專(zhuān)利名稱(chēng)：以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的細(xì)胞增殖方法，特別的是一種以 GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞移植已經(jīng)成為逐漸增多的白血病、惡性腫瘤和某些遺傳性疾病 患者的臨床治療選擇。造血干細(xì)胞來(lái)源于骨髓、臍帶血及動(dòng)員后的外周血，但由 于其來(lái)源及可獲得的細(xì)胞數(shù)量有限，限制了臨床應(yīng)用，所以造血干祖細(xì)胞的體外 擴(kuò)增是一個(gè)研究熱點(diǎn)。
Notch (Notch為一條被廣泛應(yīng)用的，進(jìn)化高度保守的細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號(hào)通 路)通路在許多發(fā)育系統(tǒng)中對(duì)細(xì)胞的命運(yùn)決定起著重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)造血系統(tǒng) 的發(fā)生和發(fā)育也具有重要的調(diào)控作用，被認(rèn)為是解決干細(xì)胞擴(kuò)增的最有前途的研 究方向之一。Notch通路(Notch通路由Notch受體、Notch配體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng) 分子組成，hDelta-like-1簡(jiǎn)寫(xiě)為hDll-l，是人Notch配體之一)與其他因子協(xié) 同作用可促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增。hDSL是由hDll-l配體蛋白中的99個(gè) 氨基酸組成的多肽，是目前國(guó)際上Notch配體中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、分子量最小、又具 有生物活性的Notch配體。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Han W等在《Blood》(《血液》，2000年95 巻1616-1625頁(yè))發(fā)表了題為"A soluble form of human Delta-like-1 inhibits differentiation of hematopoietic progenitor cells ，，("可溶性人 Delta-like-l蛋白對(duì)人造血祖細(xì)胞分化的抑制")的論文，提出純化的GST-hDSL 融合蛋白(GST為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)與細(xì)胞因子粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、 IL-1 (白介素l)、 IL-3 (白介素3)的聯(lián)合作用可以促進(jìn)小鼠造血干、祖細(xì)胞的 擴(kuò)增，但并沒(méi)有用于人造血干、祖細(xì)胞的擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種以GST-hDSL重組蛋白 增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，使其實(shí)現(xiàn)對(duì)人造血干、祖細(xì)胞的有效擴(kuò)增。 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體步驟包括
(1)從髓、外周血或臍帶血中取樣，用密度梯度離心分離出單核細(xì)胞，然 后用CD34分離試劑盒對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用免疫磁珠技術(shù)(屬現(xiàn)有技術(shù)) 對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行純化，得到CD34+細(xì)胞；
(2)采用含10%-20%胎?；蛉搜宓募?xì)胞培養(yǎng)基對(duì)上述CD34+細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)，加入細(xì)胞因子(包括粒-巨噬細(xì)胞集落剌激因子和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和濃度 為5ug/ml-50ug/ml的GST-hDSL重組蛋白，培養(yǎng)1周，換入含10%-20%胎?；蛉?血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，并重新加入細(xì)胞因子(包括粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和5ug/ral-50ug/ml的GST-hDSL重組蛋白再繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)擴(kuò) 增1周，得到增殖了的造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞。
所述的細(xì)胞因子，包括5ng/ml-15ng/ml的粒-巨噬細(xì)胞集落剌激因子和 10ng/ml-30ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明所采用GST-hDSL重組蛋白是Notch通路的配體之一，通過(guò)GST-hDSL 重組蛋白與位于CD34+造血干、祖細(xì)胞上的Notch受體結(jié)合而激活Notch通路， 激活的Notch通路有維持造血干、祖自我更新促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用，從而達(dá)到增殖 造血干、祖細(xì)胞的目的。通過(guò)從CD34+細(xì)胞或是從總集落數(shù)(CFC)及高增殖潛能 集落數(shù)(HPP-CFC)的檢測(cè)對(duì)照，本發(fā)明可有效促進(jìn)人造血干、祖細(xì)胞的增殖， 其增殖效果為現(xiàn)有技術(shù)的1. 2至5. 3倍。本發(fā)明將在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng) 用。


圖1為實(shí)施例1中CD34+造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增情況對(duì)比示意圖。 圖2為實(shí)施例1中GST-hDSL重組蛋白對(duì)集落形成(CFC)的影響對(duì)比示意圖。 圖3為實(shí)施例1中GST-hDSL重組蛋白對(duì)高增殖潛能集落(HPP-CFC)形成的 影響對(duì)比示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案
為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述的實(shí)施例。 實(shí)施例1
本實(shí)施例1是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的
(1) 臍血單核細(xì)胞的制備和CD34+造血干、祖細(xì)胞的分離純化 常規(guī)無(wú)菌條件下取正常足月順產(chǎn)胎兒臍帶血約100ml，與磷酸緩沖液以1:
2的體積比混勻稀釋?zhuān)?0支50ml的無(wú)菌離心管，每支加入15ml的淋巴細(xì)胞 分離液(密度為1.077±0.002g/ml)，再沿管壁緩緩加入已稀釋的臍血，形成清 晰層面，將離心管于2300rpm離心30min，離心后小心用吸管吸取離心管中間白 色霧狀細(xì)胞層到另一50mL無(wú)菌離心管中，加入20ml磷酸緩沖液混勻后2000 rpm 離心10 min，棄去上清液，再用磷酸緩沖液將沉淀的細(xì)胞懸浮后合并為一管， 制得臍血單個(gè)核細(xì)胞懸液；將上述臍血單個(gè)核細(xì)胞懸液于1800rpm離心10min， 棄去上清液，按300ul/l(f細(xì)胞的量向離心管中加入含10%胎牛血清及2X10—3 mol/L EDTA的磷酸緩沖液懸浮細(xì)胞，并按100111/108細(xì)胞的量分別加入FcR阻斷 劑及CD34抗體磁珠，4'C孵育30min后按照德國(guó)美天旎公司提供的MS Columns 分離系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)純化CD34+細(xì)胞，懸浮于含10%胎牛血清的函EM/F-12培養(yǎng)基(一 種細(xì)胞培養(yǎng)基，SIGMA公司產(chǎn)品或DMEM IMDM)中，制成7X 10"個(gè)細(xì)胞/ml的CD34+ 細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞比例為96%。
(2) 、造血干、祖細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增
用吸管吸取上述制備的CD34+細(xì)胞懸液，分別加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的6 個(gè)復(fù)孔中，每孔加lml，在這6個(gè)孔中分別加入10ng/ml的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和 5ng/ml的粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，再在其中三個(gè)孔中加入5ug/ml的GST-hDSL 重組蛋白以證明其作用，在第7天時(shí)將細(xì)胞吸出，離心(1800rpm， 10min)后去 除上清按分組補(bǔ)入相應(yīng)的細(xì)胞因子、蛋白及新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增7天， 經(jīng)流式檢測(cè)和集落培養(yǎng)檢測(cè)GST-hDSL重組蛋白組的CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，總集落 數(shù)以及代表更原始的造血祖細(xì)胞的高增殖潛能集落數(shù)分別是對(duì)照組的1.9、 1.2、 5.3倍，如圖l，圖2，圖3所示。CD34+造血干、祖細(xì)胞在對(duì)照組添加干細(xì)胞 生長(zhǎng)因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和GST-hDSL重組蛋白組添加干細(xì)胞生長(zhǎng)
因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、GST-hDSL重組蛋白的條件下培養(yǎng)擴(kuò)增14天， 流式檢測(cè)并計(jì)算得到CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)并將培養(yǎng)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入集落培養(yǎng)系統(tǒng)檢 測(cè)總集落數(shù)和高增殖潛能集落數(shù)數(shù)量。人臍血CD34+細(xì)胞在上述的不同條件下培 養(yǎng)擴(kuò)增14天，培養(yǎng)后的細(xì)胞通過(guò)流式分析檢測(cè)CD34+細(xì)胞的比例，乘以液體培養(yǎng) 細(xì)胞總數(shù)后再除以CD34+細(xì)胞初始細(xì)胞數(shù)即得CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。
如圖2和圖3所示，GST-hDSL重組蛋白對(duì)集落形成的影響對(duì)比干細(xì)胞生 長(zhǎng)因子和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，GST-hDSL重組蛋白組干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和GST-hDSL重組蛋白；人臍血CD34+細(xì)胞在上述的不 同條件下培養(yǎng)擴(kuò)增14天，培養(yǎng)后的細(xì)胞再轉(zhuǎn)入集落培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)CFC (圖2)和 HPP-CFC (圖3)數(shù)量。CFC:細(xì)胞數(shù)大于40的集落；HPP-CFC:直徑大于lmm的 集落。
實(shí)施例2
本實(shí)施例2是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的
(1) 骨髓單核細(xì)胞的制備和CD34+造血干、祖細(xì)胞的分離純化 常規(guī)無(wú)菌條件下取骨髓液約100ml，與磷酸緩沖液以1: 2的體積比混勻稀
釋?zhuān)?0支50ml的無(wú)菌離心管，每支加入15ml的淋巴細(xì)胞分離液(密度為 1.077±0.002g/ml)，再沿管壁緩緩加入己稀釋的臍血，形成清晰層面，將離心 管于2300rpm離心30mim離心后小心用吸管吸取離心管中間白色霧狀細(xì)胞層到 另一 50mL無(wú)菌離心管中，加入20 ml磷酸緩沖液混勻后2000 rpm離心10 min, 棄去上清液，再用磷酸緩沖液將沉淀的細(xì)胞懸浮后合并為一管，制得臍血單個(gè)核 細(xì)胞懸液；將上述臍血單個(gè)核細(xì)胞懸液于1800rpm離心10min，棄去上清液，按 300u 1/108細(xì)胞的量向離心管中加入含15%人血清及2X10—3mol/L EDTA的磷酸 緩沖液懸浮細(xì)胞，并按100111/108細(xì)胞的量分別加入FcR阻斷劑及CD34抗體磁 珠，4t:孵育30min后按照德國(guó)美天旎公司提供的MS Columns分離系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)純 化CD34+細(xì)胞，懸浮于含15%人血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基(一種細(xì)胞培養(yǎng)基，SIGMA 公司產(chǎn)品或面EM IMDM)中，制成7X 104個(gè)細(xì)胞/1111的CD34+細(xì)胞懸液，用流式細(xì) 胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞比例為96%。
(2) 、造血干、祖細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增
用吸管吸取上述制備的CD34+細(xì)胞懸液，分別加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的6 個(gè)復(fù)孔中，每孔加lml，在這6個(gè)孔中分別加入20ng/ral的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和 10ng/ml的粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，再在其中三個(gè)孔中加入20ug/ml的 GST-hDSL重組蛋白以證明其作用，在第7天時(shí)將細(xì)胞吸出，離心(1800rpm， 10min) 后去除上清按分組補(bǔ)入相應(yīng)的細(xì)胞因子、蛋白及新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增7 天，經(jīng)流式檢測(cè)和集落培養(yǎng)檢測(cè)GST-hDSL重組蛋白組的CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，總
集落數(shù)以及代表更原始的造血祖細(xì)胞的高增殖潛能集落數(shù)分別是對(duì)照組的1. 9、 1.2、 5. 3倍。 實(shí)施例3
本實(shí)施例3是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的
(1) 外周血單核細(xì)胞的制備和CD34+造血干、祖細(xì)胞的分離純化 常規(guī)無(wú)菌條件下取骨髓液約100ml，與磷酸緩沖液以l: 2的體積比混勻稀
釋?zhuān)?0支50ml的無(wú)菌離心管，每支加入15ml的淋巴細(xì)胞分離液(密度為 1.077±0.002g/ml)，再沿管壁緩緩加入已稀釋的臍血，形成清晰層面，將離心 管于2300rpm離心30min，離心后小心用吸管吸取離心管中間白色霧狀細(xì)胞層到 另一 50mL無(wú)菌離心管中，加入20 ml磷酸緩沖液混勻后2000 rpm離心10 min， 棄去上清液，再用磷酸緩沖液將沉淀的細(xì)胞懸浮后合并為一管，制得臍血單個(gè)核 細(xì)胞懸液；將上述臍血單個(gè)核細(xì)胞懸液于1800rpm離心10min，棄去上清液，按 300u 1/108細(xì)胞的量向離心管中加入含20%人血清及2X10_3mol/L EDTA的磷酸 緩沖液懸浮細(xì)胞，并按100111/108細(xì)胞的量分別加入FcR阻斷劑及CD34抗體磁 珠，4。C孵育30min后按照德國(guó)美天旎公司提供的MS Columns分離系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)純 化CD34+細(xì)胞，懸浮于含20%人血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基(一種細(xì)胞培養(yǎng)基，SIGMA 公司產(chǎn)品或DMEM IMDM)中，制成7X 1(^個(gè)細(xì)胞/ml的CD34+細(xì)胞懸液，用流式細(xì) 胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞比例為96%。
(2) 、造血干、祖細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增
用吸管吸取上述制備的CD34+細(xì)胞懸液，分別加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的6 個(gè)復(fù)孔中，每孔加lml，在這6個(gè)孔中分別加入30ng/ml的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和 15ng/ml的粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，再在其中三個(gè)孔中加入50ug/ml的
GST-hDSL重組蛋白以證明其作用，在第7天時(shí)將細(xì)胞吸出，離心(1800rpm， lOmin) 后去除上清按分組補(bǔ)入相應(yīng)的細(xì)胞因子、蛋白及新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增7 天，經(jīng)流式檢測(cè)和集落培養(yǎng)檢測(cè)GST-hDSL重組蛋白組的CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，總 集落數(shù)以及代表更原始的造血祖細(xì)胞的高增殖潛能集落數(shù)分別是對(duì)照組的1. 9、 1.2、 5. 3倍。
權(quán)利要求
1、一種以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其特征在于，具體步驟包括(1)從髓、外周血或臍帶血中取樣，用密度梯度離心分離出單核細(xì)胞，然后用CD34分離試劑盒對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用免疫磁珠技術(shù)對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行純化，得到CD34+細(xì)胞；(2)采用含10％-20％胎牛或人血清的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)上述CD34+細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，加入細(xì)胞因子，加入蛋白，培養(yǎng)1周，換入細(xì)胞培養(yǎng)基，并重新加入蛋白再繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增1周，得到增殖了的造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞。
2、 如權(quán)利要求1所述的以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞 的方法，其特征是，所述的加入細(xì)胞因子，是指加入粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因 子和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子兩種細(xì)胞因子。
3、 如權(quán)利要求1所述的以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞 的方法，其特征是，所述的加入蛋白，是指加入濃度為5ug/ml-50ug/ml的 GST-hDSL重組蛋白。
4、 如權(quán)利要求1所述的以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞 的方法，其特征是，所述的換入細(xì)胞培養(yǎng)基，是指換入含10%-20%胎?；蛉搜?清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。
5、 如權(quán)利要求1所述的以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞 的方法，其特征是，所述的重新加入重組蛋白，是指重新加入粒-巨噬細(xì)胞集 落刺激因子和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子兩種細(xì)胞因子和5ug/ml-50ug/ml的GST-hDSL重組 蛋白。
6、 如權(quán)利要求2或者5所述的以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及 祖細(xì)胞的方法，其特征是，所述的細(xì)胞因子，包括5ng/ml-15ng/ml的粒-巨噬細(xì) 胞集落剌激因子和10ng/ml-30ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法。步驟包括(1)從骨髓、外周血或臍帶血中，用密度梯度離心法分離制備單個(gè)核細(xì)胞，然后對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，而后對(duì)其進(jìn)行純化，得到CD34⁺細(xì)胞；(2)將CD34⁺細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加入細(xì)胞因子和GST-hDSL重組蛋白，培養(yǎng)后，換入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基并重新加入細(xì)胞因子和GST-hDSL重組蛋白再繼續(xù)培養(yǎng)，得到增殖了的造血干、祖細(xì)胞。從CD34⁺細(xì)胞和從總集落數(shù)及高增殖潛能集落數(shù)來(lái)檢測(cè)，本發(fā)明可有效促進(jìn)人造血干、祖細(xì)胞的增殖，并將在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK101096654SQ20071004112
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者吳明媛, 姜俊芬, 林小娟, 偉 韓 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)