共五組每組7只.陽性對照組及中藥組合物組以0.1mUl6gX胃給藥，正常對照組和拘束負荷模型組均權胃等量水溶液，每犬l次連續(xù)給藥5天，在末次灌胃30^m后進行拘束應激實驗，上述各組實驗動物在禁食和拘束結束30分鐘后尾靜脈艦脂助乳劑0.1mL/10g,40賴后小豕乙鵬醉分離腸系鵬組織，每20Dmg脂肪于lmLPBS溶液中剪碎勻漿(KAUbcnte6hni^Gemumy)勻漿，收集勻漿液1200(hFm、41C離心20min，吸取中間的澄滴液，迅速儲#^-20^:備用-在BALB-DTNB法自動檢瀾LPL活性檢擁'試驗結果'(表4):正常對照應激對照陽性對照125mg/kg500mg/kg組別CD4/CD8正常對照933.43±100加應激對照鄉(xiāng).35±60.10陽性對照740.11±69.00125mg/kg846.18±80.50500mg^kg752.81±71.20注與正常對照組相比厶厶尸O.Ol:與應激對照組相比"PO.Ol實驗結論3葡萄糖攝取不足，機體會動員儲存的脂肪來供應能量，腸系膜脂肪,活性會提離，拘束負荷使小鼠腸系鵬肪賺活性下降39.0%(P<0.05〉，表明拘朿負荷使小鼠脂肪動員能力下降.125及5001118^中藥組合物給藥組使應激負荷小鼠的恢￡^正常水平11實旌例7:對應激小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)過氧化狀態(tài)氧化及抗氣化能力的影響實驗方法:實施例4所得的血漿樣品，1BARS法測定脾臟淋巴細胞內(nèi)MDA含量及ORAC法劂定脾臟淋巴細胞內(nèi)抗氣化能力指數(shù)水平.TBARS擁定原理為MDA可與琉代巴比妥酸(TBA灘合，形成在532nm處有最大吸收峰性質(zhì)的紅色產(chǎn)物，通過比色法進行測定并計算MDA含量'ORAC測試原理為熒光素鈉在48Snm光激發(fā)下，^527mn熒光，可以被AAFH釋故的過載自由基ft化而使熒光特性消失。當抗氧化劑存在時，可與熒光素鈉競^l化劑，減暖其熒光消退的速度.實驗結果(表5〉組別MDA(納摩爾/毫升)ORAC(微庫爾Trolox當M/毫升)正常對照29.67±4.026853.97±887.0應鵬照35.12JbS.0AA24281.4±15訴.払厶陽性對照11.29±2.0**33057.36±2423.29"125mg/kg29036.35±2100.19"250mg/kg19.65±3.0"33687.11±2373.8"注與正常對照組相比厶厶尸O.Ol:與應afcCt照組相比"P0.01實敏結論拘束應激升高小豕血漿1^^含*的同時,011>^(:水平，即拘束負荷體內(nèi)處丁-氣化損傷狀態(tài)和應激組相比，125mg^kg和50Qmg^kg中藥組合物給藥組小鼠血漿內(nèi)的過氧化狀態(tài)明顯得到改蔣，同時ORAC水平明顯升髙(尸<0.01),可見中藥^_合物能明顯緩解應激誘發(fā)的體內(nèi)的氣化應激狀態(tài).實旌例8:促進拘束應激起因的小鼠免疫器官指數(shù)低f的恢復作用實驗動物:購入6周齡雄性CS7BL/6小鼠,飼INg度23^2T:，800Lux照明強度照明12h/d(7:(MM9:00),飼養(yǎng)-周后用于實臉，以F實施例9-13都是用此相同的實驗動物.試驗樣品實施例l所得中藥組合物干虔裔50Qmg溶于蒸餾水10ml，以下實施例都是用此相同的試驗樣品.應激模型拘束應激組小S固定在打有透氣孔的50mL圃錐管中進行拘腿激12h，以下實施例都是用此相同的應激模型，試驗方法小鼠隨機分4組，每組7只，分別為對照組，拘鵬教模型組，給藥低劑ft組，實驗組缺給藥一次，連續(xù)tt胃給藥5天，正常對照組和應激對照組給予等容量水崈液，除正常對照組外，其余各組給藥第二天拘束12小時，拘束恢復—二天后小鼠脫椎處死并取出脾臟和胸腺稱霣，試驗結果(表8-l〉組別脾臟指數(shù)(％)胸腺措數(shù)(％)正常對照0.54±0.040.34±0.03模型對照0.41±0.03AA0.19±0.01AA125mg/kg0.44±0.03*0.24^0.02*500mg/kg0.54±0.04"0.2S±0.03*注中藥組合物對應激小鼠免疫指數(shù)的影響(JF土J，"7)(與iF.常對照組相比厶APO.01;與應^照組相比*7<0.05〉實驗結論經(jīng)口給藥125m^kg—1及500mg*kg—'中藥組合物顯示出可以減輕拘束應激引起的免疫指數(shù)減小，證明并用中藥組^r可以改獸應激對免疫器官的損傷作用，實施例9:促進拘mjS激起因的小鼠脾臟細胞低F的恢復作用試驗方法小R隨機分4組，每組7只，分別為對照組，拘艦激模型組，給藥低劑量組，實驗組每天給藥一次，連續(xù)潘胃給藥5天，正常對照組和應激對照組給予等容量水溶液。KdE常對照組外，其余各組給藥第二天拘束12小時，拘束恢復三天后小R脫椎處死并取出脾臟，用組織研磨粘PBS溶液中分離單細跑，經(jīng)200目銅兩過濾，PBS溶液定容到10mL后細胞計數(shù)，試驗結果(表^2):組別脾臟總細胞數(shù)(x107)正常對照18.&12.0模型對照14.4±1.0厶125mg/kg17.&:1.0*注:中藥組合物對應激小鼠脾臟淋巴細胞總數(shù)的影響(f土J，/l-7)(與正常對照組相比A^O.05:與jSmXiT照組相比"尸O.Ol，*/<0.05)實驗結論經(jīng)口給藥125mgkg,1及500mgkg"中藥組合物顯示出可以在定程度上減輕拘束應激弓胞的(小鼠)脾臟細胞數(shù)減少，證明中藥組合物中藥組合物可以改并拘束應激起因的脾臟細胞低下作用，說明中藥組合物ff改整免皮低卜'作用，從而改接免疫低F易引起疲勞、各種感染癥和感染繼發(fā)癥等.實旌例10:對拘束應激起因的小鼠脾臟T淋巴細胞亞群比例紊亂的恢復作用試驗方法小鼠敏機分4組，每組7只，分別為對照組，拘^m激樓型組，給藥低劑量組，實驗組每天給葯一次，連續(xù)籌胃給藥5天，iH常對照組和應激對照組給予等容置水港液,除正常對照組外，其余各組給藥第二天拘束12小時，拘束恢復三天后小豕脫椎^E并取出脾臟，用組織研磨器在FBS洛液中分離糊胞，經(jīng)200目銅網(wǎng)過濾，1500ipm離心5min，棄上清液.加入3mLTU^HCl(pH7.65)綬沖溶液低張?zhí)幚砑t細胞，靜置2min后加PBS液5mL終止紅細胞裂解反應，150Qqmi離心5min后棄上糖液，用FBS液換洗兩次后，添加10%FCS-RFMI164O培養(yǎng)液諷整細胞,至5xl(AxllsinL人調(diào)整脾淋巴細胞濃度為5xl()6ceUsmL—',取流式細胞分析專用管，每管加入細胞息液lOO)iL,每個樣本制備兩管，進行FITC，PE雙色熒光抗體標記，第一管加入2(iLPE標記抗CD3抗體和ljiLFITC標記執(zhí)CD4抗體第二管加2|iLPE標記抗CD3抗體和3|iLPE標記抗CD8抗體.室溫閉光解育20min后加入500)iLPBS,振蕩混勻1500qim離心5min后棄上淸液,后用500(iLPBS振蕩混勻甩于檢擁每5><106個細胞中的CD3+CD4+細lfifllCD3+CD8+細胞百分，并計算CD3+CD4卜細胞M及CD3+CD8+細胞M比值。T細胞是不均-的細胞群體，依據(jù)其表面標志及功l^征，又可將其分為不同亞群，CD4+細胞(Th)WCDg"細胞(Ts)兩個主要亞群，CD4+細胞具有輔助和誘導功能，CD8+細胞具有免疫抑制作用和細胞毒功能，它們既相互協(xié)作，又有各自的功能特點，需要共同完成免,答才發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，所以維持T淋巴細胞亞群的穩(wěn)定對人體免疫功能起了重要的調(diào)節(jié)作用。試驗結果(表10O):<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>汰中藥組合物對應激小K脾臟T淋巴細胞亞群比例的影響(5士J，/l-7)(與正常對照組相比厶厶/<0.01:與應激對照組相比**/<0.01〉實驗結論拘束應激造成T淋巴細胞亞群比例紊亂的一種免疫異常狀態(tài)，經(jīng)口給藥12Smgkg"及500mffkg"中藥組合W中藥組^W顯示出可以調(diào)節(jié)拘束應激引起的脾臟T淋巴細胞亞群親亂，證明并用中藥組^4(j可以改tf拘束應激起因的免疫紊亂作用，從而改并因免疫紊亂引起的疲勞、各種感染癥和感染繼發(fā)癥等，實施例11:對拘束應激起因的小豕脾臟NK淋巴細胞數(shù)目低下的恢復作用試驗方法小鼠隨機分4組，每組7只，分別為對照組，拘束應激模型組，給藥低劑量組，實驗組每天給藥一次，連續(xù)灌胃給藥5天，IH常對照組和應激對照組給f'等容量水溶液,KGE常對照組外，其余各組給藥第二天拘束12小時，拘束恢復三天后小鼠脫椎處死并取出脾臟，用組織研磨器在PBS溶液中分離單細胞，經(jīng)200目銅網(wǎng)過濾，1500ipmmiif'離心5min,棄上淸液,加入3mLTii^HCl(pH7.65)緩沖溶液低張?zhí)幚砑t細胞，靜置2min后加PBS液5mL終止紅細胞裂解反應。150(hpm離心5min后棄l:淸液，用PBS液換洗兩次后，添加10WCS-RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至5xl06061131111/1,取流式細胞分析專用管，每管加入細胞懸液lOOpL,加入2jiLPE標記抗CD3抗休和lnLFTTC標記抗NKl.l抗體.室溫閉光醉育20min后加入500)iLPBS，振蕩混勻1500ipm離心5min后棄上消液，后用500)iLPBS振蕩混勻用于'檢測每5"06個細胞中的NK(NKl.rCD3")%,并結合淋巴細胞綜述計IF脾臟NK細胞數(shù)B,服細胞參與機體的抗腫痛、抗感染等生理腿，是機體重要的免疫細胞'因此NK細胞數(shù)目的變化與機體兔疫狀態(tài)密切相關，^fft結果(表114〉組別NK總細胞數(shù)(x107〉正常對照1.90±0.1模型對照1.74dbO.07A125mg/kg2.26i0.1*500mg/kg3.31迫2"注中藥組^Ml對應激小鼠脾臟NK細胞總數(shù)的影響(jf±,w=7)(NK細胞總數(shù)-NK細胞百分比x脾臟淋巴細胞總數(shù)，和正常對照組相比厶尸<0.05:和應^照組相比**戶<0.01，*/<0.05)。實驗結論拘束應激造成NK細胞總數(shù)減少一種免疾異常狀態(tài)，經(jīng)口給藥125mg'kg"及500mg'kg.1中藥組合物中藥組合物顯示出可以調(diào)節(jié)拘束應激引起的脾臟NK細胞數(shù)n減少，證明并用屮藥組合物可以改善拘束應激起因的免疫棄亂作用，從而改善因免疫紊亂引起的疲勞、各種感染癥和感染繼發(fā)癥等。實旌例12:對小鼠自然殺傷性細胞(natunlkiller:NK)的賦活作用實騎方法小鼠隨機分4組，毎組7K.分別為對照組，拘束應激模型組，給藥低劑,組，實驗組每天給藥一次，連續(xù)港胃給藥5天，正常對照組和應激對照組給予等容Jt水溶液.除iE常對照組外，其余各組給藥第一-天拘束12小時，拘束恢復二天后小豕脫椎處死并取出脾臟，用組織研磨器在PBS絲中分離單細胞，經(jīng)200目銅網(wǎng)過濾，1500ipm離心5min,棄h淸液。加入3mLTris~HCl(pH7.65)綬沖溶液低張?zhí)幚砑t細胞，靜置2min后加PBS液5mL終止紅細胞裂解反應.150(hpm離心5min后棄上淸液，用PBS液換洗兩次后，添加10%FCS-RPMI1640培養(yǎng)液諷整細胞^至ZxlC^cellsinL-1,實lft3^DiO標記的IELiBI胞被殺傷破損時，染料PI進入細胞標記細胞核，根據(jù)效乾細胞大小和DiO染色差異，可在FL1/FS圖中區(qū)分靶細胞群，進而研究靶細胞死亡情況，算出NK殺傷活性.具體實驗為，10%FCS-RPMI1640培養(yǎng)液將脾淋巴細胞思液調(diào)至lx106、5x10s、2.5xlW及125x1Wcells.100Ml/1濃度后，以100ML"wdT1分別添加到96孔畫底培養(yǎng)板中作為NK殺傷效應細胞.10%FCS-RPMII640培養(yǎng)液調(diào)整YAC-1細胞濃度至106mL'，添加EMO(10(iL'lmL1cells),在371C、5WC02條竹下辨齊15min后月培養(yǎng)液洗欲兩次，過300目尼龍網(wǎng)，用t述培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至lWceUs100作為NK靶細胞以100iLive!T1添加到效應細胞中(效:祀細胞比分別為100:1，50:1,25:1及12.5:1).YAC-1靶細胞自然死t率為10Vells'100(iL"祀細胞內(nèi)添加100iL培養(yǎng)液作為對照組,37TC、5WC02培養(yǎng)3小時后，每孔加入500mgl/'PI8|iL,繼續(xù)孵育一小時后取出，將培養(yǎng)板安于冰上終止殺傷反應，避光保存用f流式細胞儀檢溷，細胞儀對每個樣本中的1000個乾細胞作NK殺傷活性的檢潿分析，NK殺傷活ttfflNK細胞對YAC-1祀細胞的細胞毒性來表示，并通過以下公式計算加扯iaNK珠發(fā)祀細胞死t率-ffiffl胞自發(fā)死f:率細胞毒性(W-_X100*.100-粑細胞自發(fā)死亡率本發(fā)明計算出l鵬cytolysis時的NK的殺傷活性LU以細胞毒性為10%時所銪要的效應細胞數(shù)目)所需要的脾臟細胞數(shù)為單位來定i表示。此外，本發(fā)明還if算整個脾臟全部細胞所具有的NK細胞殺傷活性(LU10鄰leen)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>模型對照18.1±1.0厶125mg/kg30加.5"250mg/kg46似.4"注中藥組賴對應激小R脾臟NK細胞毒活性LU^脾臟的影響(至士J,/^7)(和正常對照組相比厶/<0.05:和應激對照組相比"/<0.01〉實驗結論從試驗結果表示，和疋常組比較，拘束應激使LU10鄰Ieen下降，即拘mjS激使NK細胞活性下降，經(jīng)口給藥125mg'kg-'及SOOmg'kg"中藥組合物顯示出促進脾細胞恢復的同時,也在一定程度t賦活NK細胞活性，證明并用中藥組合物可以改袢由于應激造成的NK細胞活性"F降，具有一定的免疫賦活作用.NK細胞活性下降會引起機體免疫力F降，疲勞和容易感染，故中藥組合物町以用改褲疲勞、堉強抗感染癥和感染繼發(fā)^_等的作用.實旌例13:對應激小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)過ft化狀態(tài)氧化及抗諷化能力的影響實驗方法實施例11所得的脾臟淋巴細胞懸液，PBS溶液調(diào)整細胞濃度為2xlO"cells/mL勻菜，9000q皿、4X:離心15min,離心上糖液TBARS法測定脾臟淋巴細胞內(nèi)MDA含量及ORAC法糖定脾臟淋巴細胞內(nèi)抗ft化能力Jtft水平.TBARS測定原理為MDA可與硫代巴比妥酸fTBA)縮合，形成在532nm處有肇大吸收峰性質(zhì)的紅色產(chǎn)物，通過比色法進fiiH定并計算MDA含ft,ORAC測試原理為熒光素鈉在485nm光激發(fā)下，發(fā)射527nm熒光，可以被AAPH釋放的過諷自由基氣化而使熒光特性消失，當抗載化劑存在時，可與熒光素鈉競爭載化劑，減緩其熒光消退的速度.實驗結果(表134):<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注與正常對照組相比AAP切.Ol:與應^照組相比**尸<0.01實驗結論拘束應激升高小豕脾臟細胞內(nèi)MDA含量的同時HHKORAC水平，即拘束負荷小鼠脾臟淋巴細胞處于氣化損傷狀態(tài)和應ft^相比，125mg/kg和50Qm^kg中藥組合物給藥亂小鼠啤臟細胞內(nèi)的過諷化狀態(tài)明顯得到改菩.同時細股內(nèi)ORAr水平吼顯殲布(尸<0.01)，可見中藥組合物能明顯緩解應激誘發(fā)免疫細胞內(nèi)的氣化應激狀態(tài).實1K例14:S整拘束應激引起丙ft酸氨基轉移瞎(ALT)棄亂作用實驗使用廣東省醫(yī)學實驗動物中心購入的7周齡雄性C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)fflfl[23i2lC,照明時間12h小時/天(7:(XM9:00),飼養(yǎng)一周后用于實驗。小鼠隨機分為空白對照組，拘束應激模型組，陽性藥對照組(維生素C2SQmg'kgf')，低劑量中藥組合物給藥組(250mpkg一1)，拓劑量中葯組^Mf給藥組(500mgkg—')，每組7只小鼠，共分5組.iE常對照組和拘束負荷模型組均潘胃同體積蒸館水，每天l次，第4天拘束模型組和中藥組合物給藥組以及維生素C給藥組小鼠鷹'胃30分鐘后進ffffi束應激18小時，正常對照組禁水禁食18小時，所有將小鼠乙鵬麻醉，心臟取血，10000ipm離心10min,用賴氏法tl定血漿ALT活性，結果表明經(jīng)口給藥后證明該中藥組合物可以改獸拘束應徵起因的ALT活性升高，使得ALT活性下降到正常水平(表1為改中藥組合物對拘束應激小鼠血漿ALT活性的影響，""'表示與空白對照組比較p<0.05)。實施例15:促進拘束應激引起的小鼠血漿和肝組織丙二醛(MDA)異?；謴妥饔脤嶒炇褂脧V東省醫(yī)學實驗動物中心購入的7周齡雄性C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)溫度23±2°C,照明時間12h小時/天(7:00-19:00),飼養(yǎng)一周后用:P實驗。小鼠隨機分為空白對照組，拘束應激模型組，陽性藥對照組(維生素025011^1^-1)，低劑量中藥組合物組(250mgig'1)，高劑量中藥組合物組(500mg-kg—')，每組7只小鼠，共分5組。lH常対照組和拘束負荷模型組均灌胃同體積蒸餾水，每天l次，第4天拘束模型組和中藥組合物給藥組以及維生素C給藥組小鼠灌胃30分鐘后進行拘束應激18小時，對照組禁水禁食18小時，所有將小鼠乙醚麻醉，心臟取血，10000rpm離心10min，并于冰上取出月f組織，用TBARS法測定血漿和肝組織MDA含量。結果表示，證明該中藥組合物可以改善拘束應激起因的小鼠血漿MDA含量增多(表15-1為該中藥組合物對拘束應激小鼠血漿MDA的影響，""'表示與空白對照組比較p<0.05)。表15-1抗應激中藥組合物(Ex)對拘束負荷小鼠血漿ALT活性和血漿、肝組織MDA水平的影響組別ALTMDA(ILM/1)LiverPlasma(納摩爾MDA/毫克(納摩爾MDA/毫蛋白)升)Normalmice37,25±1.6529.13±2.1026.31±0.73Stresscontrol92.75±1.91*41.63±2.32#36.42±0.72*VitaminC31.02土2.11'18.29±0.23*27.34士0.61'(250mg/kg)39.29±2.56*22.53±1.61*32.67±0.80Ex(250mg/kg)32.69±1.46*19.73±1.47*28.46±0.77*Ex(500mg/kg)實施例16:對拘束應激引起的小鼠肝臟谷胱甘肽(GSH)水平紊亂的改善作用實驗使用廣東省醫(yī)學實驗動物中心購入的7周齡雄性C57BL/6小鼠，詞養(yǎng)溫度23i2匸，照明時間12h小時/天(7:00-19:00)，詞養(yǎng)一周后用于實驗。小鼠隨機分為空白對照組，拘束應激模^絢，陽性藥對照組(維牛素C250mg七g—、低劑量中藥組合物組(250mgkg—1)，高劑量屮藥組合物組(500mg七g'1)，每組7只小鼠，共分5組。ir.常對照組和拘束負荷模型組均灌胃同體積蒸餾水，每天1次，第4天拘束模型組和中藥組合物給藥組以及維斗:素C給藥組小鼠灌胃30分鐘后進行拘束應激18小時，對照組禁水禁食18小時，正常對照組禁水禁食18小時，所有將小鼠乙醚麻醉，冰上取出肝組織用HPLC法測定肝組織的GSH水平。結果UH明該中藥組合物可較好地改善拘束應激引起的肝組織GSH水平紊亂(表2為該中藥組合物對拘束應激小鼠小鼠肝組織谷胱甘肽水平的影響，"*"表示與空白對照組比較p<0.05)。實施例17:對拘束應激引起的小鼠肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽S轉移酶(GST)活性降低的改善作用實驗使用廣東省醫(yī)學實驗動物中心購入的7周齡雄性C57BL/6小鼠，伺養(yǎng)溫度23±21C，照明時間12h小時/天(7:00-19:00),詞養(yǎng)一周后用于實驗。小鼠隨機分為空白對照組，拘束應激模型組，陽性藥對照組(維生素C250mgkg")，低劑量中藥組合物組(250mgkg"),高劑量中藥組合物組(500mg'kg—')，每組7只小鼠，共分5組。正常對照組和拘束負荷模型組均灌胃問體積蒸餾水，每天l次，第4天拘束模型組和中藥組合物給藥組以及維生素C給藥組小鼠灌胃30分鐘后進行拘束應激18小時，對照組禁水禁食18小時，正常對照組禁水禁食18小時，所有將小鼠乙醚麻醉，冰上取出肝組織，比色法測定肝纟n織的GPX和GST活性。結果證明該中藥組合物可較好地改善拘束應激引起的肝組織GPX和GST活性降低(表17-2為改屮藥組合物對拘束應激小鼠小鼠肝組織GPX和GST活性的影響，""'表示與空A對照組比較p<0.05)。表17-2抗應激中藥組合物(Ex)對拘束負荷小鼠肝組織GSH含量及GST、GSH-Px活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例18:對拘束應激引起的小鼠肝一氧化氮(NO)含量增高的改善飼養(yǎng)溫度23土21C，照明時間12h小時/天(7:00-19:00),飼養(yǎng)—周后用于實驗。小鼠隨機分為空白對照組，拘束應激模型組，陽性藥對照組(維生素C250mglg-')，低劑量中藥組合物組(250mglg—')，高劑量中藥組合物組(500mgig'1),每組7只小鼠，共分5組。正常對照組和拘束負荷模型組均灌胃同體積蒸餾水，每天1次，第4天拘束模型組和中藥組合物給藥組以及維生素C給藥組小鼠灌胃30分鐘后進行拘束應激18小時，對照組禁水禁食18小時，正常對照組禁水禁食18小時，所有將小鼠乙醚麻醉，冰上取出肝組織用Griess化學法測定NO的含量。結果表明該中藥組合物可較好地改善拘束應激引起的肝組織NO紊亂(表3為該中藥組合物對拘束應激小鼠小鼠肝NO的影響)。實施例19:抗應激中藥組合物對拘束應激引起的小鼠肝抗氧化能力指數(shù)(ORAC)降低的改善-飼養(yǎng)溫度23士2'C，照明時間I2h小時/天(7:00-19:00)，飼養(yǎng)一周后用于實驗。小鼠隨機分為苧白對照組，拘束應激模型組，陽性藥對照組(雄生素C250mg-kg")，低劑量中藥組合物組(250mg'kg"),高劑量中藥組合物組(500mg'kg'1)，每組7只小鼠，共分5組。正常對照組和拘束負荷模型組均灌胃同體積蒸餾水，每天1次，第4天拘束模型組和中藥組合物給藥組以及維生素C給藥組小鼠灌胃30分鐘后進行拘束應激18小時，對照組禁水禁食18小時，正常對照組禁水禁食18小時，所有將小鼠乙醚麻醉，冰h取出肝組織，參照Davalos等人方法并加以改進測定ORAC的含量。結果表明該中藥組合物可較好地恢復拘束應激引起的肝組織ORAC紊亂。(表19-3為改中藥組合物對拘束應激小鼠小鼠肝ORAC的影響，"*"表示與空白對照組比較p0.05)。表19-3抗應激中藥組合物(E"對拘束負荷小鼠肝組織ORAC指數(shù)和NO含量的影響TreatedgroupORACNO(微摩爾/毫升)(微摩爾Trolox當量)Normalmice10-40±0.09*89.41±1.98Stresscontrol4.80±0,06#112.34±0.96#VitaminC11.20±0.10*91.55±2.46**(250mg/kg)15.20tO.12**93.56±2.26**Ex(250mg/kg)16.60±0.18**88.7壯3.39**Ex(500mg/kg)權利要求1、一種中藥組合物的應用，其制成有效成分的原料的重量份組成為崗梅308份、山芝麻43份、五指柑59份、淡竹葉18份、木蝴蝶1份、布渣葉18份、火炭母46份、金沙藤104份、廣金錢草27份、金櫻根106份，其特征是，所述應用是在制備提高抗應激效果及治療或改善因應激負荷引起的免疫低下和/或糖脂代謝低下的藥物或健康食品或食品添加劑中的用途。2、根據(jù)權利要求1所述的中藥組^的應用，其特征是，所述應用是在制備改糖或和治療蟲應激負荷引起的免疫低下和域糖脂代謝低下而導致的慢性疲勞綜合癥的藥物或健康食品或食品添加劑中的用途，3、根據(jù)權利要求l所述的中藥組合物的應用，其特征是，所述^f用是在制備治療或改咎應激負荷f的NK細胞活性低下引起的免疫低下而導致的感染癥的藥物、健康食品或食品添加劑中的用途'。4、一種中藥組合物的應用，其制成有效成分的原料的重量份組成為崗梅308份、山SM43份、五指柑59份、淡竹葉18份、糊蝶1份、布渣葉18份、火炭母46份、金沙藤104份、廣^草27份、金樓根106份，其特征是，所述應用是在制備治療或改普載化應徵負荷引起的免疫低下和/或糖脂代謝低下的藥物、使豕食品、食品添加劑的用途，全文摘要本發(fā)明公開了一種中藥組合物的新應用，中藥組合物的制成有效成分的原料的重量份組成為崗梅308份、山芝麻43份、五指柑59份、淡竹葉18份、木蝴蝶1份、布渣葉18份、火炭母46份、金沙藤104份、廣金錢草27份、金櫻根106份，所述應用是在制備提高抗應激效果及治療或改善因應激負荷引起的免疫低下和/或糖脂代謝低下的藥物或健康食品或食品添加劑中的用途。所述中藥組合物以有效調(diào)節(jié)因應激導致的免疫器官萎縮；脾臟細胞數(shù)目減少；淋巴細胞增殖能力下降；淋巴細胞中T細胞亞群的比例紊亂；增強NK細胞殺傷活性。文檔編號A61K36/899GK101181539SQ20071003150公開日2008年5月21日申請日期2007年11月20日優(yōu)先權日2007年11月20日發(fā)明者何蓉蓉,姚新生,麗寶,廖廣群,曾玉蘭,栗原博,鄭榮波,黃曉丹申請人:廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司