專利名稱：一種反義寡聚核苷酸－碳納米管藥物載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種寡聚核苷酸與納米材料組成的藥物載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
選擇合適的靶基因作為攻擊點(diǎn)和合適的載體來提高藥物在生物體內(nèi)的表達(dá)是腫瘤治療研究中遇到的兩大課題。然而，近20年來在腫瘤分子生物學(xué)特征方面和生物相容性化學(xué)材料方面取得的進(jìn)展為靶基因的選擇打下了良好的基礎(chǔ)。
人類端粒是位于染色體末端的重復(fù)DNA序列(TTAGGG)，具有維持染色體穩(wěn)定的重要作用，端粒長(zhǎng)短變化和穩(wěn)定與細(xì)胞的衰老和癌變密切相關(guān)。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白聚合酶，它能以自身的RNA為模板合成端粒DNA，彌補(bǔ)端粒丟失，對(duì)維持端粒長(zhǎng)度，使細(xì)胞獲得永生化起重要作用。根據(jù)目前已檢測(cè)的癌組織標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，惡性腫瘤組織端粒酶檢出率高達(dá)84％~95％，而良性腫瘤及正常組織的端粒酶檢出率僅4％左右，表明端粒酶是腫瘤生長(zhǎng)所必需而不存在于正常組織的細(xì)胞成分，因此端粒酶與腫瘤之間的高度相關(guān)性使之成為治療腫瘤的理想靶點(diǎn)，是目前腫瘤基因治療研究的新熱點(diǎn)。
端粒酶有3個(gè)主要組成部分端粒酶RNA(hTR)、端粒相關(guān)蛋白(TP1)、端粒酶催化亞單位(hTERT)。端粒酶催化亞單位(hTERT)是一個(gè)最近才被克隆出來的單拷貝基因，其基因組合有逆轉(zhuǎn)錄酶催化區(qū)域的高度保守的特異序列。現(xiàn)已證明hTERT mRNA只在惡性腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株以及某些有高度再生潛力的自我更新組織(如子宮內(nèi)膜)中表達(dá)，與端粒酶活性表達(dá)一致，對(duì)癌病變特異，其上游調(diào)節(jié)對(duì)端粒酶活性表達(dá)起重要作用，被認(rèn)為是端粒酶活性的限速?zèng)Q定因素。
反義技術(shù)概念是Lzant等于1984年首次提出的，其基本原理就是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，用人工合成或生物體表達(dá)的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段以抑制或封閉專一靶基因表達(dá)的技術(shù)。
反義寡聚核苷酸(ASODN)是指能夠特異性抑制一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的短小DNA片段。反義核酸治療則是利用反義技術(shù)設(shè)計(jì)與異常激活或有害基因及其mRNA互補(bǔ)的反義寡聚核苷酸，特異性地封閉那些基因抑制其表達(dá)，從而達(dá)到減少基因產(chǎn)物，抑制細(xì)胞惡變的作用。
碳納米管(CNTs)自1991年被發(fā)現(xiàn)以來，因其獨(dú)特的性質(zhì)成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一。納米材料在生物領(lǐng)域方向的研究以零維的納米顆粒為多，碳納米管作為一種具有良好生物相容性的一維納米材料在生物領(lǐng)域的應(yīng)用則很少有報(bào)道。
一維碳納米管在空間有兩維處于納米尺度。根據(jù)碳納米管中碳原子層數(shù)的不同，碳納米管大致可以分為兩類單壁碳納米管(SWNTs)和多壁碳納米管(MWNTs)。SWNTs是由單層碳原子繞合而成的，結(jié)構(gòu)具有較好的對(duì)稱性和單一性。MWNTs是由許多柱狀碳管同軸套構(gòu)而成。
與傳統(tǒng)的零維納米顆粒相比，碳納米管在藥物載體上的應(yīng)用具有如下特點(diǎn)碳納米管特別是功能化的碳納米管具有良好的生物相容性，對(duì)生物體系毒性小，這為將碳納米管應(yīng)用到生物領(lǐng)域提供了可能；管狀結(jié)構(gòu)的碳納米管具有很高比表面積，在其壁表面修飾生物體系可以提高負(fù)載量；碳納米管通過簡(jiǎn)單的化學(xué)處理將其打斷成任意長(zhǎng)度，適用于生物領(lǐng)域的應(yīng)用；碳納米管通過簡(jiǎn)單的化學(xué)修飾使其壁表面帶上親水性的官能團(tuán)，得到在水溶液中均勻分散的碳納米管溶液體系；通過化學(xué)修飾可以使碳納米管管壁帶有不同功能的官能團(tuán)，適于不同生物體系的研究。但是，目前尚未見到利用多壁碳納米管作為藥物載體，來提高反義寡聚核苷酸在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的目的的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體，有效提高反義寡聚核苷酸的負(fù)載量和靶向性，以克服單獨(dú)使用反義寡聚核苷酸藥物轉(zhuǎn)染率低、抑制腫瘤細(xì)胞效果不明顯等缺點(diǎn)。填補(bǔ)了以碳納米管為載體來輸送靶向性生物分子或藥物的空白。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體，由碳納米管外殼和反義寡聚核苷酸組成。
上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的優(yōu)選方案之一為，所說的反義寡聚核苷酸為端粒酶催化亞單位基因的反義寡聚核苷。
上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的優(yōu)選方案之二為，所說的碳納米管長(zhǎng)度為50~200nm，直徑為10~50nm。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法，依次包括如下步驟
a)用強(qiáng)酸氧化多壁碳納米管，使多壁碳納米管管壁帶上羧基，超聲裁剪成50~200nm的短管；b)加入聚陽離子化合物修飾到碳納米管管壁上；c)將反義寡聚核苷酸組裝到多壁碳納米管上。
上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法的優(yōu)選方案之一為，所說的強(qiáng)酸為濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸或者其混合物。
上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法的優(yōu)選方案之二為，所說的聚陽離子化合物選自聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞銨、聚酰胺胺樹枝狀化合物或殼聚糖中的一種或一種以上。
上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法的優(yōu)選方案之三為，所說的反義寡聚核苷酸為端粒酶催化亞單位基因的反義寡聚核苷。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的應(yīng)用，包括將負(fù)載有端粒酶催化亞單位基因反義寡聚核苷的碳納米管作用于腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選方案為，所說的腫瘤細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物，由有效劑量的上述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體和藥學(xué)上可接受的其他成分組成。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的藥物載體的具體制備技術(shù)步驟如下(1)用濃硫酸和濃硝酸的混合物氧化多壁碳納米管，使多壁碳納米管管壁帶上羧基(-COOH)。通過超聲將之裁剪成50~200nm的短管。
(2)利用基團(tuán)之間的靜電作用力將聚陽離子化合物聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)，或聚乙烯亞銨(PEI)，或聚酰胺胺(PAMAM)樹枝狀化合物，或殼聚糖(Chitosan)等修飾到碳納米管管壁上，得到在水溶液中均勻分散的多壁碳納米管體系。
(3)利用基團(tuán)之間的靜電作用力將ASODN組裝到多壁碳納米管上，得到了負(fù)載有hTERT基因反義寡聚核苷酸的多壁碳納米管體系。
(4)將負(fù)載有hTERT基因反義寡聚核苷的碳納米管加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率及hTERT基因反義寡聚核苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制效率。
本發(fā)明的碳納米管作為藥物載體，可以選用不同種類的寡聚核苷酸序列作為起藥物作用的成分，比如基因組DNA序列、cDNA、質(zhì)粒載體、DNA疫苗、干擾RNA、核酸酶等等，而不影響本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和相應(yīng)的技術(shù)效果，所以在本發(fā)明的說明書中，均以hTERT基因反義寡聚核苷酸為例，并不意味著本發(fā)明的技術(shù)方案僅能夠用于hTERT基因反義寡聚核苷酸。
有益效果本發(fā)明利用多壁碳納米管作為藥物載體，來提高反義寡聚核苷酸在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的目的。
本發(fā)明所提供的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體，比傳統(tǒng)的零維納米顆粒更加有效地?cái)y帶反義寡聚核苷酸，與單獨(dú)使用裸反義寡聚核苷酸藥物相比對(duì)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高、靶向性強(qiáng)、抑制腫瘤細(xì)胞效果明顯。填補(bǔ)了以碳納米管為載體來輸送靶向性生物分子或藥物的空白。該藥物載體制備方法簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉、易于工業(yè)化生產(chǎn)。針對(duì)不同的生物體系，以碳納米管為載體來輸送不同的靶向性生物分子或藥物，如基因組DNA序列、cDNA、質(zhì)粒載體、DNA疫苗、干擾RNA、核酸酶等，為其它腫瘤或疾病的治療嘗試了一條新的途徑。


下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明做限定。
圖1.反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備示意圖。聚陽離子采用聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)，或殼聚糖(Chitosan)，或聚乙烯亞銨(PEI)，或聚酰胺胺(PAMAM)樹枝狀化合物。
圖2.酸化后的多壁碳納米管(MWNTs)紅外光譜。1712cm-1是羧基的吸收帶。
圖3.TEM圖。A)未經(jīng)過處理的MWNTs；B)經(jīng)過混酸氧化超聲16h的MWNTs。
圖4.HeLa細(xì)胞中MWNTs-PEI-ASODN和裸反義寡聚核苷酸的轉(zhuǎn)染率的比較。細(xì)胞經(jīng)洗滌后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖5.HeLa細(xì)胞分別經(jīng)MWNTs-PEI-ASODN和裸反義寡聚核苷酸處理24小時(shí)后的調(diào)亡百分?jǐn)?shù)比較。細(xì)胞經(jīng)洗滌后用PI處理，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如操作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。常規(guī)無機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購自上海化學(xué)試劑廠，聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)、聚乙烯亞銨(PEI)、聚酰胺胺(PAMAM)樹枝狀化合物購自Aldrich，殼聚糖(Chitosan)購自上海生化試劑公司。
下列實(shí)施例中的反義寡聚核苷酸是根據(jù)人類端粒酶催化亞單位(hTERT)基因cDNA的序列分析，選擇了起始密碼子上游的9個(gè)堿基及后續(xù)的11個(gè)堿基，共20個(gè)堿基作為作用的靶序列，設(shè)計(jì)出的反義寡聚核苷酸的序列。其核苷酸序列為5’-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3’，上述反義寡聚核苷酸序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
本發(fā)明的碳納米管作為藥物載體，可以選用不同種類的寡聚核苷酸序列作為起藥物作用的成分，比如基因組DNA序列、cDNA、質(zhì)粒載體、DNA疫苗、干擾RNA、核酸酶等等，而不影響本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和相應(yīng)的技術(shù)效果，所以在下列實(shí)施例中，以hTERT基因反義寡聚核苷酸為例，并不意味著本發(fā)明的技術(shù)方案僅能夠用于hTERT基因反義寡聚核苷酸。
實(shí)施例11.酸化MWNTs的制備將MWNTs置于混酸之中(H2SO4與HNO3的體積比為3∶1)，超聲16小時(shí)。用100nm微孔濾膜過濾所得MWNTs懸浮液，用二次蒸餾水多次漂洗直至中性。將其重新分散到二次蒸餾水中，多次離心過濾(7000rpm，5min)除去其中的大顆粒MWNTs，得到長(zhǎng)度分布在100-300nm之間且管壁上修飾有-COOH的MWNTs(紅外光譜圖2，TEM圖3)。
2.PEI-MWNTs水相體系的制備制備原理利用基團(tuán)之間的靜電作用力。
將0.5mgMWNTs與5ml 1％聚乙烯亞銨(PEI)混合。超聲15min，用200nm微孔濾膜過濾所得到的混合物，除去多余的未反應(yīng)的PEI后，分散到pH＝7.2的PBS中，得到穩(wěn)定的PEI-MWNTs水相體系。滅菌待用。
除了聚乙烯亞銨(PEI)之外，聚陽離子化合物也可以采用聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚酰胺胺樹枝狀化合物或殼聚糖，還可以使用聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞銨、聚酰胺胺樹枝狀化合物和殼聚糖的兩兩組合，或者兩種以上的組合，其制備過程相同。
3.hTERT基因反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備制備原理利用基團(tuán)之間的靜電作用力。
將ASODN分散到pH＝7.2的PBS中，其終濃度為10μM。取30μl ASODN溶液加入到25μl 0.1mg/ml的PEI-MWNTs水相體系中，靜置30min，離心過濾(7000rpm，5min)，除去多余的ASODN后，重新分散到pH＝7.2的PBS中，得到穩(wěn)定的MWNTs-PEI-ASODN水相體系。
4.Hela細(xì)胞的培養(yǎng)Hela宮頸癌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫.Hela細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃5％CO2飽和溫度下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。
5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的測(cè)定將ASODN、MWNTs-PEI-ASODN分別加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞中，在37℃5％CO2飽和溫度下培養(yǎng)24h。取未經(jīng)任何處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。胰酶消化后，用70％的乙醇固定用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)他們的轉(zhuǎn)染率。從圖4可以看出，與純的ASODN相比，MWNTs-PEI提高了ASODN的轉(zhuǎn)染率。說明功能化MWNTs可以作為一種很好的藥物載體應(yīng)用于生物領(lǐng)域。
6.細(xì)胞調(diào)亡率的測(cè)定將ASODN、MWNTs-PEI-ASODN分別加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞中，在37℃5％CO2飽和溫度下培養(yǎng)24h。取的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。胰酶消化后，用70％的乙醇固定。經(jīng)PI染色后，用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)他們的凋亡率。從圖5可以看出，與未經(jīng)任何處理的Hela細(xì)胞相比，經(jīng)ASODN作用的Hela細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。說明ASODN是一種很好的治療宮頸癌的藥物。與純的ASODN相比，經(jīng)MWNTs-PEI-ASODN作用的Hela細(xì)胞呈現(xiàn)出更高的凋亡率，這是因?yàn)镸WNTs-PEI增加了ASODN在Hela細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步說明了功能化的MMNTs是一種有效的藥物載體。
權(quán)利要求
1.一種反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體，由碳納米管外殼和反義寡聚核苷酸組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體，其特征在于，所說的反義寡聚核苷酸為端粒酶催化亞單位基因的反義寡聚核苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體，其特征在于，所說的碳納米管長(zhǎng)度為50~200nm，直徑為10~50nm。
4.權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法，依次包括如下步驟a)用強(qiáng)酸氧化碳納米管，使管壁帶上羧基，超聲裁剪成50~200nm的短管；b)加入聚陽離子化合物修飾到碳納米管管壁上；c)將反義寡聚核苷酸組裝到碳納米管上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法，其特征在于，所說的強(qiáng)酸為濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸或者其混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法，其特征在于，所說的聚陽離子化合物選自聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞銨、聚酰胺胺樹枝狀化合物或殼聚糖中的一種或一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的制備方法，其特征在于，所說的反義寡聚核苷酸為端粒酶催化亞單位基因的反義寡聚核苷。
8.權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的應(yīng)用，包括將負(fù)載有端粒酶催化亞單位基因反義寡聚核苷的碳納米管作用于腫瘤細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體的應(yīng)用，其特征在于，所說的腫瘤細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞。
10.一種反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物，由有效劑量的權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸-碳納米管藥物載體和藥學(xué)上可接受的其他成分組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反義寡聚核苷酸－碳納米管藥物載體，由碳納米管外殼和反義寡聚核苷酸組成。采用強(qiáng)酸氧化多壁碳納米管，使管壁帶上羧基，經(jīng)超聲裁剪成長(zhǎng)50~200nm，直徑為10~50nm的短管；加入聚陽離子化合物修飾到碳納米管管壁上；將反義寡聚核苷酸組裝到多壁碳納米管上。該制備方法簡(jiǎn)單、快速。該藥物載體具有轉(zhuǎn)染率高、靶向性強(qiáng)、抑制腫瘤細(xì)胞效果明顯等特點(diǎn)。針對(duì)不同的生物體系以碳納米管為載體來輸送不同的靶向性生物分子或藥物，可應(yīng)用于腫瘤或基因疾病的治療。
文檔編號(hào)A61K47/02GK101015696SQ20071003758
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者賈能勤, 連瓊 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)