專利名稱：黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的新用途。
背景技術(shù)：
黃芩素(黃芩苷元，Baicalein，BAI)是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成份之一，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示，為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為268℃-272℃(甲醇)，臨床主要用于治療各種急、慢性炎癥。有報(bào)道黃芩素對(duì)尖孢鐮刀菌和白色念珠菌有抑制作用(周立剛等，黃酮和甾體類化合物的抗真菌活性，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，3P24)，但其抗真菌活性較弱，所需的有效藥物濃度較高。
吡咯類抗真菌藥物包括咪唑組(imidazoles)和三唑組。咪唑組中有酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑等。三唑組抗真菌藥國內(nèi)已上市者有氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等。目前，臨床常用的抗真菌藥物是氟康唑、酮康唑、咪康唑，它們雖然能有效治療深部及淺表部真菌感染。但由于臨床耐藥菌株的越來越普遍，導(dǎo)致這些抗真菌藥物無效或需加大用藥量，而用藥量的增加必然加大了毒副作用的產(chǎn)生。例如酮康唑因其肝臟、心臟毒性而使治療中斷因而限制了其臨床應(yīng)用。因此，在不增加抗真菌藥物用量甚至在減少用藥量的情況下，利用增效劑有效治療真菌感染特別是耐藥性真菌感染具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
至今尚未見黃芩素作為氟康唑、酮康唑、咪康唑等吡咯類抗真菌藥物增效劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在不增加抗真菌藥物用量甚至在減少用藥量的情況下，尋找新的增效劑以有效治療真菌感染特別是耐藥性真菌感染。
本發(fā)明提供了黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的新用途，所說的抗真菌藥物是吡咯類抗真菌藥物，黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為4-16微克/毫升或微克/毫克。
上述黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量?jī)?yōu)選為8微克/毫升或微克/毫克、16微克/毫升或微克/毫克。
上述的抗真菌藥物為咪唑類抗真菌藥物或三唑類抗真菌藥物。
上述的抗真菌藥物為氟康唑、酮康唑或咪康唑。
上述應(yīng)用中，每毫升液體制劑(或每毫克固體制劑)中加入黃芩素4-16微克，同時(shí)加入氟康唑、酮康唑或咪康唑0.125-0.5微克。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，黃芩素在較低濃度時(shí)具有明確的增效作用，對(duì)于臨床分離的耐藥性菌株和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的耐藥性菌株，當(dāng)抗真菌藥物與黃芩素合用時(shí)，能明顯降低抗真菌藥物的用藥劑量，不僅能在減少用藥量的情況下同樣確保其對(duì)淺表部或深部真菌感染的治療效果，并能使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用。因此可用作抗真菌藥物的增效劑，用于不同深部和淺表真菌感染的治療。
本發(fā)明為黃芩素開辟了新用途，也為吡咯類抗真菌藥物特別是氟康唑、酮康唑、咪康唑等提供了一種有效的增效劑。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施不限于此。
實(shí)施例1黃芩素和氟康唑合用對(duì)不同臨床真菌株的作用。
材料和方法1.試藥黃芩素購自Sigma公司。
氟康唑常州第二制藥廠。
二甲亞砜中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。
黃芩素用二甲亞砜配成32mg/ml的濃度，氟康唑的濃度為2mg/ml，受試藥物于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。
2.菌株白念珠菌、克柔氏念珠菌和羊毛狀小孢子菌臨床株由上海長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供，分別采自該醫(yī)院不同科室臨床樣本，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。也可以選用白念珠菌SC5314、ATCC76625國際標(biāo)準(zhǔn)菌株。
所有實(shí)驗(yàn)用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)劃板活化，于35℃培養(yǎng)1周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法培養(yǎng)后于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液RPMI 1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO32.0g，嗎啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1000ml，濾過消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調(diào)整pH至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。
YEPD培養(yǎng)液酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。
4.儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；THZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；511型酶標(biāo)分析儀(上海第三分析儀器廠)；5.菌液制備(1)念珠菌菌液從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取念珠菌少量，接種至1mlYEPD培養(yǎng)液，于30℃以200rpm振蕩培養(yǎng)活化，使真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期。取該菌液至1mlYEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化16小時(shí)后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至3×103～5×103個(gè)/ml的濃度。
(2)羊毛狀小孢子菌菌液從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取絲狀菌少量接種至SDA斜面，于35℃培養(yǎng)一周后，再次挑取少量接種至SDA斜面，于35℃培養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)前加適量RPMI 1640培養(yǎng)液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游離于RPMI 1640培養(yǎng)液中，然后經(jīng)四層無菌紗布過濾。培養(yǎng)液經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，加RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整孢子濃度至3×103～5×103個(gè)/ml的濃度。
6.藥敏板制備取無菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI1640培養(yǎng)液100μl作空白對(duì)照；3-11號(hào)孔加入新鮮配制的菌液100μl；2號(hào)孔分別加入菌液196μl和6.4mg/ml的氟康唑溶液2μl。在2號(hào)孔加入相應(yīng)濃度的黃芩素2μl，3-11號(hào)孔加入黃芩素1μl。
對(duì)2～11號(hào)孔進(jìn)行倍比稀釋，使2～11號(hào)孔的最終氟康唑濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml；1號(hào)孔為不含藥物的RPMI 1640培養(yǎng)液，作為陰性對(duì)照，12號(hào)孔為不含藥物的菌液，作為陽性對(duì)照。各藥敏板于30℃培養(yǎng)。
7.MIC80值判定含菌96孔板分別于30℃培養(yǎng)24小時(shí)或一周后，用酶標(biāo)分析儀于620nm測(cè)各孔OD值。與陽性對(duì)照孔比，以O(shè)D值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC80(真菌生長(zhǎng)80％被抑制時(shí)的藥物濃度)。
當(dāng)藥物的MIC80值超過測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)MIC80值高于最高濃度64μg/ml時(shí)，計(jì)為“＞64μg/ml”。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2到3次，當(dāng)MIC80值能準(zhǔn)確重復(fù)時(shí)才被接受；當(dāng)MIC80值相差一個(gè)濃度以上時(shí)，則需要新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，表2。
表1黃芩素與氟康唑合用對(duì)5株臨床白念珠菌的MIC80值

注Flu表示氟康唑，BAI表示黃芩素(下同)。
表2黃芩素與氟康唑合用對(duì)3株臨床克柔氏念珠菌和羊毛狀小孢子菌的MIC80值

由表1和表2可見，8μg/ml的的黃芩素可使白念珠菌對(duì)氟康唑的MIC80值下降2-8倍，16μg/ml的的黃芩素可使臨床克柔氏念珠菌和羊毛狀小孢子菌對(duì)氟康唑的MIC80值從≥32降為≤0.5，說明黃芩素能明顯增強(qiáng)氟康唑的抗真菌作用。
實(shí)施例2黃芩素與氟康唑合用對(duì)不同臨床和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株的作用材料和方法1.試藥黃芩素購自Sigma公司。
氟康唑常州第二制藥廠。
二甲亞砜中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。
黃芩素用二甲亞砜配成32mg/ml的濃度，氟康唑的濃度為2mg/ml，受試藥物于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。
2.菌株臨床耐藥株白念珠菌均由上海長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供，分別采自該醫(yī)院不同科室臨床樣本，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。
實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株白念珠菌(SC5314-R、Y01-R)為白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314、ATCC76625經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)形成的耐藥株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。
其它實(shí)驗(yàn)步驟與方法同實(shí)施例1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，表4。
表3黃芩素與氟康唑合用對(duì)2株實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)白念珠菌耐藥株的MIC80值

表4黃芩素與氟康唑合用對(duì)5株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值

由表3、表4可以看出，原先對(duì)氟康唑耐藥的臨床白念珠菌MIC80值≥64，用16μg/ml的黃芩素即可使氟康唑的MIC80值下降為0.125-0.5μg/ml，對(duì)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的白念珠菌，用16μg/ml的黃芩素即可使氟康唑的MIC80值下降為0.5μg/ml，表明黃芩素能使菌株恢復(fù)對(duì)藥物的敏感性，大大增強(qiáng)氟康唑的抗菌效力。
實(shí)施例3黃芩素與咪康唑、酮康唑的聯(lián)合用藥材料和方法1.試藥黃芩素購自Sigma公司。
咪康唑購自中國藥品生物制品檢定所。
酮康唑購自中國藥品生物制品檢定所。
二甲亞砜中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。
黃芩素用二甲亞砜配成32mg/ml的濃度，咪康唑和酮康唑分別用二甲亞砜配成6.4mg/ml的濃度，受試藥物于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。
其它實(shí)驗(yàn)步驟與方法同實(shí)施例1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，表6。
表5黃芩素與咪康唑合用對(duì)3株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值

注Micon表示咪康唑，BAI表示黃芩素。
表6黃芩素與酮康唑合用對(duì)3株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值

注Ketocon表示酮康唑，BAI表示黃芩素。
由表5、6可見，黃芩素不但可對(duì)氟康唑合用產(chǎn)生增效作用，而且對(duì)咪康唑、酮康唑等抗真菌藥同樣具有抗菌增效作用。用8μg/ml的黃芩素即可使咪康唑、酮康唑?qū)δ退幇啄钪榫腗IC80值從16-32μg/ml下降為0.5-0.125μg/ml。
權(quán)利要求
1.黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的抗真菌藥物為吡咯類抗真菌藥物，黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為4-16微克/毫升或微克/毫克。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為8微克/毫升或微克/毫克、16微克/毫升或微克/毫克。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的抗真菌藥物為咪唑類抗真菌藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的抗真菌藥物為三唑類抗真菌藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的咪唑類抗真菌藥物為酮康唑或咪康唑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的三唑類抗真菌藥物為氟康唑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。黃芩素是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成份之一，臨床主要用于治療各種急、慢性炎癥，但其抗真菌活性較弱，所需的有效藥物濃度較高。至今尚未見黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的報(bào)道。本發(fā)明提供了黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的新用途，所說的抗真菌藥物是吡咯類抗真菌藥物，黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為4－16μg/ml。實(shí)驗(yàn)表明，黃芩素與氟康唑、酮康唑、咪康唑等抗真菌藥物合用，不僅能在減少用藥量的情況下同樣確保其對(duì)淺表部或深部真菌感染的治療效果，并能使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用。因此可用作抗真菌藥物的增效劑。
文檔編號(hào)A61K31/496GK101066263SQ200710041688
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者曹穎瑛, 戴寶娣, 王彥, 曹永兵, 朱臻宇, 徐永剛, 姜遠(yuǎn)英 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)