專利名稱：：一種由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領域：
，具體涉及一種可用于診斷或治療的由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，人類獲得了前所未有的治療疾病的手段即基因治療，其基本思路是將正常的遺傳物質(zhì)導入病人的體細胞并使之表達，產(chǎn)生有治療作用的蛋白質(zhì)，從而達到治療疾病的目的。基因治療的一個關(guān)鍵步驟即基因傳遞系統(tǒng)的建立，目的基因要借助載體——基因傳遞系統(tǒng)來達到轉(zhuǎn)染靶細胞的目的。目前在基因治療中應用較多的是脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移，其中陽性脂質(zhì)體(又稱陽離子脂質(zhì)體)具有毒性低、免疫原性以及潛在的致癌性都較低、轉(zhuǎn)移的核苷酸大小范圍廣(從寡核苷酸到人工染色體均可)且質(zhì)量控制較方便、制劑方法較簡單、劑量可控等優(yōu)勢。(KostarelosK,MillerAD.Synthetic,self-assemblyABCDnanoparticles;astructuralparadigmforviablesyntheticnon-viralvectors[J].ChemSocRev.2005,34(ll):970-994.)陽性脂質(zhì)體的基本組成是中性脂質(zhì)成分和陽性脂質(zhì)成分，其中中性脂質(zhì)成分起到穩(wěn)定雙層膜和降低陽性成分毒性的作用，同時提供陽性脂質(zhì)的細胞滲透功能。陽性脂質(zhì)成分，又稱細胞轉(zhuǎn)染素(Cytofectin)，是具有不同化學結(jié)構(gòu)的兩性分子，一般由帶正電的親水基團通過中間連接基團與疏水基團連接而成。陽性脂質(zhì)成分為整個脂質(zhì)體提供正電荷，而且具有在體外穩(wěn)定性好，在體內(nèi)可生物降解的特點。除了以上的基本組成，還可利用不同性能的材料，如多糖、親水性陽離子聚合物、寡肽、糖蛋白和表面活性劑等對脂質(zhì)體進行表面修飾，可調(diào)控其在生物體內(nèi)的過程從而提高其轉(zhuǎn)染效率。目前陽性脂質(zhì)體的制備方法通常是先將細胞轉(zhuǎn)染素和中性脂質(zhì)溶解混合，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入水或含水的混合溶液，再用漩渦和/或超聲振蕩的方式來制成脂質(zhì)體混懸液。(雷撼，陽離子脂質(zhì)體的研究進展[J].第三軍醫(yī)大學學報2005,27(24):2475-2477.)靶向治療也稱靶向給藥系統(tǒng)(targetingdrugsystem，TDS)，是指利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他活性物質(zhì)選擇性地運送到靶部位，把治療作用或藥物效應盡量限定在特定的耙細胞、組織或器官內(nèi)，而不影響正常細胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法。磁性脂質(zhì)體便是其中的一種形式磁性脂質(zhì)體是在脂質(zhì)體中摻入鐵磁性物質(zhì)制成，故當其進入體內(nèi)后，利用體外磁場的效應可以引導藥物在體內(nèi)定向移動和定位集中的靶向給藥，使其耙向性和專一性更強，診斷治療更加準確，快速，從而達到高效，速效，低毒的效果。磁性脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體具有被動靶向性，即其很容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取，通過正常生理過程運送至肝、脾、肺等器官，但到達其它的靶部位比較困難。基于這一特點，診斷學上，現(xiàn)已有將造影劑包入脂質(zhì)體來增強造影劑的組織或器官特異性方面的專利申請(發(fā)明名稱為"脂質(zhì)體"，申請?zhí)枮?5193097.4)。在包入脂質(zhì)體的造影劑中，超微超順磁性氧化鐵是一種具有磁場響應性能的磁共振耙向造影劑，將其包入脂質(zhì)體中制得的磁性脂質(zhì)體不僅具有靶向治療的作用，還具有造影的診斷學作用。磁性靶向脂質(zhì)體通常由鐵磁性物質(zhì)，抗癌藥物及脂質(zhì)體等組成，其制備方法主要有逆相蒸發(fā)法、凍融法及機械分散法等(李鐵福，鄧英杰，王雨青.磁性脂質(zhì)體的研究進展[J].藥學進展,2002,26(1):5-10.)。目前尚未見既用于診斷又用于基因治療的由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑，該靶向制劑不僅可用于診斷還可用于基因治療。本發(fā)明以上述
背景技術(shù)：
為基礎，制備得到包裹有造影劑且?guī)д姷闹|(zhì)體，并通過靜電作用使其與帶有目的基因的核酸形成復合物從而得到具有診斷及治療作用的靶向制劑。本發(fā)明提供一種由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑，其中包裹造影劑的脂質(zhì)體由中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚和造影劑組成，且中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚、造影劑的重量比為l一75:l—75:0—15:0—5:2—30份，脂質(zhì)體的平均粒徑是50—300nm，靶向制劑平均粒徑是50—500nm。上述中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、ot-生育酚、造影劑的重量比優(yōu)選為15—50:15—50:0—10:1—4:10—25份。上述中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚、造影劑的重量比最優(yōu)選為30:30:1:1:15份。上述靶向制劑中包裹造影劑的脂質(zhì)體所含的中性磷脂選自合成或半合成的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，或兩者的組合。上述靶向制劑中合成或半合成的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺選自以下材料中的一種或兩種以上的組合二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二棕櫚酰磷脂酰膽堿。上述靶向制劑中包裹造影劑的脂質(zhì)體所含的中性磷脂優(yōu)選為二油酰磷脂酰乙醇胺。上述耙向制劑中包裹造影劑的脂質(zhì)體所含的陽性脂質(zhì)選自以下材料中的一種或兩種以上的組合硬脂胺)、N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N—三甲基氯化銨、3p-[(N，,N，二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇、2，3二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基-N，N-二甲基-l-丙基三氟乙酸銨、1,2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺、二甲基雙十八烷基溴化胺。上述靶向制劑中包裹造影劑的脂質(zhì)體所含的附性脂質(zhì)優(yōu)選為3卩-[(N，,N二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇。本發(fā)明的靶向制劑中的造影劑是一種磁共振成像造影劑，優(yōu)選是含有三價鐵或二價鐵的鐵磁性物質(zhì)，最優(yōu)選是三氧化二鐵。本發(fā)明的耙向制劑中的核酸是質(zhì)粒DNA、寡核苷酸、雙鏈核酸化合物中的一種或其組合，最優(yōu)選是質(zhì)粒DNA。上述的質(zhì)粒DNA為APO-AI基因的重組表達載體、SR-BI基因的重組表達載體，或兩者的組合。本發(fā)明的另一目的是提供上述靶向制劑的制備方法。本發(fā)明以介導基因轉(zhuǎn)染的陽性脂質(zhì)體的基本組成以及磁性靶向脂質(zhì)體的制備方法為理論基礎，通過大量實驗，提供一種制備上述靶向制劑的方法將中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇與a-生育酚按重量比，溶于有機溶劑中并與造影劑溶液形成W/O乳劑，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸去有機溶劑，至凝膠形成，再加入分散介質(zhì)常溫下旋轉(zhuǎn)至懸液形成后進行均質(zhì)得到包裹造影劑的脂質(zhì)體；將制得的包裹造影劑的脂質(zhì)體混懸液與核酸溶液室溫下培育15min—24hr即得。整個操作過程為無菌操作。所述的均質(zhì)方法為過高壓均質(zhì)機、水浴超聲或者過聚碳酸酯膜。所述的有機溶劑是氯仿、乙醚、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、四氯化碳、二甲基亞砜或四氫呋喃中的一種或其組合。所述的分散介質(zhì)為注射用水、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、0.9。/。NaCl溶液或5y。葡萄糖溶液。使用Zetasizer納米粒徑及zeta電位分析儀(NANO-S，英國馬爾文儀器公司)測定本發(fā)明制得的靶向制劑平均粒徑分布在50—500nm，并呈正態(tài)分布(見圖1);〖-電位值在+30111￥以上(見圖2);高分辨透射電鏡(JEM-2010，日本電子株式會社)下觀察，可見該靶向制劑的外觀為圓形或似球形囊泡結(jié)構(gòu)，造影劑及質(zhì)粒DNA均包裹其中，且分散均勻，直徑分布在50—200nm;同時還在高分辨透射電鏡下對單個制備得到的靶向制劑用能譜分析儀(INCAOXFORD，英國OXFORD公司)進行分析，結(jié)果顯示制備得到的靶向性制劑體內(nèi)均含有硅和錳、鋅、鐵等成份，表明三氧化二鐵磁性物質(zhì)己被成功包入該靶向性制劑中(見圖3)。由此可見，本發(fā)明制得的靶向制劑結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、無毒、降解安全，完全符合靶向載體的要求。本發(fā)明通過將磁性物質(zhì)包入脂質(zhì)體中提高了脂質(zhì)體作為基因載體的靶向性，同時還因包裹有造影劑具備診斷學功能。該制劑在體內(nèi)的過程可以通過磁共振成像監(jiān)測到，并且因脂質(zhì)體的被動靶向性，某些病理學特征也可通過磁共振成像監(jiān)測到。例如動脈粥樣硬化的病理學特征之一即為不穩(wěn)定斑塊中含有大量的巨噬細胞，因此可利用該靶向制劑的被動靶向性實現(xiàn)對不穩(wěn)定斑塊的監(jiān)測及隨訪。圖1本發(fā)明制備的靶向制劑的粒徑分布2本發(fā)明制備的靶向制劑的zeta電位分布3透射電鏡下單個本發(fā)明制備的靶向制劑內(nèi)的能譜分析4A-5B動物實驗中對照組及基因治療組血管的病理切片5C-5D動物實驗中基因治療后肝組織的病理切片6A-6B動物實驗中基因治療后心、肺、脾、腎組織的病理切片圖具體實施方式現(xiàn)結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明作進一步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此?！钢苽浯判园邢蛑|(zhì)體1.1精確稱取二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，F(xiàn)luka公司)20mg，33-[N-(N，，N，-二甲氨基乙基)]氨甲?；?膽固醇(DC-Chol，Sigma公司)20mg，膽固醇(Chol，日本和光純藥工業(yè)株式會社)5mg以及a-生育酚(上海第二制藥廠)lmg于250ml圓底燒瓶中，加氯仿8ml使其完全溶解。1.2將三氧化二鐵酒石酸溶液加注射用水稀釋至5mg/ml細胞粉碎機(JY92-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司)中超聲(400w，每次5s，工作40次)，使其分散均勻，取1.5ml加入上述圓底燒瓶中，水浴超聲波清洗機(SK5200LH，上?？茖С晝x器有限公司)中超聲(500w)30min使其形成穩(wěn)定的W/0乳劑。1.3置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(N-1001D-WA，日本東京理化)上在室溫下，30rpm，0.09Mpa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，至凝膠形成。1.4加入Tris-HCl(美國Amresco公司)緩沖液10ml旋渦震蕩使凝膠脫落，置旋蒸儀上繼續(xù)旋蒸2hr至脂質(zhì)體混懸液形成。1.5置水浴超聲波清洗機中超聲(500w)2hr，制得包裹有造影劑(三氧化二鐵酒石酸溶液)的陽性脂質(zhì)體混懸液，使用Zetasizer納米粒徑及zeta電位分析儀(NANO-S，英國馬爾文儀器公司)測定脂質(zhì)體粒徑分布為50—250nm。2.構(gòu)建表達質(zhì)粒DNA2.1用TRIzol試劑(100mg/ml)從100mg大鼠肝組織中提取總RNA。并在低溫條件下(4°C)勻漿組織；將勻漿放置于153(TC水浴中5min，加入0.2ml氯仿并振蕩15s，放置于1530。C水浴中23min，隨后在低溫條件下(4°C)12000g/min離心15min;吸出上層水相，加入0.5ml異丙醇，置于1530。C水浴中10min，于低溫條件下(4。C)12000g/min離心10min;吸棄上清，加lml75X乙醇，短暫渦漩后于4°C7500g/min離心5min，取出并于室溫干燥10min;加入20)ilDEPC水溶解RNA于管底，一8(TC保存；2.2根據(jù)TAKARAOne-stepRT-PCR方法，用APO-AI引物P1、P2(P1:5，一AGGTACCGCCGCCACCATGAAAGCTGCAGTGTTG"3，，引入KpnI酶切點；P2:5，一TCTCGAGTCAAGCGTTCAGCTTCTTTTT一3,引入XhoI酶切點；上海生工生物技術(shù)服務有限公司合成)擴增出APO-AI的基因(李蘭松，李維琪，信學雷等.大鼠SR-BI胞外域與ApoA-I蛋白相互作用的確認[J].微生物學通報，2006，33(2):68—73.)。RT-PCR條件為:50°C30min、94°C4min預變性后，94°C40s、55°C40s、72°C1min進行40個循環(huán)，72。C7min后停止反應。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(購自Promega公司)連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1(購自Invitrogen公司)中，酶切鑒定，篩選陽性克隆pGEM-T/APO-AI,由上海博亞公司測序鑒定。2.3雙酶切pGEM-T/APO-AI,pcDNA3.1(+)(購自Invitrogen公司)，膠回收pcDNA3.1(+)大片段和APO-AI目的基因片段，16'C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM110，挑取生長良好的菌落，小量抽提重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/APO-AI。雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/APO-AI，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的蛋白基因表達載體在大腸桿菌中繁殖擴增后，抽取重組質(zhì)粒DNA。3.磁性脂質(zhì)體與質(zhì)粒的復合將上述制得的包裹有造影劑的脂質(zhì)體混懸液與質(zhì)粒溶液(重組表達載體pcDNA3.1(+)/APO-AI)等體積混合室溫下培育30min得到靶向制劑，粒徑分布為80—500nm。整個操作過程為無菌操作。實施例21.5將制得的脂質(zhì)體混懸液過高壓均質(zhì)機(Em-C3，加拿大Avestin公司)(15000psi，3個循環(huán))進行均質(zhì)，制得的包裹造影劑的陽性脂質(zhì)體粒徑分布為100—200nm。其余步驟同實施例l。實施例31.1精確稱取二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DOPC，日本油脂株式會社)20mg，3P-[N-(N，，N，-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-膽固醇(DC-Chol)30mg于250ml圓底燒瓶中加氯仿/乙醚(4，V/V)8ml使其完全溶解。1.2將三氧化二鐵酒石酸溶液加注射用水稀釋至3mg/ml細胞粉碎機中超聲(400w，每次5s，工作40次)，使其分散均勻，取1.5ml加入上述圓底燒瓶中，水浴超聲30min使其形成穩(wěn)定的W/O乳劑。1,4加入磷酸鹽緩沖液(pH7.4)10ml旋渦震蕩使凝膠脫落，置旋蒸儀上繼續(xù)旋蒸2hr至脂質(zhì)體混懸液形成。其余步驟同實施例1。實施例41.1精確稱取二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，日本油脂株式會社)30mg，1，2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化銨(DOTAP，Sigma公司)50mg于250ml圓底燒瓶中加氯仿/乙醚(4，V/V)8ml使其完全溶解。1.2將三氧化二鐵酒石酸溶液加注射用水稀釋至12mg/ml細胞粉碎機中超聲(400w，每次6s，工作50次)，使其分散均勻，取1.5ml加入上述圓底燒瓶中，水浴超聲30min使其形成穩(wěn)定的W/O乳劑。1.4加入5。/。葡萄糖溶液10ml旋渦震蕩使凝膠脫落，置旋蒸儀上繼續(xù)旋蒸2hr至脂質(zhì)體混懸液形成。其余步驟同實施例l。實施例51.5將制得的脂質(zhì)體混懸液分別過450nm以及220nm的碳酸酯膜，制得的包裹造影劑的陽性脂質(zhì)體粒徑分布為100_200nm。其余步驟同實施例4。實施例61.1精確稱取聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，日本油脂株式會社)40mg，2,3二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基-N,N-二甲基-l-丙基三氟乙酸銨(DOSPA，Sigma公司)60mg于250ml圓底燒瓶中加氯仿/乙醚(4，V/V)8ml使其完全溶解。1.4加入0.9%NaCl溶液10ml旋渦震蕩使凝膠脫落，置旋蒸儀上繼續(xù)旋蒸2hr至脂質(zhì)體混懸液形成。其余步驟同實施例1。實施例71.1精確稱取聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰膽堿(PEG-DPPC，日本油脂株式會社)50mg，十四烷基三甲基溴化胺(DTAB，Sigma公司)60mg于250ml圓底燒瓶中加氯仿/甲醇(4，V/V)8ml使其完全溶解1.2將三氧化二鐵酒石酸溶液加注射用水稀釋至4mg/ml細胞粉碎機中超聲(400w，每次5s，工作40次)，使其分散均勻，取1.5ml加入上述圓底燒瓶中，水浴超聲30min使其形成穩(wěn)定的W/0乳劑其余步驟同實施例1。實施例82.2根據(jù)TAKARAOne-stepRT-PCR方法，用SR-BI的引物P1、P2、P3、P4(P1:5，一AGGTACCGCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAG—3,KpnI酶切點；P2:5，_TGCCCTGGAGCTGACGCCTCCTCTGGATATTATGAC-3，；P3:5'—GTCATAATATCCAGAGGAGGCGTCAGCTCCAGGGCA—3，；P4:5，—TTCTAGATCACAGCTTGGCTTCTTGCAG~3'，弓l入Xbal酶切位點)擴增出SR-BI的基因(李蘭松，李維琪，、信學雷等.大鼠SR-BI胞外域與ApoA-I蛋白相互作用的確認[J].微生物學通報，2006，33(2):68—73.)。用SR-BI的引物1和2從含信號肽的質(zhì)粒擴增獲得信號肽。然后將信號肽基因和SR-BI基因進行Over-LapPCR獲得含信號肽的SR-BI重組基因。RT-PCR條件為50°C30min、94°C4min預變性后，94°C40s、55°C40s、72°C1min進行40個循環(huán)，72°C7min后停止反應。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，酶切鑒定，篩選陽性克隆pGEM-T/SR-BI，由上海博亞公司測序鑒定。2.3雙酶切pGEM-T/SR-BI，pcDNA3.1(+)，膠回收pcDNA3.1(+)大片段和SR-BI目的基因片段，16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM110，挑取生長良好的菌落，小量抽提重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/SR-BI。雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/SR-BI，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的蛋白基因表達載體在大腸桿菌中繁殖擴增后，抽取重組質(zhì)粒DNA。3.磁性脂質(zhì)體與質(zhì)粒的復合將上述制得的包裹有造影劑的脂質(zhì)體與質(zhì)粒溶液(重組表達載體pcDNA3.1(+)/SR-BI)等體積混合室溫下培育30min得到靶向性制劑，粒徑分布為80—500nm。整個操作過程為無菌操作。其余步驟同實施例1。實施例92.2、2.3、3同實施例8，其余步驟同實施例3。實施例103.磁性脂質(zhì)體與質(zhì)粒的復合將上述制得的包裹有造影劑的陽性脂質(zhì)體與質(zhì)粒溶液(重組表達載體pcDNA3.1(+)/AP0-AI和重組表達載體pcDNA3.1(+)/SR-BI的等質(zhì)量混合溶液)等體積混合室溫下培育30min得到靶向制劑，粒徑分布為160—450nm。整個操作過程為無菌操作。其余步驟同實施例1。實驗例11本發(fā)明建立了大鼠的動脈粥樣硬化的模型，并制備得到由包含Apo-A-I基因或SR-BI基因的耙向制劑，用該制劑對大鼠進行基因治療并檢測其療效。一.動物模型建立1.動物雄性Wistar大鼠42只，體重(210士10)g2.方法雄性Wistar大鼠喂食高脂飼料，即3°/。膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、8%豬油、83.3%基礎飼料。每日每只喂養(yǎng)飼料120g，均自由攝水。飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學清潔級動物房。二.對動物進行基因治療1.動物分組按照完全隨機的方法進行分組。共分四組，第一組(實施例1制得制劑》A組,12只，給予含Apo-A-I基因的靶向制劑；第二組(實施例8制得制劑)B組,12只，給予含SR-BI基因的靶向制劑；第三組(實施例IO制得制劑)C組,12只，給予含上述兩種基因的靶向制劑；第四組D組,6只，做為空白對照，給予生理鹽水。2.基因治療各基因治療組每只動物經(jīng)尾靜脈注入0.32ml包含基因的靶向制劑(相當于40Mg基因)，對照組每只動物亦經(jīng)尾靜脈注入0.32ml生理鹽水。治療后立刻在每只大鼠左腎上方綁縛銣鐵硼稀土磁鐵，并將動物固定在自制的木板上，4小時后取下。3.實驗動物基因治療后血生化指標的測定基因治療后，基因治療組及對照組動物分別在第3、6周清晨空腹，經(jīng)眼眶靜脈采血約2.0ml，6000rpm離心5min，取上層血清，測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)。測定在日立全自動生物化學分析儀上進行，所有數(shù)據(jù)均以(^士S)表示，組間平均數(shù)采用t檢驗(見表l)。與對照組比較，可見3周、6周各基因治療組的血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLC)明顯下降，統(tǒng)計學具有顯著差異性(P<0.01)，高密度脂蛋白(HDLC)明顯升高，統(tǒng)計學具有顯著差異性(P<0.01)。4.病理切片的制作以及動脈粥樣硬化斑塊變化的觀察對照組、基因治療組均于基因治療后3周、6周各處死6只大鼠，取出主動脈血管即心臟下方至腹主動脈分叉處約10cm，其中對照組2根血管，3周、6周各基因治療組2根血管，做大體病理標本油紅O染色，采用投影格子計數(shù)法分別計算每條主動脈內(nèi)膜總面積、胸腹主動脈內(nèi)膜面積以及油紅O染色陽性的脂質(zhì)條紋及隆起的纖維斑面積，求出各類病變面積百分比。其余血管做橫斷切片，做HE染色、油紅O染色(脂肪染色)及茜素紅染色(鈣質(zhì)染色)。對照組，D組(不含基因的磁性脂質(zhì)體復合物)83層，3周時實驗AJ且(含Apo-A-I基因的磁性脂質(zhì)體/DNA復合物)80層、實驗B}組86層、實驗d組83層、6周時實驗A2組82層、實驗B2組83層、實驗(32組88層。染色后切片由病理學專家判斷有無斑塊形成及斑塊形成的分期，判斷標準為；內(nèi)皮細胞及彈力板完整性；有無凸向管腔內(nèi)的斑塊；斑塊的內(nèi)部成分。大體病理觀對照組動物主動脈血管沿縱軸剪開，見血管管壁仍明顯僵硬增厚，血管內(nèi)膜表面多發(fā)不規(guī)則的紅色隆起。投影格子計數(shù)法分別計算每條主動脈內(nèi)膜總面積、胸、腹主動脈內(nèi)膜面積以及油紅O染色陽性的斑塊面積，求出各類病變面積百分比，脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為32.25%和1.66%。各基因治療組部分血管管壁稍僵硬，彈性有一定程度恢復，管壁略增厚，血管內(nèi)膜表面可見少量不規(guī)則的紅色隆起。投影格子計數(shù)法分別計算每條主動脈內(nèi)膜總面積、胸、腹主動脈內(nèi)膜面積以及油紅O染色陽性的斑塊面積，求出各類病變面積百分比，A組脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為9.17%和1.39%。B組分別為9.23%和1.13%、C組分別為9.21%和1.05%鏡下觀察對照組動物主動脈管壁結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，彈力板斷裂；血管內(nèi)皮細胞局灶性脫落，許多部位內(nèi)皮細胞呈增生性修復狀態(tài)，失去了其正常的單層有規(guī)律的結(jié)構(gòu)，而呈多層紊亂狀。脂質(zhì)斑塊鏡下可見內(nèi)膜下有富含脂質(zhì)的泡沫細胞。纖維斑塊的內(nèi)皮細胞增生明顯，纖維帽下可見大量泡沫細胞聚集，并斑塊突向管腔內(nèi)(見圖4A、4B)。各基因治療組動物顯示內(nèi)皮細胞局灶性脫落，并可見少量增生，排列稍紊亂，可見少許薄層斑塊存在，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細胞聚集，中層平滑肌細胞排列尚整齊(見圖4C-5B)。5.肝臟及其他臟器病理觀察取對照組、基因治療組肝組織，做橫斷面切片，進行HE染色、油紅O染色，觀察肝細胞脂質(zhì)沉積情況。取基因治療組心肌、肺臟、脾臟及腎臟做橫斷面切片，進行HE染色。對照組大鼠肝臟仍呈現(xiàn)乳黃色，油紅O染色可見肝細胞胞質(zhì)內(nèi)富含脂質(zhì)，呈強陽性?；蛑委熃M大鼠肝組織內(nèi)紅染脂質(zhì)顆粒減少(見圖5C、5D);HE染色發(fā)現(xiàn)心肌、肺臟、脾臟及腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常變化(見圖6A-6D)。說明基因治療是安全的，沒有影響其他臟器。6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用xz分析，各組分別清點有斑塊的切片數(shù)和無斑塊的切片數(shù)，采用SPSS11.5英文版軟件處理分析。對照組，D組83層，發(fā)現(xiàn)斑塊35層；3周時實驗Ai組80層切片中發(fā)現(xiàn)斑塊12層、實驗Bj且86層切片中發(fā)現(xiàn)斑塊15層、實驗G組83層切片中發(fā)現(xiàn)斑塊10層；6周時實驗AJ且82層切片中發(fā)現(xiàn)斑塊10層、實驗B2組83層切片中發(fā)現(xiàn)斑塊13層、實驗C2組88層切片中發(fā)現(xiàn)斑塊14層?；蛑委?周、6周各基因治療組與對照組的斑塊率的比較，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義(見表2、表3、表4)表l.對照組與基因治療組血生化檢査測定值(mmol/L，I±S)TCTGHDLLDL對照組10.68±0.231.28±0.320.23±0.014.20±0.510周3周10.68±0.301.31±0.170.22±0.034.19±0.266周10.69±0.141.33±0.240.23±0.114.21±0.18Apo-A-I組0周10.68±0.181.28±0.120.23±0.094.21±0.313周7.72±0,510.90±0.173.54±0.203.58±0.216周5.34±0.220.58±0.247.61±0.422.42±0.54SR-BI組0周10.67±0.131.28±0.190.23±0.124.21±0.113周7.73±0.400.88±0.203.56±0.323.64±0.346周5.30±0.120.56±0.117.59±0.332.37±0.51兩基因組0周10.68±0.251.29±0.300.22±0.134.20±0.203周7.69±0.330.90±0.143.53±0.182.87±0.156周.38±0.290.57±0.277.63±0.122.46士0.16表2.基因治療組A和對照組D切片發(fā)現(xiàn)斑塊率的比較A<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3周X2=14.6533，P<0.01;6周X2=18.6835，P<0.01，有統(tǒng)計學意義表3.基因治療組B和對照組D切片發(fā)現(xiàn)斑塊率的比較BD合計時間3周6周3周6周有斑塊的切片數(shù)15無斑塊的切片數(shù)71133570485048119118切片數(shù)總計8683833周X2:12.396，P<0.01;6周X2=14.185，P<0.01，有統(tǒng)計學意義表4.基因治療組C和對照組D切片發(fā)現(xiàn)斑塊率的比較CD合計時間3周6周3周6周有斑塊的切片數(shù)10無斑塊的切片數(shù)73143574484549121122切片數(shù)總計8388833周X2=19.0542，P<0.01;6周X2=14.4071，P<0.01，有統(tǒng)計學意義。權(quán)利要求1、一種由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑，其特征在于其中包裹造影劑的脂質(zhì)體由中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚和造影劑組成，且中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚、造影劑的重量比為l一75:1—75:0—15:0—5:2—30份，脂質(zhì)體的平均粒徑是50—300nm，靶向制劑平均粒徑是50—500nm。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向制劑，其特征在于所述的中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚、造影劑的重量比為15—50:15—50:0—10:1—4:10—25份。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向制劑，其特征在于所述的中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇、a-生育酚、造影劑的重量比為30:30:1:1:15份。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向制劑，其特征在于其中包裹造影劑的脂質(zhì)體所含的中性磷脂選自合成或半合成的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，或兩者的組合。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向制劑，其特征在于合成或半合成的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺選自以下材料中的一種或兩種以上的組合二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二棕櫚酰磷脂酰膽堿。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向制劑，其特征在于其中包裹造影劑的脂質(zhì)體所含的陽性脂質(zhì)選自以下材料中的一種或兩種以上的組合硬脂胺)、N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N—三甲基氯化銨、3(H(N，,N，二甲基胺乙基)胺基甲酰蜀膽固醇、2，3二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基-N,N-二甲基小丙基三氟乙酸銨、1，2-二油酰氧丙基-N,N，N-三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺、二甲基雙十八垸基溴化胺。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向制劑，其特征在于其中的造影劑是一種磁共振成像造影劑。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶向制劑，其特征在于其中的造影劑是含有三價鐵或二價鐵的鐵磁性物質(zhì)。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的靶向制劑，其特征在于其中的造影劑是三氧化二鐵。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向制劑，其特征在于其中的核酸是質(zhì)粒DNA、寡核苷酸、雙鏈核酸化合物中的一種或其組合。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的耙向制劑，其特征在于質(zhì)粒DNA為APO-AI基因的重組表達載體、SR-BI基因的重組表達載體，或兩者的組合。12、一種制備如權(quán)利要求1所述的靶向制劑的方法，其特征在于，將中性磷脂、陽性脂質(zhì)、膽固醇與a-生育酚按重量比，溶于有機溶劑中并與造影劑溶液形成W/O乳劑，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸去有機溶劑，至凝膠形成，再加入分散介質(zhì)常溫下旋轉(zhuǎn)至懸液形成后進行均質(zhì)得到包裹造影劑的脂質(zhì)體；將制得的包裹造影劑的脂質(zhì)體混懸液與核酸溶液室溫下培育15min—24hr即得。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備靶向制劑的方法，其特征在于，所述的均質(zhì)方法為過高壓均質(zhì)機、水浴超聲或者過聚碳酸酯膜。14、根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備靶向制劑的方法，其特征在于，所述的有機溶劑是氯仿、乙醚、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、四氯化碳、二甲基亞砜或四氫呋喃中的一種或其組合。15、根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備靶向制劑的方法，其特征在于，所述的分散介質(zhì)為注射用水、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、0.9。/。NaCl溶液或5。/。葡萄糖溶液。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領域：
，具體涉及一種可用于診斷或治療的由包裹造影劑的脂質(zhì)體及核酸組成的靶向制劑及其制備方法。本發(fā)明的靶向制劑可用于人體或動物疾病的治療或診斷，是先制備得到包裹造影劑的脂質(zhì)體，再將該脂質(zhì)體混懸液與核酸溶液室溫下培育15min-24hr，滅菌后即得。粒徑分布、電鏡觀察、zeta電位等測定結(jié)果均表明本發(fā)明制得的靶向制劑結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、無毒、降解安全，完全符合靶向載體的要求。同時本發(fā)明制備得到包含Apo-A-I基因或SR-BI基因的靶向制劑，用該制劑對大鼠進行基因治療并檢測其療效，結(jié)果表明，該靶向制劑具有很好的基因治療效果和較高的安全性。文檔編號A61K48/00GK101120921SQ20071004364公開日2008年2月13日申請日期2007年7月10日優(yōu)先權(quán)日2007年7月10日發(fā)明者何新紅,吳軼娜,悅張,揚張,瑩李,沈碧霞,鄭肖利,丹郭,陸建平,陳建明,馬小龍申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學