專利名稱：一種刺激隱核蟲幼蟲油佐劑滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滅活疫苗，具體涉及一種刺激隱核蟲幼蟲油佐劑滅活疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)：
刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans Brown 1951)是一種魚類專性寄生蟲，寄生于熱帶、亞熱帶海水魚身體引起“白點(diǎn)病”，刺激隱核蟲的宿主范圍很廣泛，除軟骨魚類對(duì)刺激隱核蟲有較強(qiáng)抵抗力外，海水硬骨魚類普遍能被刺激隱核蟲感染，嚴(yán)重感染會(huì)導(dǎo)致魚類大量死亡。
近年來(lái)刺激隱核蟲病在世界各地頻繁爆發(fā)，危害日益嚴(yán)重。我國(guó)南海海水養(yǎng)殖區(qū)也年年爆發(fā)“白點(diǎn)病”，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前防治海水魚類“白點(diǎn)病”的方法很有限，雖然一些物理和化學(xué)方法能起到一定效果，但它們都或多或少存在一些缺陷，如對(duì)魚有毒性、效果不確定或者不適用于大水體等等。
Colorni(1985)曾提出魚類對(duì)刺激隱核蟲可能會(huì)產(chǎn)生獲得性免疫保護(hù)，此后他進(jìn)一步提出由于刺激隱核蟲生長(zhǎng)于宿主的上皮層內(nèi)，與宿主有著更密切的關(guān)系，合適的疫苗可能成為防治刺激隱核蟲的有效方法。但是要對(duì)某種魚采用免疫預(yù)防措施，首先就要弄清楚該種魚是否能對(duì)刺激隱核蟲的感染產(chǎn)生獲得性免疫力，是否能得到足夠的免疫保護(hù)。Burgess等(1995)首次證明了鯔魚(Chelon labrosus)可以對(duì)刺激隱核蟲產(chǎn)生獲得性免疫保護(hù)，且保護(hù)力與感染強(qiáng)度成正比。Yoshinaga等(1997)發(fā)現(xiàn)經(jīng)刺激隱核蟲免疫后底鳉(Fundulusheteroclitus)能產(chǎn)生抗血清，該血清能使寄生蟲的幼蟲纖毛凝集，并發(fā)生阻動(dòng)(Immobiliazation)。
我們?cè)谝月研析K鲹作為動(dòng)物模型進(jìn)行刺激隱核蟲標(biāo)準(zhǔn)化傳代過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，隨著被感染次數(shù)的增加，卵形鯧鲹的抗感染能力逐漸加強(qiáng)，感染上魚的寄生蟲數(shù)量逐漸減少。迄今為止，世界上尚無(wú)任何疫苗防治海水魚類的刺激隱核蟲病即“白點(diǎn)病”。
相對(duì)于引起淡水魚類“白點(diǎn)病”的多子小瓜蟲細(xì)致而深入的免疫學(xué)研究，刺激隱核蟲的研究工作才剛剛開(kāi)始。刺激隱核蟲與多子小瓜蟲具有相似的生活史、感染模式和病理特征，魚類對(duì)這兩種纖毛蟲的免疫防御機(jī)制可能也有很多相似之處，因此我們可以借鑒一些研究多子小瓜蟲的方法來(lái)對(duì)刺激隱核蟲加以研究。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種可以有效地預(yù)防海水魚類的“白點(diǎn)病”的刺激隱核蟲幼蟲油佐劑滅活疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述刺激隱核蟲幼蟲油佐劑滅活疫苗的制備方法。
本發(fā)明的刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟 (1)收集刺激隱核蟲幼蟲液，滅活，離心，收集沉淀得到滅活幼蟲，于-80℃保存； (2)將上述幼蟲解凍后，向幼蟲中加入0.15mol/L PBS重懸后混合振蕩，作為水相；按體積比，將94％的10號(hào)白油和6％的司本-80混合，再加入2％(體積比)的硬脂酸鋁作為穩(wěn)定劑，此混合物混合攪拌加熱至透明，高壓滅菌處理后作為油相；按體積比，將水相與油相以水相∶油相＝3∶7的比例，高速攪拌乳化，重復(fù)3次，在終止攪拌前加入終濃度為0.01％(體積比)的柳硫汞溶液，即制備成刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗。
在上述制備方法中，步驟(1)中所述的滅活方法優(yōu)選為加入100ppm的福爾馬林殺死全部幼蟲，離心時(shí)間為10min。
在上述制備方法中，步驟(2)中所述的高速攪拌乳化的速度優(yōu)選為13000rpm，時(shí)間為5min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗免疫海水魚類，可以使卵形鯧鲹的寄生蟲感染強(qiáng)度下降37.2％，死亡率降低40％；可以使斜帶石斑魚的寄生蟲感染強(qiáng)度下降30.8％，死亡率降低56.7％，說(shuō)明該疫苗的免疫保護(hù)效果很好，完全能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。



圖1為卵形鯧鲹經(jīng)致死劑量幼蟲(2×104個(gè)幼蟲/魚)攻毒后的死亡情況； 圖2為斜帶石斑魚經(jīng)致死劑量幼蟲(4×104個(gè)幼蟲/魚)攻毒后的死亡情況。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1刺激隱核蟲幼蟲的收集和滅活 用脫包2小時(shí)內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染海水魚，60小時(shí)后魚皮膚和鰓上出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的滋養(yǎng)體，在接下來(lái)的24小時(shí)內(nèi)幾乎所有的滋養(yǎng)體都從魚體上脫落形成包囊前體，收集脫落的包囊前體，培養(yǎng)60小時(shí)后，包囊開(kāi)始釋放出幼蟲，幼蟲孵出后，收集蟲液，混勻后吸取5份(每份50ul)，加10ul福爾馬林殺死幼蟲，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，記算出幼蟲的濃度，然后加入100ppm的福爾馬林殺死全部幼蟲，用離心機(jī)(KUBOTA 5100)3500rpm離心10min，收集在1.5ml離心管里-80℃保存。
實(shí)施例2刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗的制備方法 將上述幼蟲解凍后，向幼蟲中加入0.15mol/L PBS重懸后混合振蕩，作為水相；按體積比，將94％的10號(hào)白油和6％的司本-80混合，再加入2％(體積比)的硬脂酸鋁作為穩(wěn)定劑，此混合物混合攪拌加熱至透明，高壓滅菌處理后作為油相；按體積比，將水相與油相以水相∶油相＝3∶7的比例，以13,000rpm高速攪拌乳化5min，重復(fù)3次，在終止攪拌前加入終濃度為0.01％(體積比)的柳硫汞溶液，即制備成刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗。
實(shí)施例3疫苗的無(wú)菌檢測(cè) 將少量制備好的疫苗用涂抹棒涂于BHI固體培養(yǎng)基板上28℃恒溫培養(yǎng)48h，無(wú)任何菌落生長(zhǎng)。
實(shí)施例4疫苗的質(zhì)量檢測(cè) 取制備的疫苗1滴輕輕滴在水中，靜止觀測(cè)30min沒(méi)有發(fā)現(xiàn)油滴散開(kāi)；取制備疫苗3,000rmp離心15min未見(jiàn)分層現(xiàn)象；考馬斯亮蘭R250(水溶性染料)和蘇丹II(油溶性染料)檢測(cè)，疫苗為蘇丹II染料顏色，疫苗為油包水劑型。
實(shí)施例5疫苗的安全性檢測(cè) 同時(shí)用刺激隱核蟲活幼蟲(2.0×104幼蟲/魚)和含有相同幼蟲數(shù)量的滅活疫苗感染卵形鯧鲹(124.5±38.1g)，4天內(nèi)被刺激隱核蟲活幼蟲感染的魚全部死亡，體表和鰓上分布著大量的刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，而被刺激隱核蟲滅活疫苗感染的魚沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，體表和鰓上也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的分布。證明該疫苗在生產(chǎn)上使用是安全的。
實(shí)施例6疫苗的免疫保護(hù)力試驗(yàn) 將制備好的疫苗經(jīng)腹腔注射卵形鯧鲹(1.5×105個(gè)幼蟲/尾魚)和斜帶石斑魚(5000個(gè)幼蟲/尾魚)，在第8周分別用亞致死劑量的幼蟲和致死劑量的幼蟲感染魚，統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組魚的寄生蟲感染程度和實(shí)驗(yàn)魚的死亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，免疫過(guò)的卵形鯧鲹其寄生蟲感染強(qiáng)度降低了37.2％，如表1所示 表1卵形鯧鲹用刺激隱核蟲幼蟲攻毒后的感染情況 死亡率降低了40％，如圖1所示。
斜帶石斑魚的寄生蟲感染強(qiáng)度降低了30.8％，如表2所示 表2斜帶石斑魚用刺激隱核蟲幼蟲攻毒后的感染情況 死亡率降低了56.7％，如圖2所示。
實(shí)驗(yàn)證明該疫苗具有較好的免疫保護(hù)效果，完全能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。
權(quán)利要求
1.一種刺激隱核蟲幼蟲油佐劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟
(1)收集刺激隱核蟲幼蟲液，滅活，離心，收集沉淀得到滅活幼蟲；
(2)向上述幼蟲中加入0.15mol/L PBS重懸后混合振蕩，作為水相；按體積比，將94％的10號(hào)白油和6％的司本-80混合，再加入2％的硬脂酸鋁作為穩(wěn)定劑，此混合物混合攪拌加熱至透明，高壓滅菌處理后作為油相；按體積比，將水相與油相以水相∶油相＝3∶7的比例，高速攪拌乳化，在終止攪拌前加入終濃度為0.01％的柳硫汞溶液，即制備成刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的滅活方法為加入100ppm的福爾馬林殺死全部幼蟲，離心時(shí)間為10min。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的高速攪拌乳化的速度為13000rpm，時(shí)間為5min。
4.一種刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗，其特征在于由權(quán)利要求1所述方法制備而成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種刺激隱核蟲幼蟲油佐劑滅活疫苗及其制備方法，包括(1)收集刺激隱核蟲幼蟲液，滅活，離心后收集沉淀于-80℃保存；(2)將幼蟲解凍，加入0.15mol/L PBS重懸后混合振蕩，作為水相；按體積比，將94％的10號(hào)白油和6％的司本-80混合，再加入2％的硬脂酸鋁作為穩(wěn)定劑，此混合物混合攪拌加熱至透明，高壓滅菌處理后作為油相；(3)按體積比，將水相與油相以水相∶油相＝3∶7的比例，高速攪拌乳化，在終止攪拌前加入終濃度為0.01％的柳硫汞溶液，即制備成刺激隱核蟲幼蟲滅活疫苗。本發(fā)明的滅活疫苗用于防治海水魚類的寄生蟲感染，其免疫保護(hù)效果好，完全能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。
文檔編號(hào)A61K39/002GK101185755SQ200710032018
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者李安興, 但學(xué)明, 柏建山 申請(qǐng)人:中山大學(xué)