專利名稱：以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法及該方法制備的植骨材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備植骨材料的方法，尤其是以鹿茸及鹿骨為原料制 備植骨材料的方法及該方法制備的植骨材料。
技術(shù)背景我國吉林、遼寧、黑龍江、河北、北京等地有很多養(yǎng)殖場(chǎng)詞養(yǎng)梅花鹿、 馬鹿。梅花鹿和馬鹿的醫(yī)學(xué)、藥學(xué)價(jià)值越來越受到關(guān)注。首先是鹿茸，梅花鹿茸為梅花鹿的幼角。多具1 2分枝。具1分枝者，習(xí)稱"二杠"， 具2分枝者，習(xí)稱"三岔"，二茬茸和頭茬茸相似。馬鹿茸又名青毛茸。 為馬鹿的幼角，形狀比花鹿茸粗大，分枝亦較多，側(cè)枝一個(gè)者習(xí)稱"單門"， 二個(gè)稱"蓮花"，三個(gè)稱"三岔"，四個(gè)稱"四岔"，或更多。其中以蓮花、三岔、四岔為主。鹿茸的顯微鑒定粉末淡黃色。①表皮角質(zhì)層表面呈顆粒狀，茸毛脫落后的毛窩呈圓洞狀。②毛茸中部直徑13-50 um，表 面由扁平細(xì)胞(鱗片)呈覆瓦狀排列的毛小皮包圍，細(xì)胞的游離緣指向毛尖， 皮質(zhì)有棕色色素，髓質(zhì)斷續(xù)或無。毛根常與毛囊相連，基部膨大作撕裂狀。 ③骨碎片表面有縱紋及點(diǎn)狀孔隙，骨陷窩呈類圓形或類梭形，邊緣骨小管 呈放射狀溝紋。橫斷面可見大的圓形孔洞，邊緣凹凸不平。④未骨化骨組 織表面多具不規(guī)則的塊狀突起物。⑤角化梭形細(xì)胞多散在。我們對(duì)東北產(chǎn) 的上、中、下三等鹿茸進(jìn)行分析，水溶性浸出物12%， 8.77% ， 7.02%;醇 溶性浸出物2. 31%， 1.08%， 0.89%;醚溶性浸出物1. 16%， 0.64%， 0.61%; 灰分26.65%， 37.79%， 40.11%。灰分中含鈣、磷。鎂等。近年來國內(nèi)外學(xué) 者已經(jīng)在鹿茸中發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，神 經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)以及具有促進(jìn)成骨、軟骨細(xì)胞增 殖的鹿茸多肽(PAP)等。骨移植是骨科修復(fù)手術(shù)的重要手段，骨庫及骨移植材料相關(guān)問題研究 一直是骨科的重要課題.國內(nèi)外的骨庫主要是儲(chǔ)存異體骨，但因異體骨來源 受限，有潛在乙肝、艾滋病交叉感染的危險(xiǎn)，不能滿足臨床對(duì)骨移植材料 的多種需求.國內(nèi)近年來已有重組合異種骨材料，該產(chǎn)品是將從牛皮質(zhì)骨 中提取的BMP與去抗原的牛松質(zhì)骨載體復(fù)合而成，經(jīng)系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床 研究，證明其既有誘導(dǎo)成骨作用和良好骨傳導(dǎo)作用，生物相容性較好，是 一種可應(yīng)用的植骨材料.由于在歐洲出現(xiàn)了瘋牛病，對(duì)國內(nèi)的重組合異種骨 產(chǎn)品的臨床應(yīng)用帶來不良影響，部分患者對(duì)用牛骨提取的具有促進(jìn)成骨作 用的植骨材料心理上有恐懼感。國內(nèi)臨床需要不受瘋牛病影響的植骨材料。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種以鹿茸及鹿骨為原料制備植 骨材料的方法及該方法制備的植骨材料，以該方法制備的植骨材料具有促進(jìn)成骨、軟骨細(xì)胞增殖的多種生長(zhǎng)因子及鹿茸多肽(PAP)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種以鹿茸及鹿 骨為原料制備植骨材料的方法，包括以下步驟A、 以鹿茸為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉成細(xì)粉，分成兩份， 一份在弱酸條件室 溫下攪拌，另一份在弱堿條件室溫下攪拌，分別過濾，合并所得的提取液， 合并所得的殘?jiān)?，殘?jiān)粝潞笥茫瑢⑻崛∫褐糜诶涔窭洳?，加入冷丙酮?脫水得沉淀物，將沉淀物用無熱源水溶解，經(jīng)中空纖維超濾器超濾，收集分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道爾頓 的部分，加入無水乙醇或丙酮沉淀，冷凍干燥后，得到鹿茸提取液凍千粉；B、 將步驟A中在弱酸條件和弱堿條件下過濾后的殘?jiān)?0 -65。C下進(jìn) 行醇水提取，經(jīng)中空纖維超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部 分，濃縮后，用0.22y的微孔濾膜過濾備用；C、 制備作為植骨材料的鹿骨載體將新鮮鹿骨的上端松質(zhì)骨切成顆粒 狀，以溫水沖洗干凈，進(jìn)行脫脂、去抗原和部分脫鈣處理后，用無熱源水浸 泡，甩干，備用；D、 將步驟B中制得的經(jīng)微孔濾膜過濾的濃縮液浸入步驟C中制得的鹿骨載體松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用；E、 在室溫下，將步驟A中得到鹿茸提取液凍干粉加入無熱源水溶解， 經(jīng)微孔濾膜過濾后，將其浸入步驟D中得到的浸泡過的鹿骨載體松質(zhì)骨顆 粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)鈷60輻射滅菌，制得以鹿茸及鹿
骨為原料的植骨材料。所述的鹿茸為梅花鹿茸或馬鹿茸中的一種。所述的梅花鹿茸為梅花鹿茸二杠或三岔；所述的馬鹿茸為馬鹿茸的蓮 花、三岔或四岔。所述的步驟A為以鹿茸原料，用粉碎機(jī)粉成80 120目細(xì)粉分成兩 份， 一半加入弱f髮強(qiáng)堿鹽，飼pH為8.5-8.8室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙 酮繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用；將另一半鹿茸粉加入弱酸，調(diào)pH 為3. 5-4.0，室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙酮繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取 液與己得提取液混合，然后將混合提取液置于0 1(TC冷柜冷藏，加入冷丙 酮，分二次脫水得沉淀物，將沉淀物用無菌水溶解，經(jīng)超濾器超濾，收集 分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道爾頓 的部分，加入無水乙醇或丙酮沉淀，冷凍干燥后，得到鹿茸提取液凍干粉。所述的弱酸為PH 3.5-4.0的醋酸或稀鹽酸；所述的弱酸強(qiáng)堿鹽為 pH8. 5-8. 8的碳酸鹽或磷酸鹽的緩沖液。所述的步驟B為將步驟A中弱酸及弱堿條件下過濾后的殘?jiān)尤胨?乙醇，控制溫度在60 -65。C，攪拌提取2 3小時(shí)，經(jīng)截留70000道爾頓的 超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，然后濃縮，用0.22 ix的微孔濾膜過濾備用。所述的步驟C為取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3X3 X3cm 的顆粒狀，以5(TC溫水沖洗干凈，將其用5--IO倍體積的丙酮浸泡過夜，取 出后待丙酮揮散，用3--5倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪后，將鹿的 松質(zhì)骨顆粒置于雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制在50-6(TC 保持3小時(shí)，然后用0. 5 M的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì)骨顆粒用無 熱源水浸泡3次，甩干備用。所述的鈷60輻射滅菌的強(qiáng)度為25拉德，照射15小時(shí)。一種上述方法制備的植骨材料，由鹿茸提取液凍干粉、鹿茸提取液濃 縮液和鹿松質(zhì)骨顆粒組成，其混合重量份數(shù)比例為鹿茸提取液凍干粉2-7份鹿茸提取液濃縮液凍干粉2-7份鹿松質(zhì)骨顆粒500-1000份。的提取物及鹿的松質(zhì)骨制備一種植骨材 料，資源豐富，價(jià)格適宜，使用安全，不會(huì)出現(xiàn)瘋牛病感染的問題。其去 抗原的鹿松質(zhì)骨載體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)與人骨網(wǎng)架結(jié)構(gòu)很接近,具有非常良好的骨傳 導(dǎo)作用;其網(wǎng)架內(nèi)復(fù)合了鹿茸中含有多種生長(zhǎng)因子及鹿茸多肽(PAP)等， 具有顯著地骨誘導(dǎo)作用。骨內(nèi)埋植試驗(yàn)結(jié)果組織學(xué)觀察6-7周時(shí),內(nèi)網(wǎng)架 間有大量未分化間充組織長(zhǎng)入，可見軟骨細(xì)胞及類骨質(zhì)形成,呈彌漫灶狀分布。術(shù)后7-8周新生軟骨融合，并有較多編織骨形成,原鹿松質(zhì)骨網(wǎng)架逐漸被 吸收，術(shù)后8-9周見較多板層骨及大量骨髓形成，原鹿松質(zhì)骨網(wǎng)架僅見少部分 殘留，是一種應(yīng)用前景廣闊的植骨材料。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩詳細(xì)說明 一種以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法，包括以下步驟A、 以鹿茸為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉成細(xì)粉，分成兩份， 一份在弱酸條件室 溫下攪拌，另一份在弱堿條件室溫下攪拌，分別過濾，合并所得的提取液， 合并所得的殘?jiān)瑲堅(jiān)粝潞笥?，將提取液置于冷柜冷藏，加入冷丙酮?脫水得沉淀物，將沉淀物用無熱源水溶解，經(jīng)中空纖維超濾器超濾，收集分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道爾頓 的部分，加入無水乙醇或丙酮沉淀，冷凍干燥后，得到鹿茸提取液凍干粉；B、 將步驟A中在弱酸條件和弱堿條件下過濾后的殘?jiān)?0 -65X:下進(jìn) 行醇水提取，經(jīng)中空纖維超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部 分，濃縮后，用0.22y的微孔濾膜過濾備用；C、 制備作為植骨材料的鹿骨載體將新鮮鹿骨的上端松質(zhì)骨切成顆粒 狀，以溫水沖洗干凈，進(jìn)行脫脂、去抗原和部分脫鈣處理后，用無熱源水浸 泡，甩干，備用；D、 將步驟B中制得的經(jīng)微孔濾膜過濾的濃縮液浸入步驟C中制得的鹿骨載體松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用；E、 在室溫下，將步驟A中得到鹿茸提取液凍干粉加入無熱源水溶解， 經(jīng)微孔濾膜過濾后，將其浸入步驟D中得到的浸泡過的鹿骨載體松質(zhì)骨顆 粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)鈷60輻射滅菌，制得以鹿茸及鹿 骨為原料的植骨材料。所述的鹿茸為梅花鹿茸或馬鹿茸中的一種。所述的梅花鹿茸為梅花鹿茸二杠或三岔；所述的馬鹿茸為馬鹿茸的蓮 花、三岔或四岔。所述的步驟A為以鹿茸原料，用粉碎機(jī)粉成80 120目細(xì)粉分成兩 份， 一半 、^ 、 調(diào)pH為8.5-8.8室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙 酮繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用；將另一半鹿茸粉加入弱酸，調(diào)pH 為3. 5-4.0，室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙酮繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取 液與已得提取液混合，然后將混合提取液置于0 1(TC冷柜冷藏，加入冷丙 酮，分二次脫水得沉淀物，將沉淀物用無菌水溶解，經(jīng)超濾器超濾，收集 分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道爾頓 的部分，加入無水乙醇或丙酮沉淀，冷凍干燥后，得到鹿茸提取液凍干粉。所述的弱酸為pH 3.5-4.0的醋酸或稀鹽酸；所述的弱酸強(qiáng)堿鹽為 pH8. 5-8. 8的碳酸鹽或磷酸鹽的緩沖液。所述的步驟B為將步驟A中弱酸及弱堿條件下過濾后的殘?jiān)尤胨?乙醇，控制溫度在60 -65。C，攪拌提取2 3小時(shí)，經(jīng)截留70000道爾頓的 超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，然后濃縮，用0.22 P的微孔濾膜過濾備用。所述的步驟C為取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3X3 X3cm 的顆粒狀，以5(TC溫水沖洗干凈，將其用5—10倍體積的丙酮浸泡過夜，取 出后待丙酮揮散，用3-5倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪后，將鹿的 松質(zhì)骨顆粒置于雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制在50-60°C 保持3小時(shí)。然后用0. 5 M的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì)骨顆粒用 無熱源水浸泡3次，甩干備用。所述的鈷60輻射滅菌的強(qiáng)度為25拉德，照射15小時(shí)。一種上述方法制備的植骨材料，由鹿茸提取液凍干粉、鹿茸提取液濃 縮液和鹿松質(zhì)骨顆粒組成，其混合重量份數(shù)比例為鹿茸提取液凍干粉2-7份鹿茸提取液濃縮液凍干粉2-7份鹿松質(zhì)骨顆粒500-1000份。 實(shí)施例1取鹿鶯的二杠為原料，稱取100克，用粉碎機(jī)粉成100目細(xì)粉。取出一半加入0. 1 Mole /L碳酸鈉緩沖溶液200ml， PH為8. 5-8. 8，室溫下攪拌 3小時(shí)后，加入丙酮100 ml繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用。將另一 半鹿茸粉加入0. 001 /L鹽酸溶液200ml ， pH為3. 5-4. 0，室溫下攪拌3小 時(shí)后，加入丙酮100ml繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液與己得提取液混合， 然后將該混合提取液置于冷柜冷藏，加入冷丙酮2500ml，分二次脫水得沉 淀物，將該沉淀物用無熱源水250 ml溶解，經(jīng)截留70000道爾頓的超濾器 超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，將之經(jīng)截留50000道爾頓的 超濾器超濾，先收集分子量大于50000道爾頓的部分，然后將分子量小于 50000道爾頓的部分，經(jīng)截留30000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量小于 30000道爾頓的部分，將分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于 50000而小于70000道爾頓的部分加入2500ml無水乙醇沉淀，冷凍干燥后， 經(jīng)稱量為4. 4克。取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3X3 X3cm的顆粒狀，稱重500 克以5(TC溫水沖洗干凈，將其用五倍體積的丙酮浸泡過夜，取出后待丙酮揮 散，用三倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪后，將鹿的松質(zhì)骨顆粒置于 雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制在50-6(TC保持3小時(shí)。 然后用0. 5M的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì)骨顆粒用無熱源水浸泡3 次，甩干。將鹿茸渣提取濃縮液80 ml經(jīng)0.22u微孔濾膜過濾后，將其浸 入該500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用。然后將鹿茸室溫下提取液凍 干粉加入無熱源水50 ml溶解，經(jīng)0. 22p微孔濾膜過濾后，將其浸入上述 500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)25拉德的鈷60， 輻射滅菌15小時(shí)，產(chǎn)品入庫。 實(shí)施例2取馬鹿茸的蓮花為原料，稱取100克，用粉碎機(jī)粉成100目細(xì)粉。稱 取100克，用粉碎機(jī)粉成100目細(xì)粉。取出一半加入0. 1 Mole /L碳酸鈉 緩沖溶液200ml，調(diào)pH為8. 5，室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙酮100 ml繼 續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用。將另一半鹿茸粉加入0.001 Mole /L 鹽酸溶液200ml，調(diào)pH為4，室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙酮100 ml繼續(xù) 攪拌2小時(shí)，過濾得提取液與已得提取液混合，然后將該混合提取液置于
冷柜冷藏，加入冷丙酮2500 ml ，分二次脫水得沉淀物，將該沉淀物用無 菌水250 ml溶解，經(jīng)截留70000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量小于70000 道爾頓的部分，將之經(jīng)截留50000道爾頓的超濾器超濾，先收集分子量大 于50000道爾頓的部分，然后將分子量小于50000道爾頓的部分，經(jīng)截留 30000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量小于30000道爾頓的部分，將分子 量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道爾頓的部 分加入2500ml無水乙醇沉淀，冷凍干燥后，經(jīng)稱量為4. 3克。將鹿茸粉經(jīng)水提取留下的殘?jiān)尤胨?00 ml、乙醇200 ml，控制溫度 在60 -65°C，攪拌提取2小時(shí)，經(jīng)截留70000道爾頓的超濾器過濾，然后濃 縮成80 ml，用0.22 u的微孔濾膜過濾備用。取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3X3 X3cm的顆粒狀，稱重500 克以5(TC溫水沖洗干凈，將其用五倍體積的丙酮浸泡過夜，取出后待丙酮揮 散，用三倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪后，將.鹿的松質(zhì)骨顆粒置于 雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制在50-60°C保持3小時(shí)。 然后用0. 5 M的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì)骨顆粒用無熱源水浸泡3 次，甩干。將鹿茸渣提取濃縮液80 ml經(jīng)0.22u微孔濾膜過濾后，將其浸 入該500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用。然后將鹿茸室溫下提取液凍 干粉加入無熱源水50 ml溶解，經(jīng)0. 22u微孔濾膜過濾后，將其浸入上述 500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)25拉德D的鈷 60，輻射滅菌15小時(shí)，產(chǎn)品入庫。 實(shí)施例3取鹿茸的三岔為原料，稱取100克，用粉碎機(jī)粉成100目細(xì)粉。取出 一半加入0. 1 Mole /L碳酸鈉緩沖溶液200ml， pH為8. 5-8. 8，室溫下攪拌 3小時(shí)后，加入丙酮IOO ml繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用。將另一 半鹿茸粉加入0. 001 Mole /L鹽酸溶液200ml，調(diào)pH為3. 5-4，室溫下攪 拌3小時(shí)后，加入丙酮100 ml繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液與已得提取 液混合，然后將該混合提取液置于冷柜冷藏，加入冷丙酮2500 ml ，分二 次脫水得沉淀物，將該沉淀物用無菌水250 ml溶解，經(jīng)截留70000道爾頓 的超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，將之經(jīng)截留50000 道爾頓的超濾器超濾，先收集分子量大于50000道爾頓的部分，然后將分 子量小于50000道爾頓的部分，經(jīng)截留30000道爾頓的超濾器超濾，收集 分子量小于30000道爾頓的部分，將分子量小于30000道爾頓的部分及分 子量大于50000而小于70000道爾頓的部分加入2500ml無水乙醇沉淀，冷 凍干燥后，經(jīng)稱量為3.4克。將鹿茸粉經(jīng)水提取留下的殘?jiān)尤胨?00 ml、乙醇200 ml，控制溫度 在60 -65°C，攪拌提取2小時(shí)，經(jīng)截留70000道爾頓的超濾器過濾，然后濃 縮成80 ml，用0.22 u的微孔濾膜過濾備用。取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3X3 X3cm的顆粒狀，稱重500 克以5(TC溫水沖洗干凈，將其用五倍體積的丙酮浸泡過夜，取出后待丙酮揮 散，用三倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪后，將鹿的松質(zhì)骨顆粒置于 雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制在50-6(TC保持3小時(shí)。 然后用0. 5 mole的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì)骨顆粒用無熱源水浸 泡3次，甩干。將鹿茸渣提取濃縮液80 ml經(jīng)0.22tM散孔濾膜過濾后，將 其浸入該500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用。然后將鹿茸室溫下提取 液凍干粉加入無熱源水50 ml溶解，經(jīng)0. 22u微孔濾膜過濾后，將其浸入 上述500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)鈷60 25 拉德，輻射滅菌，產(chǎn)品入庫。取馬鹿四岔為原料稱取100克，用粉碎機(jī)粉成100目細(xì)粉。取出- -半 加入0. 1 Mole /L碳酸鈉緩沖溶液200ml， pH為8. 5-8. 8，室溫下攪拌3小 時(shí)后，加入丙酮IOO ml繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用。將另一半鹿 茸粉加入0. 1 Mole /L醋酸緩沖溶液200ml，調(diào)pH為3. 5-4. 0，室溫下攪 拌3小時(shí)后，加入丙酮IOO ml繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液與已得提取 液混合，然后將該混合提取液置于冷柜冷藏，加入冷丙酮2500 ml ，分二 次脫水得沉淀物，將該沉淀物用無菌水250 ml溶解，經(jīng)截留70000道爾頓 的超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，將之經(jīng)截留50000 道爾頓的超濾器超濾，先收集分子量大于50000道爾頓的部分，然后將分 子量小于50000道爾頓的部分，經(jīng)截留30000道爾頓的超濾器超濾，收集 分子量小于30000道爾頓的部分，將分子量小于30000道爾頓的部分及分 子量大于50000而小于70000道爾頓的部分加入2500ml無水乙醇沉淀，冷
凍干燥后，經(jīng)稱量為2.8克。將鹿茸粉經(jīng)水提取留下的殘?jiān)尤胨?00 ml、乙醇200 ml，控制溫度 在60 -65°C，攪拌提取2小時(shí)，經(jīng)截留70000道爾頓的超濾器過濾，然后濃 縮成80 ml，用0.22 u的微孔濾膜過濾備用。取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3X3 X3cm的顆粒狀，稱重500 克以5(TC溫水沖洗干凈，將其用五倍體積的丙酮浸泡過夜，取出后待丙酮揮 散，用三倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪后，將鹿的松質(zhì)骨顆粒置于 雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制在50-6CTC保持3小時(shí)。 然后用0. 5 mole的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì)骨顆粒用無熱源水浸 泡3次，甩干。將鹿茸渣提取濃縮液80 ml經(jīng)0. 22 u微孔濾膜過濾后，將 其浸入該500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用。然后將鹿茸室溫下提取 液凍干粉加入無熱源水50 ml溶解，經(jīng)0. 22u微孔濾膜過濾后，將其浸入 上述500克鹿松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)25拉德的 鈷60，輻射滅菌，產(chǎn)品入庫。 肌內(nèi)埋植試驗(yàn)取雄性小鼠108只，體重18-20克，隨機(jī)分為9周9個(gè)時(shí)間組，每組12 只小鼠。將實(shí)施例1制備的鹿松質(zhì)骨顆粒植入小鼠右股部肌袋內(nèi)，術(shù)后按不 同時(shí)間取材，標(biāo)本固定，脫鈣，石蠟包埋，常規(guī)切片，CD染色，光鏡下組織學(xué)觀骨內(nèi)埋植試驗(yàn)取大耳白家兔9只，體重2. 800-3. 000克，雌雄不限，隨機(jī)分為9周9個(gè) 時(shí)間組，每組1只家兔，于家兔橈骨中上處截除骨段，造成骨缺損，植入實(shí)施 例1制備的鹿松質(zhì)骨顆粒，分層關(guān)閉傷口，術(shù)后不同時(shí)間取材，標(biāo)本固定，脫 鈣，石蠟包埋，常規(guī)切片，CD染色，在光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。 肌內(nèi)埋植試驗(yàn)結(jié)果各組小鼠術(shù)后一般情況良好，傷口均無感染發(fā)生，也無植入物排出。組 織學(xué)觀察，6周時(shí)，內(nèi)網(wǎng)架間有大量未分化間充組織長(zhǎng)入，可見軟骨細(xì)胞及類 骨質(zhì)形成，呈彌漫灶狀分布。術(shù)后7周新生軟骨融合，并有較多編織骨形成， 原鹿松質(zhì)骨網(wǎng)架逐漸被吸收。術(shù)后8周見較多板層骨及大量骨髓形成，原鹿 松質(zhì)骨網(wǎng)架僅見少部分殘留。各組標(biāo)本周圍均無纖維囊形成，亦未見明顯炎
性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 骨內(nèi)埋植試驗(yàn)結(jié)果組織學(xué)觀察7周時(shí)，內(nèi)網(wǎng)架間有大量未分化間充組織長(zhǎng)入，可見軟骨細(xì) 胞及類骨質(zhì)形成，呈彌漫灶狀分布。術(shù)后8周新生軟骨融合，并有較多編織 骨形成，原鹿松質(zhì)骨網(wǎng)架逐漸被吸收。術(shù)后9周見較多板層骨及大量骨髓形 成，原鹿松質(zhì)骨網(wǎng)架僅見少部分殘留。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí) 之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這 種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法，包括以下步驟A、以鹿茸為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉成細(xì)粉，分成兩份，一份在弱酸條件室溫下攪拌，另一份在弱堿條件室溫下攪拌，分別過濾，合并所得的提取液，合并所得的殘?jiān)?，殘?jiān)粝潞笥?，將提取液置于冷柜冷藏，加入冷丙酮，脫水得沉淀物，將沉淀物用無熱源水溶解，經(jīng)中空纖維超濾器超濾，收集分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道爾頓的部分，加入無水乙醇或丙酮沉淀，冷凍干燥后，得到鹿茸提取液凍干粉；B、將步驟A中在弱酸條件和弱堿條件下過濾后的殘?jiān)?0-65℃下進(jìn)行醇水提取，經(jīng)中空纖維超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，濃縮后，用0.22μ的微孔濾膜過濾備用；C、制備作為植骨材料的鹿骨載體將新鮮鹿骨的上端松質(zhì)骨切成顆粒狀，以溫水沖洗干凈，進(jìn)行脫脂、去抗原和部分脫鈣處理后，用無熱源水浸泡，甩干，備用；D、將步驟B中制得的經(jīng)微孔濾膜過濾的濃縮液浸入步驟C中制得的鹿骨載體松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥備用；E、在室溫下，將步驟A中得到鹿茸提取液凍干粉加入無熱源水溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾后，將其浸入步驟D中得到的浸泡過的鹿骨載體松質(zhì)骨顆粒中，冷凍干燥，在無菌條件下包裝，經(jīng)鈷60輻射滅菌，制得以鹿茸及鹿骨為原料的植骨材料。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的鹿茸為梅花鹿茸或馬鹿茸中的一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的梅花鹿茸為梅花鹿茸二杠或三岔；所述的馬鹿茸為馬 鹿茸的蓮花、三岔或四岔。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的步驟A為以鹿茸原料，用粉碎機(jī)粉成80 120目細(xì) 粉分成兩份， 一半加入弱酸強(qiáng) 鹽，,pH為8. 5-8. 8室溫下攪拌3小時(shí)后， 加入丙酮繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾得提取液待用；將另一半鹿茸粉加入弱酸， 調(diào)pH為3.5-4.0，室溫下攪拌3小時(shí)后，加入丙酮繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾 得提取液與已得提取液混合，然后將混合提取液置于0 1(TC冷柜冷藏，加 入冷丙酮，分二次脫水得沉淀物，將沉淀物用無菌水溶解，經(jīng)超濾器超濾，收集分子量小于30000道爾頓的部分及分子量大于50000而小于70000道 爾頓的部分，加入無水乙醇或丙酮沉淀，冷凍干燥后，得到鹿茸提取液凍 干粉。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的弱酸為pH 3.5-4.0的醋酸或稀鹽酸；所述的弱酸強(qiáng)堿 鹽為pH8. 5-8. 8的碳酸鹽或磷酸鹽的緩沖液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的步驟B為將步驟A中弱酸及弱堿條件下過濾后的殘 渣加入水、乙醇，控制溫度在60 -65°C，攪拌提取2 3小時(shí)，經(jīng)截留70000 道爾頓的超濾器超濾，收集分子量小于70000道爾頓的部分，然后濃縮，用 0.22 y的微孔濾膜過濾備用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的步驟C為取新鮮鹿肱骨上端的松質(zhì)骨，將其切成3 X3 X3cm的顆粒狀，以5(TC溫水沖洗干凈，將其用5—10倍體積的丙酮浸 泡過夜，取出后待丙酮揮散，用3—5倍體積的乙醚浸泡3小時(shí)，除去脂肪 后，將鹿的松質(zhì)骨顆粒置于雙氧水中處理，過氧化氫濃度9-11%，溫度控制 在50-60°C保持3小時(shí)，然后用0. 5M的鹽酸浸泡3小時(shí)，將制備的鹿松質(zhì) 骨顆粒用無熱源水浸泡3次，甩干備用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法， 其特征在于，所述的鈷60輻射滅菌的強(qiáng)度為25拉德，照射15小時(shí)。
9、 一種權(quán)利要求1所述的方法制備的植骨材料，其特征在于，由鹿茸 提取液凍干粉、鹿茸提取液濃縮液和鹿松質(zhì)骨顆粒組成，其混合重量份數(shù) 比例為鹿茸提取液凍干粉2-7份 鹿茸提取液濃縮液凍干粉2-7份 鹿松質(zhì)骨顆粒500-1000份。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以鹿茸及鹿骨為原料制備植骨材料的方法及該方法制備的植骨材料，用鹿茸的提取物及鹿的松質(zhì)骨制備植骨材料，資源豐富，價(jià)格適宜，使用安全，不會(huì)出現(xiàn)瘋牛病感染的問題。去抗原的鹿松質(zhì)骨載體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)與人骨網(wǎng)架結(jié)構(gòu)很接近，具有非常良好的骨傳導(dǎo)作用；其網(wǎng)架內(nèi)復(fù)合了鹿茸中含有多種生長(zhǎng)因子及鹿茸多肽等，具有顯著地骨誘導(dǎo)作用，是一種應(yīng)用前景廣闊的植骨材料。
文檔編號(hào)A61L27/36GK101147809SQ20071006005
公開日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者李德山, 王喜文 申請(qǐng)人:王喜文