專利名稱：輻照交聯(lián)異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)用生物皮制品領(lǐng)域，具體地說屬于生物皮脫細(xì)胞網(wǎng)狀支架領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物材料在治療大面積燒燙傷患者中具有重要作用。近年來，國(guó)內(nèi)外皮膚專家一直 在尋求良好的創(chuàng)面修復(fù)覆蓋材料，以消除抗原性和排異反應(yīng)為目的，制作異種皮冷凍保 存，永久性皮膚創(chuàng)面替代材料是當(dāng)前急需的新技術(shù)。為提高搶救大面積燒傷病人的療效， 具有廣闊的前景。
在中國(guó)專利CN1266716A中公開了一種交聯(lián)型豬脫細(xì)胞皮片。采用0.25%的胰蛋白 酶在4'C下，浸泡16-24小時(shí)脫細(xì)胞，然后揭去表皮。之所以要這么長(zhǎng)時(shí)間是因?yàn)樵? 'C下胰蛋白酶脫細(xì)胞水平極低，即使是這么長(zhǎng)時(shí)間，也達(dá)不到完全脫除的目的。另外， 表皮覆蓋在真皮上，阻止了胰蛋白酶對(duì)真皮細(xì)胞的浸入，也對(duì)脫細(xì)胞不利。
在中國(guó)專利CN1522766A中公開了 一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，采用 0.04~0.06%的胰蛋白酶在2~4'。下，浸泡16~20小時(shí)脫細(xì)胞，然后揭去表皮；再次浸入 0.04~0.06%的胰蛋白酶在36.8~37.2°(:下消化30~60分鐘，之后預(yù)冷，在-70~-80冷凍和 37 39'C融化的凍融，反復(fù)凍融3次，治如含抗生素的磷酸鹽緩沖液中保存。該方法的 缺點(diǎn)是 一、如此低濃度的胰蛋白酶在此溫度下脫細(xì)胞不完全；二、反復(fù)凍融會(huì)損傷支 架結(jié)構(gòu)的柔軟性和隨意性。
在中國(guó)專利CN1268401C中公開了一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料的制備方法，也是將帶 有表皮的皮片加酶涂覆劑后放置長(zhǎng)達(dá)18-50小時(shí)，脫細(xì)胞后再將表皮與真皮分離。最后 采用劑量為6 30KGry/h600)所產(chǎn)生的Y射線輻照滅菌。由于表皮覆蓋在真皮上，阻止 了胰蛋白酶對(duì)真皮細(xì)胞的浸入，對(duì)脫細(xì)胞不利。另外，采用^Co為放射源，即使裝源 50萬居里，要想以6~30KGry/h的放射劑量滿足對(duì)生物皮制劑的滅菌要求，需時(shí)長(zhǎng)達(dá) 15小時(shí)以上，在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)造成極大的不便。
在中國(guó)專利CN1732867A中公開了一種真皮面脫細(xì)胞、去抗原的敷料皮，是指對(duì)真 皮部分進(jìn)行脫細(xì)胞、去抗原的處理，而完整地保留了表皮的結(jié)構(gòu)。嚴(yán)格地說，這不能算 作豬皮脫細(xì)胞網(wǎng)狀支架。
在中國(guó)專利CN1775189A中公開了一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法，提出的用氫 氧化鈉和去污劑脫細(xì)胞的方案；該方案脫細(xì)胞的機(jī)理不明。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種輻照無菌異種皮基質(zhì)制備方法及其 產(chǎn)品。
輻照無菌異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法，主要包括
1、 取皮，用5%碘伏浸泡10~30分鐘滅菌，脫毛，去脂，裁剪，用純凈水清洗，甩 干至含水量15~25%之間；
2、 上機(jī)切皮，真皮、表皮分離，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3~0.8mm， (0.5mm ±0. 04mm最佳)
3、 脫細(xì)胞
一脫上述真皮部分首先用1~15%的氯化鈉水溶液浸泡30分鐘后用純凈水清 洗；然后用10~20%的胰蛋白酶在36-40。C下，浸泡30~50分鐘后用純凈水清洗； 使細(xì)胞核與細(xì)胞壁分離后，用36 4(TC生理鹽水清洗2 4次甩干，再用純凈水清洗
32~4次甩干，瀝水30分。
一脫后脫去80%以上組織細(xì)胞，只留殘余細(xì)胞核與細(xì)胞碎片； 二脫將上述瀝水后含水量在10-30% (25%最佳)的皮片，再用10~20%的 脫氧核糖核酸酶(DNA酶)、10~30%的核糖核酸酶(RNA酶)先后交替地在36~40 'C下，每次浸泡20~40分鐘；各浸泡2~4次后，使細(xì)胞核與細(xì)胞碎片與細(xì)胞床完全 分離；再用脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5~1.5%， 36 40'C下再次浸泡5~30分鐘， 使成纖維細(xì)胞與細(xì)胞床壁分離。
4、 除去真皮內(nèi)可誘發(fā)宿主細(xì)胞識(shí)別反應(yīng)的物質(zhì)將前述處理后的材料用PH值 7.5 8. 5的純水清洗甩干；采用常規(guī)固定劑，如福爾馬林20%， 25 36。C下，浸 泡50~120分鐘；
5、 中間體檢驗(yàn)(顯微鏡下看)
物理性能——乳白色、有彈性、彎曲不斷裂、微網(wǎng)狀； 組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常人體真皮內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相同的真皮結(jié)構(gòu)組織； 細(xì)菌和異菌檢驗(yàn)無菌 6、輻照滅菌經(jīng)過電子加速器或Co-60進(jìn)行Y射線輻照滅菌。輻照劑量150萬~400
萬拉德。照射時(shí)間60~180秒，(120秒最佳)，使產(chǎn)品成細(xì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。放置皮片的吊具與
放射源以20~60度角接觸，距離10公分。


圖1是本發(fā)明制備方法制得的產(chǎn)品；
圖2是實(shí)施例1患者術(shù)后半年愈合效果圖3是實(shí)施例2患者術(shù)后半年愈合效果圖。
具體實(shí)施例方式
1、 取皮，引用標(biāo)準(zhǔn)GB16548-1996，豬皮表面無瘢痕，無硬皮，柔軟有彈性。 取2 4個(gè)月白皮白毛豬皮背部，用5%碘伏浸泡10~30分鐘滅菌，脫毛，去脂，裁剪； 用純凈水清洗，甩干至含水量15~25%之間；放置手術(shù)臺(tái)上進(jìn)行裁剪與機(jī)器刀架相適合
(大小在350~600m之間)后進(jìn)入下道工序；
去脂脫脂，先將手工去脂的全皮放入36 37t:溫水中加入5%洗滌劑(如白貓洗潔 精)浸泡10-20分鐘，手工輕揉，將真皮底層油脂去掉后再用同溫度清水沖洗10分鐘， 手感皮片澀感。
手工拔毛，將上述浸泡后的皮片上的毛連同毛囊一起拔出后，放入36 37'C溫水中， 加入10%洗滌劑(如白貓洗潔精)浸泡10~20分鐘，手工輕揉，將真皮底層油脂去掉后 再用同溫度清水沖洗10分鐘，手感皮片澀感。使皮片囊孔中的皮屑一起清除掉。
2、 上機(jī)切皮，真皮、表皮分離，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.34.8mm，(最 佳厚度0.5 111111±0.04 111111)，注意保留基底膜的完整性。將去脂去毛后的豬皮固定在鼓 式切皮機(jī)的鼓輪上，將皮片完全貼敷在鼓輪上，并用力加壓至使皮片繃緊。用切皮機(jī)切 皮，分離表皮，留下真皮厚度0.3mm~0.8mm。用機(jī)器切皮比通常用手工撕皮的好處是: 可以更加徹底地準(zhǔn)確地清除干凈表皮上層細(xì)胞和膠原蛋白質(zhì)。
3、 脫細(xì)胞
一脫上述真皮部分首先用1 15%的氯化鈉水溶液浸泡30分鐘后用純凈水清 洗；然后用10~20%的胰蛋白酶在36~401:下，浸泡30~50分鐘后用純凈水清洗； 使細(xì)胞核與細(xì)胞壁分離后，用36-40。C生理鹽水清洗2 4次甩干，再用純凈水清洗 2 4次甩干，瀝水30分。
4一脫后脫去80%以上組織細(xì)胞，只留殘余細(xì)胞核與細(xì)胞碎片；
二脫將上述瀝水后含水量在10~30% (25%)的皮片，再用10~20%的脫氧 核糖核酸酶(DNA酶)、10~30%的核糖核酸酶(RNA酶)先后交替地在36~40°C 下，每次浸泡20~40分鐘；各浸泡2~4次后，使細(xì)胞核與細(xì)胞碎片與細(xì)胞床完全分 離；再用脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5~1.5%， 36~40°0下再次浸泡5~30分鐘， 使成纖維細(xì)胞與細(xì)胞床壁分離。
4、 除去真皮內(nèi)可誘發(fā)宿主細(xì)胞識(shí)別反應(yīng)的物質(zhì)將前述處理后的材料用PH值 7.5 8.5的注射用水清洗甩干；采用常規(guī)固定劑，如碘伏0.1%，在36'C下，浸泡 50~120分鐘；將脫細(xì)胞后的皮片定型。
定尺在無菌室內(nèi)操作，將己甩干的脫細(xì)胞真皮用無菌刀裁剪成臨床應(yīng)用尺寸。 壓平、進(jìn)行測(cè)量中間體檢驗(yàn)、包裝、封口、速凍。
5、 中間體檢驗(yàn)內(nèi)容(肉眼或顯微鏡下) 物理性能——乳白色、有彈性、彎曲不斷裂、微網(wǎng)狀；
組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常人體真皮內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相同的真皮結(jié)構(gòu)組織； 無菌1t驗(yàn)；細(xì)菌數(shù)為零 6、輻照滅菌經(jīng)過電子加速器或Co-60進(jìn)行Y射線輻照滅菌。輻照劑量150萬 ~400萬拉德。照射時(shí)間60~180秒，(120秒最佳)，使產(chǎn)品成細(xì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。放置皮片的吊 具與放射源以20~60度角接觸，距離10公分。 產(chǎn)品質(zhì)量符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 參見附圖1，依上述方法制得的輻照交聯(lián)異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)，在高倍顯微鏡下觀 察，其大體形態(tài)及組織學(xué)變化結(jié)果該異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)無細(xì)胞成分，膠原纖維排列有 序，基底膜結(jié)構(gòu)完整。
參見附圖2，實(shí)施例l
患者為男性，49歲，火焰燒傷，燒傷總面積79%，左腿部深度燒傷；采用托細(xì)胞 豬真皮移植，網(wǎng)狀爬皮均勻，3~4周后愈合；治療半年后傷口憑證無疤痕。 參見附圖3，實(shí)施例2
患者為女性，67歲，糖尿病史10年；燒傷發(fā)生3個(gè)月后，創(chuàng)面被葡萄球菌感染。 移植自體微粒皮后覆蓋豬皮真皮脫細(xì)胞支架后，創(chuàng)面4周愈合。 臨床試驗(yàn)
采用去細(xì)胞異體真皮或以本發(fā)明所述方法制得的輻照交聯(lián)異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)加自 體刃厚皮移植的方法，修復(fù)各種創(chuàng)面119例，比較各種創(chuàng)面的植皮成活率，觀察應(yīng)用不 同部位的皮膚覆蓋、去細(xì)胞異體真皮或以本發(fā)明所述方法制得的輻照交聯(lián)異種皮脫細(xì)胞 基質(zhì)與植皮成活的關(guān)系，并對(duì)部分病例進(jìn)行了組織學(xué)觀察和隨訪。結(jié)果削痂、切痂和 切瘢創(chuàng)面植皮成活率分別為(93.4±4.8) %， (92.1 ±4.6) %和(94.5±3.8) %，三者間 差異無顯著意義。結(jié)論以本發(fā)明所述方法制得的輻照交聯(lián)異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)加自體刃 厚皮移植修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面或切瘢后創(chuàng)面不失為一種較為理想的材料。
權(quán)利要求
1、輻照無菌異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法，主要包括以下步驟a、取皮，用5％碘伏浸泡10～30分鐘滅菌，脫毛，去脂，裁剪，用純凈水清洗，甩干至含水量15～25％之間；其特征在于b、上機(jī)切皮，真皮、表皮分離，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3～0.8±0.04mm；c、. 脫細(xì)胞一脫上述真皮部分首先用1~15％的氯化鈉水溶液浸泡30分鐘后用純凈水清洗；然后用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分鐘后用純凈水清洗；使細(xì)胞核與細(xì)胞壁分離后，用36～40℃生理鹽水清洗2~4次甩干，再用純凈水清洗2~4次甩干，瀝水30分；二脫將上述瀝水后含水量在10～30％的皮片，最佳含水量25％，再用10～20％的脫氧核糖核酸酶、10～30％的核糖核酸酶先后交替地在36～40℃下，每次浸泡20～40分鐘；各浸泡2～4次后，再用脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分鐘；d、. 除去真皮內(nèi)可誘發(fā)宿主細(xì)胞識(shí)別反應(yīng)的物質(zhì)將前述處理后的材料用PH值7.5~8.5的純水清洗甩干；采用常規(guī)固定劑在25～36℃下，浸泡50～120分鐘；e、輻照滅菌經(jīng)過電子加速器或Co-60進(jìn)行γ射線輻照滅菌；輻照劑量150萬～400萬拉德；照射時(shí)間60～180秒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的輻照無菌異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法，其特征在于所 述的保留基底膜的真皮部分厚度為0.5mm±0. 04mm最佳。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的輻照無菌異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法，其特征在于所 述的輻照滅菌放置皮片的吊具與放射源以20-60度角接觸，距離10公分。
4、 一種輻照無菌異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于所述的輻照無菌異種皮脫細(xì)胞 基質(zhì)是采用權(quán)利要求1~3的方法制得。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)用生物皮制品領(lǐng)域。輻照無菌異種皮脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法，主要包括取皮；上機(jī)切皮，真皮、表皮分離，脫細(xì)胞一脫用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分鐘后用純凈水清洗；二脫將上述瀝水后含水量在10～30％的皮片，再用10～20％的脫氧核糖核酸酶、10～30％的核糖核酸酶先后交替地在36～40℃下，各浸泡2～4次后，再用脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分鐘，除去真皮內(nèi)可誘發(fā)宿主細(xì)胞識(shí)別反應(yīng)的物質(zhì)；將前述處理后的材料采用常規(guī)固定劑，浸泡50～120分鐘；輻照滅菌經(jīng)過電子加速器或Co-60進(jìn)行γ射線輻照滅菌。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101468213SQ200710060519
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者翔 郭 申請(qǐng)人:翔 郭