專利名稱：人rtn4b蛋白在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及人蛋白R(shí)TN4B在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RTN家族是一個(gè)近年來所發(fā)現(xiàn)的新的基因家族。其中神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白NSP(neuroendocrine-specific protein)后被統(tǒng)一命名為RTN1，是該家族的第一個(gè)成員。根據(jù)NSP基因組序列、cDNA序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較，發(fā)現(xiàn)了另外三個(gè)人RTN家族成員(NSP類基因I，II，III)。其中兩個(gè)(NSP-like基因I，II)相繼被克隆，并被命名為RTN2和RTN3。RTN2同樣有三個(gè)C-末端相同的異構(gòu)體。但RTN3至今沒有發(fā)現(xiàn)變異剪接本。值得注意的是，RTN2和RTN3的C-末端也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)立的穿膜區(qū)域，這被認(rèn)為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)。
RTN4是人RTN家族中新近發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)成員。它類似于RTN1和RTN2，同樣有C-末端相同的三個(gè)異構(gòu)體(即RTN4A，4B，4C)。RTN4異構(gòu)體與RTN1/NSP，RTN2，RTN3異構(gòu)體一樣有著共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。這預(yù)示著它如RTN1一樣，在聯(lián)系蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中扮演了重要的角色。RTN4與人其他RTN的N-端無明顯的同源性(＜40％)，但是這些區(qū)域具有與RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)富含堿性氨基酸殘基，脯氨酸和絲氨酸。此外，在這些區(qū)域中還發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白磷酸化位點(diǎn)。并且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)體內(nèi)RTN1A和RTN1B確實(shí)是被磷酸化的。RTN4A，4B，4C的理論等電點(diǎn)分別是4.43，4.71和9.32，這與RTN1，RTN2預(yù)計(jì)的等電點(diǎn)基本相似。
創(chuàng)傷愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。創(chuàng)傷不僅使生物體局部發(fā)生一系列變化，同時(shí)還可引發(fā)不同程度的全身性反應(yīng)；在這一過程有許多細(xì)胞參與，每種細(xì)胞又分泌多種因子，這些細(xì)胞之間、因子之間、細(xì)胞和因子之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，因此它涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、粘附、通訊、增殖和分化等細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人RTN4B蛋白的一種新用途。
本發(fā)明提供了人RTN4B蛋白在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明中，雞胚尿囊膜(CAM)試驗(yàn)表明，人蛋白R(shí)TN4B可明顯促進(jìn)雞胚尿囊膜處的血管生成；小鼠角膜實(shí)驗(yàn)表明，人蛋白R(shí)TN4B可明顯促進(jìn)小鼠角膜處的血管生成；劃痕實(shí)驗(yàn)表明，人蛋白R(shí)TN4B可明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移；細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明，人蛋白R(shí)TN4B可明顯增強(qiáng)細(xì)胞的粘附力?？梢?，RTN4B(NCBI登陸號(hào)AAG12177)可以促進(jìn)創(chuàng)傷處血管愈合。
本發(fā)明中，術(shù)語“RTN4B蛋白”指可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的、序列與(NCBI登陸號(hào)AAG12177)所示多肽序列至少70％同源性的RTN4B多肽及其變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式還包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人RTN4B DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人RTN4B多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供人RTN4B蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人RTN4B多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的具有代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；蚧?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明的RTN4B蛋白可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，酵母表達(dá)系統(tǒng)可將RTN4B基因表達(dá)為蛋白。
本發(fā)明的RTN4B基因可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的RTN4B基因序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明的RTN4B核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RTN4B基因”指編碼具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合活性的多肽的編碼核苷酸序列，如核苷酸的序列號(hào)為(NCBI登陸號(hào)-AF148538)的序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指該核酸序列開放閱讀框中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與該核酸序列開放閱讀框序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出RTN4B的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與-AF148538開放閱讀框序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與-AF148538開放閱讀框序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼序列號(hào)為AAG12177氨基酸序列的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
獲得了RTN4B基因序列后，就可以將RTN4B基因序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，以獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。一旦獲得了含有RTN4B基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，就可將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人RTN4B或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人RTN4B基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人RTN4B基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人RTN4B蛋白的分子，也包括那些并不影響人RTN4B蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人RTN4B基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人RTN4B基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人RTN4B或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人RTN4B功能的抗體以及不影響人RTN4B功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人RTN4B基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人RTN4B基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中表達(dá)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人RTN4B核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將eDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長(zhǎng)至約2000bp或者更長(zhǎng)的cDNA。對(duì)于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(可通過Johns Hopkins University Welch Medical Library在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
本發(fā)明中，所述的創(chuàng)傷愈合藥物是將RTN4B蛋白與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。
本發(fā)明中，所述的藥物是片劑、針劑、粉劑、口服液或者注射劑。
本發(fā)明中，所述的藥物中RTN4B蛋白的用量為每天1微克/千克至10毫克/千克體重。
本發(fā)明中，所述的創(chuàng)傷愈合藥物是血管生成促進(jìn)藥物。
本發(fā)明蛋白，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人RTN4B蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人RTN4B蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人RTN4B蛋白多肽被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的人RTN4B可以作為創(chuàng)傷愈合藥物，尤其是血管生長(zhǎng)促進(jìn)藥物。
本發(fā)明的RTN4B可以作為靶標(biāo)，篩選抑制血管生長(zhǎng)的物質(zhì)或者方法。篩選方法包括以下步驟A選擇候選化合物；B提供檢測(cè)RTN4B表達(dá)量或者活性的體系；C用RTN4B的檢測(cè)體系選擇候選化合物；D確定RTN4B表達(dá)量或者活性在候選化合物的影響下的改變。
本發(fā)明中，可將候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)結(jié)合，候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白的活性部位緊密結(jié)合的，該候選化合物即為抑制血管生長(zhǎng)藥物的活性成分。
本發(fā)明中，將得到的候選化合物加入含有RTN4B蛋白的溶液中，然后，檢測(cè)RTN4B蛋白的表達(dá)量或者活性，RTN4B蛋白的表達(dá)量或者活性下降的候選化合物為抑制血管生長(zhǎng)藥物的活性成分。
所述候選化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反義寡核苷酸、核酶或者與RTN4B核苷酸序列互補(bǔ)的其它核酸分子；氨基酸包括肽、抗體、互作蛋白等；小分子化合物則包括天然和人工的合成的。
作為靶標(biāo)的除了RTN4B蛋白，還可以是RTN4B基因、RTN4B的mRNA、RTN4B的表達(dá)產(chǎn)物及其前述三者的特異性片斷。所述“特異性片斷”是指可以區(qū)別本發(fā)明的RTN4B與其它基因的片斷。
創(chuàng)傷愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。創(chuàng)傷不僅使生物體局部發(fā)生一系列變化，同時(shí)還可引發(fā)不同程度的全身性反應(yīng)，并且創(chuàng)傷部分會(huì)給患者帶來不同程度的痛苦感，因此，患者總是希望創(chuàng)傷盡快愈合。本發(fā)明的RTN4B可以促進(jìn)血管生長(zhǎng)，增強(qiáng)血管細(xì)胞的粘附和遷移能力，可以用于制備促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的藥劑，幫助患者縮短療程，減輕痛苦。


圖1是.雞胚尿囊膜(CAM)試驗(yàn)結(jié)果。其中，RTN4B是濾紙上加入2ul RTN4B(200ng/ul)；bf是濾紙上加入2ul bFGF(25ng/ul)；PBS是濾紙上加入2ul PBS。
圖2是角膜及淚膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1是脂層(lipid layer)；2是水層(aqueous layer)；3是粘液層(mucous layer)；4是上皮細(xì)胞層(epithelium)；5是Bowman氏膜(Bowman’s membrane)；6基質(zhì)層(stroma)；7 Descernet氏膜(Descernet’s membrane)；8內(nèi)皮細(xì)胞層(enclothelium)。
圖3是RTN4B誘導(dǎo)小鼠角膜的血管生成圖。使用hydron作為緩釋物。APBS。B200ng RTN4B。
圖4是細(xì)胞粘附比率圖。其中，黑色表示HUVEC(人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ATCCCRL-1730)，ECV304(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，CRL-1998)。
圖5是劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
圖6是細(xì)胞遷移比率圖。其中，11是陰性對(duì)照，12是RTN4B(250ng/L)，13是RTN4B(500ng/L)，14是VEGF(100ng/L)。5h和9h分別是5個(gè)小時(shí)和9個(gè)小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 雞胚尿囊膜(CAM)試驗(yàn)材料1.海蘭白殼種蛋，購(gòu)自上海家禽育種有限公司。
2.彎頭鑷子，剪刀。
3.酒精面球。
4.打孔器。
5.培養(yǎng)皿。
6.地賽米松磷酸鈉注射液。
7.Whatman一型濾紙。
8.bFGF。
步驟1.準(zhǔn)備濾紙用70％乙醇消毒的打孔器準(zhǔn)備合適數(shù)量的濾紙(直徑5mm)，放在培養(yǎng)皿中高壓濕熱滅菌并烘干。在超凈工作臺(tái)上向每一片濾紙上加地賽米松磷酸鈉注射液8ul/片，在無菌層流下風(fēng)干30分鐘。
2.在37.5攝氏度和51％的相對(duì)濕度下，培養(yǎng)海蘭白殼種蛋。在胚胎發(fā)育第3天開窗放入濾紙。具體的操作是用70％的酒精面球擦拭雞蛋的氣室端和準(zhǔn)備開窗的部位。在氣室端鉆孔并將雞蛋平放使開窗部位朝上放置約5分鐘。用美工刀片在開窗部位刻出一個(gè)邊長(zhǎng)約1cm的方框，盡量不要碰割破下面的殼膜。用帶齒的鑷子沿方框的邊將其掀開，用洗耳球從氣室端的孔抽氣，使絨毛尿囊膜與殼膜分離并下沉。用透明膠帶密封氣室端的孔和窗口。
3.在胚胎發(fā)育第10天，向?yàn)V紙片上分別加bFGF(25ng/ul)、RTN4B(200ng/ul)和PBS各2ul，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干10分鐘。打開窗口的透明膠帶，用彎頭鑷子將濾紙片放在尿囊膜上血管較少的部位，用透明膠帶封口，然后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
4.計(jì)數(shù)在胚胎發(fā)育第13天，將雞蛋取出，去掉透明膠帶，加入1ml4％多聚甲醛，固定10分鐘后，將窗口周圍的蛋殼撥開，把濾紙片和周圍的組織剪下放在裝有4％多聚甲醛的皿里。用PBS洗后，放在載玻片上，用體示顯微鏡觀察并拍照。計(jì)數(shù)濾紙片下的血管分支數(shù)。
結(jié)果如圖1所示，黑色線條為生成的血管?？梢?，放入含有RTN4B濾紙片的胚胎中，血管生長(zhǎng)明顯比其它胚胎的血管生長(zhǎng)要快。
實(shí)施例2 角膜實(shí)驗(yàn)材料KM小鼠，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司Hydron，全稱是Poly(2-hydroxypropyl methacrylate)，sigma公司步驟1.準(zhǔn)備hydron，點(diǎn)蛋白hydron全稱是Poly(2-hydroxypropyl methacrylate)，購(gòu)自sigma公司。Hydron又名hydrogel(水凝膠)，是通過發(fā)生水化作用形成起緩釋作用的凝膠，從而控制釋放速度。
將32mg硫糖鋁溶解在72μl的PBS中混勻，hydron用無水乙醇配制成12％的溶液。取兩種溶液各50μl等體積混合。
在超凈工作臺(tái)上，將混合液點(diǎn)在parafilm膜上，約0.5mm直徑，每個(gè)pellet約含有0.5μl混合液，盡量突出。點(diǎn)好后，在紫外照射下吹20分鐘。
在pellet上點(diǎn)蛋白，小鼠角膜模型中bFGF比VEGF作用強(qiáng)，所以一般bFGF用10-80ng，VEGF用160ng左右。大劑量的促血管生成因子在做抑制的實(shí)驗(yàn)的時(shí)候使用。我們的bFGF用量為50ng。
2.麻醉小鼠。
一般選用6-8周的雌性小鼠，體重約22-33g。bFGF促新生血管的作用與小鼠品系有關(guān)，常用小鼠中以C57BL和Balb/c最好。
麻醉劑的注射劑量與小鼠的體重成正比，我們用的麻醉劑(鹽酸氯氨酮∶地西泮＝2∶1)腹腔注射KM小鼠的經(jīng)驗(yàn)劑量在120μl左右。全麻后的小鼠再用lidocain·Hcl進(jìn)行局部麻醉，并擴(kuò)瞳。
3.手術(shù)放載體。
角膜的結(jié)構(gòu)如圖2。角膜是無血管的透明組織，其養(yǎng)分靠角鞏膜緣血管網(wǎng)擴(kuò)散提供。操作方法是用注射器的針頭，使其斜面向內(nèi)，沿眼球的切面向一側(cè)做口袋，跟角鞏膜緣的距離約0.5-0.7mm，注入RTN4B。如果為了避免由于機(jī)械損傷造成的假陽性，可以將距離適當(dāng)拉大。
4.手術(shù)后的小鼠在當(dāng)天和第二天在傷口處涂抹紅霉素或金霉素眼膏，以后每天滴加地塞米松一次，以便消除炎癥反應(yīng)。一般3-4d開始產(chǎn)生微血管，7-10d血管長(zhǎng)至pellet，超過10d沒有血管的視為陰性。
5.手術(shù)后1w，拍照，摘除眼球，用4％多聚甲醛固定，4℃保存，備做組化分析。可以通過蘇木精/伊紅染色，或者用巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物抗體、antiCD31抗體(IHC，BD公司，Biosciences，550389)來區(qū)分新生血管和炎癥反應(yīng)。
6.計(jì)算a.S＝C/12×3.1416×[r2-(r-L)2]；其中，SArea，面積，單位為mm2(平方毫米)；Cclock hours of neovascularization，新血管形成鐘點(diǎn)數(shù)，每一鐘點(diǎn)等于30度；rRadius of cornea，角膜半徑；Lmaximal vessel length，最大血管長(zhǎng)度。
b.S＝0.2×3.1416×VL×CN；其中，SArea，面積，單位為mm2(平方毫米)；CNclock hours of neovascularization，新血管形成鐘點(diǎn)數(shù)，每一鐘點(diǎn)等于30度。VLmaximal vessel length，最大血管長(zhǎng)度。
結(jié)果顯示，如圖3所示，與未加入RTN4B的小鼠角膜相比，用了RTN4B后，小鼠角膜的血管數(shù)量和血管長(zhǎng)度明顯增加，面積也大大增加。
實(shí)施例3 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)1.rtn4b蛋白用pbs做梯度稀釋，終濃度分別為60和600nM，并設(shè)立陰性對(duì)照(pbs和bsa)和陽性對(duì)照af(Casade biologics，5006-100)。取96孔板一塊，將上述溶液各取50微升加入不同孔中，每組五個(gè)復(fù)孔。之后置于4度包被過夜。
2.第二天將包被液吸去，用PBS洗滌各孔，洗兩遍，每孔加入150微升濃度為1毫克每毫升的BSA(牛血清白蛋白)之后置于37度封閉1小時(shí)。
3.在封閉過程中，消化細(xì)胞ECV304至單細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度。
4.將所需細(xì)胞液吸出，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，去除上清，加入所需體積無血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。
5.封閉完成后，將96孔板取出，吸取多余bsa，加入細(xì)胞懸液，每孔104細(xì)胞。之后置于37度培養(yǎng)2小時(shí)。
6.棄去培養(yǎng)基，加入pbs，100微升每孔，洗兩遍，加入MTS(Promega，G5430)，4小時(shí)后酶標(biāo)儀(Bio-rad，型號(hào)550)測(cè)定吸光值。
7.將數(shù)值進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)，作圖。
結(jié)果顯示，用了RTN4B的細(xì)胞，與只用PBS的相同細(xì)胞相比，粘附率(剩余細(xì)胞數(shù)量/初始(或者對(duì)照)細(xì)胞數(shù)量)大大增加。而且，RTN4B的用量越多，粘附率增加越多。詳見圖4。
實(shí)施例4 劃痕實(shí)驗(yàn)將ecv304細(xì)胞重懸于DMEM+10％FBS，種在35mm的平皿中，每個(gè)皿種約4×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁8個(gè)小時(shí)后，用PBS洗兩遍，加入無血清DMEM，使細(xì)胞饑餓24小時(shí)。之后用牙簽在皿上劃去一層細(xì)胞，PBS洗兩遍以去除細(xì)胞殘?jiān)?。加入蛋白?h，4h，8h，12h和23h拍照，以記錄不同時(shí)間劃痕的愈合情況。每個(gè)視野下的遷移面積等于初始面積減去不同時(shí)間拍照時(shí)的面積，比較不同實(shí)驗(yàn)組之間的結(jié)果。
在寬度相同的條件下，遷移率可以采用遷移率＝(初始距離減去不同時(shí)間拍照時(shí)的距離)/初始距離的公式計(jì)算。所用顯微鏡是Moticam，1300，所用相機(jī)為Motic，AE31。以VEGF為陽性對(duì)照。分析軟件Motic Image。
結(jié)果顯示，用了RTN4B的細(xì)胞，與只用PBS的相同細(xì)胞相比，遷移率大大增加。而且，RTN4B的用量越多，遷移率增加越多。詳見圖5和圖6。
權(quán)利要求
1.RTN4B在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，所述的創(chuàng)傷愈合藥物是將RTN4B蛋白與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，所述的藥物是片劑、針劑、粉劑、口服液或者注射劑。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，所述的藥物中RTN4B蛋白的含量為每天1微克/千克至10毫克/千克體重。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，所述的創(chuàng)傷愈合藥物是血管促進(jìn)生成藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及人蛋白R(shí)TN4B在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。創(chuàng)傷愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。創(chuàng)傷不僅使生物體局部發(fā)生一系列變化，同時(shí)還可引發(fā)不同程度的全身性反應(yīng)，并且創(chuàng)傷部分會(huì)給患者帶來不同程度的痛苦感，因此，患者總是希望創(chuàng)傷盡快愈合。本發(fā)明的RTN4B可以促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管細(xì)胞的粘附和遷移能力，可以用于制備促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的藥劑，幫助患者縮短療程，減輕痛苦。
文檔編號(hào)A61P17/00GK101015683SQ20071003659
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日
發(fā)明者余龍, 季國(guó)慶, 劉星, 吳燕華, 唐麗莎 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)