專利名稱：：一種凋亡相關基因及以其為靶點用于治療白血病的藥物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物工程領域，尤其涉及基因重組技術，特別是一種凋亡相關基因及以其為靶點用于治療白血病的藥物。
背景技術：
：細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內細胞數量動態(tài)平衡的基本措施。通過細胞凋亡清除衰老和病變的細胞，保證了機體的健康，和細胞增殖一樣，細胞凋亡也是受基因調控的精確過程。目前公認細胞凋亡受抑是白血病等惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一，臨床上內科治療惡性腫瘤的主要手段化療就是使腫瘤細胞發(fā)生凋亡而達到治療的目的。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，由于骨髓、脾、肝等造血器官中白血病細胞過度增生、凋亡減少所致。目前白血病的治療方法有化療、中西醫(yī)結合治療、骨髓移植、生物調節(jié)劑治療等方面。目前認為化療治療有效的主要原因在于其可促白血病細胞發(fā)生凋亡，但化療等毒副反應大，常見耐藥現(xiàn)象，療效差，病人最終往往死于復發(fā)；骨髓移植的效果較佳，但需要找到合適的供者，把握好移植的時機，花費大；中西醫(yī)結合、生物調節(jié)劑等療效欠佳，只能作為輔助性治療。因此，臨床上需要找到更有效的治療方法。隨著基因組學研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)急性白血病的發(fā)病往往與染色體、基因異常有關，因此基因治療被認為是潛在的、很有希望根治白血病的方法之一。基因治療就是向靶細胞(組織)導入外源基因，以糾正補償或抑制某些異?；蛉毕莼?，從而達到治療目的。其治療方式可分成四類①基因補償把有正常功能基因轉入靶細胞以補償缺失或失活。②基因糾正消除原藥異?；?，以外源基因取代之。③基因代償外源正?；虮磉_水平超過原藥的異常基因表達水平。④反義技術用人工合成或生物體合成的特定互補的DNA或RNA片段或其化學修飾產物抑制或封閉異?；蛉笔У幕虮磉_。基因治療白血病作為一個新的方法正逐步從理論研究向臨床試驗過渡，在美國已通過n期臨床試驗階段，目前基因治療主要是應用反義寡核基酸封閉原癌基因。反義技術是基因治療方法中最簡單明了的手段，應用反義核酸技術的主要的難點就是找到白血病發(fā)病的致病基因。CML存在特異性的致病基因BCR/ABL融合基因，因此CML是目前應用反義核酸技術研究最多的白血病。通過現(xiàn)有技術的改進，使用包括BCR/ABL融合基因在內的多種反義DNA/RNA和輔助基因系統(tǒng)，有望不久對CML基因治療取得突破。目前在genebank上公開了一段基因(apoptosis-relatedproteingene，GenBank編號AF229832)，該基因的序列為5'ACAATCTTGCCCAACAGTCATTCAACATGGAACAAGCCAATTATACCATCCAGTCTTTGAAGGGTGATGAGCTTCTGGCTGATGAAGACAGTTCTTATTTGGATGATACAAAAAACAAGGATGGAGTTCTGGTGGATGAATTTGGATTGCCACAGATCCCTGCTTCATAGATTTGCATCATTCAAGCATATCTTGTAAAACAAACACATATTATGGGACTAGGAAATATTTATCTTTCCAAATTTGCCATAACAGATTTAGGTTTCTTTCCTTTCTTTGAAGGAAAGTTTAATTACATTGCTCTTTTATTTTTTCCATTTAAGAGACTCATTGCTTGGGAAATGCTTTCTTCGTACTAAATTTGATTTCCTTTTTTCTTATGAAAAACGAACTCAGTTTAAAAGTTTTTTAAGCTCGTATGACTTGTTTTCATTCATTAATAAAAAAAAAAAAAAAA3'，雖然該基因被命名為"凋亡相關蛋白基因PNAS-2"。但是未見研究該基因表達與細胞凋亡關系的文獻。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種凋亡相關基因及以其為靶點用于治療白血病的藥物，所述的這種治療白血病的藥物要解決現(xiàn)有技術中的藥物和技術手段治療白血病效果不佳的技術問題。本發(fā)明提供了一種凋亡相關基因，所述的基因含有SEQIDNO:l或者SEQIDNO:2所示的堿基序列。本發(fā)還提供了一種抑制上述的凋亡相關基因的RNA干擾的靶序列，含有GC47UCv47T04或者」GC4CGC4GTT的堿基序列。本發(fā)還提供了一種載體，含有至少一種抑制上述的凋亡相關基因的RNA干擾的靶序列。進一步的，所述的一種載體中含有RNA干擾的靶序列GC4進一步的，所述的一種載體中含有RNA干擾的耙序列C4CG7TGC4。本發(fā)還提供了一種細胞，含有上述的RNA干擾的耙序列。本發(fā)還提供了一種細胞，含有上述的載體。本發(fā)還提供了一種用于治療白血病的藥物，含有有效量的上述的RNA干擾的靶序列、或者上述的載體、或者上述的細胞、或者上述的細胞。進一步的，上述所述的藥物的劑型為醫(yī)學上認可的任何一種劑型。進一步的，上述所述的藥物的劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。本發(fā)明通過RACE，得到了凋亡相關基因PNAS-2的2種不同的全長序列，這兩種全長序列的染色體定位均為9p13.3，它們657bp的開放閱讀框完全一致，編碼的是同一條包含219個氨基酸的蛋白質。通過Real—TimePCR，發(fā)現(xiàn)該基因在白血病初發(fā)、復發(fā)、未完全緩解時存在高表達，而達到完全緩解時PNAS-2的表達下調至正常水平，該基因在其它腫瘤中不存在表達上調；本發(fā)明通過構建真核表達載體并轉染細胞，得到高表達PNAS-2的細胞株，高表達PNAS-2細胞株的抗凋亡能力明顯上調，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PNAS-2是抗細胞凋亡基因過量表達PNAS-2基因后細胞凋亡率下降；PNAS-2基因高表達后執(zhí)行細胞凋亡的caspase3蛋白、AIF(凋亡誘導因子)蛋白等的含量下降；應用基因芯片及抗體芯片后發(fā)現(xiàn)PNAS-2基因高表達后通過抑制AIF介導的非caspase依賴途徑及通過抑制caspase依賴途徑中的GranzymeB—Perforin通路而抗細胞凋亡，并通過抑制抑癌基因參與白血病的發(fā)?。粊喖毎ㄎ谎芯堪l(fā)現(xiàn)PNAS-2蛋白的定位異?？赡軈⑴c了細胞凋亡及白血病發(fā)生。表明高表達的PNAS-2基因及蛋白是白血病的發(fā)病因素，PNAS-2是新發(fā)現(xiàn)的原癌基因。本發(fā)明應用PNAS-2靶向shRNA表達載體，轉染白血病細胞后可使白血病細胞生長阻滯、顯著增加白血病細胞的凋亡率，并可增加抑癌蛋白如p53、Rb的翻譯從而抑制白血病細胞增殖，表明了靶向抑制PNAS-2的shRNA表達載體可用于白血病的治療。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PNAS-2特異性參與了白血病的發(fā)病通過NorthernBlot及Real—TimePCR，發(fā)現(xiàn)該基因在白血病初發(fā)、復發(fā)、未完全緩解時存在高表達，而達到完全緩解時PNAS-2的表達恢復正常水平，但該基因在其它腫瘤中不存在表達上調，提示其高表達是白血病特異的；應用抗體芯片后發(fā)現(xiàn)該基因及蛋白高表達后可通過抑制抑癌蛋白如p53、Rb等參與白血病的發(fā)病；該基因及蛋白高表達后可通過抑制GmnzymeB—Perforin通路導致白血病細胞通過"免疫逃避"而得到進一步發(fā)展；PNAS-2蛋白在白血病細胞存在亞細胞定位異常，由此參與了白血病發(fā)生。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)抑制PNAS-2表達可治療白血病應用靶向針對PNAS-2的shRNA表達載體，轉染后可使白血病細胞阻滯于G2期，白血病細胞的凋亡率顯著增加，表明靶向抑制PNAS-2的shRNA表達的載體可用于白血病的治療。PNAS-2特異性shRNA表達載體治療白血病的機理為使剪切型Caspase3、AIF及GranzymeB的含量上升，使白血病細胞發(fā)生凋亡；使p53及Rb等抑癌蛋白含量顯著增加，并激活GranzymeB—Perforin通路，也是PNAS-2特異性shRNA能有效治療白血病的機制之一。本發(fā)明和己有技術相比，其技術進步性是顯而易見的。本發(fā)明應用RNA干擾技術抑制我們發(fā)現(xiàn)的急性白血病特異性的致病基因PNAS-2，對白血病治療具有顯著的效果。抑制PNAS-2后白血病細胞的凋亡率顯著增加；細胞周期中出現(xiàn)了G2期阻滯，從而使細胞有機會修復損傷的DNA，確?；虻臏蚀_遺傳，阻滯白血病細胞的增殖；同時p53，Rb等原先受到抑制的抑癌蛋白含量的增加，也是抑制PNAS-2表達對白血病治療有效的原因之一。圖1顯示了RACE時菌落PCR的結果，M為100bpmarker,A、B、C、D、E、F、G、H、I、J及K分別為不同的菌落PCR產物。圖2顯示了pCR4TOPO重組質粒直接或酶切后行PCR的電泳結果，左起分別為100bpmarker、質粒A的PCR產物、質粒C的PCR產物、質粒A酶切后的PCR產物、質粒C酶切后的PCR產物及500bpmarker。圖3顯示了PNAS-2的全長序列剪切方式1和2的ORF分析結果，F(xiàn)lPNAS-2(即剪切方式1)，F(xiàn)2PNAS-2(即剪切方式2)，CHMP5，CGI-34，HSPC177基因5'端序列比較。圖4顯示了PNAS-2的全長序列剪切方式1和2的染色體定位。圖5顯示了過量表達PNAS-2后細胞凋亡率的改變，圖5a為綜合三次流式細胞儀檢測結果得到的細胞凋亡率，對照組的細胞凋亡率為5.51±0.12%，PNAS-2-pTmcer轉染組的細胞凋亡率為4.07±0.30%，二者之間有顯著性差異(pO.01);圖5b及圖5c分別為激光共聚焦顯微鏡觀察對照組和PNAS-2-pTracer轉染組細胞凋亡情況的一個典型視野；從圖中可大致看出對照組的凋亡率要高于PNAS-2-pTracer轉染組；圖5b及圖5c中左上象限為收集的7-AAD熒光信號；右上象限為光鏡下的細胞；左下象限為收集的AnnexinV-APC熒光信號；右下象限為融合上述三個象限后得到的圖像。圖6顯示了過量表達PNAS-2后細胞凋亡通路的變化，圖中的GraB為GranzymeB的縮寫。圖7顯示了GFP融合蛋白表達載體轉染細胞后的WesternBlot鑒定結果。圖8顯示了PNAS-2-GFP融合蛋白的亞細胞定位，圖8a應用激光共聚焦顯微鏡可見PNAS-2-GFP融合蛋白彌漫分布于整個白血病細胞，細胞核區(qū)的融合蛋白分布似乎更為明顯；與圖8b相比，存在不一致，即PNAS-2-GFP融合蛋白在白血病細胞漿中的分布明顯增多；圖8b為文獻一——DianeMcVeyWard,MichaelB.Vaughn,ShellyLShiflett,etal.TheRoleofLIP5andCHMP5inMultivesicularBodyFormationandHIV-lBuddinginMammalianCellsTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY2005.Vol.280,No.11:p.10548-10555.中CHMP5-DsRed中PNAS-2的同源基因CHMP5的亞細胞定位，該文獻顯示了融合蛋白在Cos-7細胞中主要局限分布于核周小囊泡中；圖8a中左圖為熒光顯微鏡下觀察到的細胞，右圖為該細胞在光鏡下的圖像；圖8b中左圖為光鏡下觀察到的細胞，右圖為該細胞在熒光顯微鏡下的圖像。圖9顯示了各shRNA位點對PNAS-2的抑制效果，M:100bpmarker;con:shRNA對照組；1:shRNAI;2:shRNAII;3:sh脂AIII。圖10顯示了抑制PNAS-2表達后細胞周期的變化，圖10a為Gl期的變化情況；圖10b為S期的變化情況；圖10c為G2期的變化情況。圖11顯示了抑制PNAS-2表達后細胞凋亡率的改變，圖lla為綜合三次實驗結果；圖llb、圖llc及圖lld分別為激光共聚焦顯微鏡檢測shRNA對照組、shRNAI組與shRNAII組細胞凋亡率的視野之一。圖12顯示了抑制PNAS-2后的抑癌蛋白及凋亡相關蛋白的變化。具體實施例方式實施例1凋亡相關基因PNAS-2的全長序列的獲得及基因信息學研究1，細胞培養(yǎng)NB4急性早幼粒細胞白血病細胞株，由上海市血液學研究所提供。細胞置于含10%小牛血清的RPMI1640中，于37。C，5%C02濕空氣中培養(yǎng)，每3天傳代1次，實驗時取對數生長期細胞。2，總RNA抽提，RNA完整性檢測取5xl(^個NB4細胞加入15ml離心管中，于低溫離心機中以1500rpm，4匸離心，棄上清。細胞沉淀用冰PBS緩沖液(PH7.4)洗滌后再次離心，棄上清。加入lmlTrizol，吹打混勻后轉入1.5mlEP管中，室溫靜置5min，然后加入氯仿200pl，劇烈振蕩15-30秒，使液體充分混勻，室溫靜置2-3分鐘。低溫離心機4"C，12000rpm離心20分鐘，吸取上層無色透明水相液(約500-600pl)轉移至另一DEPC處理過的1.5mlEP管中，加等量體積異丙醇，混勻，一40。C靜置1小時，取出后于4°C12000rpm離心20分鐘，棄上清，加入1ml75%乙醇，混勻，4°C12000rpm離心20分鐘，取出后除去上清，室溫自然干燥至總RNA沉淀透明(約需15分鐘)，加入15plDEPC處理過的水溶解。取1^總RNA于1.0%瓊脂糖凝膠行電泳，可見3條清晰條帶(28s,18s,5s)，表明所提取的RNA沒有降解，符合進一步實驗的要求。3，5'cDNA末端快速擴增法使用Invitrogen公司的GeneRacerKit行5'cDNA末端快速擴增法(5'RACE)，具體參見說明書，步驟如下3.1總RNA脫磷酸10xCIPbuffer1^1，脂aseOut(40u/pl)小牛小腸堿性磷酸酶(CIP,lOu/pl)l(il，總RNA(2iig/^il)5^1，DFPC處理過的水2iil;混勻，瞬時離心，50。C孵育l小時。3.2沉淀RNA:脫磷酸后加入90plDEPC處理過的水，100pl苯酚氯仿(25:24)，劇烈混勻，室溫下以13000rpm離心5min;轉移上層水相至新的EP管中，加入10mg/ml的貽貝糖原(MusselGlycogen)2^1，3M的醋酸鈉10^d，混勻后再加入95^的乙醇220(il。置于-40。C10min。13000rpm離心20min，棄上清，力卩500pl70%的乙醇，顛混；4°C，13000rpm離心2min，棄上清，再次4。C13000rpm離心2min以收集乙醇；小心去除殘留乙醇，室溫空氣干燥2分鐘，用7plDEPC處理過的水溶解RNA。3.3mRNA脫帽反應上述7plRNA中加入10xTAPBuffer1|il，TAP(0.5u/pl)1pl，RnaseOut(40u/(il)1混勻，瞬時離心，37。C孵育1小時。再次沉淀RNA，方法同3.2。3.4連接RNA寡核苷酸至脫帽的mRNA:加7|il脫磷酸、脫帽反應后的mRNA至含有250ngRNA寡核苷酸(GeneRacerRNAOligo，序列為AGAAA-3')的管中，混勻，瞬時離心，65°C5min以去除RNA二級結構，置于冰上2min，加入lOxLigaesBuffer110MmATP1RnaseOut(40u/pl)1pi;T4RNA連接酶(5u/pl)1)il。37。C孵育1小時。再次沉淀RNA，方法同3.2。3.5逆轉錄mRNA:連接有RNA寡核苷酸的mRNA10pl，GeneRacerOligodTPrimer(序列為5'誦GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24-3')1pi，dNTPMix(25(iMeach)1pl，ddH201|al;65°C5min以去除RNA二級結構，置于冰上2min，瞬時離心。在上述13|il反應體系中加入5xFirstStrandBuffer4pl，0.1MDTT1|il，SuperscriptIII逆轉錄酶(200u/pl)1^1，RnaseOut(40u/(il)1(il;輕柔混勻，瞬時離心，50°Clh進行逆轉率，72°C15min滅活逆轉錄反應，4°C5min結束。瞬時離心。3.6去除殘留RNA:連接有GeneRacerRNAOligo的mRNA完成逆轉錄后，在反應體系中加入2u/ial的RNaseHl(il，37°C20min孵育以去除殘留的RNA。瞬時離心。4.巢式PCR使用TAKARA公司的高保真Taq酶(TAKARALATaq)，按說明書操作。引物設計使用的軟件為PrimerPremier5，7W^S-2T^瘃歹/激7:5'CGAAGAAAGCATTTCCCAAGC3'，位于該基因PNAS-2原先序列的第584—604bp;尸A^S-2T^薪歹/激2:5'CTCCCAGTTTCATAGCAT3'，位于原先序列的第82—99bp;/W^S-2尸游歹/激3:5'GACTGTTGGGCAAGATTGT3'，位于原先序列的第l一19bp。引物均由上海生工公司合成；上游引物1是Ge"e/Gcer5'5'CGACTGGAGCACGAGGACACTGA3'，上游引物2為Ge"eiacw5'AfetediV/wer:5'GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA3'。PCR反應條件均為為94°C2min;94°C30s，72°C2min，循環(huán)4次；94°C30s，70°C2min，循環(huán)4次；94°C30s，60°C30s，72°C2min，循環(huán)19次；72°C20min，4°C20min結束反應。5.TOPOTA克隆TOPOTA克隆試劑盒(TOPOTACloningKitforSequencing)購自Invitrogen公司。取新鮮巢式PCR產物4fil，SaltSolution1|il，pCR4-TOPO質粒載體1pi,室溫孵育5min后置于冰上。6.轉化化學感受態(tài)細菌力口2^TOPOTA克隆產物至化學感受態(tài)細菌(OneShotChemicallyCompetentE.coli)中，輕柔混勻，42°C30s熱休克細菌后立即置于冰上，加250(il室溫S.O.C培養(yǎng)基，37°C200rpm振蕩搖菌lh。取菌液50pl，鋪在含氨芐青霉素50pg/ml的LB平板上。37'C孵育過夜后可見在LB平板上有多個細菌克隆形成，挑選11個形態(tài)飽滿、典型的單個菌落置于含氨芐青霉素100|ig/ml的LB選擇培養(yǎng)基中振搖過夜。然后取搖菌產物1行菌落PCR，引物上游引物為Ge"e7flcer5'A^stoi/V/ww(同前)，下游引物使用與巢式PCR不同且更靠近5'端的/WAS-2尸,歹/激3(同前)，該下游引物位于原先序列的第l一19bp。結果可見11個菌落PCR產物均在三百多bp處，但C菌落PCR產物比其它產物略長(如圖l所示)。7.質粒抽提使用QIAGEN公司的QIAprepspinmimiprepkit從搖菌產物A和C中抽提質粒。質粒抽提的實驗步驟如下取3_5ml菌液置于15ml離心管中，4000rpm離心5min，棄上清，用250jilbufferPI重新懸浮細菌沉淀，并轉至1.5ml的EP管中。加入250|ilbufferP2后輕柔顛混EP管6次。加入350|ilbufferN3，立即輕柔顛混EP管6次。之后在臺式離心機(EffendorfMinispin)上以12000rpm離心10min。將上清液轉入QIAprep離心柱中，12000rpm離心1min，棄下清。在QIAprep離心柱中加入0.5mlbufferPB，12000rpm離心1min，棄下清。在QIAprep離心柱中加入0.75mlbufferPE，12000rpm離心1min，棄下清。再次12000rpm離心1min以去除殘留的洗滌緩沖液。將QIAprep離心柱放入一干凈的1.5ml離心管中，將50(ilbufferEB加入QIAprep離心柱中，靜置1min，12000rpm離心lmin，收集的管底液體即為質粒。8.質粒的鑒定及測序根據pCR4TOPO質粒載體在插入位點兩側均有限制性內切酶EcoRI的特點，限制性內切酶EcoRI酶切質粒后進行PCR驗證質粒是否含有插入序列。酶切體系為20(！1，包括10xEcoRIbuffer2nl，質粒10jil，EcoRI酶2^1，滅菌水6|11。37°C90min進行酶切，65°C20min滅活。結果示搖菌產物C中提取的質粒直接或酶切后的PCR產物均略長于搖菌產物A的PCR產物(如圖2所示)。上述結果提示在NB4細胞株中，PNAS-2基因的5'端存在兩種不同長度的剪切形式。選擇質粒送上海生工測序，測序后拼接結果見下PNAS-2全長序列剪切方式1(如SEQIDNO:1所示)(下劃線部分為5'RACE擴增出的部分，粗體字部分為原先的PNAS-2序列)5'TTCCGTTTCTGGTTTTGCTCTAGTGTTTGGGTTTCTTCGCGGCTGCTCAAGATGAACCGACTCTTCGGGAAAGCGAAACCCAAGGCTTTAAAGCAAAAGAGGATGTATGAGCAGCAGCGGGACAATCTTGCCCAACAGTCATTCAACATGGAACAAGCCAATTATACCAGTTATGGCACCCCAGAACTGGATGAAGATGATTTAGAAGCAGAGTTGGATGCACTAGGTGATGAGCTTCTGGCTGATGAAGACAGTTCTTATTTGGATGAGGCAGCATCTGCACCTGCAATTCCAGTGGATGAATTTGGATTGCCACAGATCCCTGCTTCATAGATTTGCATCATTCAAGCATATCTTGTAAAACAAACACATATTATGGGACTAGGAAATATTTATCTTTCCAAATTTGCCATAACAGATTTAGGTTTCTTTCCTTTCTTTGAAGGAAAGTTTAATTACATTGCTCTTTTATTTTTTCCATTTAAGAGACTCATTGCTTGGGAAATGCTTTCTTCGTACTAAATTTGATTTCCTTTTTTCTTATGAAAAACGAACTCAGTTTAAAAGTTTTTTAAGCTCGTATGACTTGTTTTCATTCATTAATAATAATTGAATAAAACTAAGGAATGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3'PNAS-2全長序列剪切方式2(如SEQIDNO:2所示)(下劃線部分為5'RACE擴增出的部分，粗體字部分為原先的PNAS-2序列)5'AGTGTTTGGGTTTCCTCGCGGCTGCTCAAGATGAACCGACTCTTCGGGAAAGCGAAACCCAAGGCTCCGCCGCCCAGCCTGACTTATGAGCAGCAGCGGGACAATCTTGCCCAACAGTCATTCAACATGGAACAAGCCAATTATACCATCCAGTCTTTGAAGGACAATGAGCTTCTGGCTGATGAAGACAGTTCTTATTTGGATGAGGCAGCATCTGCACCTGCAATTCCAGAAGGTGTTCCCACTGATACACAGATCCCTGCTTCATAGATTTGCATCATTCAAGCATATCTTGTAAAACAAACACATATTATGGGACTAGGAAATATTTATCTTTCCAAATTTGCCATAACAGATTTAGGTTTCTTTCCTTTCTTTGAAGGAAAGTTTAATTACATTGCTCTTTTATTTTTTCCATTTAAGAGACTCATTGCTTGGGAAATGCTTTCTTCGTACTAAATTTGATTTCCTTTTTTCTTATGAAAAACGAACTCAGTTTAAAAGTTTTTTAAGCTCGTATGACTTGTTTTCATTCATTAATAATAAAAAAAAAAAAA3'9.RACE結果的驗證為了驗證在NB4細胞株中存在FlPNAS-2及F2PNAS-2基因序列，我們在靠近PNAS-2全長序列剪切方式1和2的5'末端處設計引物。全長序列剪切方式1的上游引物為5'CCGTTTCTGGTTTTGCTCTAGTGTT3';全長序列剪切方式2的上游引物為5'GCATTGGCACGGTGGACAGTAGAGC3'。下游引物均為5'GTGGGAACACCTTCTGGAAT3'。根據設計的引物可以推斷，擴增出的全長序列的剪切方式1的PCR產物長度約在650bp,全長序列的剪切方式2的PCR產物長度約在520bp。以NB4細胞的RT產物為模板，PCR條件94°C2min;94°C45s，60°C45s，72°C45s，循環(huán)30次；72°C10min，4°ClOmin結束反應。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳后可見兩種剪切方式PCR產物的長度在我們估計范圍之內，表明RACE的結果是可靠的。10.全長PNAS-2基因信息學分析5'RACE結果顯示凋亡相關基因PNAS-2的mRNA在急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4中存在兩種不同的剪切形式，PNAS-2的全長序列剪切方式l除了在5'端比剪切方式2多出21bp外其它序列二者完全一致。剪切方式2的5'端第一個堿基為"A"，符合真核生物mRNA第一個甲基化堿基通常為"G"或"A"的形式；雖然剪切方式1的5'端第一個堿基為"T"，但不可能是混入的RNase破壞mRNA后形成的，因為RNase作用后形成的mRNA的5'端是羥基而不是磷酸基，而5'端羥基是不能連接上寡核苷酸的，因此我們認為剪切方式1是另一種剪切形式。由于PNAS-2原先已知序列中已出現(xiàn)"AATAAA"序列且其后存在"PolyA"結構，這是真核生物轉錄終止的典型結構，故我們未再行3'RACE。BLAST比對分析〔http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/網站中的Nucleotide-nucleotideBLAST(blastn)〕后我們發(fā)現(xiàn)剪切方式1和2與CHMP5(genbank編號NM—016410)，SNF7DC2基因(HomosapiensSNF7domaincontaining2，Genbank編號分別為BC007457、BC021168、BC020796、BC006974),HomosapiensCGI-34proteinmRNA(Genbank編號為AF132968),HSPC177(Genbank編號為AF161525)等的全長序列均存在有98-99%的同源性。剪切方式l和2與上述基因的657bp的"開放讀碼框"(OpenReadingFrame,ORF)完全一致(如圖3所示，其啟始ATG的位點完全一致，啟始ATG后的序列完全一致，且從啟始ATG到第一個出現(xiàn)的終止密碼子TAG之間657bp的"ORF"序列完全一致(圖中未完全顯示)，提示這些基因編碼的是同一蛋白質，提示上述基因是同源基因)，表示它們編碼的是同一條包含219個氨基酸的蛋白質(如SEQIDNO:3所示)，上述基因是同源基因。編碼的蛋白質序列見下(N端)麗RLFGKAKPKAPPPSLTGCIGTVDSRAESIDKKISRLDAELVKYKDQIKKMREGPA腿VKQKALRVLKQKRMYEQQRDNLAQQSF麗EQANYTIQSLKDTKTTVDAMKLGVKEMKKAYKQVKIDQIEDLQDQLEDMMEDANEIQEALSRSYGTPELDEDDLEAELDALGDELLADEDSSYLDEAASAPAIPEGVPTDTKNKDGVLVDEFGLPQIPAS(C端)。應用NCBI網站中的人類基因組BLAST對全長PNAS-2的染色體定位進行了研究，發(fā)現(xiàn)全長PNAS-2定位于9pl3.3，與CHMP5等基因的染色體定位一致(圖4，由左圖可見全長PNAS-2(圖中標記部分)定位于9號染色體p13.3。右圖為9號染色體短臂的局部放大，由于全長PNAS-2剪切方式1的序列暫未上傳至Genbank數據庫，故染色體定位圖上顯示的基因是其同源基因CHMP5。PNAS-2基因的命名是由于原先PNAS-2序列編碼的蛋白質與一條與本發(fā)明細胞凋亡有關的蛋白質有高度同源性，故取名為"凋亡相關蛋白基因PNAS-2"。由于行RACE后得到的全長PNAS-2的蛋白質表達序列與原先PNAS-2編碼的蛋白質相比可能會有移位，這樣的話全長PNAS-2可能與凋亡相關的蛋白質沒有同源性，全長PNAS-2可能與細胞凋亡沒有關系。在我們對PNAS-2基因信息進行了分析后，發(fā)現(xiàn)原先的啟始"ATG"與全長PNAS-2的啟始"ATG"之間有261個堿基，為3的整數倍，因此，原先推測的PNAS-2蛋白正好是全長PNAS-2蛋白的一部分，故原先對PNAS-2的命名是正確的，也提示全長PNAS-2的功能可能與細胞凋亡有實施例2本發(fā)明的凋亡相關基因PNAS-2與細胞凋亡的關系研究雖然原先的PNAS-2被命名為"凋亡相關基因"，但沒有關于該基因與細胞凋亡關系的實驗研究。雖然我們發(fā)現(xiàn)全長PNAS-2與CHMP5等基因是同源基因，也未見CHMP5等與細胞凋亡關系的實驗研究。1.PNAS-2的表達與細胞凋亡的關系1.1高保真PCR及PCR產物的回收、純化根據我們先前行5'RACE得到的PNAS-2全長序列，使用PrimerPremier5設計引物，并在上、下游引物的5'端加上BstXI酶切位點及保護性堿基(下面小寫字部分)，上游引物為5'tagccagtgtggtggTGCTCAAGATGAACCGACTCT3'，下游引物為5'tgtccactgtgctggCGAAGAAAGCATTTCCCAAGC3'，按照設計，PCR后我們可得到一段編碼完整PNAS-2蛋白的DNA序列，PCR產物長851bp。使用TAKARA公司的高保真Taq酶(LATaq)，按說明書配置PCR反應體系。PCR的反應條件為94°C4min;94°C45s，55°C1min，72°C45s，進行30個循環(huán)，最后72"C延伸10min結束反應。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。瓊脂糖凝膠電泳后使用北京鼎國生物公司的DNA快速純化/回收試劑盒回收、純化851bp的PCR產物，操作的步驟如下紫外燈下切取含DNA片段的瓊脂糖U00mg—300mg)并移入1.5mlEP管中，用移液器吸頭搗碎后按切取重量溶液A的體積比為1:3的比例加入溶液A。65"水浴5-10min，振蕩2次，待膠完全融化后置室溫，加入15^溶液B，充分混勻后轉入離心柱中，靜置2min，10000rpm30s，棄下清。加500pl溶液C于離心柱中，10000rpm30s，棄下清。重復此步驟一次。12000rpm再次離心lmin，棄下清。將離心柱裝入新的離心管中，敞開離心管管口室溫靜置10min。加入20nl5(TC水浴預熱的溶液D，靜置2min，13000rpm離心lmin，管底液體即為回收的DNA。1.2BstXI限制性內切酶單酶切使用MBI公司的限制性內切酶BstXI分別酶切PCR產物及真核表達質粒pTracer-CMV/Bsd(購自Ivitrogen公司)，瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化酶切產物。酶切后的PCR產物及pTracer-CMV/Bsd質粒使用T4DNA連接酶(MBI公司)相連接，對照質粒為pTracer-CMV/Bsd空質粒。1.3感受態(tài)細胞的轉化及陽性菌落的篩選取新鮮TOPO10感受態(tài)菌200^1，加2iil連接物，混勻，冰上放置30min。42。C熱休克30s，冰上放置2min。加入250iilS.O.C培養(yǎng)基，37°C200rpm振搖lh。取40pl涂抗氨芐青霉素瓊脂平板，37T:過夜后選擇典型的單個菌落擴菌。1.4測序鑒定使用QIAprepSpinMiniprepKit試劑盒抽提質粒，送上海生工生物公司測序，測序結果證實我們成功構建了PNAS2-pTracer重組質粒。1.5細胞轉染及篩選測序得到含正確構建的PNAS-2-pTracer質粒的細菌，使用QIAprepSpinMiniprepKit抽提細菌中的質粒(方法同前)。紫外分光光度計定量后各取1嗎PNAS-2-pTracer質粒及pTracer空質粒，使用Superfecttransfectionreagent(購自Qiagen公司)轉染質粒至U937細胞，轉染的大致步驟如下將培養(yǎng)的細胞轉至15ml離心管中，4°C1500rpm離心5min，棄上清。在細胞沉淀中加入RPMI1640培養(yǎng)基，調節(jié)細胞濃度至2xl0"ml，取1.6ml細胞懸液分別加入6孔板中。用PH7-8的TE緩沖液稀釋2pg的質粒DNA(稀釋后的最低濃度為0.1!ig/Vl)，加不含血清及抗生素的RPMI1640至100)il，混勻，瞬時離心。加8(ilSuperfectreagent至質粒DNA液中，用移液器吹打5次后置室溫孵育10min。加入400^含血清及抗生素的RPMI1640至上述轉染復合物中，用移液器吹打2次，立即用移液器滴入6孔板中。實驗分3組，PNAS-2-pTracer組、對照組即con-pTracer組及未轉染組。轉染后48h加含5pg/ml殺稻瘟菌素及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液2ml進行篩選，2周后可見轉染組均有分裂相細胞并形成集落，而未轉染組的細胞幾乎全部死亡。根據pTmcer-CMV/Bsd質粒帶GFP這一特點，在轉染第28天使用流式細胞儀分選出GFP陽性細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。1.6半定量PCR鑒定PNAS-2過量表達效果TRIZOL法抽提PNAS-2-pTracer組及con-pTracer組細胞的總RNA，使用SuperscriptIII逆轉錄酶進行逆轉錄。PCR使用的PNAS-2上游引物為5'GAGCAGCAGCGGGACAAT3'，下游引物；5'GTGGGAACACCTTCTGGAAT3'。以(3-actin為內參照，上游引物5TCGACAACGGCTCCGGCAT3'，下游引物5'AAGGTGTGGTGCCAGATTTTC3'。94°C2min;94°C45s，55°C45s，72°C45s，進行30個循環(huán)；72°C10min結束反應。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后使用復日凝膠成像系統(tǒng)分析PNAS-2及(3-actin的灰度值。我們發(fā)現(xiàn)PNAS-2-pTracer組中PNAS-2基因的表達較con-pTracer組升高1.73倍。1.7凋亡檢測檢測細胞凋亡時磷脂酰絲氨酸外翻的AnnexinV-APC及核染料7-AAD(7-Amino-actinomycin)均購自BDPharMingen公司。檢測細胞凋亡的操作步驟大致為收集2><105細胞，PBS洗滌2次，重新懸浮于lxBindingBuffer,力[]5piAnnexinV隱APC，避光孵育15min后加5|al7-AAD，繼續(xù)避光孵育5min;1小時內流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測。FCM檢測AnnexinV-APC時使用FL-4通道，用遠紅外通道(650nmlong-passfilter)檢測7-AAD熒光，重復實驗三次，配對t檢驗結果示對照組的凋亡率為5.51±0.12%，PNAS-2-pTracer轉染組為4.07±0.30%(p=0.0096<0.01)，表明PNAS-2過量表達可致細胞凋亡率下降。使用激光共聚焦顯微鏡檢測凋亡時，AnnexinV-APC的激發(fā)波長(EX)為633nm，檢測波長(EM)為700-780nm;7-AAD的EX為543nm，EM為560-615nm。隨機取視野，計數至少200個細胞，計算AnnexinV-APC(+)/7-AAD(-)和AnnexinV-APC(+)/7-AAD(+)細胞占細胞總數的百分比。得到對照組的細胞凋亡率為6.90%，PNAS-2-pTracer轉染組的細胞凋亡率為3.76%，實驗組的細胞凋亡率與對照組相比下降，表明PNAS-2過量表達確實可致細胞凋亡率下降，說明PNAS-2是抗細胞凋亡基因(如圖5所示)。2,PNAS-2抗細胞凋亡的途徑2.1蛋白質抽提各取PNAS-2-pTracer轉染組及con-pTracer轉染組細胞約1><107左右，懸浮細胞總蛋白抽提試劑盒購自上?？党缮锕こ坦?，按說明書操作。2.2.BCA蛋白質定量蛋白質定量試劑盒購自上?？党缮锕こ坦荆凑f明書操作。2.3生物素標記蛋白樣品取lmg生物素反應物，溶解于0.1mlDMF，終濃度為10mg/ml，取不超過200pg的蛋白樣品，用標記緩沖液稀釋到50^1。在200嗎蛋白樣品中加入29嗎生物素標記物，生物素標記物和蛋白樣品的比值保持在1:7?；旌暇鶆颍谑覝卣袷幏跤?h。2.4純化生物素標記的蛋白反復顛倒純化柱，使膠重懸后將純化柱放入2ml收集管中，通過重力作用使其干燥。倒掉收集管中的溶液，重新將純化柱放入2ml收集管，使用Eppendorf臺式離心機，4000rpm離心4min，倒掉溶液。將純化柱轉移到新的1.5ml離心管中，小心地將生物素標記蛋白樣品加到純化柱子的中心。4000rpm離心4min，收集純化的生物素標記的蛋白樣品。2.5生物素標記的蛋白樣品與芯片雜交將抗體芯片(AntibodyMicroArray，購自美國LABVISION公司)浸在封閉緩沖液中室溫孵育30min以封閉抗體芯片。將芯片放在紙巾上，空氣中干燥。在生物素標記的蛋白樣品中加入雜交緩沖液，終體積為100(il。將芯片放入潮濕的片匣中，緩慢的將蓋玻片覆在芯片上，小心地向蓋玻片下雜交區(qū)內加入樣品，在室溫下孵育2h。將芯片從潮濕的片匣中取出，浸入50ml洗液中，洗掉蓋玻片。2.6芯片結果檢測在50ml離心管中加入約40ml洗液，將芯片浸入，室溫下?lián)u動10min。共清洗三次，每次更換新的洗液。將芯片取出，放在紙上，小心快速地從芯片邊緣將液體吸干(芯片雜交區(qū)要保持濕潤)。揭掉檢測匣的塑料襯墊后小心地將檢測匣放在芯片上，通過檢測匣的一個孔，緩慢的向匣內加入約1000iil鏈親和素。將芯片放在架子上，室溫孵育45min后取下檢測匣，在50ml錐形離心管中加入洗液，將芯片浸入，以60rpm低速連續(xù)搖動清洗芯片。將芯片浸入50ml錐形離心管中的35ml洗液中，室溫，60rpm連續(xù)搖動10min以清洗芯片。重復此步驟步3次。將芯片取出，放在紙上，小心快速地從芯片邊緣將液體吸干，但芯片雜交區(qū)要保持濕潤。揭掉檢測匣的塑料襯墊后小心地將檢測匣放在芯片上，通過檢測匣的一個孔，緩慢的向匣內加入約1000pl抗體-Cy3檢測試劑。將芯片放在架子上，室溫孵育45min。在50ml錐形離心管中加入洗液，將芯片浸入，以60rpm低速連續(xù)搖動清洗芯片。將芯片浸入50ml錐形離心管中的35ml洗液中，室溫，60rpm連續(xù)搖動10min以清洗芯片。重復此步驟步3次。在50ml離心管中加入ddH20，小心迅速的將芯片浸入后取出，空氣干燥。2.7掃描及標準化:使用Genepix4000B于532nm激發(fā)后進行圖像掃描。用GenepixPro6.0分析軟件讀取芯片上每個點的數值，獲得數據文件后根據三次重復的點的信號強度并計算均值，取均值的中位數做標準化后獲得標準值。將兩張需比較的芯片的標準值相比，獲得比值，根據比值篩選上調及下調1.5倍的蛋白。2.8芯片結果分析PNAS-2基因高表達后執(zhí)行細胞凋亡的caspase3蛋白、AIF蛋白等的含量下降，表明細胞凋亡途徑受抑，再次證實PNAS-2是抗細胞凋亡基因；PNAS-2過量表達后也抑制了GranzymeB及Perforin蛋白的表達，表明溶酶體凋亡途徑中的AIF通路及GranzymeB—Perforin通路被抑制，高表達的PNAS-2通過抑制溶酶體凋亡途徑抑制細胞凋亡。因此，PNAS-2基因高表達后通過抑制AIF介導的非caspase依賴途徑及通過抑制caspase依賴途徑中的GranzymeB—Perforin通路抗細胞凋亡。(如圖6所示，顯示了經典內外源性凋亡通路中的caspase9，caspase8的含量沒有變化，提示上述經典通路沒有改變。)實施例3本發(fā)明的凋亡相關基因PNAS-2的表達與白血病發(fā)病的關系目前未見PNAS-2及其同源基因如CHMP5等與白血病發(fā)病關系的實驗研究。l.RealTimePCR方法檢測PNAS-2在患者中的表達1.1病例收集患者均為上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院的住院及門診患者。其中包括①、初發(fā)急性白血病患者樣本44例，其中急性淋巴細胞白血病9例；急性髓細胞白血病35例，包括M2患者3例，M3患者8例，M4患者18例，M5患者6例。②、完全緩解(CR)樣本27例，包括4例M2患者，18例M3，1例M4，2例M5及2例ALL患者。③、復發(fā)樣本12例，分別為2例M2，5例M3，4例M4禾Q1例ALL患者。、未CR樣本9例，包括2例M3,3例M4，3例M5,1例ALL。、非白血病患者樣本66例，包括42例非腫瘤性疾病患者和24腫瘤性疾病患者。以上樣本均為骨髓液或外周血，分離出單個核細胞后檢測PNAS-2基因的表達。⑥此外還取了31例接受手術治療的惡性腫瘤患者的組織標本，標本取自癌組織和正常組織，組織樣本均由病理科醫(yī)師明確診斷。1.2單個核細胞的分離采集患者骨髓液或外周血3—5ml，肝素抗凝。Ficoll淋巴細胞分離液(上海華精高科技生物有限公司)分離單個核細胞。操作如下抗凝骨髓液或外周血用等量生理鹽水稀釋后，沿管壁緩慢加入已放有4-6mlFicoll淋巴細胞分離液的試管中，2500rpm室溫離心20min，吸出單個核細胞層，用生理鹽水洗滌兩次。如混雜有紅細胞，用4一6ml紅細胞裂解液4-C放置8min，1500rpm離心5min，沉淀加入5ml生理鹽水洗滌。分離出的單個核細胞中幼稚細胞的比例在90%以上，計數板計數，分裝后液氮存儲備用。1.3總RNA抽提、RNA完整性檢測及cDNA合成操作同前。1.4引物設計使用引物設計軟件PrimerPremier5設計引物。PNAS-2上游引物為5'CAGAAAGCCTTGCGAGTT3'，下游引物為5'ACCGTGGTCTTGGTGTCC3'，產物長度131bp。RPII(NM—000937Homosapienspolymerase(RNA)II(DNAdirected)polypeptideA〕作為參照，其上游引物為5'gCACCACgTCCAATgACAT3'，下游引物為5'gTgCggCTgCTTCCATAA3'，產物長度267bp。1.5RealTimePCR檢測:使用TaKaRa公司的RealTimePCR試劑盒，RealTimePCR儀為ABI7900HT(ABI公司)。實時定量PCR反應采用10|il體系，384孔板，3復孔，并用U937細胞株的RT產物作為校準樣本，在冰上按說明進行如下操作SYBRPremixExTaqTM(2X)5pl，ROX0.2pl，10uM上游引物0.2(^1，10uM下游引物0.2iil，cDNA模板1.0pl，ddH2O3.4jil;混勻后瞬時離心，置PCR儀上進行反應，反應條件95°C10s;95°C5s，60°C30s，40個循環(huán)。在實時熒光定量PCR反應的后期，產物經融解、冷卻后得到融解曲線。反應結束后，使用RealTimePCR儀自帶的SDS2.1軟件分析實驗結果。1.6患者中PNAS-2相對含量的檢測根據每例樣本3復孔的CT值，減去同一384孔板上的校準樣本的CT值，分別得到PNAS-2的deltaCT(ACT)平均值及RPII的ACT平均值。用PNAS-2的ACT平均值減去其對應RPII的ACT平均值得到的即為PNAS-2的deltadeltaCT(AACT)，AACT值越小，表明PNAS-2基因的表達越高；反之則表明PNAS-2基因表達越1.7RealTimePCR的結果PNAS-2及RPII的融解曲線成單峰，說明擴增產物單一。PNAS-2在44例初發(fā)急性白血病患者樣本中的(AACT值為-3.02±1.85)表達顯著高于27例CR患者樣本(AACT值為0.99士1.85)，p二O.OOOO。與27例CR樣本相比，PNAS-2在9例未CR(AACT值為-2.25±1.04)和12例復發(fā)急性白血病患者樣本中的表達(AACT值為-3.11士1.68)也顯著高于CR樣本(p值均為0.0000);但初發(fā)、復發(fā)及未CR患者樣本兩兩之間并無統(tǒng)計學差異(p值均大于0.05)(見表1)。表l團體Z檢驗的結果1:樣本來源于外周血或骨髓液的單個核細胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>初發(fā)、復發(fā)及未CR樣本中PNAS-2表達也顯著高于44例非腫瘤性疾病患者的單個核細胞樣本(AACT值為0.10士1.97)及22例腫瘤患者的單個核細胞樣本(AACT值為0.49±2.11)，p值均小于O.Ol。PNAS-2的表達隨著急性白血病病人的病程改變而變化且具有統(tǒng)計學意義即初發(fā)時高表達，完全緩解后表達下調，復發(fā)時PNAS-2的表達又上升。PNAS-2在腫瘤患者的癌組織、正常組織中的表達顯著低于初發(fā)、復發(fā)及未CR患者且有統(tǒng)計學意義。癌組織(AACT值為0.10士1.94)和正常組織(AACT值為0.55±1.89)之間PNAS-2的表達并無統(tǒng)計學差異^=0.0907)。癌組織、正常組織與CR樣本、非腫瘤患者樣本及腫瘤患者樣本之間無統(tǒng)計學差異(p值均大于0.05)，均處于低水平表達(見表2)。表2.團體f檢驗的結果2:初發(fā)、未CR、復發(fā)、CR、非腫瘤性疾病及腫瘤性疾病患者標本來自單個核細胞，癌組織和正常組織標本來自惡性腫瘤患者的組織樣本。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>2.PNAS-2高表達后與腫瘤發(fā)生有關蛋白的變化2.1抗體芯片中抑癌蛋白的變化抗體芯片的操作同前。PNAS-2過量表達后抑癌蛋白APC(AdenomateousPolyposisColi)、BRCA2、CD84、FHIT(FragileHistidineTriad)、p130/Rb2、p14ARF/p16Beta、p53、Retinoblastoma(Rb)、WilmTumorProtein(WT1)下降，而抗體芯片中其余的抑癌蛋白無變化。2.2抗體芯片中其它與腫瘤發(fā)生有關蛋白的變化:PNAS-2過量表達后抑制了GranzymeB及Perforin蛋白的表達，表明GranzymeB—Perforin通路受到抑制。3.PNAS-2蛋白的亞細胞定位研究3.1高保真Taq酶PCR:高保真Taq酶PCR擴增由5'RACE得到的全長PNAS-2基因，按pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO的說明書及文獻設計引物。PNAS-2的上游引物為5'TGCTCAAGATGAACCGAC3'，下游引物為5'TGACCATATTCTTTGCAGGA3'。PCR反應體系配制同前。PCR反應條件為94°C2min;94°C30s，60°C30s，72°C1min，循環(huán)30次；72°C10min，4°C20min結束反應。Cow^/7DA^4由寡核苷酸正鏈5'GTTAACGAATTCCCGCGGGGTGACCA3'和負鏈5'GGTCACCCCGCGGGAATTCGTTAACA3'序列退火后連接而得；Co"加/2由寡核苷酸正鏈5'GAATTCATGCACCACCACCA3'和負鏈5'GGTGGTGGTGCATGAATTCA3'序列退火后連接而得。3.2質粒構建PCR產物或退火后的DNA寡核苷酸經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后應用TOPOTA克隆插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO質粒，操作同前。我們將能表達PNAS-2N端蛋白、連接區(qū)蛋白及GFP蛋白的重組質粒命名為PNAS-2-GFP-pcDNA3;將僅能表達GFP蛋白的重組質粒命名為GFP-pcDNA3(TOPOTA插入的序列為Cb^ra/7ZWJ);將能表達3個組氨酸、連接區(qū)蛋白及GFP蛋白的重組質粒命名為His-GFP-pcDNA3(TOPOTA插入的序列為Cow加/2ZWJ)。質粒轉化TOPOIO化學感受態(tài)菌、挑選菌落等實驗步驟同前。3.3質粒抽提及測序鑒定使用QIAMiniPrepKit抽提質粒，操作同前。質粒送上海生工生物工程公司測序，測序結果示重組質粒構建成功。3.4轉染及篩選使用Superfecttransfectionreagent轉染重組質粒至U937細胞。方法同前。實驗時設置了未轉染的U937對照組，加500嗎/ul的G418約21天未轉染的U937對照組細胞幾乎全部死亡，而重組質粒轉染的各組細胞生長良好。3.5WesternBlot鑒定:蛋白質抽提及BCA蛋白質定量同前。(1)變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE):按下述配方制備10。/。的分離膠(pH8.8)，丙烯酰胺雙丙烯酰胺30:0.8%w/v2.5ml，1.0MTris-ClpH8.83ml,20%SDS38jil，ddH201.9ml;混合，灌膠前加入10%APS36^1，TEMED5pl;用注射器將配制好的溶液緩慢加入到裝配好的板中至凝膠高度為6厘米左右，預留1.5cm高度配制積層膠。每板凝膠溶液上覆蓋0.1%SDS，放置1小時左右至聚合完全。(2).制備4。/。的積層膠(pH6.8):丙烯酰胺雙丙烯酰胺30:0.8%w/v660(il，1MTris-ClpH6.8630^1，20%SDS25^1，ddH203.6ml;混合，灌膠前加入10%APS25|il，TEMED5(il;使用Whatman3mm濾紙吸去分離膠上層覆蓋的所有溶液，如上配制積層膠。用10ml注射器將積層膠加入板中至頂端，小心插入梳子。l小時左右凝膠聚合完全。(3).樣品準備準備lx上樣緩沖液的樣品液，如6pl蛋白樣品加入3pl3x上樣染液儲存液。每孔配制含30嗎總蛋白樣的樣品液。上樣前煮沸3分鐘。3x上樣染液儲存液(Laemmli上樣染液)的配方lMTris-ClpH6.82.4ml，20%SDS3ml，甘油(100%)3ml，卩-巰基乙醇1.6ml，溴酚藍0.006g，加水至總體積10ml(儲存于4°C)。(4).上樣及電泳凝膠電泳前，拔去梳子，每孔均用lx電泳緩沖液清洗。上、下層電泳槽中加入lx電泳緩沖液，上層槽中緩沖液液面需超過上樣孔頂端1到2cm。BioRad電泳槽中需加入500ml的lx電泳緩沖液。將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣，標準加進第一個孔中。使用BioRad電泳裝置，凝膠電泳于4'C，樣品首先在20mA恒定電流下電泳至染料接近分離膠頂端。然后60mA恒定電流電泳至溴酚藍剛出膠底部。(5).蛋白質轉移準備好BioRad蛋白轉移裝置夾板，凝膠用lx轉移緩沖液稍微清洗。吸水紙，濾紙(比凝膠稍大一些)用lx轉移緩沖液預濕，如下順序裝配于轉移裝置上。(負極)吸水紙一濾紙一凝膠一PVDF膜一濾紙一吸水紙(陽極)。30mA恒流條件下，4。C轉移過夜。lx轉移緩沖液配方Tris堿15.14g，甘氨酸72.07g，甲醇1L，加水至為總體積5L。(6).膜的封閉和抗體孵育膜在5XBSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。TBS洗膜3次，每次5分鐘。封閉過的膜加入anti-GFPIgG抗體(購自MolecularResearchCenter公司)孵育，室溫孵育1.5小時以使抗原抗體結合。TBS洗膜3次，每次5分鐘。加入HRP標記的二級抗體(Anti-rabbit，康成生物工程公司，稀釋比例為1:2000)以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準，室溫孵育膜1小時。TBS洗膜3次，每次5分鐘。(7).結果檢測及分析化學發(fā)光試劑盒購自上?？党缮锕こ坦荆伙@影液、定影液及X光膠片均購自上海冠龍照相器材有限公司?；瘜W發(fā)光試劑盒中兩種試劑等比例混合即為反應液，將膜置于反應液中室溫孵育5分鐘，去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光，圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。如圖7所示，圖中的PNAS為轉有PNAS-2-GFP-pcDNA3質粒的U937細胞，可見檢測出一條約30-40KD的PNAS-2-GFP融合蛋白；圖中的GFP為轉有GFP-pcDNA3質粒的U937細胞，可見檢測出一條約20-30KD的GFP蛋白；圖中所示的His為轉有His-GFP-pcDNA3質粒的U937細胞，可見檢測出一條約20-30KD的GFP融合蛋白；圖中所示的U937為未轉有pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO質粒的U937細胞，因無GFP而不能檢測出GFP蛋白。結果與我們的設計相符，表明上述質粒構建成功且已成功轉入了U937細胞，可進行下一步的亞細胞定位研究。也說明了在體內，PNAS-2確實可以翻譯成蛋白質。3.6亞細胞定位研究轉染4周后研究PNAS-2-GFP融合蛋白的亞細胞定位。PBS洗滌各組細胞后固定與載玻片上。激光共聚焦顯微鏡檢測GFP蛋白，見PNAS-2-GFP-pcDNA3質粒轉染的U937白血病細胞中GFP融合蛋白不均勻分布于整個細胞(如圖8a所示)，其在細胞核區(qū)的融合蛋白分布與文獻報道的PNAS-2同源蛋白CHMP5在Cos-7細胞(為非洲綠猴腎臟細胞)中的分布(如圖8b所示)相似，但細胞漿中彌漫分布的GFP融合蛋白明顯比圖8b要多。綜合文獻(DianeMcVeyWard,MichaelB.Vaughn,ShellyL.Shiflett,etal.TheRoleofLIP5andC腹P5inMultivesicularBodyFormationandHIV-1BuddinginMammalianCellsTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY2005.Vol,280,No.11:p.10548-10555.)報道及激光共聚焦顯微鏡檢測圖像，PNAS-2蛋白在白血病細胞中不僅僅定位于細胞核周的小囊泡結構，還彌漫分布于細胞漿中。而GFP-pcDNA3及His-GFP-pcDNA3轉染組的結果相似，GFP融合蛋白均彌漫分布于細胞漿及細胞核中。文獻(DianeMcVeyWard,MichaelB.Vaughn,ShellyL.Shiflett,etal.TheRoleofLIP5andC畫P5inMultivesicularBodyFormationandHIV-1BuddinginMammalianCellsTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY2005.Vol.280,No.11:p.10548-10555.)報道CHMP5-DsRed或CHMP5-GFP在Cos-7細胞中局限分布于核周的小囊泡我們發(fā)現(xiàn)PNAS-2-GFP融合蛋白在U937白血病細胞株中不僅僅存在于細胞核周的小囊泡，還彌漫分布于細胞漿內，說明了PNAS-2蛋白在U937白血病細胞株中的定位與文獻報道不一致。由于CHMP5/PNAS-2參與多泡體(MVB)的組成，而MVB是局限分布于細胞漿的，由此可見PNAS-2蛋白的應該是較局限定位于細胞漿而非彌漫性分布于細胞漿中的。因此，PNAS-2蛋白在U937細胞中的亞細胞定位很可能存在異常。PNAS-2-GFP融合蛋白在U937白血病細胞株中的彌漫分布提示了PNAS-2蛋白不僅作為構成成份存在于MVB結構中，還可能獨立存在于細胞漿中。大量文獻表明蛋白質定位的異常可參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如TRAF4基因在乳腺癌細胞中存在異常高表達，表明其參與惡性腫瘤的發(fā)生。而且還有實驗發(fā)現(xiàn)TRAF4蛋白正常情況下定位于細胞漿，但在絕大多數的乳腺癌患者中TRAF4蛋白則定位于細胞核中，提示TRAF4蛋白的異常定位腫瘤的發(fā)病有關(KrajewskaM,KrajewskiS,ZapataJM，etal.TRAF-4expressioninepithelialprogenitorcells.Analysisinnormaladult,fetal,andtumortissues.Am.J.Pathol.,1998.152:p.1549隱1561.;RegnierC.H.,TomasettoC,Moog-LutzC.，etal.PresenceofanewconserveddomaininCART1,anovelmemberofthetumornecrosisfactorreceptor-associatedproteinfamily,whichisexpressedinbreastcarcinoma.J.Biol.Chem.，1995.270:p.25715-25721.)。與之類似，PNAS-2蛋白在急性白血病細胞株中存在的亞細胞定位異常也參與了白血病的發(fā)生。實施例4抑制本發(fā)明的凋亡相關基因PNAS-2表達對白血病治療效果的研究由于上述實驗結果表明PNAS-2基因為抗細胞凋亡基因，且是在白血病中存在特異性高表達的新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，因此我們應用RNA干擾技術，研究抑制凋亡相關基因PNAS-2表達對白血病的治療作用。l.靶向PNAS-2基因的特異性shRNA質粒載體的構建1.1shRNA序列的設計將我們行5'RACE后得到的PNAS-2全長序列1輸入Genescript公司的在線shRNA設計軟件"siRNATargetFinder"，軟件自動分析和顯示候選shRNA并最終構建出插入片段。根據文獻報道的shRNA設計原則和經驗，進一步在候選shRNA中篩選最佳者，并在Blast中對靶序列進行同源性分析，排除shRNA非特異性抑制其它基因片段的可能，最終確定3條高度特異性針對PNAS-2的19nt片段，并設計了不與人體任何mRNA序列配對的對照組序列。我們在上游DNA模板單鏈前加上限制性內切酶BamHI的酶切位點序列，下游DNA模板單鏈前加上限制性內切酶HindIII的酶切位點序列，這樣相應的2條DNA模板單鏈退火后形成的5'及3'末端能直接與BamHI及Hindin限制性內切酶雙酶切后的pRNATU6.1/NEO相連接。shRNAI的設計位點F:5'GATCCCGr爿a4GC4GA4TCC爿TT04ttcaagagaTTUGCrCTTTTTTCCAAA3'下劃線部位為BamHI的酶切位點；小寫字部分為環(huán)結構(loop結構)；斜體字部分為PNAS-2特異的靶序列；下同。R::>i丄11iA1L^uA丄lLrAtctcttgaaTCAATGGATTCTGCTCTACGGG3'粗體字部位為HindIII的酶切位點，下同。shRNAII的設計位點F:5'GATCCC4CG7UGC4Grr^rttcaagagaJCrGCG爿crC4GrGC7TTTTTTCCAAA3'ATAACTGCGACTCAGTGCTGGG3'。shRNAIII的設計位點F:5'GATCC爿7T7UG爿7TGCC爿C404ttcaagaga7CTJ7TCTTTTTTCCAAA3'TCTGTGGCAATCCAAATTCGGG3'。shRNAcontrol的設計^[立點F:5'GATCCCG7TCrCC04XCGTGrC4CGTttcaagagaXCG爿TTTTTTCCAAA3'ACGTGACACGTTCGGAGAAGGG3'。上述DNA模板單鏈均由上海博亞生物工程公司合成。1.2退火建立20pl反應體系DNA模板單鏈F、R各lpl，20xSSC1|il，ddH2017nl，混勻，95t:加熱10min;取出后室溫放置1小時。1.3pRNATu6.1/NEO雙酶切:'shRNA表達質粒載體pRNATU6.1/NEO購自Genescript公司，使用限制性內切酶BamHI及HindIII(均為MBI公司)雙酶切shRNA表達質粒載體pRNATU6.1/NEO，酶切產物行瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化后回收(操作同前)。BamHI及HindIII雙酶切反應體系10xY+/Tango4^，pRNATU6.1/NEO空質粒載體2pl，BamHI(lOu/^il)2pl，HindIII(10u/pl)2pi,ddH201037。C孵育6小時。1.4連接T4連接酶(MBI公司)反應體系為10pl，包括退火后的sh認A插入片斷3111，酶切后的pRNATU6.1/NE03|il，10xT4LigaseBuffer1^1，T4連接酶lpl，ddH202|il，混勻后，置22。C孵育16h。1.5感受態(tài)細胞的轉化及陽性菌落的篩選取新鮮TOPO10化學感受態(tài)菌200)il,加2W連接產物，小心混勻，冰上放置10min。42。C熱休克30秒，冰上放置2min后加入250plS.O.C培養(yǎng)基，置于細菌搖床37°C200rpm振搖2h。取40pl菌液涂于含50pg/W氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37'C孵育過夜。1.6PCR及測序鑒定孵育24后挑選典型的單個菌落入3ml含100!ig/^il氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C200rpm振搖培養(yǎng)過夜，取菌液2pl進行PCR，上游引物5'TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG3'，下游引物5'TAGAAGGCACAGTCGAGG3'。94°C4min;94°C45s，55°C45s，72°C45s，進行30個循環(huán)，最后72"延伸10min結束反應。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，菌落PCR的結果提示質粒構建成功。取2ml經菌落PCR鑒定的菌液，送上海博亞生物工程公司測序，測序結果表明質粒構建成功。2.細胞轉染及篩選質粒抽提采用Qiagen公司的QIAprepSpinMiniprepKit,抽提質粒方法同前。定量后各耳又1M"g，使用Superfecttransfectionreagent(貝勾自Qiagen公司)轉染重組質粒至U937，HL-60等白血病細胞，轉染步驟同前。實驗分5組，shRNAcontrol組、shRNAI組、shRNAII組、shRNAIII組及未轉染組。轉染48h后加含500嗎/mlG418及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液2ml進行篩選，3周后可見轉染組均有分裂相細胞并形成集落，而未轉染組細胞均死亡。將轉染組細胞由24孔板轉至6孔板及細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。根據pRNATU6.1/NEO質粒帶GFP這一特點，在藥物篩選后第28天使用流式細胞儀(BectonDickinson公司)分選出GFP陽性細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。3.半定量PCR鑒定shRNA封閉效果TRIZOL法抽提shRNAcontrol組、sh脂AI組、shRNAII組、shRNAIII組細胞總RNA，使用SuperscriptIII逆轉錄酶(購自Invitrogen公司)按說明書進行逆轉錄。PCR使用的PNAS-2上游引物為5'TGCTCAAGATGAACCGACTCT3'，下游引物；5'GTGGGAACACCTTCTGGAAT3'。以(3-actin為內參照，上游引物為5TCGACAACGGCTCCGGCAT3'，下游引物5'AAGGTGTGGTGCCAGATTTTC3'。94°C2min;94°C45s，55°C45s，72°C45s，進行30個循環(huán)；72°C10min結束反應。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后使用復日凝膠成像系統(tǒng)分析PNAS-2及卩-actin的灰度值。結果顯示shRNAI組中PNAS-2的抑制效果最佳，PNAS-2的表達下降了80%以上，shRNAII組中，PNAS-2的表達下降了75%以上，(如圖9所示，可見shRNAI組及shRNAII組轉染的U937細胞中PNAS-2的抑制效果佳)，故我們使用shRNAI組和II組質粒研究其對白血病的治療作用。4.治療效果的評定4.1抑制PNAS-2后對細胞周期的影響我們發(fā)現(xiàn)shRNAI組轉染細胞在培養(yǎng)時增殖較對照組細胞要慢，.提示抑制PNAS-2后存在細胞周期阻滯，因此我們進行了細胞周期分析。取對照組及shRNAI干擾組細胞U937細胞各2Xl()6/m1,1500rpm5分鐘離心后棄上清，加入4。C儲存的PBS1.5ml并搖勻。加入一2(TC儲存的無水乙醇1ml慢滴慢搖，再加入一2(TC無水乙醇1ml來回搖勻，1500rpm5分鐘離心后棄上清。用70。/。lXPBS固定細胞，12h室溫過夜后1500rpm5分鐘離心后棄上清，搖勻。PBS2ml洗滌細胞后1500rpm5分鐘離心后棄上清，搖勻。用r^RNA酶100—200ul37。C水浴15分鐘后上機檢測。通過流式細胞儀發(fā)現(xiàn)對照組和干擾組的G1期分布無顯著性差異(P>0.05)。兩組細胞的S期分布也無明顯變化。shRNAI干擾組的G2期細胞明顯增多，說明出現(xiàn)了細胞周期阻滯，經統(tǒng)計后顯示顯著性差異(P<0.05)，即抑制PNAS-2后，細胞周期中出現(xiàn)了G2期阻滯(如圖10所示)。HL-60等白血病細胞的結果與U937白血病細胞的結果一致。4.2抑制PNAS-2后細胞凋亡率的變化流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測方法同前。綜合三次實驗結果，流式細胞儀檢測示shRNA對照組的凋亡率為3.52±1.25%，而shRNAI組的細胞凋亡率增加至12.00±0.54%，兩者有顯著統(tǒng)計學差異(PO.Ol)，shRNAII組的細胞凋亡率增加至8.85±1.80%，兩者有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。激光共聚焦顯微鏡檢測示shRNA對照組的細胞凋亡率為5.5%，shRNAI組的細胞凋亡率為14.7%，shRNAII組的細胞凋亡率為13.8%。(如圖11所示，可見抑制PNAS-2后細胞凋亡率上升。)HL-60等白血病細胞的結果與U937白血病細胞的結果一致。表明抑制PNAS-2表達后可促使白血病細胞發(fā)生凋亡。4.3抑制PNAS-2后的抑癌蛋白及凋亡相關蛋白的變化如圖12所示，應用WesternBlot(方法同前)檢測了shRNAI組與對照組轉染細胞中剪切型Caspase3(單抗購自R&D公司)，AIF(單抗購自abcam公司)，GranzymeB(單抗購自Clontech公司)，p53(單抗購自R&D公司)，Rb(單抗購自CST公司)等蛋白的變化。發(fā)現(xiàn)抑制PNAS-2表達后剪切型Caspase3、AIF及GranzymeB的含量上升，表明抑制PNAS-2表達后細胞凋亡增加，凋亡通路中AIF介導的途徑及GranzymeB—Perforin通路激活。抑制PNAS-2表達后p53及Rb等抑癌蛋白含量的顯著增加，加之能避免白血病細胞發(fā)生"免疫逃避"的GranzymeB—Perforin通路的激活，是PNAS-2特異性shRNA治療白血病有效的機制之一。由此我們可知，本發(fā)明應用RNA干擾技術抑制PNAS-2對白血病治療有效。具體表現(xiàn)為白血病細胞的凋亡率顯著增加；細胞周期中出現(xiàn)了G2期阻滯，從而使細胞有機會修復損傷的DNA，確?；虻臏蚀_遺傳，阻滯白血病細胞的增殖；而p53，Rb等原先受到抑制的抑癌蛋白含量的增加，也是抑制PNAS-2表達對白血病治療有效的原因之一。序列表<110〉上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院王，海嶸陳，芳源<120>—種凋亡相關基因及以其為靶點用于治療白血病的藥物<160>3<170>Patentlnversion3.1<210>1<211〉1040<212>DNA<213>PNAS-2-l<400>1ttccgtttctggttttgctctagtgtttgggtttcttcgcggctgctcaagatgaaccga60ctcttcgggaaagcgaaacccaaggctccgccgcccagcctgactgactgcattggcacg120gtggacagtagagcagaatccattgacaagaagatttctcgattggatgctgagctagtg180aagtataaggatcagatcaagaagatgagagagggtcctgcaaagaatatggtcaagcag240犯昭ccttgcg紹tttta犯gcaaaagaggatgtatg昭cagcsgcgggacaatcttgcc300caacagtcattcaacatggaacaagccaattataccatccagtctttgaaggacaccaag360accacggttgatgctatgaaactgggagtaaaggaaatgaagaaggcatacaagcaagtg420aagatcgaccagattgaggatttacaagaccagctagaggatatgatggaagatgcaaat480g,tcc犯g犯gcactgagtcgcagttatggcaccccagaactggatgaagatgattta540gaagcagagttggatgcactaggtgatgagcttctggctgatgaagacagttcttatttg600gatgaggcagcatctgcacctgcaattccagaaggtgttcccactgatacaaaaaacaag660gatggagttctggtggatgaatttggattgccacagatccctgctteatagatttgcatc720attcaagcatatcttgtaaaacaaacacatattatgggactaggaaatatttatctttcc780aaatttgccataacagatttaggtttctttcctttctttgaaggaaagtttaattacatt840gctcttttattttttccatttaagagactcattgcttgggaaatgctttcttcgtactaa900atttgatttccttttttcttatgaaaaacgaactcagtttaaaagttttttaagctcgta960tgacttgttttcattca1toateataattg幼t肌aacta3gg犯tggg3犯犯aaa犯31020a犯肌犯犯3肌3aaaa犯a1040<210〉2<211>1019<212〉DNA<213〉PNAS-2-2<400>2agtgtttgggtttcctcgcggctgctcaagatgaaccgactcttcgggaaagcgaaaccc60aaggctccgccgcccagcctgactgactgcattggcacggtggacagtagagcagaatcc120attgacaagaagatttctcgattggatgctgagctagtgaagtataaggatcagatcaag180aagatgagagagggtcctgcaaagaatatggtcaagcagaaagccttgcgagttttaaag240caaaagaggatgtatgagcagcagcgggacaatcttgcccaacagtcattcaacatggaa300caagccaattataccatccagtctttgaaggacaccaagaccacggttgatgctatgaaa360ctgggagtaaaggaaatgaagaaggcatacaagcaagtgaagatcgaccagattgaggat420toc肪gacc3gct堪3ggatetgatggaagatgcaaatg犯atcc肌gaagcactgagt480cgcagttatggcaccccagaactggatgaagatgatttagaagcagagttggatgcacta540ggtgatgagcttctggctgatgaagacagttcttatttggatgaggcagcatctgcacct600gcaattccagaaggtgttcccactgatacaaaaaacaaggatggagttctggtggatgaa660tttggattgccacagatccctgcttcatagatttgcatcattcaagcatatcttgtaaaa720caaacacatattatgggactaggaaatatttatctttccaaatttgccataacagattta780ggtttctttcctttctttgaaggaaagtttaattacattgctcttttattttttccattt840aagagactcattgcttgggaaatgctttcttcgtactaaatttgatttccttttttctta900tgaaaaacgaactcagtttaaaagttttttaagctcgtatgacttgttttcattcattaa960teat肌ttg3at犯aactaagg犯tgggaa犯^犯肌aaaa犯as犯aaaaaaaaaaa1019<210>3<211>219<212>PRT<213〉PNAS-2<400〉3MetAsnArgLeuPheGlyLysAlaLysProLysAlaProProProSer151015LeuThrGlyCyslieGlyThrValAspSerArgAlaGluSerlieAsp202530LysLyslieSerArgLeuAspAlaGluLeuValLysTyrLysAspGin354045lieLysLysMetArgGluGlyProAlaLysAsnMetValLysGinLys505560AlaLeuArgValLeuLysGinLysArgMetTyrGluGinGinArgAsp65707580859095GinSerLeuLysAspThrLysThrThrValAspAlaMetLysLeuGly100105110ValLysGluMetLysLysAlaTyrLysGinValLyslieAspGinlie115120125GluAspLeuGinAspGinLeuGluAspMetMetGluAspAlaAsnGlu130135140lieGinGluAlaLeuSerArgSerTyrGlyThrProGluLeuAspGlu145150155160AspAspLeuGluAlaGluLeuAspAlaLeuGlyAspGluLeuLeuAla165170175AspGluAspSerSerTyrLeuAspGluAlaAlaSerAlaProAlalie180185190ProGluGlyValProThrAspThrLysAsnLysAspGlyValLeuVal195200205AspGluPheGlyLeuProGinlieProAlaSer21021權利要求1.一種凋亡相關基因，其特征在于所述的基因含有SEQIDNO1或者SEQIDNO2所示的堿基序列。2.—種抑制權利要求1所述的凋亡相關基因的RNA干擾的靶序列，其特征在于含有G71GC4GA4TCC乂7TCL4或者C4C704gc4Grr^T的堿基序列。3.—種載體，含有至少一種抑制權利要求1所述的凋亡相關基因的RNA干擾的耙序列。4.如權利要求3所述的一種載體，其特征在于含有RNA干擾的靶序列5.如權利要求3所述的一種載體，其特征在于含有RNA干擾的靶序列爿gC4CGrcGC4Grrf。6.—種細胞，含有權利要求2所述的RNA干擾的靶序列。7.—種細胞，含有權利要求3所述的載體。8.—種用于治療白血病的藥物，含有有效量的權利要求2所述的RNA干擾的靶序列、或者權利要求3所述的載體、或者權利要求6所述的細胞、或者權利要求7所述的細胞。9.如權利要求8所述的一種用于治療白血病的藥物，其特征在于所述的藥物的劑型為醫(yī)學上認可的任何一種劑型。10.如權利要求9所述的一種用于治療白血病的藥物，其特征在于所述的藥物的劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。全文摘要本發(fā)明提供了一種凋亡相關基因，所述的基因含有SEQIDNO1或者SEQIDNO2所示的堿基序列。本發(fā)明還提供了一種載體，所述的載體中含有至少一種抑制上述所述的凋亡相關基因的RNA干擾的靶序列。本發(fā)明還提供了一種細胞，所述的細胞中含有上述所述的載體。本發(fā)明還提供了一種用于治療白血病的藥物，所述的藥物中含有有效量的上述所述的RNA干擾的靶序列、或者(含有上述所述RNA干擾靶序列的)載體或者上述所述的細胞。本發(fā)明應用RNA干擾技術抑制PNAS-2，對白血病治療具有顯著的效果。文檔編號A61P35/00GK101333530SQ20071004342公開日2008年12月31日申請日期2007年6月29日優(yōu)先權日2007年6月29日發(fā)明者王海嶸,陳芳源申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院