專利名稱：：阻止艾滋病毒和性病病原體性傳播的消毒劑硝酸鑭的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及硝酸鑭的新用途，更具體而言是用硝酸鑭制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑。
背景技術(shù)：
：性傳播疾病是全世界衛(wèi)生防疫和生殖健康的一大難題。以美國為例，每年的新病例有1200萬，1994年預(yù)防開支達(dá)到170億美元。在發(fā)展中國家(包括中國)，性傳播疾病引起的危害和損失也是巨大的。據(jù)我國權(quán)威部門公布的材料，我國性病的年增長率超過30%，艾滋病和艾滋病毒感染者的增長率，1999年比1998年分別增長105%和250%。在20多種性傳播疾病中，危害最大的是艾滋病。到2002年底，全球己死亡艾滋病人3000萬人，僅2002年就死亡310萬人，有4200萬人感染上了艾滋病毒，2002年就有500萬新感染者，每天有約一萬五千人新感染t.艾滋病毒，其中婦女約占總數(shù)的44%。由同性或異性性傳播引起的感染者占8090%.雖然已有高效聯(lián)合療法(雞尾酒療法)可以減少發(fā)病率和死亡率，但還不能治愈。所需要的醫(yī)療費(fèi)用更是絕大部分發(fā)展中國家的患者無法承受的開支。己有研究表明，其它的性傳播疾病會增加艾滋病毒感染的機(jī)會，所以針對殺滅其它性傳播疾病病原體的殺微生物劑的使用，除了直接減少這些疾病的發(fā)生之外，還會間接地阻止艾滋病毒的性傳播。因此，目前的主攻方向是研制出高效、價廉和安全的針對艾滋病毒的消毒劑。由此可見，研制出實(shí)用的消毒劑是社會十分迫切需要的。中國是稀土礦藏的貯藏大國，也是稀土化合物的生產(chǎn)大國，每年有大量初級稀土化合物出口。國內(nèi)外有相當(dāng)數(shù)量的科學(xué)家從事稀上化合物的應(yīng)用研究。就發(fā)明人目前所知稀土化合物在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥業(yè)中有廣泛用途。在醫(yī)藥業(yè)中'3-磺基異煙酸釹(臨床上稱為Trombodym)用于抗凝血(倪嘉纘主編.稀土生物無機(jī)化學(xué).科學(xué)出版社.1995:39-41);2.2%硝酸鈰(氯化鈰、乙酸鈰也可)水合物和1%磺胺嘧啶銀制成的水包油型基質(zhì)的半固體軟膏用于治療燒傷(倪嘉纘主編.稀土生物無機(jī)化學(xué).科學(xué)出版社.1995:42-47);鈦鐵試劑釹、釤制成的軟膏具有抗炎殺菌作用(倪嘉纘主編.稀土生物無機(jī)化學(xué).科學(xué)出版社.1995:47-50);磺基水楊酸稀土具有很好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和解熱作用(王流芳'吳集貴，鄧汝溫，谷貴文'張訓(xùn)凱'李渭莉，趙秀媛.科學(xué)通報(bào)，1990,35:1077;英文版，1991,36:117);現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)稀土化合物、配合物具有抗癌作用(王夔，韓萬書.中國生物無機(jī)化學(xué)十年進(jìn)展.高等教育出版社.1997:26-27)及抗艾滋病作用。我們發(fā)現(xiàn)硝酸鑭對人艾滋病毒的抑制活性(治療指數(shù)TI值)可以達(dá)到44004500，作為一種抗艾滋病毒的一種小分子化合物，它具有價格低廉，來源豐富，而且對人體的毒副作用小等特點(diǎn)。技術(shù)內(nèi)容及其它本發(fā)明的目的在于用有明確制備方法、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、市場上有售的化學(xué)試劑硝酸鑭，提供一種用硝酸鑭制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的新型消毒劑。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了下列的技術(shù)方案按硝酸鑭和賦型劑質(zhì)量比為l:1001:1000000的比例，制成片劑、乳劑、膠囊或凝膠。下面用實(shí)驗(yàn)來說明用硝酸鑭阻止人艾滋病毒和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的有益效果。一、硝酸鑭體外抗HIV-l病毒活性檢測的實(shí)驗(yàn)方法用硝酸鑭作為測試對象和世界首選抗艾滋病藥物AZT作為陽性對照，用MTT方法分別測試它們對50%C8166細(xì)胞產(chǎn)生的毒性(即IC5。)；用合胞體形成抑制實(shí)驗(yàn)測定它們對H9/HIV-1，感染細(xì)胞合胞體的50y。抑制率(EC5。)。然后用IC5。/EC5。得到它們的治療指數(shù)TI值，以確定在上述實(shí)驗(yàn)條件下它們對HIV病毒的抑制活性。病毒感染性的滴定HIV-1滴定按Johnson&Byington(1990)所述方法改良進(jìn)行在96孔培養(yǎng)板上，將HIV-1貯存液作5倍稀釋，共8個梯度，每個梯度設(shè)6孔，同時設(shè)置對照組。每孔加入C8166細(xì)胞50ul(2X107孔)，每孔體積為200ul。37°C，5%0)2培養(yǎng)。第三天補(bǔ)加新鮮完全培養(yǎng)基100yl，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞致病變效應(yīng)(Cyt叩athiceffect,CPE)，以每孔是否有合胞體的形成來確定；按Reed&Muench方法計(jì)算病毒的TCID5。(500/0Tissuecultureinfectiousdose)，即引起50%培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE的病毒上清稀釋度。MTT方法測定細(xì)胞存活與增殖將96細(xì)胞孔培養(yǎng)板低速離心后，小心吸去150u1上清，然后每孔加5mg/mlMTT溶液20"1，37°C，5%<:02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時，每孔加lOOu120%SDS-50%DMF，37。C孵育過夜，用Bio-Rad3550ELISA儀測定(測定波長為595咖；參考波長為655nm)。樣品對宿主細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)取4X107mlC8166細(xì)胞懸液100u1與不同濃度的樣品溶液混合，置37°C，5%(1)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3或5天，然后測定其細(xì)胞毒性IC5。(50°/。inhibitionconcentration)。樣品對HIV誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板上，將待測物用培養(yǎng)基進(jìn)行5倍稀釋，共8個梯度，每孔100u1，設(shè)2個重復(fù)孔，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照。對于HIV感染的細(xì)胞，每孔加4X10VmlC8166細(xì)胞懸液80u1，然后每孔加20u1HIV-1上清，每孔體積為200n1。在37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染后第三天觀察樣品對合胞體形成的影響。在倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。EC5。(50%effectiveconcentration)為抑制合胞體形成達(dá)50%時的樣品濃度。計(jì)算1，細(xì)胞生長抑制率ft)-(l—實(shí)驗(yàn)孔0D值Z對照孔0D值)X100(樣品的毒性)2，合胞體形成的生長抑制率(%)=(1—實(shí)驗(yàn)孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))X100(合胞體方法)3，ICs。為對50%的宿主細(xì)胞產(chǎn)毒性的樣品的濃度；EQ為具有50%合胞體形成抑制率的樣品的濃度。治療指數(shù)(TI值)為ICs。/EC5。的比值。研究中發(fā)現(xiàn)，所有測試樣品中，水合硝酸鑭為抗艾滋病毒活性最優(yōu)者，水合硝酸鈰也有一定的抗艾滋病毒活性。以下將結(jié)合附圖來詳細(xì)描述本發(fā)明，在附圖中圖1顯示的是陽性對照物AZT在上述實(shí)驗(yàn)研究中所得到的結(jié)果。圖2顯示的是抗艾滋病毒活性最優(yōu)者水合硝酸鑭在上述實(shí)驗(yàn)研究中第一次實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果。圖3顯示的是抗艾滋病毒活性最優(yōu)者水合硝酸鑭在上述實(shí)驗(yàn)研究中第二次平行實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果。由圖l可見AZT在上述實(shí)驗(yàn)中測得的IG。值為3.36ymol/L,ECs。值為0.227mnol/L(即0.000679umol/L),治療指數(shù)TI值為14798.%。結(jié)論:AZT具有很高的HIV病毒抑制活性。由圖2、3可見:水合硝酸鑭在上述實(shí)驗(yàn)中測得的IC犯值為2.65umol/L，EU值為0.000569umol/L，治療指數(shù)TI值為4657.29;由圖3可見水合硝酸鑭在上述實(shí)驗(yàn)中測得的ICs。值為3.48umol/L，ECso值為0.000789umol/L，治療指數(shù)TI值為4410.65。兩次平行實(shí)驗(yàn)的IC5。平均值為3.065umol/L，EG。平均值為0.000679umol/L，治療指數(shù)TI平均值為4533.97。二、硝酸鑭對HSV-1的抑制作用和對Vero細(xì)胞的毒性作用用PRA法測定硝酸鑭對人單純皰疹病毒(HSV)的抑制作用將Vero細(xì)胞懸液加入到24孔板(24X105/well)，37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；待細(xì)胞單層鋪滿24孔板后，每孔加200"1病毒上清或培養(yǎng)基，輕搖，使病毒稀釋液和細(xì)胞單層充分接觸，37°C，5%0)2孵育1小時；用RPMI1640培養(yǎng)基對藥物作兩倍稀釋，設(shè)置阿昔洛韋作陽性對照；小心吸出培養(yǎng)基，加入PBS洗板；加入未凝的瓊脂糖覆蓋培養(yǎng)基[A(RPMI1640+2%FCS，12ml，37。C水浴保溫)、B(1%現(xiàn)配瓊脂糖13ml，60。C水浴保溫)混和液]，每孔加lml。加入稀釋好的待測樣品液，每孔0.5ml，但第6孔(病毒生長孔)和第12孔(細(xì)胞生長孔)不加樣品液；置37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。然后用2%甲醛固定細(xì)胞10min;加入700u1龍膽紫染液，染色20min;用自來水輕輕洗滌3次，倒置晾干，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑。通過計(jì)算得到樣品硝酸鑭對病毒的抑制率。.空斑減少率(％)=(病毒對照組空斑數(shù)一藥物處理空斑數(shù))/病毒對照組空斑數(shù)X100用MTT法檢測硝酸鑭對細(xì)胞的毒性作用在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測化合物用培養(yǎng)基2倍稀釋。作7個稀釋度，每孔100u1，設(shè)兩個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含化合物的細(xì)胞對照組和空白組及阿昔洛韋陽性對照；離心(1000rpm,100min)，用完全培養(yǎng)基重懸Vero細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔加入100u1(4XlOVwell)細(xì)胞懸液；置37r，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。然后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板低速離心，棄去150ul培養(yǎng)上清，如人25ulMTT溶液(5mg/ml)，37°C，5%(:02培養(yǎng)箱中孵育4小時，加入20%SDS-50%DMF(pH4.7)，孵育過夜；用酶標(biāo)儀測定各孔的OD值。通過計(jì)算得到樣品硝酸鑭對細(xì)胞的存活率的影響，了解其毒性作用。細(xì)胞存活率(％)=實(shí)驗(yàn)孔00值/對照孔00值乂100通過實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)果表1硝酸鑭對HSV-1的抑制作用、對Vero細(xì)胞的毒性作用和TI值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、用MTT法測定硝酸鑭對性傳播疾病病菌白色念珠菌的抑制作用取待測樣品10mg，用100iil函SO助溶后，滴加900"1沙保氏培養(yǎng)基，充分混合后.使?jié)舛葹?0mg/ml，過濾除菌，置4X:保存；首先將待測樣品在96孔培養(yǎng)板上稀釋至合適的濃度，同時設(shè)置陰性對照和空白對照，每系列孔(除空白和生長對照孔外)，取100ul加入到下一孔，最終孔棄去lOOlil.用頭孢菌素作陽性對照，濃度稀釋方法與待測藥物相同；用沙保氏培養(yǎng)基把菌懸液濃度從4.5X106cfu/ml調(diào)到4.5X105cfu/ml，將稀釋好的菌液加入板中，每孔100iil，第9孔不加；接種菌液后，培養(yǎng)板于37'C，5%0)2培養(yǎng)中培養(yǎng)24小時，觀察生長情況。待陰性對照孔生長良好后，96孔培養(yǎng)板以1000rpm離心lOmini.吸出150u1培養(yǎng)基，每孔各加5mg/ml的MTT(含lmM甲萘醌)25yl.放入37。C溫箱4小時，然后各孔加20%SDS-50%DMF(pH4.7)100u1;培養(yǎng)板37。C放置12小時后，用酶辨儀于波長595nm，參考波長655nm下，測定0D值。通過計(jì)算得到樣品硝酸鑭對細(xì)菌的抑制率。抑制率(％)=(1—實(shí)驗(yàn)孔0D值/對照孔0D值)X100通過實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)果-表2硝酸鑭對白色念珠菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、硝酸鑭在制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求1所說的硝酸鑭在制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑的制備方法，為按硝酸鑭和賦型劑質(zhì)量比為1:100~1:1000000的比例，制成片劑、乳劑、膠囊或凝膠。3、權(quán)利要求1所說的應(yīng)用硝酸鑭制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑，其在抗HIV-1中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求1所說的應(yīng)用硝酸鑭制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑，其在抗HSV-1中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求1所說的應(yīng)用硝酸鑭制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑，其在抗白色念珠球菌中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑，更具體地說，涉及一種用市場上有售的化學(xué)試劑硝酸鑭來制備阻止人艾滋病和其它性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的消毒劑。本發(fā)明針對通過生殖道傳播的性傳播疾病病原體HIV-1、HSV-1和白色念珠球菌，用我國資源豐富、市場上有售的化學(xué)試劑硝酸鑭來制備消毒劑，提供一種預(yù)防和控制艾滋病及其它性傳播疾病有效、低毒、價廉的新型消毒劑。文檔編號A61K33/22GK101172114SQ200710065799公開日2008年5月7日申請日期2007年4月11日優(yōu)先權(quán)日2007年4月11日發(fā)明者鐘文遠(yuǎn)申請人:鐘文遠(yuǎn)