專利名稱：：柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥柴胡總多糖新的藥用用途。具體涉及柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,SLE)是一種病因不甚明確的炎性結(jié)締組織病，主要發(fā)病在女性，也可累及兒童。一項(xiàng)多國(guó)多中心研究表明，目前系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病率為12.5/10萬39/10萬。SLE通常被視為代表性的自身免疫病，是一種難治的、反復(fù)發(fā)作、致死率高的嚴(yán)重自身免疫病。SLE自身免疫異常的表型具有高度多樣性，幾乎涉及整個(gè)免疫系統(tǒng)，包括免疫耐受缺損、淋巴細(xì)胞凋亡障礙、T或B細(xì)胞功能調(diào)節(jié)障礙、NK細(xì)胞功能缺損、補(bǔ)體缺陷、自身抗原抗體形成的免疫復(fù)合物清除障礙、細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)障礙等。除皮膚、粘膜外，常累及腎臟、心臟、肝臟、肺以及神經(jīng)系統(tǒng)等內(nèi)臟器官，常伴有發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)痛等全身癥狀，并在血液中存在多種抗自身抗體，是一種累及多系統(tǒng)、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病程遷延反復(fù)的自身免疫性疾病。補(bǔ)體系統(tǒng)在自身免疫性疾病的預(yù)防及疾病損傷中,起著所謂"雙刃劍〃的作用。一方面,補(bǔ)體系統(tǒng)功能的正常，可以有效地促進(jìn)循環(huán)免疫復(fù)合物的運(yùn)送及清除:另一方面，補(bǔ)體系統(tǒng)功能的缺陷,包括組分的缺失或功能的失常,又會(huì)參與對(duì)組織的損傷。SLE活動(dòng)期患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞活性增強(qiáng)，產(chǎn)生大量抗自身尤其是抗ds-DNA抗體，與自身抗原在體內(nèi)形成大量免疫復(fù)合物，活化補(bǔ)體，消耗大量補(bǔ)體C3和C4成分，使C3，C4降低。而非活動(dòng)期SLE患者B淋巴細(xì)胞活性基本正常，體內(nèi)自身抗體水平也基本正常，補(bǔ)體消耗減少，使補(bǔ)體正常或輕度偏高。因此，血清中高Ig，低補(bǔ)體C3，C4是SLE活動(dòng)性的重要指標(biāo)。補(bǔ)體活化造成的III型變態(tài)反應(yīng)的直接作用和對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響可加重SLE的病理損害，影響SLE病程的發(fā)展和臨床表現(xiàn)。由于SLE患者體內(nèi)產(chǎn)生大量的循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于組織、器官等，尤其是腎臟，?？梢鹉I小球腎炎(即狼瘡性腎炎)。一旦免疫復(fù)合物沉積于腎組織內(nèi)即激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引起一系列的免疫損傷反應(yīng)(in型變態(tài)反應(yīng))血管內(nèi)凝血因子的激活，毛細(xì)血管通透性增加，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，局部組織細(xì)胞的壞死，蛋白溶解或裂解酶的大量釋放，以及一系列調(diào)節(jié)腎小球細(xì)胞增殖、基質(zhì)增生的細(xì)胞因子的釋放等等，從而產(chǎn)生腎臟的各種病理變化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的腎臟病變稱為狼瘡性腎炎(L叩usN印hritis，LN)。LN是SLE的重要臨床組成部分。SLE患者約35X90%有腎臟累及的臨床表現(xiàn)，如蛋白尿、紅、白細(xì)胞尿，管型尿及腎小管和小球?yàn)V過功能的變化。腎臟病理檢查發(fā)現(xiàn)90%患者在光鏡下可出現(xiàn)異常；采用免疫熒光或電鏡等復(fù)雜技術(shù)，幾乎所有SLE患者均有不同程度的腎臟累及。腎臟損害的嚴(yán)重程度與SLE的預(yù)后密切相關(guān)。多數(shù)SLE患者最終出現(xiàn)腎功能不全,嚴(yán)重影響著患者的生命(畢志剛，劉曉華.紅斑狼瘡現(xiàn)代診療.第l版[M].江蘇江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2000.98-100)。SLE的治療主要以對(duì)癥的長(zhǎng)期監(jiān)控治療為主,治療藥物主要為非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、性激素等治療藥物。盡管糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑能控制病情，但其長(zhǎng)期應(yīng)用產(chǎn)生的不良反應(yīng)也是患者致死原因之一。研究表明，高水平抗自身抗體和補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活所引發(fā)的免疫性組織損傷是SLE患者發(fā)病的重要機(jī)制，而且與SLE的發(fā)生與預(yù)后有顯著聯(lián)系。通過特異性抑制補(bǔ)體組成成分激活，降低抗ds-DNA抗體水平，有望提高治療SLE的臨床療效，減少不良反應(yīng)。臨床急需高效低毒的藥物來防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡。柴胡為常用中藥，為傘形科柴胡屬(Bupleurum)多種植物的根,具有疏散退熱、舒肝、升陽的功效，主治感冒發(fā)熱、寒熱往來、瘧疾、胸肋脹痛、月經(jīng)不調(diào)及子宮脫垂等癥。柴胡的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，迄今為止，己報(bào)道含有皂甙、揮發(fā)油、黃酮、甾醇、香豆素、糖類、木質(zhì)素、有機(jī)酸、多炔及生物堿等?，F(xiàn)代藥理研究證明柴胡具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用。文獻(xiàn)(張興權(quán)，陳鴻珊.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1989，3(1):31.)報(bào)道柴胡(5"p7e"r鵬c/7//7e/weDC)多糖能顯著增加脾系數(shù)；提高巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞功能；能提高病毒特異抗體滴度；能明顯增加淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和皮膚遲發(fā)超敏反應(yīng)，顯示免疫促進(jìn)作用。從狹葉柴胡(^//^e"r鵬sco/^/7eri/Wi湖Willd)中分離出的黃酮和皂苷顯示良好的免疫抑制活性(WenJC,LiWC，JennHL，etal.Phytochmistry,2003,64:1375.)。從其他柴胡(及/z^e〃r:朋/a化at鵬L)中分出的柴胡多糖IIb能抑制補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑激活所致的溶血反應(yīng)，顯示免疫抑制作用(YamadaH,RaKS，KiyoharaH,etal.CarbohydrRes，1989,189:209.)。但未涉及對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的作用。綜觀國(guó)內(nèi)外的研究，均未見報(bào)道柴胡總多糖的防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥效及其藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供中藥柴胡總多糖新的藥用用途，具體涉及柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。本發(fā)明從中藥柴胡中分離提取得到總多糖提取物。所述總多糖提取物經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)有較強(qiáng)抗補(bǔ)體活性，整體動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)其具有很強(qiáng)的防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡作用。本發(fā)明所述的中藥柴胡包括柴胡(v9叩7e"r腿c力i/e/weDC)，狹葉柴胡(ie"7xwscor加"eri/b7i"j77Willd)禾口小葉黑柴胡(j9〃/x/e"ir//z75TW't力i/Wolff)。本發(fā)明的目的通過下述方法實(shí)現(xiàn)1、制備柴胡總多糖柴胡藥材以95%乙醇冷浸提取，濾過，藥渣于室溫下置通風(fēng)處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80%，離心，沉淀冷凍干燥即得總多糖提取物，收率達(dá)3%以上，多糖含量超過65%。2、柴胡總多糖用于防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣綜合征試驗(yàn)按常規(guī)方法，選用昆明種和BALB/c小鼠，以空腸彎曲菌滅活菌株免疫，建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡綜合征模型。柴胡總多糖灌胃給藥。將試驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束處理后，觀察動(dòng)物的血清中抗體水平及尿蛋白水平。取腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變，取脾和胸腺測(cè)定器官指數(shù)。結(jié)果證實(shí)，柴胡總多糖對(duì)小鼠狼瘡樣綜合征引起的腎損傷有明顯的保護(hù)作用。整體試驗(yàn)證實(shí)柴胡總多糖對(duì)小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡有防治作用。圖1是SLE模型小鼠(昆明種)尿蛋白水平。圖2是SLE模型小鼠(昆明種)抗ds-DNA抗體水平。圖3是空白對(duì)照組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖4是模型對(duì)照組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖5是SLE模型組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖6是柴胡多糖給藥組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖7是陽性對(duì)照(潑尼松)組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖8是SLE模型小鼠(BALB/c)尿蛋白水平。圖9是SLE模型小鼠(BALB/c)抗ds-DNA抗體水平。圖10是SLE模型小鼠(BALB/c)抗組蛋白抗體水平。圖ll是空白對(duì)照組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖12是模型對(duì)照組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖13是SLE模型組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖14是柴胡多糖(30mg/kg)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖15是柴胡多糖(15mg/kg)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖16是陽性對(duì)照(潑尼松)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取柴胡藥材100g，以95%乙醇冷浸提取，藥渣于室溫下置通風(fēng)處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以S三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積加乙醇至含醇量80%，離心，沉淀冷凍干燥即得總多糖，產(chǎn)物收率達(dá)3%以上，多糖含量超過65%。所述的柴胡藥材可選自柴胡(5"/7eyr咖c/yy7朋seDC)，狹葉柴胡(5"/7e"r鵬sco/^o/ejy'/b7i鵬Willd)或小葉黑柴胡(5";7e〃r柳57wY/j7Wolff)。表1是柴胡總多糖收率及含量。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2昆明種小鼠30只(16—20g)，隨機(jī)分為5組(A、B、C、D、E組)。A組為正常對(duì)照組，B組為模型對(duì)照組，C組為SLE模型組，D組為柴胡多糖組，E組為醋酸潑尼松組。初次免疫，A組為正常對(duì)照組，尾根部皮下注射生理鹽水，B組為模型對(duì)照組，尾根部皮下注射弗氏完全佐劑，其余各組以空腸彎曲菌配合弗氏完全佐劑尾根部皮下注射，免疫誘導(dǎo)SLE樣綜合征，每只小鼠注射量為50Ul。初次免疫后第14天加強(qiáng)免疫l次A組和B組皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射空腸彎曲菌菌懸液，每只小鼠注射量為0.2ml。小鼠在免疫當(dāng)天開始灌胃給藥，每天一次至第32天。D組柴胡多糖給藥劑量為30mg/kg，E組醋酸潑尼松組給藥劑量為5mg/kg，B組和C組均給予配藥用空白賦形劑(5%羧甲基纖維素鈉，CMC),A組不灌胃。小鼠于免疫后d32，摘眼球放血處死，取血測(cè)定血清抗自身抗體水平，檢測(cè)免疫功能。取腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。病理損傷評(píng)級(jí)，按損傷的嚴(yán)重程度分為輕、中、重度，分別給l、2、3分，無病理損傷給O分。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和模型對(duì)照組相比，SLE模型鼠的尿蛋白明顯升高，柴胡多糖對(duì)SLE樣綜合征小鼠尿蛋白有明顯的降低作用(附圖1)。與正常對(duì)照組和模型對(duì)照組相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗體水平明顯升高，柴胡多糖對(duì)SLE樣綜合征小鼠抗ds-DNA抗體水平有明顯的降低作用(附圖2)。腎病理檢測(cè)顯示，正常組小鼠腎臟正常，模型對(duì)照小鼠基本正常。模型組小鼠腎臟均有炎性細(xì)胞侵潤(rùn)、腎小球增大和腎小球囊腔縮小。柴胡多糖給藥組僅有一只小鼠腎臟有腎小球部分增大，腎小球囊腔縮小，無炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。陽性對(duì)照藥強(qiáng)地松僅有一只小鼠的腎小球部分增大、囊腔縮小，伴炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。結(jié)果表明，柴胡總多糖在體內(nèi)抑制ds-DNA抗體水平，降低尿蛋白水平，明顯改善腎小球的增大，抑制炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，有緩解SLE樣小鼠腎損傷作用。表2是昆明種小鼠腎病理損傷評(píng)級(jí)(X土SD)(n=25)。表2組別數(shù)量腎小球炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腎小球囊腔縮小正常60±0氺氺0±0**模型對(duì)照60.2±0.4林0.2±0.4林SLE模型60.8±0.41±0柴胡多糖(30mg/kg)60±0**0.2±0.4**潑尼松(5mg/kg)_^_Q.2士0.4林_0.2±0.4**其中，求與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01。實(shí)施例3BALB/c小鼠48只(16—20g)，隨機(jī)分為5組(A、B、C、D、E、F組)。A組為正常對(duì)照組(n=8)，B組為模型對(duì)照組(n=8)，C組為SLE模型組(n=10)，D組為柴胡多糖30mg/kg組(n=8)，E組為柴胡多糖15mg/kg組(n=8)，F(xiàn)組為醋酸潑尼松組(n=8)。初次免疫，A組為正常對(duì)照組，足跖部皮下注射生理鹽水，B組為模型對(duì)照組，足跖部皮下注射弗氏完全佐劑，其余各組以空腸彎曲菌配合弗氏完全佐劑足跖部皮下注射，免疫誘導(dǎo)SLE樣綜合征，每只小鼠注射量為50"1。初次免疫后第14天加強(qiáng)免疫1次A組和B組尾靜脈注射生理鹽水，其余各組注射空腸彎曲菌菌懸液，每只小鼠注射量為0.2ml。在免疫當(dāng)天開始給小鼠灌胃給藥，每天一次至第34天。D組柴胡多糖給藥劑量為30mg/kg，E組柴胡多糖給藥劑量為15mg/kg，F(xiàn)組醋酸潑尼松組給藥劑量為5mg/kg，B組和C組均給予配藥用空白賦形劑(5%羧甲基纖維素鈉，CMC)，A組不灌胃。免疫后第35天，取BALB/c小鼠血測(cè)定血清抗自身抗體水平。取小鼠胸腺、脾稱重，求器官指數(shù)。器官指數(shù)=臟器重(mg)/10g體重。取雙側(cè)腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。病理損傷評(píng)級(jí)，按損傷的嚴(yán)重程度分為輕、中、重度，分別給l、2、3分，無病理損傷給O分。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和模型對(duì)照組相比，SLE模型鼠的尿蛋白明顯升高，柴胡多糖30mg/kg對(duì)SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白有明顯的降低作用，柴胡多糖15tng/kg對(duì)SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白也有一定的降低作用(附圖8)。與正常對(duì)照組和模型對(duì)照組相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體水平明顯升高，柴胡總多糖30mg/kg對(duì)SLE樣綜合征小鼠升高的抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體水平有明顯的降低作用；柴胡總多糖15rag/kg對(duì)SLE樣綜合征小鼠的高抗ds-DNA抗體水平有一定的降低作用，但是與模型組相比沒有顯著性差異，但柴胡總多糖15rag/kg對(duì)SLE樣綜合征小鼠的高抗組蛋白抗體水平有明顯的降低作用(附圖9，10)。與正常小鼠和模型對(duì)照組相比，免疫使模型組小鼠的脾指數(shù)升高。與模型組相比，柴胡總多糖30mg/kg和陽性對(duì)照藥潑尼松均顯著性抑制小鼠免疫后脾指數(shù)升高，但潑尼松對(duì)脾指數(shù)有過度抑制作用，脾指數(shù)低于正常小鼠(p<0.001)，柴胡總多糖15mg/kg對(duì)小鼠脾指數(shù)無影響。與正常小鼠和模型對(duì)照組相比，免疫使模型組小鼠的胸腺指數(shù)升高。與模型組相比，陽性對(duì)照藥潑尼松能顯著性降低胸腺指數(shù)，柴胡總多糖30mg/kg和柴胡總多糖15mg/kg對(duì)胸腺指數(shù)無影響。表3是BALB/c小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(X土SD)(n=49)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中，承與SLE模型組比較P〈0.05;種與SLE模型組比較P〈0.01，林承與SLE模型組比較P〈0.001。腎病理檢測(cè)顯示，正常組小鼠腎臟正常，模型對(duì)照小鼠基本正常。模型組小鼠腎臟腎小球腫脹、腎小球囊腔縮小、腎小球細(xì)胞數(shù)的增多；與模型組小鼠相比，正常組小鼠腎小管正常，模型對(duì)照小鼠腎小管基本正常，模型組小鼠腎小管腫脹。柴胡總多糖30mg/kg對(duì)SLE樣模型小鼠的腎臟病變有明顯的改善作用，柴胡總多糖15mg/kg對(duì)SLE樣模型小鼠的腎臟病變有一定的改善作用(附圖ll,12，13，14,15)。表4是BALB/c小鼠腎病理損傷評(píng)級(jí)(X土SD)(n=49)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，*與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01。結(jié)果證實(shí)，柴胡總多糖在體內(nèi)能抑制SLE樣綜合征小鼠的抗自身抗體水平的升高(抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體)，改善小鼠的體液免疫應(yīng)答亢進(jìn),抑制脾腫大；柴胡總多糖在體內(nèi)能降低SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白水平，明顯改善腎小球和腎小管的病變，有緩解SLE樣小鼠的腎損傷作用，可制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物和防治自身免疫性疾病等藥物。權(quán)利要求1、柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，具體涉及柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性藥物中的用途。本發(fā)明從中藥柴胡中分離提取得到總多糖提取物，平均產(chǎn)物收率3.32％，多糖含量超過65％。所述總多糖經(jīng)整體動(dòng)物模型試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣綜合征小鼠的自身免疫反應(yīng)亢進(jìn)和腎損傷有明顯的保護(hù)作用，證實(shí)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣綜合征有防治作用?？芍苽浞乐蜗到y(tǒng)性紅斑狼瘡藥物和防治自身免疫性疾病等藥物。文檔編號(hào)A61P37/08GK101095708SQ20071004345公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年7月5日優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日發(fā)明者弘力,晗徐,錚王,章蘊(yùn)毅,陳道峰申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)