專利名稱：一種雞球蟲疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞球蟲疫苗的制備方法，是一種超聲波致弱強毒雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊的方法。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是一種分布很廣，危害性很大的腸道寄生原蟲病，它主要是由于艾美耳球蟲寄生于腸上皮細(xì)胞引起的疾病，它由艾美耳屬的九種球蟲所引起。病原隸屬頂復(fù)門，真球蟲目之艾美耳屬原蟲，其生活史分為裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個階段，前兩個階段在雞體內(nèi)進(jìn)行，后一階段在體外進(jìn)行，其間已經(jīng)孢子化的卵囊可經(jīng)口感染。在生產(chǎn)中，雞球蟲病不僅引起雛雞大批死亡，更為嚴(yán)重的是會明顯降低雞的生產(chǎn)性能，造成重大的經(jīng)濟損失，尤其對集約化養(yǎng)雞業(yè)更是如此。該病以出血性腸炎、血痢、雛雞高發(fā)病率和死亡率為特征，有時雛雞感染率高達(dá)80％以上，死亡率可達(dá)20％-50％，成為危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。
目前，對該病的防治主要有藥物防治法和疫苗控制法，其中藥物防治球蟲病主要是通過在飼料或飲水中拌混預(yù)防或治療劑量的抗球蟲藥來達(dá)到防治球蟲病的作用。常用的球蟲藥有磺胺喹噁啉(SQ4)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、氨丙琳、球痢靈、氯苯胍、敵菌凈、尼卡巴嗪、球痢靈、球蟲粉、澳氯常山酮以及喹諾酮類等，但長期使用藥物防治會造成抗藥株產(chǎn)生，防治價格昂貴。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使用疫苗來預(yù)防雞球蟲病的發(fā)生就成為既科學(xué)又經(jīng)濟的防治方法，具有良好的發(fā)展前景。目前國內(nèi)外已研制開發(fā)的雞球蟲疫苗有強毒株蟲苗、弱毒株蟲苗和球蟲基因工程苗等。其中，強毒株蟲苗以美國Dorn即dMitChel動物保健公司的混合卵囊球蟲疫苗Coccivac為代表，它在5-10日齡通過飲水或飼料給雞接種少量含有8種球蟲的混合卵囊，通過雞群繁殖后把子代卵囊播撒到墊料上，使雞群反復(fù)感染而不斷增強免疫力。但這種強毒蟲苗問世40多年來并沒有被廣泛使用，主要原因是其存在兩大缺陷一是存在于蟲苗中的各種球蟲株都是完全致病性的；二是由于混入飲水或飼料中的卵囊分布不均勻，造成雞群攝入卵囊量的不一致，結(jié)果有的雞感染太輕，不足以產(chǎn)生免疫力，有的雞攝入卵囊過多而引起發(fā)病。
由于活的強毒株蟲苗未經(jīng)致弱，如果免疫量不準(zhǔn)確或免疫接種經(jīng)雞傳代后卵囊的數(shù)量越來越多，有可能導(dǎo)致球蟲病的爆發(fā)，于是致弱疫苗應(yīng)運而生。目前對強毒株球蟲的致弱方法主要有三種理化致弱法、雞胚傳代致弱法和早熟卵囊選育法。
理化致弱法是通過對卵囊進(jìn)行冷卻、加熱、超聲、離子輻射等物理性處理，而使之減毒。
雞胚傳代致弱法是將球蟲子孢子接種到雞胚絨毛尿囊膜上培養(yǎng)，連續(xù)傳代多次后獲得對雞致病性低，但仍保持良好免疫原性的“雞胚適用株”，其致病力的減弱是由于第2代裂殖體從原來的粘膜固有層轉(zhuǎn)而全部寄生在腸腺上皮細(xì)胞的緣故，不引起出血，對組織損傷小，以此致弱蟲株免疫的雞對強毒株的攻擊有良好的保護作用。但雞胚傳代致弱方法有四大缺點①致弱性能相對不穩(wěn)定，當(dāng)轉(zhuǎn)為雞傳代時毒力返強快；②通過雞胚生產(chǎn)大量商品化致弱蟲株的卵囊比較困難；③隨雞胚傳代次數(shù)增加，蟲體的免疫原性就會減少或喪失，實際上難以獲得既保持良好的免疫力，又使毒力較弱的最佳組合；④最主要的局限性在于流行最廣的巨型、堆型和早熟艾美耳球蟲雖然可以在雞胚內(nèi)發(fā)育，但卵囊生長不良，因此通過雞胚傳代生產(chǎn)“全價”致弱蟲苗就受到了限制。
早熟卵囊選育法是根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲致弱蟲株，其致病力的減弱是由于第2代裂殖體沒有完全分化或者在成熟時變得非常小的機理，利用這些致弱蟲株制成球蟲疫苗能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生免疫力，同時對雞保持無害。這種蟲苗能防止發(fā)病，而不是抵抗感染，盡管用苗后雞群仍有卵囊排出，但雞群的球蟲病確實得到預(yù)防和控制。如由北京農(nóng)學(xué)院段嘉樹教授研制并投入生產(chǎn)的口服球蟲疫苗，就是采用此方法制成的。此外，目前人們在努力開發(fā)球蟲病基因疫苗，嘗試用純化的抗原來免疫雞以求得保護。如Garker(1982)應(yīng)用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗球蟲的單克隆抗體來鑒定球蟲抗原取得成功，已研制出防治家禽球蟲病的亞單位苗；Danforth(1986)首次研制成功球蟲病重組苗，即從大腸桿菌中提取了柔嫩艾美耳球蟲的抗原(命名為5401)，用5401免疫雞后用同種卵囊攻擊，在體增重、飼料轉(zhuǎn)化率等方面明顯地優(yōu)于對照組，與堆型艾美耳球蟲無交叉反應(yīng)。利用基因工程技術(shù)對球蟲感染和免疫的基本性質(zhì)的理解已經(jīng)取得了進(jìn)步，但離制作基因工程苗的目標(biāo)還很遙遠(yuǎn)，轉(zhuǎn)入實用階段尚待時日。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雞球蟲疫苗的制備方法，為克服現(xiàn)有強毒株雞球蟲致弱方法的技術(shù)缺陷，其使用安全、操作簡便、效果好的雞球蟲超聲波致弱方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的一種雞球蟲疫苗的制備方法，其特征在于是采用超聲波致弱的方法，其具體的步驟為(1)首先進(jìn)行卵囊孢子化，擴增雞球蟲卵囊，將分離出的卵囊放入置有10倍體積的2.5％的重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，溶液深度約0.6cm，放入溫度為28～30℃恒溫箱中，培養(yǎng)5天；培養(yǎng)期間每天對培養(yǎng)液輕輕攪拌4～5次，當(dāng)有90％以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆茫?2)其次進(jìn)行超聲波致弱卵囊，將以上收集的孢子化卵囊加蒸餾水3000-5000轉(zhuǎn)/分離心2-3次除去重鉻酸鉀溶液后，置于100ml小燒杯中，計數(shù)后再將小燒杯放入裝有碎冰塊的1000ml大燒杯進(jìn)行冰浴后，置于超聲波儀隔音箱升降臺上，使升降臺上升至變幅桿浸入溶液10mm后，將功率調(diào)至最小位置200瓦，調(diào)整好超聲時間為3秒，調(diào)整間隙時間為3秒進(jìn)行致弱，超聲時間為8-12分鐘。(3)超聲結(jié)束后，如若不立即使用，將100ml球蟲卵囊液加入2％重鉻酸鉀溶液100ml，1％疊氮鈉溶液1.5ml，放置4℃冰箱備用；使用前將球蟲卵囊溶液加10倍體積的蒸餾水，以4000轉(zhuǎn)/分離心3次，每次3分鐘，以除去重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液后制成口服疫苗。用血細(xì)胞計數(shù)板法進(jìn)行卵囊計數(shù)，按每只雞4000個孢子化卵囊以滴口方式喂給雛雞，首次免疫7日齡，二次免疫為14日齡?？诜庖咔昂?天不能給雞喂抗球蟲藥。
本發(fā)明的積極效果是致弱的球蟲均無致病性，接種雛雞安全可靠，且具有良好的免疫原性；致弱方法是直接的，在規(guī)定的時間內(nèi)，可同時致弱多種雞球蟲，如柔嫩、堆型、巨型、毒害和早熟艾美耳球蟲等，并且保持良好的免疫原性；其方法簡易實用，便于農(nóng)村推廣應(yīng)用；并降低了使用成本。
下面結(jié)合試驗例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述強毒球蟲致弱試驗雞球蟲卵囊的致弱過程采集球蟲病雞糞便→收集混合卵囊→增殖艾美耳球蟲卵囊→艾美耳球蟲卵囊置于超聲波儀致弱→計數(shù)卵囊→口服接種雛雞。
免疫接種的操作步驟將含有孢子化球蟲卵囊50ml的重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液加10倍體積的蒸餾水離心除去，離心3次，每次離心3分鐘，轉(zhuǎn)數(shù)為4000轉(zhuǎn)/分，將離心后的上清液倒掉，以清除重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液，將離心后的卵囊沉淀加蒸餾水50ml，用吸管吹吸均勻，用血細(xì)胞計數(shù)板法進(jìn)行卵囊計數(shù)，使用1000μl微量移液器給雞口服滴注，按每只雞4000個孢子化卵囊以滴口方式喂給雛雞，首次免疫7日齡，二次免疫為14日齡?？诜庖咔昂?天不能給雞喂抗球蟲藥。
下面是接種免疫試驗免疫保護性試驗 將130只7日齡AA肉雞分為致弱免疫組90只、不致弱免疫組30只、不免疫對照組10只3個組。致弱免疫組將90只7日齡AA肉雞雛分為3組，每組30只雞，分為超聲致弱5分鐘組、超聲致弱10分鐘組、超聲致弱15分鐘組，用超聲波致弱的柔嫩艾美耳球蟲卵囊口服免疫。超聲致弱5分鐘組30只雞又分為3組，每組10只雞，每組免疫劑量分別為4×103、8×103、16×103個/只，共進(jìn)行2次免疫，首免7日齡，二免14日齡，21日齡時用野毒株卵囊進(jìn)行攻蟲，攻蟲劑量為5×104個/只。超聲致弱10分鐘組、超聲致弱15分鐘組的分組與免疫方法同超聲致弱5分鐘組。不致弱免疫組用未經(jīng)超聲波致弱的柔嫩艾美耳球蟲卵囊免疫30只7日齡AA肉仔雞，每組10只，免疫劑量分別為4×103、8×103、16×103個/只，首免7日齡，二免14日齡，21日齡時用野毒株卵囊進(jìn)行攻蟲，攻蟲劑量為5×104個/只。不免疫對照組21日齡時用野毒株卵囊進(jìn)行攻蟲，攻蟲劑量為5×104個/只。實驗期間分別測定各組雞的體重變化，攻蟲后第7天以盲腸病變計分、排卵數(shù)、糞便計分等指標(biāo)測定其免疫性能，并計算各組免疫保護率。結(jié)果見表-1。
表-1超聲波致弱柔嫩艾美耳球蟲免疫保護性

結(jié)果盲腸病變計分于攻蟲后第7天剖殺試驗雞只，取其盲腸，觀察盲腸病變程度。當(dāng)兩側(cè)盲腸病變不一致時，以嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn)，結(jié)果見表-2。
將上述各試驗組與對照組進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計，結(jié)果表明致弱5分鐘、10分鐘和不致弱柔嫩艾美耳球蟲卵囊試驗組與對照組差異顯著(p＜0.05)。致弱15分鐘組中的4×103、16×103個/只試驗組與對照組差異不顯著，盲腸病變計分為3分，盲腸病變較為嚴(yán)重，8×103組盲腸病變計分為2分，盲腸損害中等。致弱10分鐘組盲腸病變計分均為2分，盲腸損害中等。致弱5分鐘和不致弱F2組的盲腸病變計分相同，免疫劑量為4×103、8×103、16×103個/只的盲腸病變計分為2分、2分、1分。不免疫對照組盲腸病變計分為4分，盲腸病變最為嚴(yán)重。
攻蟲后第7天每克糞便中的卵囊數(shù)為了便于觀察，試驗中采用5g糞便來測定其中的卵囊數(shù)，然后將結(jié)果除以5來計數(shù)每克糞便的卵囊數(shù)，在攻蟲后第7天收集當(dāng)天的糞便觀察卵囊數(shù)，結(jié)果見表-2。
統(tǒng)計分析結(jié)果表明各組糞便中的卵囊數(shù)與對照組差異極顯著(p＜0.01)。致弱卵囊免疫的各個試驗組中，以致弱10分鐘組排出卵囊總數(shù)最少，OPG為1.4×104，致弱5分鐘組排出卵囊總數(shù)最多，OPG為3.4×104。
糞便計分對攻蟲第7天的糞便進(jìn)行計分表明致弱5分鐘、致弱10分鐘、不致弱F2組與對照組之間糞便計分差異顯著(p＜0.05)，致弱15分鐘組與對照組之間差異不顯著。
體重變化結(jié)果試驗組雞的增重與對照組的增重差異顯著(p＜0.05)，其中致弱10分鐘組4×103個/只卵囊免疫組增重最多，平均增重達(dá)180克/只。
保護率致弱10分鐘和15分鐘試驗組的保護率為100％，致弱5分鐘和不致弱F2組的保護率為60~90％，未免疫對照組的保護率為60％。
討論從以上試驗結(jié)果可以看出，在免疫保護率方面，致弱卵囊免疫組的免疫保護率均高于不致弱免疫組和對照組。致弱10分鐘、致弱15分鐘2組的保護率均達(dá)到100％，致弱5分鐘的保護率分別為90％、70％、70％，均高于不致弱組的保護率80％、70％、60％，同時也高于不免疫對照組的保護率60％。
在肉仔雞平均增重方面，致弱10分鐘組中的3個免疫劑量免疫后，肉仔雞平均增重分別為180、170、168g/只，均高于致弱5分鐘組、15分鐘組、不致弱組和對照組的平均增重，說明在增重方面，致弱10分鐘組的免疫效果最好。
在糞便計分方面，致弱10分鐘組中的3個免疫劑量免疫后的糞便計分均為1分，致弱5分鐘組和不致弱組的糞便計分分別為2分、1分、0分，而致弱15分鐘組的糞便計分為3分、2分、2分，對照組糞便計分為4分，可以說明致弱10分鐘組的糞便計分最小，免疫效果最好。
在攻蟲7天后的卵囊排出量方面，致弱10分鐘組中卵囊計數(shù)OPG分別為0.7×104、0.5×104、0.2×104，均低于其他致弱免疫組、不致弱免疫組和不免疫對照組。
在盲腸病變計分方面，致弱10分鐘組中的3個免疫劑量免后的盲腸病變計分均為2分，與致弱5分鐘和不致弱組基本持平，低于致弱15分鐘組和不免疫對照組，由此說明致弱10分鐘組中的3個免疫劑量免后的盲腸病變計分較小，免疫效果較好。
綜上所述，采用超聲波法致弱柔嫩艾美耳球蟲卵囊比不用超聲波致弱的卵囊對預(yù)防雞球蟲病是安全有效的，肉仔雞的保護率明顯提高，增重顯著。尤其是致弱10分鐘組，首免7日齡，二免14日齡，免疫劑量為4×103組免疫效果最為理想。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實施例1首先進(jìn)行卵囊孢子化，擴增雞球蟲卵囊，將分離出的卵囊放入置有10倍體積的2.5％的重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，溶液深度約0.6cm，放入溫度為28～30℃恒溫箱中，培養(yǎng)5天；培養(yǎng)期間每天對培養(yǎng)液輕輕攪拌4～5次，當(dāng)有90％以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆?；其次進(jìn)行超聲波致弱卵囊，將以上收集的孢子化卵囊加蒸餾水3000轉(zhuǎn)/分離心2次除去重鉻酸鉀溶液后，置于100ml小燒杯中，計數(shù)后再將小燒杯放入裝有碎冰塊的1000ml大燒杯進(jìn)行冰浴后，置于超聲波儀隔音箱升降臺上，使升降臺上升至變幅桿浸入溶液10mm后，將功率調(diào)至最小位置200瓦，調(diào)整好超聲時間為3秒，調(diào)整間隙時間為3秒進(jìn)行致弱，超聲時間為8分鐘。超聲結(jié)束后，如若不立即使用，將100ml球蟲卵囊液加入2％重鉻酸鉀溶液100ml，1％疊氮鈉溶液1.5ml，放置4℃冰箱備用；使用前將球蟲卵囊溶液加10倍體積的蒸餾水，以4000轉(zhuǎn)/分離心3次，每次3分鐘，以除去重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液后制成口服疫苗。用載玻片計數(shù)法進(jìn)行卵囊計數(shù)，即用吸管吸取1ml球蟲卵囊液，溶于10ml水中制成10倍的稀釋液，經(jīng)充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，取?.05ml置于載玻片上，再覆加蓋玻片，計數(shù)整個蓋玻片內(nèi)的卵囊數(shù)。其計算公式為每毫升球蟲卵囊液中卵囊數(shù)＝蓋玻片內(nèi)的卵囊數(shù)×200；按每只雞4000個孢子化卵囊以滴口方式喂給雛雞，首次免疫7日齡，二次免疫為14日齡?？诜庖咔昂?天不能給雞喂抗球蟲藥。
實施例2首先進(jìn)行卵囊孢子化，擴增雞球蟲卵囊，將分離出的卵囊放入置有10倍體積的2.5％的重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，溶液深度約0.6cm，放入溫度為28～30℃恒溫箱中，培養(yǎng)5天；培養(yǎng)期間每天對培養(yǎng)液輕輕攪拌5次，當(dāng)有90％以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆茫黄浯芜M(jìn)行超聲波致弱卵囊，將以上收集的孢子化卵囊加蒸餾水4000轉(zhuǎn)/分離心3次除去重鉻酸鉀溶液后，置于100ml小燒杯中，再將小燒杯放入裝有碎冰塊的1000ml大燒杯進(jìn)行冰浴后，置于超聲波儀隔音箱升降臺上，使升降臺上升至變幅桿浸入溶液10mm后，將功率調(diào)至最小位置200瓦，調(diào)整好超聲時間為3秒，調(diào)整間隙時間為3秒進(jìn)行致弱，超聲時間為10分鐘。超聲結(jié)束后，如若不立即使用，將100ml球蟲卵囊液加入2％重鉻酸鉀溶液100ml，1％疊氮鈉溶液1.5ml，放置4℃冰箱備用；使用前將球蟲卵囊溶液加10倍體積的蒸餾水，以4000轉(zhuǎn)/分離心3次，每次3分鐘，以除去重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液后制成口服疫苗。用載玻片計數(shù)法進(jìn)行卵囊計數(shù)，按每只雞4000個孢子化卵囊以滴口方式喂給雛雞，首次免疫7日齡，二次免疫為14日齡。口服免疫前后2天不能給雞喂抗球蟲藥。
實施例3首先進(jìn)行卵囊孢子化，擴增雞球蟲卵囊，將分離出的卵囊放入置有10倍體積的2.5％的重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，溶液深度約0.6cm，放入溫度為28~30℃恒溫箱中，培養(yǎng)5天；培養(yǎng)期間每天對培養(yǎng)液輕輕攪拌4~5次，當(dāng)有90％以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆茫黄浯芜M(jìn)行超聲波致弱卵囊，將以上收集的孢子化卵囊加蒸餾水5000轉(zhuǎn)/分離心3次除去重鉻酸鉀溶液后，置于100ml小燒杯中，再將小燒杯放入裝有碎冰塊的1000ml大燒杯進(jìn)行冰浴后，置于超聲波儀隔音箱升降臺上，使升降臺上升至變幅桿浸入溶液10mm后，將功率調(diào)至最小位置200瓦，調(diào)整好超聲時間為3秒，調(diào)整間隙時間為3秒進(jìn)行致弱，超聲時間為12分鐘。超聲結(jié)束后，如若不立即使用，將100ml球蟲卵囊液加入2％重鉻酸鉀溶液100ml，1％疊氮鈉溶液1.5ml，放置4℃冰箱備用；使用前將球蟲卵囊溶液加10倍體積的蒸餾水，以4000轉(zhuǎn)/分離心3次，每次3分鐘，以除去重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液后制成口服疫苗。用載玻片計數(shù)法進(jìn)行卵囊計數(shù)，按每只雞4000個孢子化卵囊以滴口方式喂給雛雞，首次免疫7日齡，二次免疫為14日齡?？诜庖咔昂?天不能給雞喂抗球蟲藥。
權(quán)利要求
1.一種雞球蟲疫苗的制備方法，其特征在于是采用超聲波致弱的方法，其具體的步驟為(1)首先進(jìn)行卵囊孢子化，擴增雞球蟲卵囊，將分離出的卵囊放入置有10倍體積的2.5％的重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，溶液深度約0.6cm，放入溫度為28～30℃恒溫箱中，培養(yǎng)5天；培養(yǎng)期間每天對培養(yǎng)液輕輕攪拌4～5次，當(dāng)有90％以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆茫?2)其次進(jìn)行超聲波致弱卵囊，將以上收集的孢子化卵囊加蒸餾水3000-5000轉(zhuǎn)/分離心2-3次除去重鉻酸鉀溶液后，置于100ml小燒杯中，計數(shù)后再將小燒杯放入裝有碎冰塊的1000ml大燒杯進(jìn)行冰浴后，置于超聲波儀隔音箱升降臺上，使升降臺上升至變幅桿浸入溶液10mm后，將功率調(diào)至最小位置200瓦，調(diào)整好超聲時間為3秒，調(diào)整間隙時間為3秒進(jìn)行致弱，超聲時間為8-12分鐘。(3)超聲結(jié)束后，如若不立即使用，將100ml球蟲卵囊液加入2％重鉻酸鉀溶液100ml，1％疊氮鈉溶液1.5ml，放置4℃冰箱備用；使用前將球蟲卵囊溶液加10倍體積的蒸餾水，以4000轉(zhuǎn)/分離心3次，每次3分鐘，以除去重鉻酸鉀、疊氮鈉溶液后制成口服疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞球蟲疫苗的制備方法，其特征在于具體的步驟為首先進(jìn)行卵囊孢子化，擴增雞球蟲卵囊，將分離出的卵囊放入置重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，當(dāng)有90％以上的卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆茫黄浯芜M(jìn)行超聲波致弱卵囊，將以上收集的孢子化卵囊加蒸餾水離心除去重鉻酸鉀溶液后，置于100ml小燒杯中，計數(shù)后再將小燒杯放入裝有碎冰塊的1000ml大燒杯進(jìn)行冰浴后，置于超聲波儀進(jìn)行致弱。其使用安全、操作簡便、效果好的雞球蟲超聲波致弱方法。
文檔編號A61P33/00GK101045159SQ20071005562
公開日2007年10月3日 申請日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者趙 權(quán), 劉春杰 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)