專利名稱：：一種重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及基因工程重組蛋白疫苗，特別是涉及一種預(yù)防動物口蹄疫病毒感染的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的烈性傳染病。豬、牛、羊都可感染口蹄疫病毒而發(fā)生口蹄疫，輕者在口、舌、唇、蹄、乳房等部位出現(xiàn)水泡、破潰及爛斑等病變，重者發(fā)生死亡。口蹄疫的發(fā)生和流行會造成巨大的直接和間接的經(jīng)濟損失(江鵬斐，趙啟祖，謝慶閣，口蹄疫研究進展中國農(nóng)業(yè)科學1999，32(6):93100)。國際獸疫局(OIE)將口蹄疫列為A類家畜傳染病。世界各國對預(yù)防和控制口蹄疫都十分重視。除屠殺感染口蹄疫的家畜外，接種疫苗是預(yù)防和控制口蹄疫的主要措施(M.WoolhouseandA.Donaldson，Managingfoot-and-mouthdisease:thescienceofcontrollingdiseaseoutbreaks.Nature410(2001)，pp.515-516)。傳統(tǒng)的口蹄疫疫苗由滅活的初步純化的口蹄疫病毒加油佐劑乳化制成的滅活苗，對易感家畜有相當?shù)谋Ｗo作用，但存在滅活不充分而引發(fā)口蹄疫的可能。此外，在生產(chǎn)這種疫苗過程中動用的有活力的口蹄疫病毒是一種不可忽視的潛在傳染源。二十世紀80年代初以來，許多國家投入了大量人力、物力和財力研制新型口蹄疫疫苗，研究的疫苗有重組蛋白疫苗，合成肽疫苗，活載體疫苗和DNA疫苗等(Ward,G.，Rieder，E.&Mason，P.W.(1997).PlasmidDNAencodingreplicatingfoot-and-mouthdiseasevirusgenomesinducesantiviralimmuneresponsesinswine.JournalofVirology71，7442-7447;BerinsteinA，TamiC，Taboga0，SmitsaartE，CarrilloE.Protectiveimmunityagainstfoot-and-mouthdiseasevirusinducedbyarecombinantvacciniavirus.Vaccine.2000Apr28;18(21):2231-8)。一些疫苗顯示了較好的效果，但大部分仍在實驗室的探索之中?？谔阋卟《?foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)是口蹄疫的病原體，是小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了7個血清型，即0、A、C型(稱歐洲型)，SAT1、SAT2、SAT3型(南非1、2、3型，稱非洲型)和Asial型(亞洲I型，稱亞洲型)。研究表明，體液免疫在抗口蹄疫病毒感染中起主要作用(Constructionandevaluationofanattenuatedvaccineforfoot—and-mouthdisease:difficultyadaptingtheleaderproteinase—deletedstrategytotheserotype01virus.VirusRes1998May;55(1):49-60)。隨著基因工程技術(shù)的的發(fā)展，安全高效的基因工程疫苗的將逐漸取代安全性差的傳統(tǒng)滅活疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供的應(yīng)用重組DNA和基因工程技術(shù)在大腸桿菌生產(chǎn)的一種重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗，對口蹄疫病毒特別是Asial型口蹄疫病毒感染有防治作用。本發(fā)明中，應(yīng)用重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗免疫豚鼠，免疫后獲得的血清在細胞中和試驗和乳鼠中和實驗中，具有良好的中和口蹄疫病毒的作用，其保護效果不亞于陽性疫苗對照(商品化的滅活口蹄疫疫苗)。本發(fā)明提供的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗在生產(chǎn)方式上區(qū)別于傳統(tǒng)滅活口蹄疫病毒疫苗，且在安全性上具有傳統(tǒng)滅活口蹄疫病毒疫苗無法比擬的優(yōu)勢。本發(fā)明還涉及該重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗在制備用于防治動物口蹄疫病毒感染的生物制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。本發(fā)明還涉及該重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗的施用對象、施用方法、藥物學載體和施用劑量。本發(fā)明中術(shù)語的含義在本發(fā)明的上下文中，所使用的術(shù)語除非另外說明，一般具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。特別地，下列術(shù)語具有如下的含義口蹄疫病毒感染引起的相關(guān)疾病是由FMDV引起的偶蹄類動物共患的接觸性傳染病。FMDV是一種RNA病毒，其基因組約包含7500-8000個堿基。FMDV主要以唾液的方式傳播，傳播的速度很快，易引發(fā)大面積的流行。牛、豬、羊、鹿等均為口蹄疫病毒的感染動物。Asial型口蹄疫病毒本發(fā)明中，Asial型口蹄疫病毒和亞洲一型口蹄疫病毒具有相同的含義o口蹄疫病毒敏感細胞株指可被口蹄疫病毒感染的細胞株，一般由人工分離獲得。如可被Asial口蹄疫病毒毒株AKT03感染的B服21細胞株。重組蛋白疫苗是利用分子克隆技術(shù)，將編碼具有免疫原性的蛋白或多肽的基因克隆到原核或真核細胞的表達載體上，用此載體在細菌或真核細胞(酵母細胞或哺乳動物細胞)生產(chǎn)的具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽，這種蛋白質(zhì)或多肽在應(yīng)用于機體后可刺激機體(人或動物)發(fā)生特異性的體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答。若將病毒如口蹄疫病毒基因編碼的具有免疫原性的蛋白或多肽的基因克隆到原核或真核細胞的表達載體上，用其在細菌或真核細胞(酵母細胞或哺乳動物細胞)生產(chǎn)的由病毒基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽是具有抗病毒作用的重組蛋白疫苗。這種疫苗在應(yīng)用于機體(人或動物)后可誘導(dǎo)機體發(fā)生特異性的體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答，防止病毒如口蹄疫病毒引起的感染?？谔阋卟《綱P1抗原是FMD病毒殼蛋白的一部分，它可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生具有保護作用的口蹄疫病毒中和抗體。核酸疫苗也稱為DNA疫苗，是攜帶能引起保護性免疫反應(yīng)的抗原基因的真核細胞表達質(zhì)粒。注射后，DNA疫苗可被肌肉細胞和樹突狀細胞攝取，以染色體外DNA的形式在細胞內(nèi)停留較長的時間，并表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，后者刺激機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答。佐劑佐劑(adjuvant)是和抗原一起應(yīng)用后能夠增強抗原免疫原性的物質(zhì)。包括但不限于鋁佐劑、油佐劑、膠體顆粒佐劑、多種細菌或細菌細胞壁的成分(殺死的百日咳毒桿菌、分枝桿菌的胞壁酰二肽、細菌脂多糖)、福氏完全佐劑、細菌的熱休克蛋白、細菌的DNA、人工合成的含CpG的寡核苷酸、Toll樣受體的激活劑。非特異性免疫增強劑是指能非特異增強，體免疫反應(yīng)的制劑，這些制劑包括但不限于卡介苗(BacillisCalmette-Gruen，BCG)，短小棒狀桿菌(Corynabacteriumparvum，金黃色葡萄球菌，CD40配體，細菌核糖體提取物(Ribosomalfractions),細菌膜提取物(membranarbacterialfractions)，細菌膜proteoglycanes,polyarginine，HSP-60,HSP-70，HSP-90和CTLA-4抑制劑等。病原體載體疫苗是將編碼某一蛋白抗原的基因轉(zhuǎn)入減毒的病毒或細菌而制成的疫苗。病原體載體疫苗在應(yīng)用于人體后，會在體內(nèi)增殖并將蛋白抗原的基因表達成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，后者刺激人體發(fā)生免疫應(yīng)答。可將一種病原體的兩個或多個蛋白抗原的編碼基因、兩種或多個病原體的蛋白抗原編碼基因種轉(zhuǎn)入同一種病原體制成病原體載體疫苗。痘苗病毒(vacciniavirus)是常用的載體，已被用于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、麻疹病毒、單純皰疹病毒等重組載體疫苗的研制。另外，金絲雀痘病毒(canarypoxvirus),減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒、減毒傷寒桿菌、卡介苗也可作為病原體載體疫苗的載體。有些病原體載體疫苗，如采用減毒傷寒桿菌為載體的霍亂和痢疾口服疫苗可經(jīng)天然的病原體感染途徑接種，并能誘導(dǎo)分泌型IgA，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)點。藥物學可接受的載體藥物學可接受的載體(pharmaceuticallyacc印tablecarrier)是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)，此載體適合將本發(fā)明提供的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗應(yīng)用于個體。該載體可以是有機的、無機的、天然的或合成的。該載體包括各種溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳化劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩吸收的試劑、和其他的適合本發(fā)明中的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗應(yīng)用的載體。藥物學可接受的載體的選擇決定于本發(fā)明中本發(fā)明提供的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗的應(yīng)用方式?？勺⑸溆玫妮d體包括水、生理鹽水、PBS緩沖液(phosphatebufferedsalinesolution)、平衡鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油和乳化劑和濕化劑等。乳化劑可包括水包油乳化劑(oil/wateremulsion)和油包7夂乳化劑(owater/oilemulsion)。治療有效劑量是指在應(yīng)用后個體產(chǎn)生理想中和抗體效價的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗的劑量。這個"劑量"的多少決定于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的標準技術(shù)，還要參考其他因素，包括并不限于個體的大小，健康情況和疾病的嚴重程度等。本發(fā)明的重組蛋白疫苗可通過肌肉注射的方式給動物接種，接種的劑量為200-5000叫。為了加強效果，可在第一次免疫后14或21天進行1次加強免疫。為了達到理想的治療效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對此劑量作調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。在一些情況下，重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗可被多次施用。給藥途徑在應(yīng)用時，本發(fā)明中的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗可以經(jīng)由各種合適的給藥途徑(Route)來達到理想的效果。本發(fā)明中的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗可經(jīng)腸外給藥途徑施用，這些途徑包括皮下，肌肉、腹腔、鞘內(nèi)、皮內(nèi)和淋巴結(jié)內(nèi)注射。鎳親和柱本發(fā)明中，"鎳親和柱"與"鎳金屬螯合柱"具有相同的含義。上鎳親和柱前樣品本發(fā)明中的"上鎳親和柱前樣品"是指實施例7的7.1中的含有重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗原核表達載體的細菌裂解上清。流穿樣品本發(fā)明中的"流穿樣品"是指在實施例7的7.1中，含有重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗原核表達載體的細菌裂解上清加樣到鎳金屬螯合柱時，從加樣開始到加樣結(jié)束收集的流經(jīng)鎳金屬螯和柱的樣品。洗滌液洗柱樣品本發(fā)明中的"洗滌液洗柱樣品"是指在實施例7的7.1中用洗滌緩沖液洗鎳金屬螯和柱時，收集的流經(jīng)鎳金屬螯和柱的洗滌緩沖液。洗脫樣品(含自的蛋白)本發(fā)明中的"洗脫樣品(含目的蛋白)"是指在實施例7的7.1中，洗脫緩沖液流經(jīng)洗滌液洗滌后的鎳金屬螯和柱時，收集的樣品(含目的蛋白)。除鹽后樣品l、2、3(含目的蛋白)本發(fā)明中的"除鹽后樣品l、2、3(含目的蛋白)"是指實施例7的7.2中，在用裝填有S印hadexG25介質(zhì)的除鹽柱除鹽過程中，鎳金屬螯和柱洗脫緩沖液在流經(jīng)洗滌液洗滌后的鎳金屬螯和柱時，收集的洗脫樣品(含目的蛋白)上除鹽柱后，分段收集的用IOmMPBS，pH7.2洗脫的蛋白(含目的蛋白)。附圖l說明A2重組pET-28a(+)質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，EcoRI/HindIII酶切后可見目的DNA片段。泳道1:DNAMarker泳道2:EcoRI/HindIII酶切質(zhì)粒，765bp處可見目的DNA片段。附圖2說明A6重組pET-28a(+)質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，EcoRI/HindIII酶切后可見目的DNA片段。泳道1:EcoRI/HindIII酶切質(zhì)粒，816bp處可見目的DNA片段泳道2:未酶切質(zhì)粒泳道3:DNAMarker附圖3說明A7重組pET-28a(+)質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，EcoRI/HindIII酶切后可見目的DNA片段。泳道1:DNAMarker泳道2:EcoRI/HindIII酶切質(zhì)粒，1128bp處可見目的DNA片段泳道3:未酶切質(zhì)粒附圖4說明A9重組pET-28a(+)質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，EcoRI/HindIII酶切后可見目的DNA片段。泳道1:EcoRI/HindIII酶切質(zhì)粒，948bp處可見目的DNA片段泳道2:DNAMarker附圖5說明:含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2的SDS一PAGE電泳圖，經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其中含有SEQIDNO5所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌&L21表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2約占菌體總蛋白的70%。泳道l:誘導(dǎo)前。泳道2:IPTG誘導(dǎo)3h。在33KD處為目的蛋白泳道3:蛋白Marker附圖6說明含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6的SDS一PAGE電泳圖，經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其中含有SEQIDNO6所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6約占菌體總蛋白的40%。泳道1:IPTG誘導(dǎo)3h，在34.82KD處為目的蛋白。泳道2:誘導(dǎo)前。泳道3:蛋白Marker附圖7說明含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7的SDS一PAGE電泳圖，經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其中含有SEQIDNO7所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2約占菌體總蛋白的45%。泳道l:IPTG誘導(dǎo)3h。在48.01KD處為目的蛋白泳道2:誘導(dǎo)前泳道3:蛋白Marker附圖8說明:含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9的SDS一PAGE電泳圖，經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其中含有SEQIDNO8所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9約占菌體總蛋白的35%。泳道l:蛋白Marker泳道2:誘導(dǎo)前泳道3:IPTG誘導(dǎo)3h。在39.77KD處為目的蛋白附圖9說明含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2純化的SDS-PAGE電泳圖。經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度達95%。泳道l:蛋白Marker泳道2:上鎳親和柱前樣品泳道3:流穿樣品泳道4:洗滌液洗柱樣品泳道5:洗脫樣品[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A2)]泳道6:除鹽后樣品1[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A2)]泳道7:除鹽后樣品2[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A2)]泳道8:除鹽后樣品3[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A2)]附圖10說明含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6純化的SDS-PAGE電泳圖。經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度達95%。泳道l:上鎳親和柱前樣品泳道2:流穿樣品泳道3:洗滌液洗柱樣品泳道4:洗脫樣品[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A6)]泳道5:除鹽后樣品1[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A6)]泳道6:除鹽后樣品2[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A6)]泳道7:蛋白Marker附圖11說明含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7純化的SDS-PAGE電泳圖。經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度達95%。泳道1:蛋白Marker泳道2:上鎳親和柱前樣品泳道3:流穿樣品泳道4:洗滌液洗柱樣品泳道5:洗脫樣品[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A7)]泳道6:除鹽后樣品1[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A7)]泳道7:除鹽后樣品2[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A7)]附圖12說明含重組pET-28a(+)質(zhì)粒大腸桿菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9純化的SDS-PAGE電泳圖。經(jīng)GIS凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度達95%。泳道1:蛋白Marker泳道2:上鎳親和柱前樣品泳道3:流穿樣品泳道4:洗滌液洗柱樣品泳道5:洗脫樣品[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A9)]泳道6:除鹽后樣品1[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A9)]泳道7:除鹽后樣品2[含目的蛋白(重組口蹄疫病毒融合蛋白A9)]下面結(jié)合具體的制備實施例和生物學效果實施例，并參照附圖進一步詳細地描述本發(fā)明。這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。具體實施方式在如下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，例如MolecularCloning—書(J.Sambrook，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)所述的方法。實施例l合成重組口蹄疫病毒融合蛋白(A2)編碼基因的構(gòu)建1.1A2編碼基因DNA片段1的合成采用二輪PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段1。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物1:5'TACGGTGMGAATCTTCTCGCCGCGGTGACCTGGCAGCACTGGCACGTCGTGTTAA3'引物2:5'ACGAGCGGTCTGAGTTTCGCCACCAGAGGTCGGCAGACGGTTGTTAACACGACGTGCCA3'引物3:5'GAATTCAGATCTGGCGGCTACAACGGCAAAACCACCTACGGTGAAGAATCTTCT3'引物4:5'MGCTTGGATCCAACGAAACGGTCCAGAACGAAAGCAACATCAGTGTGCAGGCGACGAGCGGTCTGAGTTTC3'將引物l、引物2互為模板做第一輪PCR。第一輪PCR反應(yīng)條件95°C，45s;55°C，lmin;72°C，2min;5個循環(huán)，5個循環(huán)后72'C延伸IOmin。將得到的PCR產(chǎn)物作為模板，引物3、引物4為引物，做第二輪PCR。第二輪PCR反應(yīng)條件94。C，30s;55'C，lmin;72°C，2min;25個循環(huán)，25個循環(huán)后72。C延伸10min。將第二輪PCR產(chǎn)物做2免瓊脂糖凝膠電泳。采用北京鼎國公司的DNA回收試劑盒回收用PCR合成的重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段1，并將其克隆入pMD18-TVect質(zhì)粒(TakaRa公司)。將克隆有重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基DNA片段l的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，測定插入片段的DNA序列(上海生工生物工程有限公司)，測序結(jié)果表明插入片段序列正確。1.2A2編碼基因DNA片段2的合成采用PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物5:5'TGGTGACTTAGCAGCACTCGCACGCCGTGTAAATAATCGCCTTCCAGGTGGTACTACTC3'引物6:5'CTGCTTCTCTGGAGCGATGATCTCCTGCTTACGACGATCTTGAGTAGTACCACCTGGAA3'引物7:5'CCATGGTTGAATTCAGATCTGGTGGCGAATCTTCCCGTCGTGGTGACTTAGCAGCACTC3'引物8:5'CTCGAGTCAMGCTTGGATCCGAGATCGAAATTCCAGGTCTGCTTCTCTGGAGCGATGA3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段2的方法如實施例l中l(wèi).l。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，測定插入片段的DNA序列(上海生工生物工程有限公司)，測序結(jié)果表明插入片段序列正確。1.3重組口蹄疫病毒融合蛋白(A2)編碼基因的構(gòu)建用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2。用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段1的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段1。用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段1連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段三聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，用Bglll消化含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段三聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段2二聚體連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因DNA片段五聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。此五聚體含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因的DNA片段，重組口蹄疫病毒融合蛋白A2編碼基因的序列如SEQIDN0:5所示，其編碼的蛋白質(zhì)為重組口蹄疫病毒融合蛋白A2，其氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。實施例2重組口蹄疫病毒融合蛋白(A6)編碼基因的構(gòu)建2.1A6編碼基因DNA片段1的合成采用二輪PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物1:5'TACGGTGAAGAATCTTCTCGCCGCGGTGACCTGGCAGCACTGGCACGTCGTGTTAA3'引物2:5'ACGAGCGGTCTGAGTTTCGCCACCAGAGGTCGGCAGACGGTTGTTAACACGACGTGCCA3'引物3:5'GAATTCAGATCTGGCGGCTACAACGGCAAAACCACCTACGGTGAAGAATCTTCT3'引物4:5'AAGCTTGGATCCAACGAAACGGTCCAGAACGAAAGCAACATCAGTGTGCAGGCGACGAGCGGTCTGAGTTTC3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1的方法如實施例l中l(wèi).l。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段l的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明插入片段序列正確。2.2A6編碼基因DNA片段2的合成采用PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物5:5'TGGTGACTTAGCAGCACTCGCACGCCGTGTAAATAATCGCCTTCCAGGTGGTACTACTC3'引物6:5'CTGCTTCTCTGGAGCGATGATCTCCTGCTTACGACGATCTTGAGTAGTACCACCTGGAA3'引物7:5'GMTTCAGATCTGGTGGCGAATCTTCCCGTCGTGGTGACTTAGCAGCACTC3'引物8:5'CTCGAGTC嵐GCTTGGATCCGAGATCGAAATTCCAGGTCTGCTTCTCTGGAGCGATGA3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段2的方法如實施例l中l(wèi).1。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明插入片段序列正確。2.3A6編碼基因DNA片段3的合成采用PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段3。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物9:5'CTGGCTGCACTGGCTCGCCGTGTTAATAATCGCCTGCCGGGTGGCGAAGAAAATTACGGTGGTG3'引物10:5'CGAAGGCCACATCGGTATGCAGACGACGGGCGGTCTGGGTTTCACCACCGTAATTTTCT3'引物11:5'GAATTCAGATCTGGTGGTGAGAGTAGTCGTCGTGGTGACCTGGCTGCACTGGCTCGC3'引物12:5'MGCTTGGATCCCTGGGTCAGTTTCACGAAACGGTCCAGCACGAAGGCCACATCGGTAT3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段3的方法如實施例l中l(wèi).1。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段3的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明插入片段序列正確。2.4重組口蹄疫病毒融合蛋白(A6)編碼基因的構(gòu)建用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段3的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2、3二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1二聚體的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1、2三聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2、3二聚體的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2、3二聚體，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1、2三聚體的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段2、3二聚體連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因DNA片段1、2、3五聚體的重組pMD18_TVect質(zhì)粒。此五聚體含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因的DNA片段，重組口蹄疫病毒融合蛋白A6編碼基因的序列如SEQIDN0:6所示，其編碼的蛋白質(zhì)為重組口蹄疫病毒融合蛋白A6，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。實施例3合成重組口蹄疫病毒融合蛋白(A7)編碼基因的構(gòu)建3.1A7編碼基因DNA片段1的合成采用二輪PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物1:5'TACGGTGAAGAATCTTCTCGCCGCGGTGACCTGGCAGCACTGGCACGTCGTGTTAA3'引物2:5'ACGAGCGGTCTGAGTTTCGCCACCAGAGGTCGGCAGACGGTTGTTAACACGACGTGCCA3'引物3:5'GAATTCAGATCTGGCGGCTACAACGGCAAAACCACCTACGGTGAAGAATCTTCT3'引物4:5'AAGCTTGGATCCAACGAAACGGTCCAGAACGAAAGCAACATCAGTGTGCAGGCGACGAGCGGTCTGAGTTTC3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段1的方法如實施例l中l(wèi).l。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段l的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果表明插入片段序列正確。3.2A7編碼基因DNA片段2的合成采用PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物5:5'TGGTGACTTAGCAGCACTCGCACGCCGTGTAAATAATCGCCTTCCAGGTGGTACTACTC3'引物6:5'CTGCTTCTCTGGAGCGATGATCTCCTGCTTACGACGATCTTGAGTAGTACCACCTGGAA3'引物7:5'GAATTCAGATCTGGTGGCGAATCTTCCCGTCGTGGTGACTTAGCAGCACTC3'引物8:5'CTCGAGTCAAAGCTTGGATCCGAGATCGAAATTCCAGGTCTGCTTCTCTGGAGCGATGA3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段2的方法如實施例l中l(wèi).l。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果表明插入片段序列正確。3.3A7編碼基因DNA片段3的合成采用PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段3。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物9:5'CTGGCTGCACTGGCTCGCCGTGTTAATAATCGCCTGCCGGGTGGCGAAGAAAATTACGGTGGTG3'引物10:5'CGAAGGCCACATCGGTATGCAGACGACGGGCGGTCTGGGTTTCACCACCGTAATTTTCT3'引物11:5'GMTTCAGATCTGGTGGTGAGAGTAGTCGTCGTGGTGACCTGGCTGCACTGGCTCGC3'引物12:5'AAGCTTGGATCCCTGGGTCAGTTTCACGAAACGGTCCAGCACGAAGGCCACATCGGTAT3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段3的方法如實施例l中l(wèi).1。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白編碼基因DNA片段3的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果表明插入片段序列正確。3.4重組口蹄疫病毒融合蛋白(A7)編碼基因的構(gòu)建用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BaMH和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1的PMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段3的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、BglII消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2，用BglII消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1二聚體的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1、2三聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、BglII消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體,用BglII消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1、2三聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1、2、3五聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、BglII消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體，用BglII消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1、2、3五聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段2、3二聚體連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因DNA片段1、2、3七聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。此七聚體含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因的DNA片段，重組口蹄疫病毒融合蛋白A7編碼基因的序列如SEQIDN0:7所示，其編碼的蛋白質(zhì)為重組口蹄疫病毒融合蛋白A7，其氨基酸序列如SEQIDN0:3所示。實施例4合成重組口蹄疫病毒融合蛋白(A9)編碼基因的構(gòu)建4.1A9編碼基因DNA片段1的合成采用二輪PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物1:5'CTGGCTGCACTGGCTCGTCGTGTTAATAATCGCCTGCCGGGTGGCGAAGAAAATTACGGTGGTG3'引物2:5'CGAAGGCCACATCGGTATGCAGACGACGGGCGGTCTGGGTTTCACCACCGTAATTTTCT3'引物3:5'GMTTCAGATCTGGTGGTGAGAGTAGTCGTCGTGGTGACCTGGCTGCACTGGCTCGT3'引物4:5'AAGCTTGGATCCCTGGGTCAGTTTCACGAAACGGTCCAGCACGAAGGCCACATCGGTAT3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1的方法如實施例l中l(wèi).1。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段l的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序。4.2A9編碼基因DNA片段2的合成采用PCR方法合成重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段2。設(shè)計并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)引物5:5'TGGTGACTTAGCAGCACTCGCACGCCGTGTAAATAATCGCCTTCCAGGTGGTACTACTC3'引物6:5'CTGCTTCTCTGGAGCGATGATCTCCTGCTTACGACGATCTTGAGTAGTACCACCTGGAA3'引物7:5'CCATGGTTGAATTCAGATCTGGTGGCGMTCTTCCCGTCGTGGTGACTTAGCAGCACTC3'引物8:5'CTCGAGTCAAAGCTTGGATCCGAGATCGAAATTCCAGGTCTGCTTCTCTGGAGCGATGA3'采用的PCR反應(yīng)條件、回收和克隆重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段2的方法如實施例l中l(wèi).l。將含重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Novagen公司)。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)，酶切鑒定方向，方向正確后送于上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果表明插入片段序列正確。4.3重組口蹄疫病毒融合蛋白(A9)編碼基因的構(gòu)建用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1的pMD18-TVect質(zhì)粒得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段2的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段l、2二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2二聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2二聚體，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2二聚體的PMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2二聚體連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2四聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。用BamHI、Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2四聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒，得到帶有BamHI和Bglll粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2四聚體，用Bglll消化載有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2二聚體的pMD18-TVect質(zhì)粒得到線性質(zhì)粒，用T4連接酶將帶BamHI和BglII粘性末端的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2四聚體連接入此線性質(zhì)粒，得到含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因DNA片段1、2六聚體的重組pMD18-TVect質(zhì)粒。此六聚體含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因的DNA片段，重組口蹄疫病毒融合蛋白A9編碼基因的序列如SEQIDNO:8所示，其編碼的蛋白質(zhì)為重組口蹄疫病毒融合蛋白A9，其氨基酸序列如SEQIDN0:4所示。實施例5重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9編碼基因的克隆、次級克隆5.1分別將前述實施例中所述的含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9的編碼基因DNA片段克隆入pMD18-TVect質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109'細胞，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒(J-Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Molecularcloning,1989)。5.2重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9編碼基因亞克隆入原核表達載體用EcoRI和HindIII消化含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9的編碼基因DNA片段的pMD18-TVect質(zhì)粒和pET28a(+)空質(zhì)粒。用T4連接酶將含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9的編碼基因DNA片段分別與酶切后的pET28a(+)線性載體相連接，轉(zhuǎn)化入表達菌大腸桿菌BL21(DE3)，提取質(zhì)粒，用EcoRI和HindIII酶切鑒定，其DNA的瓊脂糖電泳如圖一、圖二、圖三、圖四所示。分別對含有重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9編碼基因DNA片段的pET-28a(+)質(zhì)粒進行DNA測序(上海生工生物工程有限公司)。重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9的編碼基因DNA片段序列如SEQIDNO:5、6、7、8所示。實施例6重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2、A6、A7、A9的表達將含有SEQIDN05、6、7、8所示核苷酸序列的原核表達載體的單菌落接種于含100mlLB培養(yǎng)基，于500ml三角燒瓶中，37。C震蕩培養(yǎng)至0D600為0.6。加入IPTG使其終濃度為lmM/L，37。C震蕩培養(yǎng)3小時。將培養(yǎng)物收集于50mL離心管中，5000rpm、4°C離心15min。棄上清，收集細菌，立即使用或一70。C凍存。對表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白進行SDS—PAGE電泳，其中含有SEQIDNO5所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A2約占菌體總蛋白的70%(見圖五)；含有SEQIDNO6所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A6約占菌體總蛋白的4(m(見圖六)；含有SEQIDNO7所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A7約占菌體總蛋白的45%(見圖七)；含有SEQIDNO8所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白A9約占菌體總蛋白的35%(見圖八)。分別將上述的含有重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2、A6、A7、A9原核表達載體的細菌重懸于細胞裂解液(20mMTris，0.5MNaCl，5mM咪唑，調(diào)pH至7.9)中，l克濕菌/3ml細胞裂解液，加DNA酶至終濃度2mg/mL，加lmMMg2S04(10pl/ml)，加50mMPMSF(O.5pl/ml)，冰上孵育30min，5000rpm，離心15min，棄上清。對沉淀加結(jié)合液，1克濕菌產(chǎn)生的沉淀加6ml結(jié)合液(20mMTris，0.5MNaCl，5raM咪唑，6M尿素，調(diào)pH至7.9)。冰浴震搖2小時。5000rpm，離心30min，收上清留用。此上清即為含有重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2、A6、A7、A9原核表達載體的細菌裂菌上清(上鎳親和柱前樣品)。實施7重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2、A6、A7、A9的純化7.1親合層析用磷酸鹽緩沖液裝柱(20mMphosphate,pH7.21MNaCl)，層析介質(zhì)為S印harose4B-Ni2+(Pharmacia)并平衡。將含有重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2、A6、A7、A9原核表達載體的細菌裂解上清(見實施例6)加到鎳金屬螯合柱中，并收集流穿樣品。用洗滌緩沖液(20mMTris，pH7.9，0.5MNaCl，20mM咪唑，3M尿素洗柱，收集洗柱后的洗滌緩沖液。用洗脫緩沖液(20mMTris，pH7.9，0.5MNaCl,1M咪唑，2M尿素)洗脫，收集洗脫的蛋白。直到吸收值不再下降為止，用容器接取不同時段的流出液。7.2除鹽用S印hadexG25(Pharmacia)裝柱并用2個柱床體積的雙蒸水洗柱。用2個柱床體積的10mMPBS,pH7.2洗柱后，將鎳親和柱洗脫的蛋白上柱后，再用10mMPBS，pH7.2上柱，分段收集洗脫的蛋白，分裝后于一70。C凍干保存。用SDS-PAGE電泳對純化的重組口蹄疫病毒融合蛋白進行鑒定，其中含有SEQIDNO5所示核苷酸序列的原核表達載體表達的蛋白(A2)純化后，其純度達95%(見圖九)。其他的含有SEQIDNO6、7、8所示核苷酸序列的原核表達載體的大腸桿菌BL21表達菌表達的重組口蹄疫病毒融合蛋白(A6、A7、A9)經(jīng)純化后，純度分別達到95%、95%、95%，結(jié)果見圖十、圖H"^—、圖十二。實施例8重組口蹄疫病毒融合蛋白A2、A6、A7、A9的免疫每組3只豚鼠，分三組，雙后肢肌肉注射。實驗組重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗免疫(A2、A6、A7、A9)400ug/mL與等體積206油佐劑混合，肌肉注射lmL/只/次。陽性對照組牛Asial/0口蹄疫病毒滅活苗免疫(內(nèi)蒙生物制藥廠生產(chǎn))肌肉注射1mL/只/次。陰性對照組PBS與等體積206油佐劑混合，肌肉注射lmL/只/次。免疫時間第l天進行第一次免疫，第21天進行第二次免疫。在二次免疫后的第21天無菌取豚鼠心臟血，放置于試管中。37°C1小時。4'C傾斜放置過夜，待血潸充分析出后，收集血清，無菌分裝，-2(TC保存。用于做ELISA、細胞中和實驗、乳鼠中和實驗。實施例9重組口蹄疫病毒融合蛋白A2二次免疫豚鼠血清中口蹄疫病毒特異性抗體的檢測(間接ELISA法)用純化的滅活A(yù)sial型口蹄疫病毒做為包板的抗原。包被液為0.05M，PH值9.6的碳酸鹽緩沖液。包被液與純化的滅活A(yù)sial型口蹄疫病毒液(內(nèi)蒙古生物制藥廠)等體積混合，每孔1004'C包被過夜。用含0.05%吐溫20的PBS洗滌液洗板3次后，加入封閉液(含5WFBS的PBS)200nl于37'C孵箱放置2小時。洗滌液洗板3次，將重組口蹄疫病毒融合蛋白A2二次免疫后21天的豚鼠血清及陰性對照組、陽性對照組豚鼠血清(在實施例8制備)梯度稀釋后，加入酶標板，100pl/孔，設(shè)雙復(fù)孔，于37'C孵箱放置1小時。洗滌液洗板3次，加入l:5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗豚鼠IgG抗體，10(Vl/孔，37。C孵育l小時，洗滌液洗板3次，加入OPD底物溶液及H202避光放置10分鐘，用50ul2M硫酸終止顯色反應(yīng)，酶標儀測OD值(A492)，結(jié)果見表l。表1:重組口蹄疫病毒融合蛋白A2二次免疫豚鼠血清ELISA效價<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注蛋白疫苗重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗實驗組滅活疫苗牛Asial/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)果重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗免疫組抗體效價幾何均數(shù)大于l:1000。滅活疫苗免疫組抗體效價幾何均數(shù)大于1:1414。PBS組抗體效價幾何均數(shù)小于1:100。滅活疫苗組抗體效價大于重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗組的抗體效價。實施例10重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2免疫血清的細胞中和實驗細胞中和實驗在內(nèi)蒙古生物制藥廠進行，采用"AKT03"型口蹄疫病毒毒株(Asial口蹄疫病毒毒株，內(nèi)蒙古生物制藥廠提供)。將生長良好的BHK21細胞(內(nèi)蒙古生物制藥廠提供)消化計數(shù)，按細胞數(shù)5X104/(100uL'孔)鋪96孔平底細胞培養(yǎng)板。37°C，5%C02，培養(yǎng)24h，使細胞鋪滿單層。稀釋待測血清(實施例8中獲得的豚鼠血清)，各稀釋度血清終體積為250UL。將各個稀釋度血清與等量(即250uL)的100TCID50病毒液中和，置于37°C，1h，進行中和反應(yīng)。吸棄孔內(nèi)的細胞培養(yǎng)液，細胞對照孔加入IOOiiL細胞培養(yǎng)液，病毒對照孔加入100TCID50的病毒液100pL。實驗孔加入前述的各種稀釋度的血清和等量病毒中和反應(yīng)后的中和液IOOuL。置于37。C，5%C02，培養(yǎng)48h。采用Reed-Muench法，鏡下判斷CPE(致細胞病變效應(yīng))及用結(jié)晶紫染色法進行判定，如果孔中細胞結(jié)晶紫染色完全著色，病毒無致細胞病變效應(yīng)，判定為中和抗體100%保護，由此測定出二次免疫后21天豚鼠血清細胞中和實驗中，中和抗體100%保護細胞的最高抗體效價，結(jié)果見表2。表2:重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2免疫豚鼠血清細胞中和實驗細胞100%保護率的最高抗體效價免疫豚鼠血清編號中和抗體效價中和抗體效價幾何均數(shù)蛋白疫苗豚鼠l>1:724>1:724蛋白疫苗豚鼠2>1:724蛋白疫苗豚鼠3〉1:724滅活疫苗豚鼠l〉1:724>1:539滅活疫苗豚鼠21:512滅活疫苗豚鼠31:512PBS豚鼠1<1:3<1:3PBS豚鼠2<1:3PBS豚鼠3<1:3注蛋白疫苗重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗實驗組滅活疫苗牛Asial/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)果蛋白疫苗免疫組的中和抗體效價均大于l:724。滅活疫苗免疫組抗體效價幾何均數(shù)大于l:539。PBS組幾乎無中和抗體產(chǎn)生。蛋白疫苗組中和抗體效價大于滅活疫苗組。結(jié)論和傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，重組口蹄疫病毒融合蛋白A2免疫豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體。實施例11重組口蹄疫病毒融合蛋白A6免疫血清的細胞中和實驗重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A6氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示，實驗方法同實施例IO，結(jié)果見表3。表3:重組口蹄疫病毒融合蛋白A6免疫免疫豚鼠血清細胞中和實驗細胞100%保護率的最高抗體效價<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注蛋白疫苗重組口蹄疫病毒融合蛋白A6疫苗實驗組滅活疫苗牛Asia1/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)果蛋白疫苗免疫組的中和抗體效價均大于l:724。滅活疫苗免疫組抗體效價幾何均數(shù)大于h539。PBS組幾乎無中和抗體產(chǎn)生。蛋白疫苗組中和抗體效價大于滅活疫苗組。結(jié)論和傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，重組口蹄疫病毒融合蛋白A6免疫豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體。實施例12重組口蹄疫病毒融合蛋白A7免疫血清的細胞中和實驗重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A7氨基酸序列如序列表SEQIDNO3所示，實驗方法同實施例IO，結(jié)果見表4。表4:重組口蹄疫病毒融合蛋白A7免疫豚鼠血清細胞中和實驗細胞100%保護率的最高抗體效價<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注蛋白疫苗重組口蹄疫病毒融合蛋白A7疫苗實驗組滅活疫苗:牛Asia1/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)果蛋白疫苗免疫組的中和抗體效價大于h645。滅活疫苗免疫組抗體效價幾何均數(shù)大于1:539。PBS組幾乎無中和抗體產(chǎn)生。結(jié)論和傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，重組口蹄疫病毒融合蛋白A7免疫豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體。實施例13重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A9免疫血清的細胞中和實驗重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A9氨基酸序列如序列表SEQIDNO4所示，實施方法同實施例IO，結(jié)果如表5:表5:重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A9免疫豚鼠血清細胞中和實驗細胞100%保護率的最高抗體效價<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注蛋白疫苗重組口蹄疫病毒融合蛋白A9疫苗實驗組滅活疫苗牛Asia1/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)果蛋白疫苗免疫組的中和抗體效價均大于l:724。滅活疫苗免疫組抗體效價幾何均數(shù)大于l:539。PBS組幾乎無中和抗體產(chǎn)生。重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A9免疫豚鼠血清的中和抗體效價大于滅活疫苗陽性對照組結(jié)論和傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，重組口蹄疫病毒融合蛋白A9免疫豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體。實施例14重組口蹄疫病毒融合蛋白A2免疫血清的乳鼠中和實驗乳鼠中和實驗在內(nèi)蒙古生物制藥廠進行，采用"AKT03"型口蹄疫病毒毒株(Asial口蹄疫病毒毒株，內(nèi)蒙古生物制藥廠提供)。根據(jù)測得的病毒毒價(滴度10—8)，稀釋病毒液到200LD50/0.1ml。將待檢測血清(實施例8中獲得的豚鼠血清)57。C滅活半小時后，倍比稀釋待檢測血清，與等體積口蹄疫病毒液混合，37'C孵育1小時。實驗分組為蛋白疫苗組、滅活疫苗組、PBS組，經(jīng)乳鼠頸背部皮下注射前述的倍比稀釋待檢測血清與等體積口蹄疫病毒液混合后孵育l小時的中和液，O.lml/只。連續(xù)觀察3天，記錄各組發(fā)病、死亡情況。各組待測血清的血清稀釋度到1:512時乳鼠存活情況如表6。表6:重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A2免疫豚鼠血清中和抗體對乳鼠保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注蛋白疫苗即重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗實驗組滅活疫苗牛Asial/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)論重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗刺激豚鼠產(chǎn)生中和抗體，對乳鼠有較高的保護效果，表明重組口蹄疫病毒融合蛋白A2疫苗可用于預(yù)防動物感染口蹄疫病毒。實施例15重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A6免疫血清的乳鼠中和實驗實施方法同實施例14，各組待測血清的血清稀釋度到l:128時乳鼠存活情況如表7:表7:重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A6免疫豚鼠血清中和抗體對乳鼠的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注蛋白疫苗即重組口蹄疫病毒融合蛋白A6疫苗實驗組滅活疫苗牛Asial/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)論重組口蹄疫病毒融合蛋白A6疫苗刺激豚鼠產(chǎn)生中和抗體，對乳鼠有較高的保護效果，表明表明重組口蹄疫病毒融合蛋白A6疫苗可用于預(yù)防動物感染口蹄疫病毒。實施例16重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A7免疫血清的乳鼠中和實驗實施方法同實施例14,各組待測血清的血清稀釋度到1:128時乳鼠存活情況如表8:表8:重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A7免疫豚鼠血清中和抗體對乳鼠的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注蛋白疫苗即重組口蹄疫病毒融合蛋白A7疫苗實驗組滅活疫苗牛Asial/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)論重組口蹄疫病毒融合蛋白A7疫苗刺激豚鼠產(chǎn)生中和抗體，對乳鼠有較高的保護效果，表明表明重組口蹄疫病毒融合蛋白A7疫苗可用于預(yù)防動物感染口蹄疫病毒。實施例17重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A9免疫血清的乳鼠中和實驗實施方法同實施例14，各組待測血清的血清稀釋度到l:256時乳鼠存活情況如表9:表9:重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗A9免疫豚鼠血清中和抗體對乳鼠的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注蛋白疫苗即重組口蹄疫病毒融合蛋白A9疫苗實驗組滅活疫苗牛Asia1/0口蹄疫病毒滅活苗陽性對照組PBS:PBS陰性對照組結(jié)論重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗刺激豚鼠產(chǎn)生中和抗體，對乳鼠有較高的保護效果，表明表明重組口蹄疫病毒融合蛋白A9疫苗可用于預(yù)防動物感染口蹄疫病毒。序列表<110>北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司〈120〉一種重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗〈160>8<210>1<211>300〈212>PRT〈213〉人工序列<400>1MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuVal151015ProArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMet202530GlyArgGlySerGluPheArgSerGlyGlyGluSerSerArgArg354045GlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgArgValAsnAsnArgLeuPro505560GlyGlyThrThrGinAspArgArgLysGinGlulielieAlaPro657075GluLysGinThrTrpAsnPheAspleuGlySerGlyGlyGluSer808590SerArgArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgArgValAsnAsn95100105ArgLeuProGlyGlyThrThrGinAspArgArgLysGinGlulielieAlaGlyTyrGlyAspThrSerValAlaSerArgArgLeulieAlaGlyGluValAsnGinGluGlySerProGluAsnGlyLeuAlaGlyGlyPheValArgGlyProGlyProGluSerSerAsnArglielieLysLeu110115120LysGinThrTrpAsnPheAspLeuGlySerGly125130135LysThrThrTyrGlyGluGluSerSerArgArg140145150AlaLeuAlaArgArgValAsnAsnArgLeuPro155160165GluThrGinThrAlaArgArgLeuHisThrAsp170175180LeuAspArgPheValGlySerGlyGlyGluSer185190195AspLeuAlaAlaLeuAlaArgArgValAsnAsn200205210GlyThrThrGinAspArgArgLysGinGlulie215220225LysGinThrTrpAsnPheAspLeuGlySerGly230235240ArgArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgArg245250255LeuProGlyGlyThrThrGinAspArgArgLys260265270AlaProGluLysGinThrTrpAsnPheAspLeu275280285AlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHisHis290295300<210>2<211>317<212>PRT<213>人工序列〈400>2MetGlySerSer1ProArgGlySerGlyArgGlySerGlyAspLeuAlaGlyGlyThrThrGluLysGinThrSerArgArgGlyArgLeuProGlyAlaArgArgLeuValLysLeuThrAspLeuAlaAlaHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuVal51015HisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMet202530GluPheArgSerGlyGlyGluSerSerArgArg354045AlaLeuAlaArgArgValAsnAsnArgLeuPro50'5560GinAspArgArgLysGinGlulielieAlaPro657075TrpAsnPheAspLeuGlySerGlyGlyGluSer808590AspLeuAlaAlaLeuAlaArgArgValAsnAsn95100105GlyGluGluAsnTyrGlyGlyGluThrGinThr110115120HisThrAspValAlaPheValLeuAspArgPhe125130135GinGlySerGlyGlyGluSerSerArgArgGly140145150LeuAlaArgArgValAsnAsnArgLeuProGly155160165GlyThrLysGinLysThrAlaLeuGluThrLeuAspTyrGlyArgArgThrAlaPheValHisHis317<210>3〈211>421<212>PRT〈213〉人工序列<400>3MetGly1ProArgThrGinThrTrpThrTyrAlaArgGinThrArgPheGluGluValAsnArgArgGlySerAspArg170Asn'Phe185GlyArgGlyAspGlyGlyGluLysSerArgArgLeuAlaArgValLysAspLeuGlyThrLysGinSerGlyGlyLeuThrGinArgProArgLeuAlaThrThrGly200Arg215Ala230Val245Ser260Asn275Leu290Lys305GluValArgGlySerArgHisLeuSerSerSerAlaThrThrGlyGlyteuThrAlaGinTrpHisMetPheLeuAspAsnLeuHis5His20Glu35Ala50Gin65Trp80Asp95GlyGlu110HisThr125GinGly140LeuAla155AspArg170AsnPheArgLysGinGlulielieAlaProGlu175180AspLeuGlySerGlyGlyTyrAsnGly190195GluSerSerArgArgGlyAspLeuAla205210AsnAsnArgLeuProThrSerGlyGly220225ArgLeuHisThrAspValAlaPheVal235240SerGlyGlyTyrAsnGlyLysThrThr250255ArgArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAla265270LeuProThrSerGlyGlyGluThrGin280285ThrAspValAlaPheValLeuAspArg295300AlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHis310315HisHisHisHisSerSerGlyLeuVal1015AlaSerMetThrGlyGlyGinGinMet2530ArgSerGlyGlyGluSerSerArgArg4045AlaArgArgValAsnAsnArgLeuPro5560ArgArgLysGinGlulielieAlaPro7075PheAspLeuGlySerGlyGlyGluSer8590AlaAlaLeuAlaArgArgValAsnAsn100105GluAsnTyrGlyGlyGluThrGinThr115120AspValAlaPheValLeuAspArgPhe130135SerGlyGlyGluSerSerArgArgGly145150ArgArgValAsnAsnArgLeuProGly160165ArgLysGinGlulielieAlaProGlu175180AspLeuGlySerGlyGlyGluSerSerArgLeuArgLysLeuThrGinThrLeuThrAspGlyArgAlaValHis421ArgGlyProGlyArgLeuLeuThrAlaAlaThrGinThrTrpThrTyrAlaArgGinThrArgPheGluGluValAsnArgArgGlySer185AspLeu200GlyGlu215HisThr.230GinGly245LeuAla260AspArg275AsnPhe290GlyGlu305ArgVal320AlaArg335ValGly350SerSer365AsnArg'380LeuHis395LysLeu410<210>4<211>363<212>PRT〈213〉人工序列<400>4MetGly1ProArgGlyArgGlyAspGlyGlyLeuHisThrGinSerGlyGlyLeuGluThrGlySerHis5SerHis20SerGlu35AlaAla50GluAsn65AspVal80SerGly95190195AlaAlaLeuAlaArgArgValAsnAsnArg205210GluAsnTyrGlyGlyGluThrGinThrAla220225AspValAlaPheValLeuAspArgPheVal235240SerGlyGlyGluSerSerArgArgGlyAsp250255ArgArgValAsnAsnArgLeuProGlyGly265270ArgLysGinGlulielieAlaProGluLys280285AspLeuGlySerGlyGlyTyrAsnGlyLys295300GluSerSerArgArgGlyAspLeuAlaAla310315AsnAsnArgLeuProThrSerGlyGlyGlu325330ArgLeuHisThrAspValAlaPheValLeu340345SerGlyGlyTyrAsnGlyLysThrThrTyr355360ArgArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArg370375LeuProThrSerGlyGlyGluThrGinThr385390ThrAspValAlaPheValLeuAspArgPhe400405AlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHis415420HisHisHisHisHisSerSerGlyLeuVal1015MetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMet2530PheArgSerGlyGlyGluSerSerArgArg4045LeuAlaArgArgValAsnAsnArgLeuPro5560TyrGlyGlyGluThrGinThrAlaArgArg7075AlaPheValLeuAspArgPheValLysLeu8590GlyGluSerSerArgArgGlyAspLeuAla100105AlaGinTrpAspGlyHisGinLeuAspAsnLeuGluThrGlyAlaArgPheHisLeuAspAsnLeuGluThrGlyAlaArgPheAlaGluAspSerArgArgAspHisAlaArgPheAlaGluAspSerArgArgAspAlaAsnValGlyArgLysLeuHis363ArgArgAspAlaAsnValGlyArgLysLeuLeuTyrAlaGlyValGinGlyArgVal110LysGin125LeuGly140LeuAla155TyrGly170AlaPhe185GlyGlu200ValAsn215GinGlu230GlySer245AlaArg260GlyGly275PheVal290GluSer305AsnAsn320'Glulie335SerLys350AsnGluSerArgGlyValSerAsnlieGlyArgGluLeuSerArglieLeuAsnlieGlyArgGluLeuSerArglieGlyValThrAspArgLeuAlaAlaArglieGlyValThrAspArgLeuAlaGluAsnGinArgArgProProAlaLeu115Ala130Glu145Asn160Gin175Arg190Arg205Pro220Pro235Ser250Asn265Thr280Phe295Gly310Gly325Glu340Ala355ProProSerAsnThrPheGlyGlyGluSerArgAlaValAspGlyLysLeu<210>5〈211>900〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉53tgggC8gC3gccatcatcatcatcatcacagcagcggccatggctagcatgactggtggacagca幼tgggtcgcggatgaatcttcccgtcgtggtgacttagcsgcactcgcacgccggtggtactsctc幼gatcgtcgtaagcsggsgatcatcgaatttcgatctcggatctggtggcgaatcttcccgtcgtgcgccgtgtaaataatcgccttccatggtggtactactcaagatcgctccagagaagcagacctggaatttcgatctcggataccacctacggtgaagaatcttctcgcc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中和試驗中，可以中和Asial型口蹄疫病毒，對Asial型口蹄疫病毒敏感細胞株細胞具有保護作用。7.權(quán)利要求5中所述的特異性抗口蹄疫病毒抗體在口蹄疫病毒的乳鼠中和試驗中，可以中和Asial型口蹄疫病毒，對乳鼠具有保護作用。8.權(quán)利要求l、2、3、4中任一所述的疫苗用于制備用于防治Asial型口蹄疫病毒或Asial型口蹄疫病毒突變體感染引起的相關(guān)疾病的疫苗的用途。9.權(quán)利要求8所述的用途中，Asial型口蹄疫病毒感染的對象是牛，或者是羊，或者是豬，或者鹿，或是其他類型偶蹄動物中的一種，或者是人。10.按照權(quán)利要求8所述的用途，其中用于防治口蹄疫病毒感染的疫苗在應(yīng)用于權(quán)利要求9所述的對象時，其應(yīng)用劑量是藥物有效劑量。11.按照權(quán)利要求8所述的用途，其中用于防治口蹄疫病毒感染的疫苗在應(yīng)用于權(quán)利要求9所述的對象時，可與藥物學可接受的載體承載應(yīng)用。12.按照權(quán)利要求8所述的用途，其中用于防治口蹄疫病毒感染的疫苗在應(yīng)用于權(quán)利要求9所述的對象時，和佐劑或/和非特異性免疫增強劑聯(lián)合應(yīng)用。13.按照權(quán)利要求8所述的用途，其中用于防治口蹄疫病毒感染的疫苗在應(yīng)用于權(quán)利要求9所述的對象時，和一種或多種其它口蹄疫疫苗聯(lián)合應(yīng)用。14.按照權(quán)利要求8所述的用途，其中用于防治口蹄疫病毒感染的疫苗在應(yīng)用于權(quán)利要求9所述的對象時，經(jīng)腸外給藥途徑施用，這些途徑包括皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹腔、鞘內(nèi)、靜脈注射。15.權(quán)利要求1、2、3、4中任一所述的疫苗用于制備用于防治和Asial型口蹄疫病毒有交叉抗原的其它類型的口蹄疫病毒感染引起的相關(guān)疾病的疫苗的用途。全文摘要本發(fā)明提供了根據(jù)亞洲一型口蹄疫病毒設(shè)計的重組口蹄疫病毒融合蛋白疫苗。實驗證明，應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的本發(fā)明中的疫苗具有良好的免疫效果和防治口蹄疫感染功效。本發(fā)明提供了重組口蹄疫病毒蛋白疫苗氨基酸序列及其核苷酸序列及預(yù)防口蹄疫病毒感染方面的研究。文檔編號A61P31/14GK101244269SQ20071006384公開日2008年8月20日申請日期2007年2月13日優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日發(fā)明者于永利,任繼玲,張永勝,徐海飛,華王,王麗穎申請人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司