專利名稱：：球蟲(chóng)重組卡介苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種球蟲(chóng)重組卡介苗，包括穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗和整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗，同時(shí)還公開(kāi)了其制備方法，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：雞球蟲(chóng)病是由艾美爾屬的一種單細(xì)胞寄生性原蟲(chóng)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，遍及世界各地。長(zhǎng)期以來(lái)本病防治主要依賴于藥物，但由于雞球蟲(chóng)的抗藥性日趨嚴(yán)重，加之普遍存在的藥物殘留、研制開(kāi)發(fā)新藥成本高、周期長(zhǎng)，免疫效果差，免疫程序復(fù)雜等問(wèn)題，使人們將目光轉(zhuǎn)向了分子疫苗。加強(qiáng)免疫效果以及對(duì)免疫增強(qiáng)劑的研究已成為當(dāng)前球蟲(chóng)疫苗研究的熱點(diǎn)。人們?cè)鴩L試過(guò)將球蟲(chóng)的抗原基因在不同的表達(dá)環(huán)境迸行表達(dá)，但目前仍沒(méi)有一種抗原基因能夠提供完全的免疫保護(hù)，而且受表達(dá)系統(tǒng)的限制，以大腸桿菌為原核表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白抗原性較差。因此，有必要采用基因工程方法發(fā)展一種高效，廉價(jià)的新型雞球蟲(chóng)疫苗?？ń槊缡悄壳笆澜缟蠎?yīng)用最廣泛、最安全的疫苗。它本身是一種很好的非特異免疫增強(qiáng)劑，能增加機(jī)體免疫功能，單次接種即能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生完全持久的細(xì)胞免疫和體液免疫，并且易于生產(chǎn)，價(jià)格低廉，適宜于廣大農(nóng)村。這些優(yōu)勢(shì)使卡介苗成為表達(dá)重組外源基因的一種非常理想的活菌疫苗載體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種球蟲(chóng)重組卡介苗，包括兩種抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的新型疫苗，即穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗和整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下首先獲得柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行TA克隆，測(cè)序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261和整合表達(dá)載體PMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和PCR篩選得到陽(yáng)性柔嫩艾美耳球蟲(chóng)重組卡介苗，包括穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗和整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗。本發(fā)明所提供的兩種重組卡介苗疫苗菌株，將其命名為rBCGPMV26卜RH0和rBCGPMV361-RHO.本發(fā)明以球蟲(chóng)保護(hù)性抗原Rhomboid基因?yàn)槔M(jìn)行穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體的構(gòu)建。1、穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的制備從構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)雜交蟲(chóng)株F2cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出l個(gè)Rhomboid蛋白家族相關(guān)基因，根據(jù)己克隆的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Rhomboid新基因序列的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克隆。測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的pMV261穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒Rho-261電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37。C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子，PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45。C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。將制備好的穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RH0以100ug/只的劑量通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，并同時(shí)設(shè)BCG組和紅、白對(duì)照組，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，對(duì)保護(hù)率、相對(duì)增重率、0PG、ACI、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO可對(duì)抗中等劑量球蟲(chóng)的攻擊,試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，攻蟲(chóng)后卵囊排出量顯著減少，體重增長(zhǎng)顯著增加，盲腸病變較小,保護(hù)率達(dá)到78.8%以上。各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于對(duì)照組(結(jié)果見(jiàn)表l)。其中陰性對(duì)照組ACI值為90.6，而rBCGPMV261-RHO免疫組ACI值分別為208.1、181.4、167.2，說(shuō)明使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲(chóng)指數(shù)，而滴鼻點(diǎn)眼和口服組ACI值均達(dá)到180以上，以這兩種途徑免疫抗球蟲(chóng)效果非常有效。BCG免疫的三組其ACI值在154.6171.0之間，效果也明顯高于對(duì)照組，提示我們單獨(dú)使用BCG對(duì)增強(qiáng)雞球蟲(chóng)免疫保護(hù)力也有一定的效果，其中以口服方式免疫效果更好。穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗免疫雛雞后能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫和體液免疫，表現(xiàn)為CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量和特異性抗體滴虔明顯高于對(duì)照組(P〈0.01)。2、整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的制備根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Rhomboid新基因序列的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR，TA克隆，測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的pMV361整合表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒Rho-361電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37t:培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子，PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45'C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。將重組卡介苗rBCGPMV361-RH0以100ug/只的劑量通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，對(duì)保護(hù)率、相對(duì)增重率、OPG、ACI、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲(chóng)指數(shù)，其中rBCGPMV36卜RH0滴鼻點(diǎn)眼和口服免疫組ACI值達(dá)到188.2和187.8，具有很好的抗球蟲(chóng)效果。整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV361-RHO可對(duì)抗中等劑量球蟲(chóng)的攻擊，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，攻蟲(chóng)后卵囊排出量顯著減少，體重增長(zhǎng)顯著增加，盲腸病變較小，三種免疫途徑保護(hù)率分別為80%、70.6%、63.5%(結(jié)果見(jiàn)表2)。以滴鼻點(diǎn)眼免疫方式效果更為明顯。用整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗免疫雛雞后能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫和體液免疫，CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量和特異性抗體滴度均較之陰性對(duì)熙組有不同程度的提高(P〈0.05)。將本發(fā)明提供的兩種球蟲(chóng)重組卡介苗通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞后，口服接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，通過(guò)保護(hù)率、相對(duì)增重率、OPG、ACI、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，球蟲(chóng)重組卡介苗rBCGPMV261-RHO和rBCGPMV361-RHO組均具有明顯的免疫促進(jìn)作用，各指標(biāo)均強(qiáng)于陰性對(duì)照組，能夠有效地抵抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊的攻擊，ACI值到達(dá)180以上，具有很好的抗球蟲(chóng)效果。本發(fā)明的積極效果在于卡介苗活載體疫苗本身具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫佐劑作用，而且又能高效表達(dá)球蟲(chóng)蛋白，使表達(dá)的蛋白發(fā)揮很好的免疫保護(hù)作用，兩者優(yōu)勢(shì)組合，達(dá)到更好的預(yù)防雞球蟲(chóng)病的目的。并且這一新型疫苗熱穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn).免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng)村。本發(fā)明所用到的Rhomboid基因是我實(shí)驗(yàn)室獲得的一個(gè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的新基因。Rhomboid蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與表皮生長(zhǎng)因子及表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的調(diào)節(jié)器，而且已發(fā)現(xiàn)Rhomboid與頂器門(mén)原蟲(chóng)的黏附和侵入宿主細(xì)胞有關(guān)，說(shuō)明Rhomboid基因作為疫苗候選基因的價(jià)值。這樣的活載體疫苗既能發(fā)揮卡介苗本身較強(qiáng)的細(xì)胞免疫佐劑作用，又能使表達(dá)的蛋白發(fā)揮免疫保護(hù)作用，達(dá)到更好的預(yù)防雞球蟲(chóng)病的目的。因此這兩種疫苗的研制具有非常廣闊的前景和應(yīng)用價(jià)值。圖l為PMV261-Rho載體構(gòu)建示意圖。圖2為PMV361-Rho載體構(gòu)建示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明以球蟲(chóng)保護(hù)性抗原Rhomboid基因?yàn)槔M(jìn)行穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體的構(gòu)建，并不以任何形式限制本發(fā)明。本發(fā)明球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的制備實(shí)施例l穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的制備步驟.參照Rhomboid基因DNA序列及穿梭載體pMV261物理圖譜設(shè)計(jì)兩對(duì)引物并引入酶切位點(diǎn)。上游引物QF1:5、-CTGACTGCAGATGTCGGACATCGAATCCCAGAG-3、；其中5、端含有Pstl位點(diǎn)；下游引物QR:5、-GACTATCGATTTATGCGCATCCCATGGGCAAAGG-3';5、端含有Clal位點(diǎn)。將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，凝膠回收片段與同樣進(jìn)行酶切的穿梭表達(dá)載體pMV261連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化AcoWDH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用PstI、ClaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，重組質(zhì)粒命名為PMV261-Rho(如圖l所示)。將BCG接種于MB7H9ADC液體培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，沉淀用10%甘油洗滌，最后重懸lml10%甘油中，用于電轉(zhuǎn)化。取60-80ulBCG感受態(tài)菌液加入O.lug重組質(zhì)粒PMV261-Rho置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2.5KV，電容25uF，電阻1000Q。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入MB7H9ADC培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)2d后涂布于含20ug/mlKanMB7H9ADC培養(yǎng)基平板，約3w后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化菌落。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基(含Kan)，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PCR證實(shí)陽(yáng)性克隆后，45'C水浴中誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，10(TC5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Westernblotting鑒定。實(shí)施例2整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的制備步驟參照Rhomboid基因DNA序列及穿梭載體pMV361物理圖譜設(shè)計(jì)兩對(duì)引物并引入酶切位點(diǎn)。上游引物QF2:CTGACAGCTGATGTCGGACATCGMTCCCAGAG;其中5、端含有PvuII位點(diǎn)；下游引物QR:5、-GACTATCGATTTATGCGCATCCCATGGGCAAAGG-3';5'端含有Clal位點(diǎn)。將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體并迸行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，凝膠回收片斷與整合表達(dá)載體pMV361連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡h'DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用和PvuII、ClaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，重組質(zhì)粒命名為PMV361-Rho(如圖2所示)。取60-80ul感受態(tài)BCG菌液加入O.lug重組質(zhì)粒PMV361-Rho置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2.5KV，電容25uF，電阻1000Q。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入MB7H9ADC培養(yǎng)基中，37r培養(yǎng)2d后涂布于MB7H9ADC培養(yǎng)基平板。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PCR證實(shí)陽(yáng)性克隆后45"水浴中誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，100。C5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Westernblotting鑒定。試驗(yàn)例l穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的用途實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用剛出殼的海蘭小公雛，雛雞6日齡時(shí)，隨機(jī)分為8組，每組20只。7日齡時(shí)將穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RH0以100ug/只的劑量通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，并同時(shí)設(shè)BCG滴鼻點(diǎn)眼免疫組、BCG口服免疫組，BCG頸部皮下注射免疫組和紅白對(duì)照組。紅白對(duì)照組接種PBS，紅對(duì)照組最后攻蟲(chóng)，白對(duì)照組不攻蟲(chóng)。分三次免疫，每次間隔一周，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊lX104個(gè)/只進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)判定，包括保護(hù)率、相對(duì)增重率、0PG、ACI等，免疫后采血，流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+、CD8+進(jìn)行細(xì)胞水平免疫檢測(cè)，分離血清ELISA方法對(duì)體液免疫水平進(jìn)行檢測(cè)。攻蟲(chóng)前每組雞隨機(jī)取10只逐只分別稱重并標(biāo)號(hào)記錄，攻蟲(chóng)后每隔一天對(duì)對(duì)應(yīng)的雞逐只稱重，觀察攻蟲(chóng)后雞的體重變化情況，以及最后的增重情況，計(jì)算相對(duì)增重；攻蟲(chóng)后每天檢査糞便，并從第五天開(kāi)始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取lg，加入10tnL自來(lái)水制成10倍稀釋液，取一滴置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)球蟲(chóng)卵囊總數(shù)；于攻蟲(chóng)后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按Johnson設(shè)計(jì)的病變記分法記分。計(jì)算ACI二相對(duì)增重率+存活率-病變值-卵囊記分。結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于不免疫攻蟲(chóng)對(duì)照組。說(shuō)明我們所采用的免疫程序是安全有效的，陰性對(duì)照組的ACI僅為90.6，而單獨(dú)使用BCG能不同的提高抗球蟲(chóng)指數(shù)，其中BCG口服組ACI達(dá)到了171.0，發(fā)揮了BCG作為免疫增強(qiáng)劑的效果，效果尤為突出的是本發(fā)明所提供的穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO，免疫方式采用滴鼻點(diǎn)眼和口服，抗球蟲(chóng)指數(shù)ACI值均達(dá)到180以上，說(shuō)明抗球蟲(chóng)效果非常有效。穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO可對(duì)抗中等劑量球蟲(chóng)的攻擊，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，攻蟲(chóng)后卵囊排出量顯著減少，體重增長(zhǎng)顯著增加，盲腸病變較小，保護(hù)率達(dá)到78.8%以上(結(jié)果見(jiàn)表l)。將發(fā)明的新型疫苗rBCGPMV261-RHO免疫雛雞后，于第三次免疫后l周，每組隨機(jī)各取10只雞放血處死，取脾臟，力B2mLPBS，在200目篩上研磨，用PBS稀釋成細(xì)胞懸液(10MVmL)。取100uL細(xì)胞懸液，加？1^標(biāo)記的抗004+和？￡標(biāo)記的抗008+兔抗雞單克隆抗體，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入O.5mL熒光保存液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明免疫組及8〔6組004+、CD8+變量明顯高于陰性對(duì)照組，而^〔0匿261-朋0滴鼻組雞的004+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)均升高，與其他個(gè)組相比差異均極顯著(P〈0.01)。每次免疫前心臟采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)F2株子孢子蛋白作為包被抗原，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)雞血清中IgG變化情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果一免后各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。二免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價(jià)，其中，rBCGPMV261-RHO滴鼻組和rBCGPMV261-RHO口服組血清抗體吸光度最高，于其它組相比差異極顯著(P〈0.01)。試驗(yàn)例2整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗的用途實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用剛出殼的海蘭小公雛，雛雞6日齡時(shí)，隨機(jī)分為8組，每組20只。7日齡時(shí)將整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGP匿361-RH0以100ug/只的劑量通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，并同時(shí)設(shè)BCG滴鼻點(diǎn)眼免疫組、BCG口服免疫組，BCG頸部皮下注射免疫組和紅白對(duì)照組。紅白對(duì)照組接種PBS，紅對(duì)照組最后攻蟲(chóng)，白對(duì)照組不攻蟲(chóng)。分三次免疫，每次間隔一周，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊1X10MV只進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)判定，包括保護(hù)率、相對(duì)增重率、OPG、ACI等，免疫后采血，流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+、CD8+進(jìn)行細(xì)胞水平免疫檢測(cè)，分離血清ELISA方法對(duì)體液免疫水平進(jìn)行檢測(cè)。攻蟲(chóng)前每組雞隨機(jī)取10只逐只分別稱重并標(biāo)號(hào)記錄，攻蟲(chóng)后每隔一天對(duì)對(duì)應(yīng)的雞逐只稱重，觀察攻蟲(chóng)后雞的體重變化情況，以及最后的增重情況，計(jì)算相對(duì)增重；攻蟲(chóng)后每天檢查糞便，并從第五天開(kāi)始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取lg，加入10mL自來(lái)水制成10倍稀釋液，取一滴置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)球蟲(chóng)卵囊總數(shù)；于攻蟲(chóng)后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按Johnson設(shè)計(jì)的病變記分法記分。計(jì)算AO相對(duì)增重率+存活率-病變值-卵囊記分。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲(chóng)指數(shù)，其中rBCGPMV361-RH0滴鼻點(diǎn)眼和口服免疫組ACI值達(dá)到188.2和187.8，具有很好的抗球蟲(chóng)效果。整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗rBCGPMV361-RHO可對(duì)抗中等劑量球蟲(chóng)的攻擊，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，攻蟲(chóng)后卵囊排出量顯著減少，體重增長(zhǎng)顯著增加，盲腸病變較小，三種免疫途徑保護(hù)率分別為80%、70.6%、63.5%(結(jié)果見(jiàn)表2)。以滴鼻點(diǎn)眼免疫方式效果更為明顯。將發(fā)明的新型疫苗rBCGPMV36卜RH0免疫雛雞后，于第三次免疫后l周，每組隨機(jī)各取10只雞放血處死，取脾臟，用PBS稀釋成細(xì)胞懸液，取100uL細(xì)胞懸液，加？11^標(biāo)記的抗004+和？￡標(biāo)記的抗008+兔抗雞單克隆抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明免疫組及8〔0組[04+、CD8+變量明顯高于陰性對(duì)照組。每次免疫前心臟采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)F2株子孢子蛋白作為包被抗原，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)雞血清中IgG變化情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果一免后各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。二免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價(jià)。表l穿梭載體重組卡介苗rBCGPMV261-RHO對(duì)E.tenella攻擊的保護(hù)效果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2整合載體重組卡介苗rBCGPMV361-RHO對(duì)E.tenella攻擊的保護(hù)效果OPG值Xl(f個(gè)增重(g)盲腸病變記分ACI分組平均值保護(hù)率平均值相對(duì)增重平均值相對(duì)病變ACI<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、一種球蟲(chóng)重組卡介苗，其特征在于首先獲得球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行TA克隆，測(cè)序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261或整合表達(dá)載體PMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和PCR篩選得到陽(yáng)性球蟲(chóng)重組卡介苗。2、一種穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗，是通過(guò)以下步驟制備的從構(gòu)建球蟲(chóng)雜交蟲(chóng)株F2cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出1個(gè)Rhomboid蛋白家族相關(guān)基因，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Rhomboid新基因序列的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克隆；測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的pMV261穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5ct中，將重組質(zhì)粒Rho-261電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37'C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子，PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45'C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。3、一種整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗，是通過(guò)以下步驟制備的根據(jù)己克隆的球蟲(chóng)Rhomboid新基因序列的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR，TA克隆，測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的pMV361整合表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒Rho-361電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37。C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子，PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45"熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。全文摘要本發(fā)明提供一種球蟲(chóng)重組卡介苗，包括穿梭表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗和整合表達(dá)載體球蟲(chóng)重組卡介苗疫苗。卡介苗活載體疫苗本身具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫佐劑作用，能高效表達(dá)球蟲(chóng)蛋白，使表達(dá)的蛋白發(fā)揮很好的免疫保護(hù)作用，兩者優(yōu)勢(shì)組合，達(dá)到更好的預(yù)防雞球蟲(chóng)病的目的。疫苗具有非常好的抗球蟲(chóng)效果，熱穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易；免疫力持久，單次接種可持續(xù)誘導(dǎo)長(zhǎng)期對(duì)“靶抗原”的免疫反應(yīng)，可減少接種次數(shù)，簡(jiǎn)化免疫程序，增強(qiáng)對(duì)球蟲(chóng)病的免疫效果；基因操作和生產(chǎn)過(guò)程較為簡(jiǎn)單，安全性高，球蟲(chóng)抗原可在BCG細(xì)胞壁上持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)；產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn)，免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序，大大降低了成本，便于推廣。文檔編號(hào)A61K39/002GK101234196SQ200710056370公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者宮鵬濤,張西臣,李建華,舉楊,王秋悅申請(qǐng)人:吉林大學(xué)