專利名稱：一種蟾酥提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蟾酥提取物及其制備方法，該蟾酥提取物的主要成分為 脂蟾毒配基、華蟾毒精和蟾毒靈這三種蟾毒配基混合物。
背景技術(shù)：
藥用蟾蜍為兩棲綱蟾蜍科動物中華大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor) 或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)。蟾酥為中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍 的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液，經(jīng)加工干燥制成。古今驗方廣泛應用蟾 蜍、蟾酥拔毒消腫、定痛殺蟲、強心利尿。經(jīng)現(xiàn)代科學研究，發(fā)現(xiàn)蟾酥中的 脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈三種脂溶性成分的混合物不但具有明顯的抗 腫瘤作用，而且還能將腫瘤細胞轉(zhuǎn)化為正常細胞(誘導腫瘤細胞分化)、誘 導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞新生血管形成、降低腫瘤轉(zhuǎn)移等作用。中國專利申請"蟾蜍或蟾酥中三種抗癌化合物的制劑及其制備方法"(申 請?zhí)?00610045893.7，公開號為1810827A)使用乙醇、丙酮等有機溶劑提 取，提取物經(jīng)硅膠、氧化鋁等色譜柱分離，并以不同比例石油醚、乙酸乙酯、 丙酮、乙醇、甲醇等溶劑梯度洗脫的方法分別得到脂蟾毒配基、華蟾毒精、 蟾毒靈三種脂溶性成分，合并取得此三種蟾毒配基混合物，其總含量高于80 %。但其中許多條件如溶劑的濃度、樣品上樣方法及洗脫劑的具體比例等都 尚未公開，且梯度洗脫操作復雜、費時。此外，從安全性和療效的角度考慮, 三種脂溶性成分的總含量有待進一步提高。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題即是提供一種脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈三種蟾毒配基混合物含量超過90%的蟾酥提取物及其制備方法。本發(fā)明人經(jīng)過試驗驚奇地發(fā)現(xiàn)，采用無水乙醇為提取溶劑；并且采用一 定比例的石油醚和丙酮等度洗脫，不僅提取效率高，簡化了步驟，還進一步 提高了上述三種蟾毒配基混合物含量，可以達到卯％水平以上。 本發(fā)明提供的一種蟾酥提取物的制備方法，其包括下列步驟-① 將蟾酥藥材用無水乙醇回流提??；② 將上述提取液濃縮后經(jīng)硅膠柱分離，用體積比為3~10:1的石油醚和 丙酮等度洗脫，收集洗脫液，過濾，蒸干即得含有三種蟾毒配基混合物的蟾 酥提取物。較佳地，為增加提取效率及節(jié)約提取溶劑，步驟①中所述的蟾酥藥材通 常先研磨粉碎成粉(過60目篩)；而綜合考慮提取效果及所需的成本、時間， 每次提取時藥材與無水乙醇的比例優(yōu)選lg:5 20ml，更優(yōu)選lg:10 12.5ml; 每次提取時間優(yōu)選20-60分鐘， 一般在40分鐘左右；共提取1 3次。較佳地，為增大上樣量，易于工業(yè)化生產(chǎn)，步驟②中將濃縮的提取液加 入硅膠拌樣，蒸干得拌樣硅膠，所得拌樣硅膠干法上樣。其中，加入硅膠的 量以能完全吸附蟾酥提取物濃縮液為宜，優(yōu)選為最初稱取的蟾酥藥材重量的 0.5 3倍左右，更優(yōu)選0.6 1倍。更佳地，為達到更好的純化效果，在所得拌樣硅膠干法上樣前先將硅膠 濕法裝柱，預先用所述洗脫劑石油醚和丙酮浸泡洗脫。本發(fā)明步驟②中洗脫劑石油醚和丙酮的更佳體積比為4~6:1。本發(fā)明優(yōu)選的硅膠為100-160目的粗孔硅膠。采用本發(fā)明上述制備方法制得的蟾酥提取物中脂蟾毒配基、華蟾毒精、 蟾毒靈這三種蟾毒配基混合物的重量百分比含量均在90%以上，通常在 91~99%范圍。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點在于采用綠色安全的乙醇溶劑提取，采 用上樣量較大的干法上樣，使用等度洗脫，簡化了純化方法，進一步提高了三種脂溶性成分的總含量，達到高于卯％水平。并且，本發(fā)明提取純化方法 及所用設備簡單，成本較低，操作簡便，耗時較短，易于工業(yè)化生產(chǎn)，三種 脂溶性成分可以得到較好的純化，純化效率高，純化純度大幅提高，減小了 藥物的毒副作用，可以提高藥物的安全有效性。


圖l為本發(fā)明蟾酥提取物經(jīng)純化后的HPLC色譜圖。
具體實施方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。 實施例1取蟾酥藥材l克，加無水乙醇10ml，加熱回流40min，上述條件下提2 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入0.9克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取 20克硅膠以石油醚丙酮(體積比5: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠， 用石油醚丙酮(體積比5: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別(如 圖1所示，保留時間為7.184min的為蟾毒靈，8.886min的為華蟾毒精， 9.549min的為脂蟾毒配基)，收集含有這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干， 即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物占整個提取物的重量百分 比為98.01%。實施例2取蟾酥藥材2克，加無水乙醇25ml，加熱回流40min，上述條件下提2 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入1.8克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取 22克硅膠以石油醚丙酮(體積比5: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠， 用石油醚丙酮(體積比5: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別， 收集含有脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干，即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物含量為97.94°%。實施例3取蟾酥藥材3克，加無水乙醇35ml，加熱回流40min，上述條件下提2 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入3克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取22 克硅膠以石油醚丙酮(體積比5: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠，用 石油醚丙酮(體積比5: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別，收 集含有脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干， 即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物含量為99.08%。實施例4取蟾酥藥材2克，加無水乙醇15ml，加熱回流40min，上述條件下提3 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入1.8克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取 22克硅膠以石油醚丙酮(體積比6: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠， 用石油醚丙酮(體積比6: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別，收集含有脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干，即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物含量為96.37%。 實施例5取蟾酥藥材2克，加無水乙醇10ml，加熱回流20min，上述條件下提3 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入1克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取22 克硅膠以石油醚丙酮(體積比4: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠，用 石油醚丙酮(體積比4: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別，收 集含有脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干， 即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物含量為91.06°%。實施例6取蟾酥藥材2克，加無水乙醇40ml，加熱回流60min，上述條件下提1 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入2克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取22 克硅膠以石油醚丙酮(體積比3: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠，用 石油醚丙酮(體積比3: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別，收集含有脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干，即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物含量為90.33%。 實施例7取蟾酥藥材l克，加無水乙醇15ml，加熱回流40min，上述條件下提2 次。將提取液趁熱過濾，旋蒸濃縮后加入3克硅膠拌樣，得拌樣硅膠。取21 克硅膠以石油醚丙酮(體積比10: 1)浸泡后濕法裝柱，加入拌樣硅膠， 用石油醚丙酮(體積比10: 1)洗脫劑進行等度洗脫。通過HPLC鑒別，收集含有脂蟾毒配基、華蟾毒精、蟾毒靈這三種脂溶性成分的洗脫液，蒸干，即得本發(fā)明蟾酥提取物，其中三種蟾毒配基混合物含量為95.38%。上述實施例中所述的蟾酥藥材購自江蘇寶應興平蟾蜍養(yǎng)殖基地，粉碎研 磨至60目左右；硅膠為青島美高集團產(chǎn)品，粗孔，100-160目，柱直徑2 厘米，柱高20厘米。
權(quán)利要求
1、一種蟾酥提取物，其含有重量百分比≥90％的脂蟾毒配基、華蟾毒精和蟾毒靈三種蟾毒配基混合物。
2、 如權(quán)利要求1所述的蟾酥提取物，其特征在于該三種蟾毒配基混合 物在蟾酥提取物中的含量為91~99%。
3、 如權(quán)利要求1所述的蟾酥提取物的制備方法，其包括下列步驟① 將蟾酥藥材用無水乙醇回流提取；② 將上述提取液濃縮濃縮后經(jīng)硅膠柱分離，用體積比為3~10:1的石油 醚和丙酮等度洗脫，收集洗脫液，過濾，蒸干即得含有三種蟾毒配基混合物 的蟾酥提取物。
4、 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟①中所述的蟾酥藥 材為蟾酥粉，每次提取時藥材與無水乙醇的比例為lg:5 20ml，提取時間為 20-60分鐘，共提取1~3次。
5、 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟②中將濃縮的提取 液加入硅膠拌樣，蒸干得拌樣硅膠，所得拌樣硅膠干法上樣。
6、 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的加入硅膠的重量 為蟾酥藥材重量的0.5 3倍。
7、 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的加入硅膠的重量 為蟾酥藥材重量的0.6~1倍。
8、 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于在所得拌樣硅膠干法上 樣前先將硅膠濕法裝柱，預先用所述洗脫劑石油醚和丙酮浸泡洗脫。
9、 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟②中洗脫劑石油醚 和丙酮的體積比為4 6:1。
10、 如權(quán)利要求3 9任一項所述的制備方法，其特征在于所述的硅膠為 100-160目的粗孔硅膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟾酥提取物及其制備方法，該制備方法包括①將蟾酥藥材用無水乙醇回流提取；②將上述提取液濃縮，經(jīng)硅膠柱分離，用體積比為3～10∶1的石油醚和丙酮等度洗脫，收集洗脫液，過濾，蒸干即得含有三種蟾毒配基混合物的蟾酥提取物。本發(fā)明的制備方法簡便、易于操作并適于工業(yè)化生產(chǎn)，制得的本發(fā)明蟾酥提取物中三種蟾毒配基混合物的含量均≥90％。
文檔編號A61P35/00GK101322723SQ200710041880
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日
發(fā)明者丹 劉, 劉小葉, 奉建芳, 林 祝, 陳滿倉 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院