專利名稱：松果菊苷在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及松果菊苷的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域的新用途。
背景技術(shù)：
肉灰蓉(HeraCistaneMs)是中醫(yī)補(bǔ)益藥物中的常用品種，屬列當(dāng)科肉蓯 蓉屬植物，藥用品為其干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，又名大蕓、精筍、縱蓉、肉松 蓉、地精，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為"上品"，具有補(bǔ)腎益精、潤(rùn)腸通便 之功效，主治男子陽(yáng)痿、女子不孕等證。
松果菊苷是從管花肉蓯蓉(Cistanche tubulosa)中分離、純化的一種化 合物。以往的研究表明松果菊苷可以提高多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，具有很 強(qiáng)的抗氧化作用，還可延長(zhǎng)動(dòng)物壽命和抗衰老作用。目前用于治療抗衰老或 老年性癡呆。
帕金森病(PD)是中老年人神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病。其特征性病理改變是中 腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性減少，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺濃度明顯下降，目前 治療主要依賴多巴胺替代療法。盡管神經(jīng)科學(xué)家采取包括左旋多巴制劑在內(nèi) 的各種治療方法，但目前所有的研究都提示無(wú)法阻止多巴胺能神經(jīng)元變性減 少的進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供松果菊苷在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。 松果菊苷是從肉蓯蓉中提取的一種化合物，其公知的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 3</formula>本發(fā)明提供了松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。 上述的松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中可與矯味劑、溶劑或輔劑— 起制成口服液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠囊劑、注射劑、滴丸劑、糖漿劑、膏劑。
由于采用了上述的技術(shù)解決方案，松果菊苷可以用來(lái)制備治療帕金森病 的藥物，給帕金森病患者的治療帶來(lái)了新的希望。


圖1松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的保護(hù)作用；
圖2 GADD153的mRNA在不同組別中的表達(dá)電泳圖3松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型GADD153 mRNA表達(dá)的影響；
圖4 GADD153的蛋白在不同組別中的表達(dá)電泳圖5松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞GADD153蛋白表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用藥理試驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說明其在用 來(lái)制備治療帕金森病的藥物的新的用途。
松果菊苷可以采用目前公開的文獻(xiàn)的記載制備方法制備。如可以采用如 下方法制備
將管花肉蓯蓉(產(chǎn)地為新疆和田)的干燥肉質(zhì)莖10kg粉碎后，用體積分 數(shù)為95%的乙醇回流提取3次，每次2h。將提取液合并，減壓濃縮至膏狀， 加少量水制成混懸液。以石油醚、乙酸乙醋、水飽和正丁醇依次分別萃取3 次，萃取液濃縮備用。取正丁醇萃取物10 g，用約2倍的水溶解之，隨后 注人D101大孔吸附樹脂柱(柱床體積約1000ml)，先以3000ml去離子水洗 脫，棄去水洗脫液，再以3倍柱床體積的體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液洗脫， 即約3000ml，棄去。最后采用體識(shí)分?jǐn)?shù)為20%的甲醇水溶液作洗脫液，以 500ml為一個(gè)餾分，用聚酞胺薄層色譜檢識(shí)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯化鐵乙 醇溶液作顯色劑，收集并合并有目標(biāo)點(diǎn)的餾分進(jìn)行減壓濃縮。濃縮物經(jīng)葡聚 糖凝膠LH-20柱色譜，用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇水溶液等度洗脫。將含有較高純度的餾分合并，減壓濃縮至干，得到2g樣品(所有減壓濃縮的水浴鍋溫
度均低于6(TC)。以HPLC測(cè)定—峰面積比f(wàn)f，松果菊昔的相對(duì)含量為87%。將 上述粗品配制成0. 15kg/L的甲醇溶液，采用半制備型高效液相色譜法純化。 進(jìn)樣量為120juL，收集保留時(shí)間為13.6min的組分。將其減壓濃縮(在6(TC 以下)至有少量液體時(shí)取出，冷凍干燥，最后得灰白色無(wú)定形粉末220mg， 此即為松果菊苷的標(biāo)準(zhǔn)品。松果菊苷公知的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
1、松果菊苷對(duì)1甲基-4苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)介導(dǎo)的SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞系損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)
由于帕金森病的病因是多巴胺能神經(jīng)元減少，SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞是 研究帕金森病的典型細(xì)胞模型。以往的研究表明1甲基-4苯基-批啶離子 (1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)處理SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞 后使SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞細(xì)胞存活率隨MPP+的濃度增加而降低。本試驗(yàn)以 lmM的l甲基-4苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+) 介導(dǎo)的損傷的SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞系為研究帕金森病的細(xì)胞模型。
1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組
SH-SY5Y細(xì)胞每2 3d用10%DMEM培養(yǎng)液換液1次。待細(xì)胞增長(zhǎng)至80% 融合時(shí)，用0. 25%胰酶消化細(xì)胞，按1x105分瓶傳代，置于5%C02的細(xì)胞培 養(yǎng)箱中。試驗(yàn)用細(xì)胞分為對(duì)照組、MPP+組和松果菊苷不同濃度組。用DMEM 培養(yǎng)液將MPP+按1: 10梯度稀釋成400mM，按1: 100體積比例加入96孔板 或6孔板中，使MPP+終濃度分別為0.25mM， 0. 5函，lmM， 2mM， 4mM。松果 菊苷用DMEM培養(yǎng)液按1: 10梯度稀釋成lmg/ml與10ug/ml兩個(gè)工作濃度。 按1: 100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為l/ig/ml， lOpg/ml, 100iiig/ml。六孔板每孔總體積為2ml， 96孔板每孔總體積為200/n。每項(xiàng)相 同實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
1. 2檢測(cè)細(xì)胞活性MTT(四氮唑藍(lán))為荷蘭Duchefa公司產(chǎn)品。MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活 率的影響1x104密度S—FFSY5Y細(xì)胞200ul接種于96孔板，24h后換含MPP+ 終濃度分別為0. 25mM， 0. 5mM， lraM， 2mM, 4mM的培養(yǎng)液，每濃度3復(fù)孔， 置于5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育，分別于6h， 12h， 24h， 48h時(shí)各孔加入MTT20/xl， 繼續(xù)孵育4h取出培養(yǎng)板。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150M1，充分震蕩 10min，待藍(lán)色顆粒完全溶解后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biorad產(chǎn)品)570nm處測(cè)定 吸光度值。松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響終濃度lmM MPP+與松果菊苷分別為lMg/ml， 10Mg/ral， 100Mg/ral同時(shí)加入96孔板置 5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育48h。余同上。
1. 3試驗(yàn)結(jié)果
圖1:松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型具保護(hù)作用。三種濃度的松 果菊苷處理的SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞存活率均比MPP+組明顯增高(P〈0. 01)
MPP+ lmM處理的SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞48小時(shí)存活率為45. 3±3. 21%， 1/xg/ml，而松果菊苷處理上述細(xì)胞的細(xì)胞存活率對(duì)應(yīng)為85.97±3.41%， 10ptg/ml為129. 97±4. 84%, 100ptg/ml為164. 1±3. 91%。松果菊苷三種濃度與 MPP+ lmM對(duì)照處理比較，細(xì)胞存活率具有明顯差異(P〈0.01)。因此松果菊
苷不僅有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，而且還可能有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。l蹄/ml， 10|Lig/ml， 100Mg/ml松果菊苷的SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞存活率均比MPP+組明 顯增高(P〈0.01)，而且細(xì)胞存活率與松果菊苷濃度呈劑量依賴關(guān)系。因此試 驗(yàn)結(jié)果表明松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的損傷具有顯著的保護(hù)作用。
2、 松果菊苷對(duì)介導(dǎo)的損傷的SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞的保護(hù)作用的機(jī)制
試驗(yàn)
GADD153是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及其它應(yīng)激狀態(tài)的共同通路，同時(shí)又會(huì)引起細(xì) 胞凋亡的重要分子，它在帕金森病這一目前存在著多種發(fā)病機(jī)制的疾病的研 究中有著重要的地位。
2.1 RT-PCR檢測(cè)GADD153的mRNA表達(dá)
反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand c薩Synthesis Kit)購(gòu)自 MBI公司。
終濃度lraM MPP+與松果菊苷分別為l|Ug/ml， lO/xg/ml, lOO/^g/ml同時(shí)加入6孔板置5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，按 Trizol法提取總RNA。取—>gRM7按反—轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。聚合 酶鏈反應(yīng)總體積為25ul ，引物序列為GADD153 (上引物 5'-GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC-3，和下引物5，-GTCTACTCCAAGCCTTCCCCC TGCG -3，) . /3-Actin (上引物5，- ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3，，下引物 5，-TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC-3，)。擴(kuò)增目的產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別為422bp ， 244bp。94。C預(yù)變性5min，循環(huán)參數(shù)為95。C變性0. 5 min， 60。C退火0. 5 min, and 72 °C延伸1 min共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物4ul，電泳后拍照。 2. 2 Western Blot檢測(cè)GADD153蛋白表達(dá)
終濃度lraM MPP+與松果菊苷分別為lMg/ml， 10nig/ml, 100Mg/nil同時(shí) 加入6孔板置5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，加 入60mL蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，IOCTC變性10min。用lowry法測(cè)定樣 品蛋白濃度。電泳積層膠60V 30min，分離膠120V 90min; PVDF膜轉(zhuǎn)膜 110V 100min。加1:50小鼠抗人GADD153單克隆抗體，4。C過夜。TBST溶液 洗滌3次，每次10min,加含服P的兔抗小鼠二抗室溫孵育2h，化學(xué)發(fā)光法 顯影X膠片。每個(gè)樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的/3-actin比較后作統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析。
圖2:在對(duì)照組(Con)， MPP+組(M)， ljug/ml松果菊苷組(El)， 10/ig/ml 松果菊苷組(CE2)， 100/xg/ml松果菊苷組(CE3)中的GADD153的mRNA的表達(dá)。
圖3: MPP+ lraM處理SH-SY5Y細(xì)胞后GADD153 mRNA水平較對(duì)照組明顯 升高(P〈0.01)。而加入松果菊苷組的GADD153 mRNA水平較MPP+組明顯下降 (P<0. 01)。
圖4:在對(duì)照組(Con)， MPP+組(M)， lpg/ml松果菊苷組(El)， 1(^g/ml 松果菊苷組(CE2)， 100/xg/ml松果菊苷組(CE3)中的GADD153蛋白的表達(dá)。
圖5: MPP+組的GADD153蛋白的表達(dá)較對(duì)照組有顯著的增長(zhǎng)，而不同濃 度的松果菊苷組的GADD153蛋白的表達(dá)與MPP+組相比明顯降低。(P<0. 01)
通過RT-PCR和Western-Blot，發(fā)現(xiàn)GADD153的表達(dá)與對(duì)照組相比也明 顯降低。其中在松果菊苷最高濃度組(100mg/L) GADD153 mRNA水平降到了最低(P<0. 01)，而Western Blot的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)GADD153的蛋白表達(dá)同時(shí)將到 了最低(P<0. 01)?；谏鲜鼋Y(jié)果廠可以iX為松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控GADD153來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
上述試驗(yàn)結(jié)果表明松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作 用。而松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用是通過調(diào) 控GADD153來(lái)實(shí)現(xiàn)的。松果菊苷可以用來(lái)制備治療帕金森病的藥物。
使用方法
松果菊苷50mg/kg小鼠體重的劑量灌胃，成人體重按60kg計(jì)算，為每 日20mg 口服。 實(shí)施例
上述松果菊苷可以和藥劑學(xué)上可接受的輔劑(如果需要的話)，按照常 規(guī)制藥方法，制成口服劑和注射劑。
實(shí)施例1 制成片劑、丸劑、沖劑、糖漿劑、膏劑。
除松果菊苷外可根據(jù)需要添加矯味劑，或輔劑如增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)或免疫力的維 生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，或能協(xié)同作用能治療帕金森病的藥物。該片劑、丸 劑、沖劑、糖漿劑、膏劑成分包括
松果菊苷 5%-90% (重量比)
矯味劑 0.1-1% (重量比)
輔劑 適量
上述矯味劑可選自a -環(huán)糊精(a -CD)、 P -環(huán)糊精(P -CD)、 N-LOK變 性淀粉、蔗糖、木糖醇、高果糖、甜蜜素、甜菊糖和蛋白糖中的一種或多種。
輔劑可選自人體需要的維生素或氨基酸，如維生素B，維生素C，賴氨 酸，谷氨酸等。
實(shí)施例2制成膠囊劑。該膠囊劑成分包括
松果菊苷15%-30% (重量比)
矯味劑 0.5-10% (重量比)
上述矯味劑主要有羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯 酸樹脂等。也可添加輔劑，輔劑可選自人體需要的維生素或氨基酸，如維生 素B，維生素C，賴氨酸，谷氨酸等。實(shí)施例3制成注射劑、滴丸劑。該注射劑、滴丸劑成分包括 松果菊苷 20%-30°/T(重量比)—溶劑 適量以上實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換 或變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)該屬于本發(fā)明的范疇，應(yīng)由各權(quán)利要 求所限定。
權(quán)利要求
1、松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用，其中，所述松果菊苷是從肉蓯蓉中提取的，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
2、如權(quán)利要求1所述的松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中可與矯味 劑、溶劑或輔劑一起制成口服液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠囊劑、注射劑、 滴丸劑、糖漿劑、膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了松果菊苷對(duì)MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。由于松果菊苷可以用來(lái)制備治療帕金森病的藥物，給帕金森病患者的治療帶來(lái)了新的希望。
文檔編號(hào)A61P25/16GK101313912SQ200710041519
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者唐紅敏, 李文偉, 楊云柯, 越 范, 蔡定芳, 虹 趙, 顧喜喜 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院