專利名稱：一種視黃醇x受體用于篩選紫草素及其衍生物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中草藥領域，具體地說，是關于紫草素及其衍生物的應用，更具體地，是
關于視黃醇x受體用于篩選紫草素及其衍生物的應用。
背景技術：
人體的許多生命活動受到一類脂溶性激素和維生素的調(diào)控，這些脂溶性激素和維生素 可以穿過細胞膜進入細胞內(nèi)，并通過細胞核受體的介導發(fā)揮作用。人們把所有的細胞核激
素受體統(tǒng)稱為激素核受體超家族，這是一類配體依賴的轉錄因子，成員眾多，共分29個 亞家族200余個成員(Novac N, W a/., Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2004;3:335-46; Gronemeyer H, " a/" Nat Rev Drug Discov. 2004 Nov;3:950-64.)。
核受體選擇性地與某些化學物質相結合，引發(fā)細胞的生理效應，參與代謝、生長、發(fā) 育、分化、死亡和免疫等幾乎所有的生理過程的調(diào)節(jié)。核受體表達或調(diào)控異常與人體的許 多疾病如心血管疾病、糖尿病、癡呆癥和癌癥密切相關，針對核受體開發(fā)的藥物也因而廣 泛應用于這些疾病的治療(Gronemeyer H, W a/., Nat Rev Drug Discov.， 2004;3:950-64; Metivier R, W a/" EMBO Rep. 2006 Feb;7:161-7;Cases M， " "/ ， Curr Top Med Chem. 2005;5:763-72.)。
在核受體超家族中， 一個引人注目的亞家族是維生素A受體，包括視黃酸受體(RAR) 和視黃醇X受體(RXR)兩類，由于利用的啟動子和剪切方式的不同，每一類受體各有a、 P和Y三種不同亞型(Szanto A, " a/., Cell Death Differ. 2004 Dec;l 1 Suppl 2:S126-43.; Okuno M, a/., Curr Cancer Drug Targets. 2004 May;4:285-98)。此類受體的許多激動劑或拮抗劑 已被證明可應用于治療人類以及動物的多種疾病，包括用于預防和治療癌癥和癌前期病 變，如乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、 肺癌、喉癌、口腔癌、血液和淋巴系統(tǒng)腫瘤，用于治療組織非典型增生、發(fā)育障礙、粘膜 白斑病、粘膜乳頭瘤以及卡波西肉瘤(Okuno M， fl./， Curr Cancer Drug Targets, 4: 285-98， 2004)。
RXRa在核受體超家族中屬于維生素A受體亞家族成員，該基因受維生素A代謝衍 生物，如9-d&RA，以及一些多聚非飽和脂肪酸，如DHA等的調(diào)控，主要通過形成同源或異源二聚體的形式起作用，可與其形成異源二聚體的核受體包括維生素D受體(VDR)、 過氧物酶體增殖激活受體(PPAR)以及多種孤兒受體，如肝X受體(LXR)、胚胎X受 體(PXR)、持續(xù)激活受體(CAR)和孤兒受體TR3/Nur77/NGFI-B等，RXRa的這一特性， 使其成為核受體超家族中最重要的成員之一 (KastnerP， Wa/,Cel1， 1995， 83， 859-869; MangelsdorfD丄，Wa/.， Cell, 1995， 83， 841-850; Zhang XK, e,a/.， Nature, 1992， 358， 587-591)。
隨著細胞信號轉導研究的深入，人們對視黃醇類受體分子作用機制有了更全面的了 解。以往的觀點認為，視黃醇類受體的生物學作用主要是由于調(diào)控特定靶基因的轉錄，如 視黃醇(Retinoid)通過RARE可上調(diào)RARf3、p21和RB表達，抑制TGFoc的表達等(Bastien J，"a/., Gene.2004Mar 17;328:1-16)。基于這樣的理解，許多開發(fā)的視黃醇類藥物主要利 用其對靶基因轉錄調(diào)控的影響，誘導細胞分化。目前，對RAR的靶基因了解多一些，但 RXR的靶基因至今仍未完全確定，研究表明RXR的生物學作用可能主要不是由位于核內(nèi) 通過調(diào)控它的異源雙鏈活性作用于靶基因的轉錄介導。遺傳學研究進一步表明， RXRa,RXR(57—缺失突變會發(fā)生發(fā)育障礙，但表達缺失僅AF2結構域的 RXRa-AAF2/RXRp力RXRy—z'不影響發(fā)育，顯示RXRa的活性不僅僅由于轉錄活性，還可 能作為異源二聚體的沉默的伴隨因子或者通過一個不依賴于轉錄通路的功能起作用
(Chen J，Wfl/" Development. 1998 May; 125:1943-9)。有趣的是，近年來發(fā)現(xiàn)，RXR在受 到不同配體的調(diào)控時，可在細胞質和細胞核之間進行穿梭，執(zhí)行不同的生物學功能，如細 胞增殖、分化和凋亡(Cao X, er a/， Mol. Cell Biol. 24: 9705-25, 2004)。發(fā)明人相繼在Science
(2000)和Cdl (2004)雜志上，報道了一類化合物可誘導RXRoc與類固醇/甲狀腺/視黃 醇受體超家族中的另一種孤兒成員TR3形成異源二聚體，暴露出RXRoc基因序列上的出 核信號肽(NES),從而誘導其出核，并通過TR3的介導，作用于線粒體上Bcl-2，使后 者從一個抗凋亡分子向促凋亡分子構型轉變，誘導細胞色素c釋放，從而引起細胞凋亡(Li H, et al. Science. 2000 Aug 18;289:1159-64.; Lin B, et al., Cell. 2004 Feb 20; 116 (4): 527-40)。
由于RXR參與許多核受體以及生長和凋亡信號轉導通路中關鍵信號分子的功能調(diào) 控，該基因被認為是核受體超家族中最有開發(fā)前景的重要成員。
紫草為紫草科植物(Boraginaceae)，從新疆紫草Arnebiaeuchroma (Royle) Johnst、 紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.)或內(nèi)蒙紫草(Arnebia guttata Bunge)的 干燥根中提取得到。紫草性甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)，味苦，性寒，有清熱涼血，透疹解 毒的功能。紫草含多種萘醌類色素如紫草素、乙酰紫草色素等。新疆紫草含有P, P-二甲基丙烯 酰紫草素(P, p-Dimethyl-acryl-shikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(Acetyl shikonin)、 異丁酰紫草素(Isobutyryl shikonin)、異戊酰紫草素(Isovalerylshikonin)、 p-羥基異戊酰 紫草素(卩-Hydroxyixovalerylshikonin)、去氧紫草素(Deoxyshikonin)等。
近年來，中醫(yī)臨床研究證明紫草對于治療多種癌癥有較好的效果，并證明了其主要的 活性成分是紫草素及其衍生物。目前對紫草素及其衍生物抗腫瘤作用的研究報道，包括抑 止腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡、抑制DNA拓撲異構酶、抑制蛋白酪氨酸激酶核抗血管 增生活性等(Chen X, " a/" Phytother Res. 2002 May;16:199-209.; Shen CC, " a/.， J Nat Prod. 2002Dec;65:1857-62)。但是，紫草素及其衍生物抗腫瘤作用的機理至今尚不明了，并且 一直沒有找到一個明確的作用靶點，因而難以對該結構進行有效的修飾和優(yōu)化，這是制約 其進一步開發(fā)成為抗癌藥物的最主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人在研究紫草素及其衍生物對于腫瘤細胞的作用機理的過程中發(fā)現(xiàn)，其 對于腫瘤細胞的作用與細胞中視黃醇X受體的水平密切相關，紫草素及其衍生物可直接 結合于視黃醇X受體，視黃醇X受體為紫草素及其衍生物的作用靶點。
因此，本發(fā)明的第一個目的在于，提供一種紫草素及其衍生物用于制備調(diào)控視黃醇X 受體的活性與功能的藥物的應用。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種將視黃醇X受體用于篩選紫草素及其衍生物的 應用。
根據(jù)本發(fā)明，紫草素及其衍生物可以抑制RXR的轉錄激活功能。 根據(jù)本發(fā)明，紫草素及其衍生物還可以誘導RXR從細胞核轉位到細胞質。 本發(fā)明提供的視黃醇X受體可以用于指導篩選紫草素及其衍生物，例如，可通過生 物信息學等手段在體外模擬紫草素特別是其衍生物和RXR的作用，從而指導篩選紫草素
及其衍生物，從中獲得具有抗腫瘤活性的化合物，并可將獲得的藥物進而制備可調(diào)控視黃 醇X受體的活性與功能的藥物。


圖1為紫草素及衍生物與RXRoc直接作用的示意圖。 圖2顯示紫草素及衍生物抑制RXRa的轉錄激活作用。圖3為紫草素及衍生物誘導RXRoc從細胞核轉位到細胞質。
圖4為紫草素及衍生物誘導癌細胞凋亡。
圖5為紫草素及衍生物對癌細胞生長的抑制作用。
圖6為紫草素及衍生物對不表達RXRa的CV-1細胞和轉染了 RXRa的CV-l/RXRa
細胞系的生長作用的調(diào)控。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實驗室手冊》
(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商 所建議的條件。
實施例l、紫草素及其衍生物的制備
稱取20kg四川密花滇紫草(市售)，磨碎后過20目篩，收集過篩后獲得的紫草粉末， 用95%乙醇進行常溫滲濾提取，至提取液為近無色為止。
合并提取液，減壓濃縮至溶液變?yōu)樽霞t色，于濃縮液中加入濃縮液體積1/3 1/2的 2%NaOH,至溶液由紫紅色變?yōu)樗{色。
過濾除去不溶物后，加入濃HC1酸化溶液，至溶液由藍色變?yōu)樽霞t色，此時有大量 沉淀生成，靜置過夜。
收集沉淀物，用蒸餾水洗至中性。將沉淀物干燥，收獲粉末固體粗產(chǎn)物約250g。然 后將粗產(chǎn)物用三氯甲垸溶解，并每50毫升加17克120 160目硅膠攪拌均勻上柱。洗脫 劑分別用石油醚(60 卯。C) 一丙酮和石油醚(1: 1) 一丙酮一三氯甲垸(h 1)，依次 洗脫并分別收集洗脫液。將洗脫液濃縮至沉淀析出，然后重結晶(重結晶方法參考專利號 為02114973.9的中國專利)，純化紫草類化合物，產(chǎn)物結構已經(jīng)MNR、 MSUV和元素分 析數(shù)據(jù)確定。
用于后續(xù)實施例中實驗的紫草素及其衍生物包括紫草素(SK01)、 (3,p-二甲基丙烯 酰紫草素(SK02)、乙酰紫草素(SK03)、 1,4-二乙酰-p,p-二甲基丙烯酰紫草素(SK08)、 5，8-二乙酰-P,P-二甲基丙烯酰紫草素(SK09)以及桂皮酰紫草素(SK10)。
實施例2、紫草素及其衍生物直接作用于RXRa
6以實施例1制備得到的紫草素及其衍生物，分別處理在體外的或在細菌中合成的 RXRa-GST蛋白，并用配體競爭結合實驗，研究紫草素及其衍生物與RXRct受體的作用 關系。
在存在或不存在測試化合物(即實施例1中所述的紫草素及其衍生物)情況下，與^H] 同位素標記的[SH]9c^-RA—同培育RXRa蛋白，于4'C孵育。其中，9c&RA是RXRa的 強內(nèi)源性配體，因此可作為陽性對照。
24h后，加入GST-agarose室溫放置lh，用PBS洗條三次后，用液閃儀分析測試化合 物與RXRa的結合，結果如圖l所示。
根據(jù)圖1所示，RXRoc與SH標記的配體^H]9c^-RA結合，通過競爭結合試驗，紫草 素及其衍生物可競爭性地置換出RXRoc/[3H]9c^-RA中的^H]9c^-RA,這一作用呈濃度依 賴性關系。
根據(jù)上述結果，紫草素及其衍生物是RXR(x的配體，可直接作用于RXRa。
實施例3、紫草素及其衍生物對RXRa轉錄活性的調(diào)控
取CV-1細胞(ATCC， CCL-70)，于24孔組織培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。 將培養(yǎng)過夜的CV-1細胞，轉染RXRa和(TREpal) 2-tk-CAT或卩RARE-tk-CAT，其 中，以)3-gal作為內(nèi)對照。
轉染24h后換液，在已知可上調(diào)RXRa轉錄活性的化合物如9ck-RA存在的情況下， 加或不加入測試化合物(即實施例1中所述的紫草素及其衍生物)以處理細胞。20h后， 以RLB (reporter lysis buffer,購自Promega)裂解細胞，然后，根據(jù)產(chǎn)品說明書的方法， 測定裂解液的P-gal值及CAT值，并以CAT值除以P-gal值求得相對的轉錄活性值，實驗 結果如圖2所示。
根據(jù)圖2的結果，紫草素及其衍生物可不同程度地抑制RXR的轉錄活性。紫草素及 其衍生物對RXR轉錄活性的抑制程度與化合物的結構，以及化合物與RXR的結合能力 密切相關。本研究還發(fā)現(xiàn)紫草素及其衍生物對RXR的另外兩種不同亞型(3和y，有非常 相似的作用。以上結果說明，根據(jù)靶點RXR的結合和調(diào)控能力，是指導化合物結構改造 和活性篩選的重要依據(jù)。
實施例4、紫草素及衍生物誘導RXRa出核
取H460肺癌細胞(ATCC， HTB-177)和MGC803胃癌細胞(購自中科院上海細胞 庫)，用含10X胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)分別培養(yǎng)，同時，取H292肺癌細胞(ATCC， CRL-1848)、 SMMC7721肝癌細胞(中科院上海細胞庫，TChul3)、 MGC803胃癌細胞和ZR-75-l乳腺癌細胞(ATCC， CRL-1500)，以含10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基(購自Hyclone)分別培養(yǎng)。
取上述培養(yǎng)好的細胞，再分別接種于覆有蓋玻片的24孔組織培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，當 培養(yǎng)約24h，細胞密度達到80%左右時，分別用以下溶液處理細胞
(1) 僅0.5%胎牛血清(FBS);
(2) 加有紫草素或其衍生物的0.5XFBS; 其中，以(1)作為對照組。
反應板中各孔溶液的總體積均為Iml，紫草素和紫草素衍生物工作濃度均為lpM。
細胞經(jīng)處理10小時后，用0.1M磷酸鹽緩沖液PBS洗滌3遍，用4%多聚甲醛溶液 固定，再以含1 %Triton的O.IM PBS溶液穿孔5min;接著，用含5%BSA的O.IM PBS 溶液，于37"C封閉半小時，然后加入l: 500稀釋的兔抗RXRa多克隆抗體(SantaCruz， D-20)作為一抗，4"C過夜后。
取上步過夜處理后的細胞溶液，于室溫放置15min，吸掉一抗后，用0.1M的PBS 洗滌3次，每次洗滌5min;然后加入1:500稀釋的cy3耦連的猴抗兔二抗(購自Chemicon， AP128C)，于37'C放置30min后，吸掉二抗，用0.1M PBS洗滌3次，每次洗滌5min。
采用上述相同的方法，用抗Hsp60 (購自SantaCruz， sc-1722) /cy3 (購自Chemicon， AP128C)抗體免疫共染色檢測細胞線粒體。DAPI (購自Sigma)染色用于檢測細胞核。 然后用MRC-1024MP激光掃描聚焦顯微鏡觀察內(nèi)源性RXRa的亞細胞定位(BioRad)， 結果如圖3所示。
根據(jù)圖3的結果，以紫草素及其衍生物處理細胞10小時后，RXRcc從細胞核中遷移 出，并且在出核后，定位于線粒體上；而對照組中的RXRoc則仍留在細胞核中。 上述結果表明紫草素及其衍生物可以誘導RXRa從細胞核向細胞質的遷移。
實施例5、紫草素及其衍生物抑制細胞生長與細胞內(nèi)RXRa表達水平密切相關
我們用紫草素及其衍生物處理多種細胞，包括表達不同RXRoc水平的肺癌細胞H460、 SMMC7721肝癌細胞、MGC803胃癌細胞和ZR-75-l乳腺癌細胞，以及不表達RXRa的 CV-I (ATCC， CCL-70)。
5.1、紫草素及其衍生物誘導癌細胞凋亡
除H460細胞用1640培液培養(yǎng)外，其余細胞均用DMEM配液培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)于24孔板組織培養(yǎng)板中，按常規(guī)培養(yǎng)條件37度，5%的二氧化碳，24小時后，分別用以下之 一處理細胞(1) 僅0.5XFBS;(2) 加有紫草素或紫草素衍生物的0.5XFBS; 其中，(1)作為對照組。反應板中各孔溶液的總體積均為lml，紫草素和紫草素衍生物工作濃度均為5pM。 處理24h后，細胞用0.5%胰酶消化，用0.1MPBS洗滌后，用4%多聚甲醛進行固定，以lpg/mlDAPI (購自Sigma)進行染色，用熒光顯微鏡進行觀察細胞核的形態(tài)，結果如圖4所示。根據(jù)圖4，對照組中，細胞形態(tài)較為正常，但在紫草素處理的細胞，細胞核出現(xiàn)收縮、 碎裂等凋亡的典型特征，提示紫草素具有顯著誘導細胞凋亡的能力。5.2、 利用MTT法檢測紫草素及其衍生物抑制細胞生長選擇上述不同類型的細胞，H460用I640培液，其余細胞用DMEM培液，37°C， 5 %的二氧化碳培養(yǎng)于24孔板組織培養(yǎng)板中，24小時后，加入不同濃度(0， 0.625， 1.25， 2.5， 5， 10yM)的紫草素及其衍生物，處理3天后加入5|al MTT溶液(5mgMTT溶于 lml去離子水中，0.22|^m濾膜過濾)，作用4小時棄去加有MTT的培液，再加入200^1 DMSO,振搖數(shù)分鐘后，用酶標儀檢測每孔吸光度(OD)值，以對照組OD值為100%， 藥物處理組的OD值除以對照組OD值x100。/。，繪制藥物作用后的細胞生長曲線，得到圖 5結果。根據(jù)圖5結果，不同紫草素及其衍生物對癌細胞的生長抑制作用能力不同，那些對 RXR有較好結合能力和對RXR轉錄有較好抑制作用的化合物，對癌細胞的生長抑制作用 明顯較強。5.3、 紫草素及其衍生物抑制細胞生長與細胞內(nèi)RXRoc表達水平的關系 為了進一步研究藥物是否通過依賴于細胞內(nèi)表達的RXRa起作用，我們按常規(guī)方法建立穩(wěn)定表達RXRa的CV-l/RXRot細胞系。用紫草素及其衍生物處理CV-1和CV-l/RXRot 細胞系，觀察紫草素及其衍生物對其生長的影響。將CV-1和CV-l/RXRoc細胞以1000細胞每孔的密度鋪96孔扳。培養(yǎng)(含10%血清 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C， 二氧化碳濃度為5%)24小時后，加入不同濃度的紫草素及其 衍生物，處理3天后加入5pl MTT溶液(5mg MTT溶于lml去離子水中，0.22pm濾膜過濾)作用4小時棄去，另加入20(V1DMSO，振搖數(shù)分鐘后，用酶標儀檢測每孔吸光度 (OD)值，以對照組OD值為100%，藥物處理組的OD值除以對照組OD值><100%，繪 制藥物作用后的細胞生長曲線，得到圖6結果。根據(jù)圖6結果，紫草素及其衍生物對不表達RXRoc的CV1細胞和表達了 RXRa的 CV-l/RXRa細胞系的作用能力不同。與不表達RXRa的CV1細胞相比，紫草素處理的表 達有RXRa的CV-l/RXRa細胞生長曲線明顯左移，表明細胞內(nèi)上調(diào)表達的RXRa可顯著 提高紫草素對癌細胞生長抑制作用的敏感性。由以上的結果可知，紫草素及衍生物可顯著抑制多種癌細胞，如肺癌、肝癌、胃癌和 乳腺癌等細胞的生長，誘導這些癌細胞發(fā)生凋亡，而對正常細胞無明顯作用。同時，發(fā)現(xiàn) 紫草素及衍生物抑制癌細胞生長和誘導癌細胞凋亡與其細胞內(nèi)RXRa的水平密切相關。因此，視黃醇X受體可以用于指導篩選紫草素及其衍生物，例如，可通過生物信息 學等手段在體外模擬紫草素特別是其衍生物和RXRot的作用，從而指導篩選紫草素及其衍 生物，從中獲得具有調(diào)控RXRa活性的化合物藥物，也可用于指導紫草素及其衍生物的結 構修飾，從而獲得活性更高的化合物。綜上所述，紫草可以通過結合到RXRa使其轉錄激活作用被抑制，同時還可以促進 RXRoc從細胞核定位到細胞質，從而引起各種癌細胞系的調(diào)亡。
權利要求
1、 一種紫草素及其衍生物的應用，其特征在于，用于制備調(diào)控視黃醇x受體的活性與功能的藥物。
2、 如權利要求l所述的應用，其特征在于，所述藥物用于抑制視黃醇X受體的轉錄 活性。
3、 如權利要求l所述的應用，其特征在于，所述藥物用于誘導視黃醇X受體從細胞 核轉位到細胞質。
4、 如權利要求l所述的應用，其特征在于，所述藥物用于誘導細胞凋亡。
5、 一種視黃醇X受體的應用，其特征在于，用于篩選紫草素及其衍生物。
6、 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述受體作為靶點用于篩選紫草素及其 衍生物。
7、 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述篩選是篩選與視黃醇X受體具有相 互作用的紫草素及其衍生物。
8、 如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述與視黃醇X受體具有相互作用的紫 草素及其衍生物具有腫瘤治療的活性。
9、 如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述腫瘤包括肺癌、肝癌、胃癌、乳 腺癌等惡性腫瘤。
10、 一種視黃醇X受體的應用，其特征在于，作為受體靶點用于指導紫草素及其衍 生物的結構修飾。
11、 如權利要求10所述的應用，其特征在于，所述結構修飾是基于與視黃醇X受體 的相互作用。
12、 如權利要求10或11所述的應用，其特征在于，所述結構修飾進一步用于篩選具 有調(diào)控視黃醇X受體的功能和活性的化合物。
13、 如權利要求12所述的應用，其特征在于，所述化合物具有治療腫瘤的活性。
14、 如權利要求13所述的應用，其特征在于，所述腫瘤包括肺癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌等惡性腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種紫草素及其衍生物用于制備調(diào)控視黃醇X受體的活性與功能的藥物，視黃醇X受體用于篩選紫草素及其衍生物，以及視黃醇X受體作為受體靶點用于指導紫草素及其衍生物的結構修飾的應用。本發(fā)明提供的視黃醇X受體作為受體靶點，可以用于指導篩選紫草素及其衍生物，從中獲得具有調(diào)控RXRα活性的化合物藥物，也可用于指導紫草素及其衍生物的結構修飾，從而獲得活性更高的化合物。
文檔編號A61K31/122GK101310714SQ20071004121
公開日2008年11月26日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權日2007年5月24日
發(fā)明者張曉坤, 曾錦章, 力 王 申請人:中國科學院上海生命科學研究院;上海生茂投資有限公司