專(zhuān)利名稱(chēng)：：核苷酸分子septin1sr1及其在制備免疫制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，提供了一種核苷酸分子，即SEPTIN1SR1，本發(fā)明還提供了該核酸分子在制備免疫制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：S印tin是一個(gè)GTP酶家族，最早是在5"acc/ar卿ycescereWw'ae酵母中被鑒定的。S印tin的功能研究主要有兩方面首先是S印tin蛋白形成10nni直徑的頸絲環(huán)繞胞漿膜內(nèi)側(cè)的母芽頸一周，作為胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的載物臺(tái)[Bi，E.，Maddox,P.,Lew,DJ.，"a丄(1998)/Ce"^io丄142:130卜1312.;Boyne,JR.,Yosuf，國(guó).，Bieganowski，P.,etW(2000)/CeW113:4533-4543.]。次之，S印tin與極性生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[Barral，Y.'Mermall,V.，Mooseker，MS.,eta丄(2000).#o〗Ce".5,841-851;Takizawa,PA.，Derisi,幾.，Wilhelm,JE.，eta丄(2000).5bj'e/7ce.290,341-344]。然而，尚未有人報(bào)道關(guān)于S印tinl在制備免疫制劑中的應(yīng)用。自身免疫性疾病(autoimmunediseases)是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。自從Donath與Landsteiner提出此概念以來(lái)，許多疾病相繼被列為自身免疫性疾病，常見(jiàn)的自身免疫病有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺機(jī)能元進(jìn)、青少年糖尿病v原發(fā)性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎以及許多種皮膚病、慢性肝病，等等。這些病名對(duì)許多人來(lái)說(shuō)并不很陌生。這類(lèi)疾病的治療有一個(gè)共同點(diǎn)，都需要用免疫抑制劑來(lái)抑制針對(duì)自身機(jī)體的免疫反應(yīng)。最常用的是腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)制劑，如強(qiáng)的松、氫化可的松、地塞米松等，大家往往將其簡(jiǎn)稱(chēng)"激素"。如果療效不佳，還可能用環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤等所謂細(xì)胞毒性藥物，這些藥既可用來(lái)抑制免疫，又用于治療癌癥。所有免疫抑制劑有個(gè)主要的共同的不良作用，它們會(huì)不同程度地影響機(jī)體的抗感染、抗腫瘤免疫功能。因此，眾多專(zhuān)家一直在研究其他治療方法。自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，但自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B細(xì)胞的激活，是自身免疫性疾病發(fā)病過(guò)程中一個(gè)必然的環(huán)節(jié)。因而，許多學(xué)者將自身免疫性疾病分為T(mén)細(xì)胞介導(dǎo)的、自身抗體介導(dǎo)的、及聯(lián)合介導(dǎo)的自身免疫性疾病三種。B細(xì)胞激活后的重要產(chǎn)物——自身抗體已作為診斷自身免疫性疾病的標(biāo)志物，而目前還沒(méi)有常規(guī)檢測(cè)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的特異性指標(biāo)。因此，自身免疫性疾病的治療和相關(guān)藥物是目前醫(yī)藥界一個(gè)重要課題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備免疫制劑的核酸分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述核酸分子的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于制備免疫制劑的核酸分子，它的序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。在本發(fā)明中被稱(chēng)為SEPTIN1SR1。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"核苷酸分子SEPTIN1SR1"指具有抑制SEPTIN1蛋白活性并且含有與AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU序列高度同源的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-15個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地l-5個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為IO個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。例如，在A(yíng)UUCAUCGAGGAGCAAUUU或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU后(3'端)加入若干dT(脫氧胸苷)后形成的序列。本發(fā)明中，SEPTIN1SR1的序列可以包括ATTCATCGAGGAGCAATTT和AAATTGCTCCTCGATGAAT。本發(fā)明中，SEPTIN1SR1的序列可以包括5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3，或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。本發(fā)明中，SEPTIN1SR1的序列可以是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。本發(fā)明中，SEPTIN1SR1的序列可以是ATTCATCGAGGAGCAATTT禾口A(yíng)AATTGCTCCTCGATGAAT。本發(fā)明中，SEPTIN1SR1的序列可以是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'和5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3，。本發(fā)明還提供了上述核酸分子的制備方法，即按本發(fā)明中，SEPTIN1SR1的序列可以將各核糖核酸基團(tuán)或者脫氧核糖核酸基團(tuán)依次脫水縮合。本發(fā)明還提供了上述核酸分子在制備免疫制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的SEPTIN1SR1是SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以特異性的阻滯淋巴細(xì)胞的分裂或促進(jìn)淋巴細(xì)胞其凋亡。研究表明，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤(pán)、腦、心臟、外周血白細(xì)胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，S印tinl蛋白只在外周血、胸腺和脾臟的淋巴細(xì)胞中大量表達(dá)，這說(shuō)明S印tinl蛋白主要在淋巴細(xì)胞中發(fā)揮功能，而不會(huì)對(duì)其它組織或者細(xì)胞起作用。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)顯示，以表達(dá)正常S印tinl的細(xì)胞為對(duì)照，S印tinlS206A(即在S印tinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳)突變體會(huì)使細(xì)胞不進(jìn)入G2期，即細(xì)胞不能分裂；S印tinlS206E(即在S印tinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)镋)突變體使G2期細(xì)胞大大增加，即促進(jìn)細(xì)胞分裂。這說(shuō)明S印tinl可調(diào)控細(xì)胞分裂，尤其是206位的絲氨酸殘基。這也說(shuō)明，如果將S印tinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳、抑制S印tinl蛋白活性或者使S印tinl蛋白失活，就白的抑制劑或者失活劑，施用于細(xì)胞，就可以使細(xì)胞停止分裂。另一方面，一旦篩選到了S印tinl蛋白的增強(qiáng)劑，施用于細(xì)胞，就可以使細(xì)胞加速分裂生長(zhǎng)。綜上所述，S印tinl可調(diào)控細(xì)胞分裂，尤其是淋巴細(xì)胞的細(xì)胞分裂。S印tinl的突變體或者抑制劑可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。而本發(fā)明的SEPTIN1SR1作為SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以特異性的阻滯淋巴細(xì)胞的分裂或促進(jìn)淋巴細(xì)胞其凋亡，因而，可以與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合制成免疫制劑。本發(fā)明中，所述的免疫制劑可以用于治療和緩解自身免疫性疾病。本發(fā)明中，所述的自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、青少年糖尿病、原發(fā)性血小板紫癜和自身免疫性溶血性貧血等。上述疾病的共同點(diǎn)就是自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B細(xì)胞的激活。本發(fā)明的S印tiril是淋巴細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖所必需的。SEPTIN1SR1作為SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以使細(xì)胞不進(jìn)入G2期，即細(xì)胞不能分裂；將其施用于上述自身免疫性疾病患者，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，骨髓移植(Bonemarrowtransplantation)是各種血液腫瘤、再生不良性貧血癥、重度地中海型貧血癥以及一些先天性免疫缺乏癥或代謝性疾病救命的根本治療方法。在骨髓移植手術(shù)期間，由于成熟免疫細(xì)胞被一率殺滅，患者的免疫力極其低下，需要住在無(wú)菌室進(jìn)行治療，給患者帶來(lái)了非常大的痛苦。SEPTIN1SR1作為SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡，將其用于骨髓移植及其前期準(zhǔn)備工作，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，減輕患者及其家屬的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明的SEPTIN1基因可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的SEPTIN1基因序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明的SEPTIN1核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SEPTIN1基因"指編碼具有SEPTIN1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列號(hào)為(NCBI登陸號(hào)NM一052838)的序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指該核酸序列開(kāi)放閱讀框中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與該核酸序列開(kāi)放閱讀框序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出神經(jīng)元分化相關(guān)基因SEPTIN1的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與剛—052838開(kāi)放閱讀框序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與剛—052838開(kāi)放閱讀框序列的同源性至少70%,較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼序列號(hào)為NP—443070氨基酸序列的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為l-90個(gè)，較佳地1-6()個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-IO個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。獲得了SEPTIN1基因序列后，就可以將SEPTIN1基因序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，以獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。一旦獲得了含有SEPTIN1基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，就可將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)。本發(fā)明的SEPTIN1SR1，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。SEPTIN1SR1可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類(lèi)藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人SEPTIN1可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的SEPTIN1還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的SEPTIN1SR1被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該抑制劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明中，所述的免疫制劑是由含有效治療量的SEPTIN1SRI和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發(fā)明還提供了一種用于治療自身免疫性疾病的試劑盒。該試劑盒中包括SEPTIN1SR1。該試劑盒還可含有使用說(shuō)明、分子標(biāo)記、將S印tinl蛋白的抑制劑引入細(xì)胞或者組織所需的其他試劑，例如緩沖液等。將SEPTIN1SR1引入細(xì)胞或者組織，可以將細(xì)胞的有絲分裂停滯在S期，即使細(xì)胞不分裂，或者使細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制病變的淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。本發(fā)明的SEPTIN1SR1可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。將SEPTIN1SR1用于自身免疫性疾病患者，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，減輕患者及其家屬的負(fù)擔(dān)。圖1為S印tinl的組織表達(dá)譜圖。其中，1為心臟、2為腦、3為胎盤(pán)、4為肺、5為肝、6為骨胳肌、7為腎、8為胰腺、9為脾臟、IO為胸腺、ll為前列腺、12為睪丸、13為卵巢、14為小腸、15為大腸、16為外周血白細(xì)胞。圖2為s印tinl蛋白在17種人類(lèi)細(xì)胞系中的表達(dá)情況圖。圖3為s印tinl蛋白與CK2互作IB-免疫印跡雜交試驗(yàn)的結(jié)果。圖4為s印tinl蛋白在Jurkat細(xì)胞株的定位結(jié)果。圖5為s印tinl蛋白被CK2體內(nèi)磷酸化的結(jié)果。圖6為s印tinl蛋白被CK2體外磷酸化的結(jié)果。圖7為septinl蛋白在Jurkat細(xì)胞株內(nèi)被SEPTIN1SR抑制的結(jié)果。圖8為空載體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)。為圖9-ll空白對(duì)照，由流式細(xì)胞儀分析而得。圖9為野生型s印tinl蛋白轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)。為圖10-ll的對(duì)照，由流式細(xì)胞儀分析而得。圖10為s印tinl蛋白S206A突變體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)，由流式細(xì)胞儀分析而得?？梢?jiàn)，與圖8和9相比，G2期細(xì)胞幾乎沒(méi)有。圖11為s印tinl蛋白S206A突變體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。橫坐標(biāo)為基因組數(shù)，由流式細(xì)胞儀分析而得。可見(jiàn)，與圖8和9相比，G2期細(xì)胞明顯增加。具體實(shí)施方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方案，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等人的《分子克隆》實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或者按照生產(chǎn)商建議的條件進(jìn)行操作。實(shí)施例1S印tinl的組織中的表達(dá)情況1.1Northern探針制備用ClontechMultipleTissuenorthen膜檢測(cè)成人組織中s印tinl基因的分布情況，所用探針為克隆到的s印tinl全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(即NCBI登陸號(hào)腦—052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。1)用s印tinl基因的特異的引物從構(gòu)建好并己經(jīng)測(cè)序的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒純化后，用GeneQuantII型紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后DNA的濃度。2)DNA模板經(jīng)100。C熱變性2min后，用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒以隨機(jī)引物標(biāo)記法摻入Y-32PdCTP。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，加入EDTA至終濃度20隱ol/L中止反應(yīng)，IOO'C熱變性5min，置于冰上。3)將探針用MicroSpinG-25純化柱純化。純化前后分別取樣lW稀釋IOO倍，取3W稀釋液點(diǎn)樣在WhatmanDE81濾紙上，用Monitor900型放射性檢測(cè)儀測(cè)定其放射強(qiáng)度(cps)。將純化后的放射性強(qiáng)度除以純化前的放射性強(qiáng)度記為摻入率，摻入率大于30%則認(rèn)為探針制備合格。1.2Northen雜交1)將雜交膜用2XSSC液潤(rùn)濕后將膜帶RNA的一面朝上放入雜交管中，每10cm2膜面積加入lml甲酰胺預(yù)雜交液，預(yù)雜交液含50%甲酰胺，5XSSPE，l()XDenhardt試劑，2%SDS,1000mg/L小牛胸腺DNA。42。C預(yù)雜交2-4小時(shí)。2)預(yù)雜交結(jié)束后，將純化后的標(biāo)記探針加入剩余的預(yù)雜交液中。42'C雜交48小時(shí)。3)雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交液棄去，加入雜交洗脫液l(2XSSC，0.05%SDS)室溫洗滌3次，每次30min，其間不停晃動(dòng)膜。然后加入雜交洗脫液2(0.IXSSC，O.1%SDS)，5(TC洗滌2次，每次30min。用Monitor900型放射性檢測(cè)儀測(cè)定整張膜上的放射強(qiáng)度。如果背景的放射強(qiáng)度過(guò)高，可以適當(dāng)?shù)奶岣呦茨囟?，再次洗滌?)將洗滌完畢的膜放入保鮮袋中封口，進(jìn)行放射自顯影.結(jié)果顯示，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤(pán)、腦、心臟、外周血白細(xì)胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，S印tinl的mRNA僅在外周血、胸腺、脾臟等組織中有表達(dá)，而且在胸腺中表達(dá)量最高。詳見(jiàn)圖l。實(shí)施例2western-blot分析s印tinl蛋白在17種人類(lèi)細(xì)胞系中的表達(dá)情況1、17種人類(lèi)細(xì)胞系的培養(yǎng)所選17種細(xì)胞均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，其組織來(lái)源及培養(yǎng)條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(2)分別取每種上清10W進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(3)用BIORAD轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，冰浴中轉(zhuǎn)移2hr，電壓為100V。置于麗春紅染色液中510min,水洗去染料，標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶。(4)封閉將膜放置于30ml封閉緩沖液中，室溫下置于搖床震蕩lhr。(5)—抗反應(yīng)按推薦的稀釋比加入s印tinl特異性抗體(購(gòu)于SANTACRUZ公司)，將膜浸于稀釋好的一抗中，室溫下?lián)u床孵育2hr;用洗滌緩沖液洗膜4次，每次10min;(6)二抗反應(yīng)按1:1,0000的稀釋比加入HRP耦聯(lián)的抗羊抗體，將膜浸于稀釋好的二抗中，室溫下?lián)u床孵育lhr;用洗滌緩沖液洗膜4次，每次10min。(7)ECL發(fā)光反應(yīng)把膜用三倍稀釋或不稀釋的ECL發(fā)光試劑顯影曝光。結(jié)果顯示，S印tinl主要在T細(xì)胞(Jurkat，ATCC;6T-CEM，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院)和B細(xì)胞(EB-3,ATCC)中表達(dá)。實(shí)施例3S印tinl在Jurkat細(xì)胞中的定位本發(fā)明中，首先將全長(zhǎng)s印tinl的cDNA構(gòu)建入Ds-Red-Cl熒光表達(dá)載體。將所得的RFP一s印tinl重組子轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中，培養(yǎng)48小吋，經(jīng)過(guò)固定處理后，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。具體步驟如下(1)收取懸浮培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞，充分打散后滴加在涂有多聚賴(lài)氨酸的載波片上，靜置5min后置于4X的多聚甲醛中室溫固定10min(分鐘)。(2)PBS洗三遍，于O.2%TritonX-100中室溫打孔15min。(3)PBS洗三遍，于含有10%馬血清、1%BSA的TBS中室溫封閉1hr(小時(shí))。(4)TTBS洗一遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的一抗(抗s印tinl抗體，1:20)，37°C孵育2hr。(5)TTBS洗三遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的二抗(Rhodamine-抗羊，1:100)，37°C孵育lhr。(6)TTBS洗三遍，于lPgDAPI溶液中37°C染色20min。(7)TTBS洗三遍，封片，上熒光顯微鏡觀(guān)察。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)s印tinl呈細(xì)胞質(zhì)分布(如圖4)，且其分布具有一定的極性，另外，其分布隨細(xì)胞周期的變化有所不同，在細(xì)胞分裂的全過(guò)程中，s印tinl極有可能在紡錘體兩極的中心粒周?chē)植?，在中期以后，s印tinl還會(huì)在兩細(xì)胞分裂溝處聚集。實(shí)施例4pull-down檢測(cè)s印tinl蛋白與CK2激酶的互作1、將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有PCMV-Myc-CK2a的細(xì)胞裂解液(細(xì)胞數(shù)5X106)與50pl50%的谷胱甘肽瓊脂糖珠和2(^g的GST在搖床上4。C孵育2h.2、4°C，2000rpm離心2分鐘。3、將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分為兩等份，各加入50pl谷胱甘肽瓊脂糖珠，其中一管加入10(ag的GST蛋白，另一管加入l(Vg的GST-s印tinl融合蛋白，4°C搖床孵育2小時(shí)。4、2000rpm離心2分鐘，上清取到新的離心管中，4°C保存，以備后用。5、用lml冰浴的裂解緩沖液(20mMTris-clpH8.0,500mMNaCl，lmMEDTA'1%NP-40)洗珠子，2000rpm離心l分鐘，棄上清，再重復(fù)洗3次。6、用20pl20mM的還原谷胱甘肽(在50mM的Tris-ClpH8.O的緩沖液中)從珠子上洗脫GST融合蛋白和與它結(jié)合的蛋白。2000rpm離心2分鐘。7、洗脫的蛋白加入等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸4分鐘。8、WesternBlotting檢測(cè)。結(jié)果顯示，如圖3所示，S印tinl與CK2能相互作用。實(shí)施例5CK2激酶在體外、體內(nèi)磷酸化s印tinl1、體外磷酸化(1)取His-CK2a激酶0.2tig,底物蛋白5yg(GST-s印tinl，GST-s印tinl-206A)'加入lXKinasebuffer(cellsignal公司)，反應(yīng)體系中另含有200pMr-32p-ATP(5|aCi/(xl)。(2)在30'C讓反應(yīng)物作用30分鐘，然后加5pl5XSDS上樣緩沖液終止反應(yīng)。(3)取20^1反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，膠染色、脫色。(4)真空干燥儀上干膠60'C2小時(shí)，冷卻后，壓上X-光片，-8(TC曝光。(5)顯影2、體內(nèi)磷酸化(1)將PCMV-HA-CK2a分別與PCMV-myc-s印tin1、PCMV-myc-s印Unl(206A)共轉(zhuǎn)染人H1299細(xì)胞系(2)37°C培養(yǎng)48hr后收獲細(xì)胞并裂解。(3)向每500(il細(xì)胞裂解液中加入3(alanti-myc—抗(sigma)，25^1ProteinGPlus/ProteinAAgarose(sigma公司)，置于4。C搖床緩慢震蕩1小時(shí)。(4)2000rpm離心l分鐘后用lXPBS洗滌Agarose三次(5)向Agarose中加入2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸4分鐘。取上清20pl進(jìn)行SDS-PAGE電泳(6)用磷酸化蛋白染色試劑盒(invitrogen)染色結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)，S印tinl均可被CK2激酶磷酸化。體外磷酸化詳見(jiàn)圖5，體內(nèi)磷酸化詳見(jiàn)圖6。實(shí)施例6檢測(cè)s印tinl的磷酸化突變體對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)及周期的影響1、分別將PCMV-myc，PCMV-myc-s印tinl,PCMV-myc-s印tinl(S206A),PCMV-myc-s印tinl(S206E)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞2、37°C培養(yǎng)60hr后流式細(xì)胞儀檢測(cè)個(gè)細(xì)胞的周期結(jié)果顯示，s印tinl(S-A)突變體(即將s印tinl蛋白第206位絲氨酸突變?yōu)楸彼?alanine，Ala，A))導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，G2/M期細(xì)胞明顯減少，而s印tinl(S-E，即將s印tinl蛋白第206位絲氨酸突變?yōu)楣劝彼?glutamicacid，Glu,E))突變體則不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但引起細(xì)胞G2/M期增高。這提示，s印tinl可以維持細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行，s印tinl206位絲氨酸突變時(shí)，細(xì)胞不能正常分裂。實(shí)施例7細(xì)胞中RNA干擾s印tinl的表達(dá)1、將合成的siRNA溶于去RNAase的ddH20中，制成50mM的工作母液2、取5W脂質(zhì)體(GIBC0公司脂質(zhì)體Lipfectmine2000)與250WOPTI—MEM培養(yǎng)基混合均勻，靜置5min3、取25PlsiRNA工作母液與250riOPTI—MEM培養(yǎng)基混合均勻4、將2與3溶液混合均勻，室溫靜置20min5、將lXl(r的懸浮細(xì)胞離心收集并用lXPBS洗滌一次，用40CmiOPTI—MEM培養(yǎng)基重懸后與4所得溶液混合，加入6孔板一孔6、37°C培養(yǎng)5hr后更換完全培養(yǎng)基7、繼續(xù)培養(yǎng)48-60hr后收獲細(xì)胞，取出一半細(xì)胞進(jìn)行western-blot檢測(cè)s印tinl的表達(dá)情況，同時(shí)另一半細(xì)胞用于流式細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示，在l^g/ml的PHA刺激下，60小時(shí)內(nèi)干擾septinl的Jurkat細(xì)胞的增殖水平。在培養(yǎng)了60小時(shí)后，干擾組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖幅度大大降低。權(quán)利要求1.一種分離出的核酸分子，其特征在于，它的序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。2.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括ATTCATCGAGGAGCAATTT和AAATTGCTCCTCGATGAAT。3.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3,或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。4.一種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。5.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是ATTCATCGAGGAGCAATTT和AAATTGCTCCTCGATGAAT。6.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT墨3，和5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3，。7.—種如權(quán)利要求1、2、3或者4所述的核苷酸分子的制備方法，其特征在于，按權(quán)利要求l、2、3或者4所述的核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團(tuán)或者脫氧核糖核酸基團(tuán)依次脫水縮合。8.如權(quán)利要求1、2、3或者4所述的核苷酸分子在制備免疫制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，提供了一種核苷酸分子，即SEPTIN1SR1，本發(fā)明還提供了該核酸分子在制備免疫制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的核苷酸序列包括序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。本發(fā)明的SEPTIN1SR1可以特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂停滯或者凋亡。將SEPTIN1SR1用于自身免疫性疾病患者，就可以特異性的使淋巴細(xì)胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，減輕患者及其家屬的負(fù)擔(dān)。文檔編號(hào)A61K31/7088GK101240273SQ20071003718公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者丁向明,龍余,余文博,唐麗莎申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)