專利名稱：防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜禽寄生蟲藥物防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種防治兔球蟲病的注射型中西藥聯(lián)合緩釋劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
球蟲病是對養(yǎng)兔業(yè)、養(yǎng)雞業(yè)危害最嚴重的一種寄生蟲病。球蟲病對兔的病死率可達40～80％，我國每年用于抗球蟲藥物的費用高達數(shù)十億元。截止目前，控制球蟲病的主要手段仍然依賴于抗球蟲藥的化學(xué)防治，例如地克株利、氯苯胍等。由于抗球蟲藥的長期使用，球蟲對藥物產(chǎn)生耐藥性成了無法避免的嚴重問題。正如Schnitzer和Grunberg(1975)所說，“耐藥性總是形影不離地伴隨著化學(xué)治療的發(fā)展而發(fā)展，一部化學(xué)藥物治療的歷史就是耐藥性產(chǎn)生的歷史。”事實證明，目前市售的任何一種抗球蟲藥在使用一定時間后，都會引起球蟲的耐藥性。
由于球蟲耐藥蟲株日益增多，使許多抗球蟲藥的防治效果顯著降低，甚至完全失效，即使是提高藥物濃度也無濟于事，許多實驗已經(jīng)證明，化學(xué)藥物和抗生素用藥的濃度越高，球蟲產(chǎn)生耐藥性的速度越快，因此提高藥物濃度反而導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)的殘留，影響食品安全。進入上世紀七十年代，抗球蟲新藥的開發(fā)速度已經(jīng)趕不上耐藥蟲株出現(xiàn)的速度，尤其是球蟲的多重耐藥性蟲株的出現(xiàn)，更是給球蟲病有效的藥物防治提出了難題。
中草藥在我國已經(jīng)使用了數(shù)千年，直至今天，這些藥物對球蟲的治療效果依然存在，因此，人們普遍認為球蟲對中草藥不容易產(chǎn)生抗性。究其原因，可能是因為每種中草藥的成分均很復(fù)雜，一種藥物中往往含有多種有效成分，多種功能，中草藥組成復(fù)方后成分更加復(fù)雜。正如聯(lián)合用藥可以減緩球蟲抗藥性產(chǎn)生的道理一樣，球蟲要對中草藥內(nèi)眾多的有效成分同時產(chǎn)生耐藥性實際上非常困難。因此，開發(fā)中草藥抗球蟲劑日益受到人們的重視。
但是，當(dāng)前絕大多數(shù)的抗球蟲中草藥，無論是煎飲劑或是粉劑，都是通過口服方式給藥。當(dāng)兔或雞發(fā)生球蟲病較嚴重時，食欲減退乃至廢絕，動物就不能通過口服獲得應(yīng)達到的治療劑量，結(jié)果防治效果受到影響。傳統(tǒng)的中草藥散劑和煎劑發(fā)揮藥效的速度比西藥慢；依靠自由采食或飲水經(jīng)口服攝入藥物的途徑，會因某些藥物有異味、動物患病，食欲、飲欲改變而不能攝入規(guī)定的劑量，進而影響療效。人工灌服雖可克服自由飲食的缺點，但因該方法費工費力，僅適用于零星發(fā)病的情況。由此可見，傳統(tǒng)的中草藥散劑和煎劑似乎更適宜用于平時的預(yù)防，而對于大群動物暴發(fā)急性球蟲病的治療就顯得力不從心。
由此可見，中藥和西藥在防治球蟲病中各有其自己的優(yōu)缺點，中西藥結(jié)合應(yīng)是今后球蟲病防治的方向之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，克服西藥易引起球蟲產(chǎn)生耐藥性和中草藥經(jīng)口服難以攝入規(guī)定劑量而影響療效及藥效速度慢等缺陷，提供一種可適當(dāng)減少西藥的用量，不受食欲影響，給藥劑量準確，并大大降低防治藥物的用量，延長有效防治時間，降低用藥成本，延緩球蟲產(chǎn)生抗藥性，達到安全有效預(yù)防和治療兔球蟲病的注射型中西藥聯(lián)合緩釋劑；本發(fā)明的另一目的是提供該中西藥聯(lián)合緩釋劑的制備方法。
本發(fā)明中草藥部分選擇青蒿、苦參、白頭翁、仙鶴草、柴胡、地榆、黃芪進行組合是因為青蒿清熱涼血，含有青蒿素、苦味質(zhì)和揮發(fā)油等藥用成分，青蒿素有強力抗原蟲作用，據(jù)文獻報道，青蒿對球蟲子孢子和第一、二代裂殖體具有一定的抑制作用。苦參清熱燥濕、袪風(fēng)殺蟲，含有苦參堿、氧化苦參堿等生物堿及黃酮類物質(zhì)，有抗原蟲和殺滅蟯蟲的作用。白頭翁清熱解毒、涼血止痢，含有白頭翁素、三萜皂苷等藥用成分，具有抗阿米巴原蟲作用，并有明顯殺滅陰道滴蟲(一種原蟲)作用。青蒿、苦參和白頭翁在體外試驗中均有較強的抑制球蟲卵囊孢子化作用。仙鶴草收斂止血、補虛、殺蟲，含仙鶴草素、仙鶴草內(nèi)酯、鞣質(zhì)、甾醇、有機酸、皂苷等，有抗病毒和原蟲作用，根芽有驅(qū)除絳蟲作用。柴胡解表退熱、疏肝解郁、升提陽氣，含有柴胡苷、柴胡醇及α-波菜甾醇等揮發(fā)油，具有抑制結(jié)核桿菌、多種病毒及瘧原蟲的作用。地榆涼血止血、清熱解毒，含鞣質(zhì)、三萜皂苷和維生素A等，具有廣譜抗菌作用，主治血痢菌痢、消化道出血等，可治療球蟲引起的便血癥。黃芪補氣升陽、固表止汗、托毒生肌、利水消腫，含有蔗糖、葡萄糖醛酸、粘液質(zhì)、多種氨基酸、苦味素、膽堿、甜菜堿等，具有增加網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，增強機體免疫力作用，其中甜菜堿還能影響球蟲在體內(nèi)的發(fā)育及侵害力，改善動物感染球蟲后的生產(chǎn)性能，增強動物抗球蟲活性。上述七種藥物中既有抑殺球蟲的藥物，又有改善球蟲病癥狀的藥物，還有提高機體免疫力的藥物，它們聯(lián)合使用，標(biāo)本兼治，相互協(xié)同發(fā)揮作用，盡可能地減少了球蟲產(chǎn)生耐藥性的概率。
西藥則選用伯氨喹啉。伯氨喹啉是治療瘧疾的藥物，能夠破壞瘧原蟲的糖代謝和氧化過程，抑制線粒體的氧化作用，干擾DNA合成，對紅外期及各型瘧原蟲配子體，有較強的殺滅作用。另外還可用于治療焦蟲病、附紅細胞體病等。據(jù)本發(fā)明人試驗，伯氨喹啉對球蟲也有強烈的殺滅作用，用于治療球蟲病也有良好的效果。但有報道說伯氨喹啉毒性較一般抗瘧藥大，有少數(shù)紅細胞缺乏葡萄糖6-磷酸脫氫酶的人，用藥后可發(fā)生急性溶血性貧血。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。
防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑，該緩釋注射劑的組分與各組分的重量份為青蒿3～6份，苦參3～6份，白頭翁2～5份，仙鶴草2～5份，柴胡1～3份，地榆1～3份，黃芪1～3份，伯氨喹啉0.06～0.35份，包合劑β-環(huán)糊精2～4份。
該緩釋注射劑配方可進一步優(yōu)選為青蒿4份，苦參4份，白頭翁3.5份、仙鶴草3.5份，柴胡1份，地榆2份，黃芪3份，伯氨喹啉0.147份，β-環(huán)糊精3份。
防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑的制備方法，按以下步驟進行(1)按配方稱取中草原料藥青蒿、苦參、白頭翁、仙鶴草、柴胡、地榆、黃芪，各在45～50℃下烘干、粉碎、混合，備用；(2)將步驟(1)混合藥粉，加95％乙醇浸泡提取兩次，每次加乙醇量為沒過藥面1～2cm，每次浸泡時間2～3天，分離并合并兩次乙醇提取液，以冷熱交替法除去該液中鞣質(zhì)后得暗綠色乙醇提取物上清液，備用；(3)將步驟(2)第二次乙醇提取分離所剩藥渣，加蒸餾水浸泡提取2次，每次加水量為剛沒過藥面，每次浸泡時間2～3天，分離并合并兩次水提取液，以冷熱交替法除去該液中鞣質(zhì)后得暗褐色水提取物上清液，備用；(4)按配方稱取伯氨喹啉，溶解于4～5倍量的蒸餾水中，備用；(5)按配方稱取β-環(huán)糊精，加入少量蒸餾水濕潤環(huán)糊精，再加入步驟(4)伯氨喹啉水溶液，研磨15分鐘，并在室溫下讓水份蒸發(fā)至包合物呈稠糊狀；(6)在步驟(5)稠糊狀包合物中，加入步驟(2)乙醇提取物上清液，研磨15分鐘，以后每天研磨2～4次，15分鐘/每次，在潔凈的室內(nèi)讓乙醇揮發(fā)至包合物呈膏糊狀；(7)在步驟(6)膏糊狀包合物中，加入步驟(3)水提取物上清液，研磨至成勻質(zhì)懸濁狀藥液；(8)將步驟(7)勻質(zhì)懸濁狀藥液，以在室溫下讓水分蒸發(fā)或補充消毒生理鹽水的方法調(diào)控該藥液的體積，使其每毫升藥液中含有相當(dāng)于1克中草藥生藥和0.003～0.015克伯氨喹啉；并按需要量分裝、滅菌，即成注射劑產(chǎn)品。
本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明在發(fā)現(xiàn)原治療瘧疾藥物-伯氨喹啉對球蟲也具有強烈殺滅作用的基礎(chǔ)上，將伯氨喹啉與7味中草藥聯(lián)合研制成防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑，既發(fā)揮了西藥作用速度快的特點，又發(fā)揮了中藥不易使球蟲產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點，快慢結(jié)合，標(biāo)本兼治，從而發(fā)揮最佳的整體抗球蟲效果，并在不降藥效的前提下適當(dāng)減少了西藥用量，減輕對球蟲的選擇壓力，有利于延緩球蟲對防治藥物產(chǎn)生抗藥性；二是本發(fā)明緩釋注射劑在應(yīng)用中，使用方便，給藥劑量準確，不受家兔食欲大或小的影響，保證療效，并大大降低了防治藥物的用量，延長有效防治時間，由以往的一周左右延至二個月以上；三是本發(fā)明緩釋注射劑制備工藝先進，中草原藥先用醇提取，再用水提取的方式效果優(yōu)于水或醇的單提；中西藥主劑與包合料輔劑配比合理，注射性能良好，并降低了生產(chǎn)成本；四是本發(fā)明緩釋注射劑經(jīng)臨床防治試驗明確，在預(yù)防上，每只兔注射1.0ml即可收到預(yù)防球蟲病的良好效果；在治療上，每只兔注射1.5ml到2ml，用藥后2～3天拉痢均停止，兔的食欲恢復(fù)，第7天檢查糞便球蟲卵囊，絕大多數(shù)兔已轉(zhuǎn)陰，球蟲卵囊平均減卵率為96.4％和98.4％，均超過了口服中草藥散劑組94.6％和口服西藥組93.2％；2個月內(nèi)未見明顯的球蟲病復(fù)發(fā)癥狀，基本上達到治愈的目的；五是本發(fā)明緩釋注射劑對動物安全，貯藏性好，成本低廉，有利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。經(jīng)注射常用最大劑量(2ml/每兔)3倍的情況下(試驗例6)，家兔生長良好、表現(xiàn)安全，其中，伯氨喹啉雖有一定毒性，但其在該劑中的含量是很低的，且伯氨喹啉與β-環(huán)糊精包合后，是緩慢地釋放到家兔的血液中去，所以可有效減輕伯氨喹啉的毒副作用，增加安全性；此外，該劑室溫放置2個月，冰箱冷藏8個月(還在繼續(xù)中)沒有發(fā)現(xiàn)異樣；用室溫保存2個月和冰箱冷藏6個月的緩釋劑抽樣防治兔球蟲病，其防治效果與制備不超過1周的緩釋劑沒有差別；該中西藥聯(lián)合緩釋注射劑中的中草藥按照藥店中藥飲片零售價計算，其防治成本每只兔為0.18元，中草藥散劑為2.20元，西藥組為0.19元，較口服西藥組低5.3％，比口服中草藥散劑組低91.8％，如果中草藥原料來自批發(fā)市場，中草藥原料成本將可進一步下降1/3～1/2。。
具體實施例方式
通過以下實施例和試驗例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但這并不是對本發(fā)明在任何意義上的具體限制。
對以下實施例有關(guān)事項的說明青蒿、苦參、仙鶴草、白頭翁、柴胡、地榆、黃芪杭州中藥飲片廠出品的凈制中藥飲片，從杭州市張同泰藥店購得。
磷酸伯氨喹啉常熟市實業(yè)化工廠生產(chǎn)，含量為99％，批號為060528。
β-環(huán)糊精陜西省禮泉化工有限實業(yè)公司生產(chǎn)，含量為99.5％，批號為060410。
實施例1(防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑的制備1)
(1)將青蒿、苦參、白頭翁、仙鶴草、柴胡、地榆、黃芪，各在45～50℃鼓風(fēng)烘箱中干燥4小時以上，分別用中藥粉碎機粉碎成細粉狀；稱取已粉碎的青蒿30、苦參58g、白頭翁各20g、仙鶴草47、柴胡10g、地榆30、黃芪各12g，混合均勻，備用；(2)將步驟(1)混合藥粉，加95％乙醇浸泡提取兩次，每次加乙醇量為沒過藥面1cm，容器密封以防乙醇揮發(fā)，浸泡過程中每天攪拌1～2次，3天后離心分離提取液，合并兩次提取液，水浴中加熱至沸，冷卻后放在冰箱中過夜，再在4℃，4000轉(zhuǎn)/分的低溫條件下離心50分鐘，除去乙醇提取液中的鞣質(zhì)沉淀物后，得暗綠色乙醇提取物上清液，備用；(3)將步驟(2)第二次乙醇提取分離后所剩藥渣，加蒸餾水浸泡提取2次，每次加水量為剛沒過藥面，每次浸泡時間2天，離心分離，合并兩次提取液，放在冰箱中過夜，在4℃，5000轉(zhuǎn)/分的低溫條件下離心50分鐘，除去水提取液中的鞣質(zhì)沉淀物后，得暗褐色水提取物上清液，備用；(4)按配方稱取伯氨喹啉0.83g，用4ml蒸餾水溶解，備用；(5)按配方稱取β-環(huán)糊精20g，加入少量蒸餾水濕潤環(huán)糊精，再加入步驟(4)伯氨喹啉水溶液，研磨15分鐘，并在室溫下水份揮發(fā)至包合物呈稠糊狀；(6)在步驟(5)稠糊狀包合物中，加入步驟(2)乙醇提取物上清液，研磨15分鐘，以后每天研磨2～4次，15分鐘/每次，在潔凈的室內(nèi)讓乙醇揮發(fā)至包合物呈膏糊狀；(7)在步驟(6)膏糊狀包合物中，加入步驟(3)水提取物上清液，研磨至成勻質(zhì)懸濁狀藥液；(8)將步驟(7)勻質(zhì)包合懸濁狀藥液，以室內(nèi)不時研磨、攪拌促使水分蒸發(fā)或補充消毒生理鹽水的方法，調(diào)控該藥液的體積達到207ml，以使其每毫升藥液中含有相當(dāng)于1.0g中草藥生藥和伯氨喹啉0.004g；按需要量分裝、滅菌、包裝，即成產(chǎn)品。
實施例2(防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑的制備2)本例中，稱取已粉碎的青蒿40g、苦參38g、白頭翁35g、仙鶴草36 g、柴胡19g、地榆20g、黃芪30g；乙醇添加量每次沒過藥面1cm，乙醇每次浸泡時間2天；水每次浸泡時間2天；伯氨喹啉稱取1.74g，用7ml蒸餾水溶解；β-環(huán)糊精稱取30g；其余制備方法，工藝均同于實施例1。最終使每毫升藥液中含有相當(dāng)于1.0g中草藥生藥和伯氨喹啉0.008g。
實施例3(防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑的制備3)本例中，稱取已粉碎的青蒿40g，苦參40g，白頭翁35g、仙鶴草35g，柴胡10g，地榆20g，黃芪30g；乙醇添加量每次沒過藥面2cm，乙醇每次浸泡時間3天；水每次浸泡時間3天；伯氨喹啉稱取1.47g，用7ml蒸餾水溶解；β-環(huán)糊精稱取30g；其余制備方法，工藝均同于實施例1。最終使每毫升藥液中含有相當(dāng)于1.0g中草藥生藥和伯氨喹啉0.007g。
實施例4(防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑的制備4)本例中，稱取已粉碎的青蒿60g、苦參32g、白頭翁50g、仙鶴草22g、柴胡28g、地榆11g、黃芪20g；乙醇添加量每次沒過藥面2cm，乙醇每次浸泡時間2天；水每次浸泡時間3天；伯氨喹啉稱取3.35g，用13.4ml蒸餾水溶解；β-環(huán)糊精稱取40g；其余制備方法，工藝均同于實施例1。最終使每毫升藥液中含有相當(dāng)于1.0g中草藥生藥和伯氨喹啉0.015g。
試驗例1(不同提取方法對中草藥提取液物理性狀的影響)相同的藥物配比，以(1)水煎、(2)水浸泡、(3)乙醇浸泡和(4)先乙醇浸泡再用水浸泡四種提取方法對提取液物理性狀的影響進行比較，其中，(1)水煎提取液外觀混濁，需要去除鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)后才變澄清，而且濃縮后特別粘稠，制成注射液后注射器容易被粘堵，造成注射困難；(3)乙醇浸泡提取液外觀綠褐色，由于大多數(shù)水溶性蛋白和醣類不會被提取出來，故提取液澄清，流動性好；(4)先用乙醇浸泡，藥物中的水溶性蛋白質(zhì)被乙醇凝固，再用水浸泡時不會被提取出來，所以提取液也較澄清，可以省略去除蛋白的步驟，濃縮后液體的粘稠度也較水浸泡提取液小，制成注射液后性狀也比較理想。(2)水浸泡提取液的性狀則介于水煎提取液與醇提取后水浸泡提取液之間。綜合療效試驗的結(jié)果，確定采用先醇提取后用水提取的中草藥有效成分提取方法。
試驗例2(原料藥與β-環(huán)糊精重量比對藥效持續(xù)時間的影響)由于伯氨喹啉用量比例很小，所以本試驗著重探討中草藥與β-環(huán)糊精的重量比對藥效持續(xù)時間的影響。
30日齡的獺兔32只，糞便檢查均帶有球蟲卵囊，均分4組，每組8只，分別以中草藥原料藥(配方同實施例3)與β-環(huán)糊精重量比為9∶1、7∶1和5∶1制成的3種緩釋劑(依次稱之為緩釋劑1、緩釋劑2和緩釋劑3)防治兔球蟲病，每只兔(體重約1kg)注射1ml，另外設(shè)不注射任何藥作對照，分別于第0天、7天、14天、21天、28天、35天、45天和60天早晨采集兔糞便，用鹽水漂浮法檢查球蟲卵囊數(shù)，即稱取糞便樣品3克，置于50ml燒杯中，加15ml飽和生理鹽水，攪拌均勻，用40目銅篩過濾，濾液倒入10ml青霉素瓶靜置20分鐘以上，用蓋玻片沾取表面少量液體，置載玻片上，在10×10倍顯微鏡下計數(shù)5個視野中球蟲的卵囊總數(shù)，作為該兔的球蟲卵囊數(shù)，計算出各組球蟲卵囊平均數(shù)及減卵率，結(jié)果見下表1。
由表1可見，不用藥對照組兔糞中球蟲卵囊數(shù)持續(xù)增加，注射緩釋劑后，球蟲卵囊數(shù)均明顯減少。當(dāng)原料藥與β-環(huán)糊精重量比為9∶1時，第一周兔糞便的球蟲卵囊數(shù)在三個用藥組中是最低的，但從第二周開始，球蟲卵囊數(shù)迅速增多，超過了原料藥與β-環(huán)糊精重量比為7∶1和5∶1的兩個組，說明藥物提取液中的有效成分沒有被β-環(huán)糊精充分包被，有相當(dāng)部分的藥物提取物是呈游離狀態(tài)，所以第一周其作用最強，但隨后因為被β-環(huán)糊精包被的藥物可以釋放出來的劑量不足，不能很好抑制球蟲的繁殖，所以球蟲卵囊增多；而緩釋劑2組和緩釋劑3組的藥物緩釋效果相近，不過原料藥與β-環(huán)糊精重量比為5∶1時，藥液太稠，注射不夠順暢，加上β-環(huán)糊精含量增加的同時也相應(yīng)增加了成本，因此原料藥與β-環(huán)糊精的重量比以7∶1左右為好。
表1 注射不同中草藥緩釋劑后兔糞便中的球蟲卵囊數(shù)

試驗例3(不同提取方式對中西藥聯(lián)合緩釋劑抗球蟲效果的影響)
相同配方(實施例3)和重量的中草藥混合粉劑三份，分別以蒸餾水、95％乙醇、及先95％乙醇后蒸餾水三種方式浸泡提取有效成分，去除提取液中的鞣質(zhì)和蛋白，用相同比例的伯氨喹啉和β-環(huán)糊精等包被制成中西藥聯(lián)合緩釋劑(分別稱為緩釋劑W、緩釋劑A和緩釋劑AW)。
選擇有球蟲卵囊排出的30日齡肉兔24只，均分4組，每組6只，分別注射以蒸餾水提取、95％乙醇提取和先用95％乙醇提取后用蒸餾水提取三種不同提取方式制備的中西藥聯(lián)合緩釋劑1ml，以不使用任何抗球蟲藥處理為對照組，分別在0天、7天、14天、21天、28天、35天、45天和60天采集兔糞便樣品，按上面介紹的飽和鹽水漂浮法，鏡檢計數(shù)球蟲卵囊數(shù)，計算組球蟲卵囊平均數(shù)及減卵率，結(jié)果見表2。
表2注射有效成分不同提取方式制備的中西藥聯(lián)合緩釋劑對肉兔糞便中的球蟲卵囊數(shù)的影響

由表2可見，以中草藥水提取物制備的緩釋劑W前二周對球蟲抑制效果比較好，但4周以后，抗球蟲效果明顯減弱，說明β-環(huán)糊精對中草藥的水提取組分的包合性能不盡如人意，分析原因可能是因為β-環(huán)糊精中間的空穴具有疏水性，水溶性物質(zhì)不能很好地進入空穴所致；β-環(huán)糊精對中草藥醇提取物的包合性能較好；相比之下又以先用醇提取，再用水提取的提取方式制備的緩釋劑AW抗球蟲效果比單獨用醇提取制備的緩釋劑A要更好一些，可能是因為用兩種溶劑提取，被提取出來的有效成分更多之故；不用抗球蟲藥的對照組，在試驗期間兔糞中的球蟲卵囊數(shù)均高于試驗前。
試驗例4(中西藥聯(lián)合緩釋劑的劑量效應(yīng)試驗)本試驗中，中西藥聯(lián)合緩釋劑采用實施例3所制產(chǎn)品；中草藥散劑采用實施例3的中草原料藥配方。
選擇帶有球蟲卵囊體重0.8～1.8kg的家兔72只，均分6組(每組12只)，第1～3組在試驗開始時，分別注射中西藥聯(lián)合緩釋劑1.0ml/只、1.5ml/只和2.0ml/只，飼喂不含抗球蟲藥的日糧；第4組飼喂含中草藥散劑的日糧；第5組飼喂含0.003％地克珠利或0.0125％氯羥吡啶的日糧；第6組飼喂不含任何抗球蟲藥的日糧作為對照組；分別于0天、7天、14天、21天、28天、35天、45天和60天采集兔糞便，以飽和鹽水漂浮法檢查球蟲卵囊，計算組球蟲卵囊平均數(shù)及減卵率，結(jié)果見表3。
由表3可見，每只兔注射中西藥聯(lián)合緩釋劑1.0ml即可收到防治球蟲病的較好效果，隨著中西藥聯(lián)合緩釋劑注射劑量的增加，兔糞便中排出的球蟲卵囊數(shù)進一步減少。這與一些口服中草藥隨劑量增加，抗球蟲指數(shù)也增加的趨勢一致。試驗期間，每只兔注射中西藥聯(lián)合緩釋劑1.5ml和2ml組的球蟲卵囊平均減卵率為96.4％和98.4％，均超過了口服中草藥散劑組(94.6％)和口服西藥組(93.2％)。在本試驗中，以每只兔注射2ml效果最好。
表3 中西藥聯(lián)合緩釋劑不同注射劑量對兔糞球蟲卵囊數(shù)的影響

試驗例5(不同配方中西藥聯(lián)合緩釋劑的抗球蟲效果)
選擇帶有較多球蟲卵囊體重0.8～1.6kg的家兔18只，均分3組(每組6只)，分別注射實施例1、實施例2和實施例3制備的中西藥聯(lián)合緩釋劑(分別稱緩釋劑1、緩釋劑2和緩釋劑3)，每只兔注射2ml。分別于0天、7天、14天、21天、28天、35天、45天和60天采集兔糞便，以飽和鹽水漂浮法檢查球蟲卵囊，計算組球蟲卵囊平均數(shù)及減卵率，結(jié)果見表4。
表4 注射不同配方緩釋劑后兔糞中的球蟲卵囊數(shù)和減卵率

三種配方制備的中西藥聯(lián)合緩釋劑以緩釋劑2和緩釋劑3的效果較好。
試驗例6(中西藥聯(lián)合緩釋劑的急性毒性試驗)體重約1kg的肉兔6只，每只分多點皮下注射實施例3所制中西藥聯(lián)合緩釋劑共6ml，觀察注射后48小時兔的局部和全身反應(yīng)；在注射前、注射后1小時、2小時、4小時、24小時和48小時測量兔體溫和每分鐘的心跳次數(shù)；在注射后二個月隨機抽取4只兔解剖檢查內(nèi)臟器官有無病變，注藥部位緩釋劑的吸收情況，觀察組織有無增生、壞死等。
結(jié)果是，注射后1小時，雖然還可觸摸到注射部位微隆的小包，局部皮膚無紅腫，體溫、心跳與不注射緩釋劑組的兔沒有差別，對兔的活動和食欲沒有影響；經(jīng)二個月飼養(yǎng)，兔體增重比口服抗球蟲藥物組的兔提高，毛色光亮，解剖后未見內(nèi)臟器官有病理變化，注射部位無異常；說明在常用最大劑量3倍的注射劑量情況下，本發(fā)明中西藥聯(lián)合緩釋劑對兔也是安全的。
體重1.5kg的蛋雞、體重約1kg的肉雞，注射本發(fā)明實施例3所制中西藥聯(lián)合緩釋劑4ml，對蛋雞產(chǎn)蛋性能，對肉雞生長性能均無不利影響，一個月后觀察，注射中西藥聯(lián)合緩釋劑雞的外觀體況好于不注射的雞；說明本發(fā)明產(chǎn)品對雞也是安全的。
試驗例7(中西藥聯(lián)合緩釋劑的保質(zhì)期試驗)實施例1、2、3與4的中西藥聯(lián)合緩釋劑分裝在密封的20ml塑料瓶(橡膠瓶塞，蠟封)中，分別放置于8～26℃的室溫和4～8℃的冰箱中保存，每隔半個月檢查緩釋劑的性狀看有無發(fā)霉、變質(zhì)或異味產(chǎn)生，結(jié)果室溫放置2個月，冰箱冷藏8個月(還在繼續(xù))沒有發(fā)現(xiàn)異樣。用室溫保存2個月和冰箱冷藏6個月的緩釋劑抽樣防治兔球蟲病，其防治效果與制備不超過1周的緩釋劑沒有差別；室溫放置4個月，肉眼觀察無發(fā)霉變質(zhì)，因沒有進行動物試驗，保質(zhì)期是否可達4個月尚不清楚，但至少說明中西藥聯(lián)合緩釋劑的保質(zhì)期能滿足一般用戶的使用要求。
試驗例8(中西藥聯(lián)合緩釋劑的臨床治療試驗)表現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、拉痢、腹部膨脹、頻頻排尿，個別粘膜黃染，糞檢可見大量球蟲卵囊的病兔60只，體重1kg左右的兔注射實施例3中西藥聯(lián)合緩釋劑1ml，體重2kg以上的兔注射2ml，用藥后2～3天拉痢均停止，兔的食欲恢復(fù)，第7天檢查糞便球蟲卵囊，絕大多數(shù)兔已轉(zhuǎn)陰，僅少數(shù)兔糞便中尚有少數(shù)幾個卵囊，2個月內(nèi)未見明顯的球蟲病復(fù)發(fā)癥狀，基本上達到治愈的目的。
試驗例9(中西藥聯(lián)合緩釋劑防治兔球蟲病的成本)選擇糞便中帶有球蟲卵囊的斷奶仔兔48只，均分4組，第1組飼喂不含任何抗球蟲藥的基礎(chǔ)日糧，在試驗開始時注射實施例3一針本發(fā)明的中西藥聯(lián)合緩釋劑(2ml/只)；第2組飼喂含1％添加量的實施例3抗球蟲中草藥配方散劑的日糧；第3組飼喂含地克珠利0.003％或者含0.0125％氯羥吡啶的對照日糧(兩種上抗球蟲藥輪換使用)；第4組只飼喂不含任何抗球蟲藥的基礎(chǔ)日糧；試驗期2個月；觀察各組的增重、死亡率，計算各組的防治費用。
結(jié)果第1、2、3、4組的平均增重分別為2.02±0.05kg、1.76±0.09kg、1.78±0.09kg和0.90±0.10kg，注射中西藥聯(lián)合緩釋劑組比不加藥對照組提高增重124.4％，分別比口服中草藥組和口服西藥組提高14.8％和13.5％(P＞0.05)；各組的死亡率分別為0、8.3％、8.3％和41.7％。使用中西藥聯(lián)合緩釋劑防治兔球蟲病不僅能增加體重，而且能降低兔的死亡率。
中草藥按照藥店中藥飲片零售價計算再加20％的損耗和微利，西藥按批發(fā)價計算，中西藥聯(lián)合緩釋劑組的防治成本為每只兔為0.18元，中草藥散劑組為2.20元，西藥組為0.19元。中西藥聯(lián)合緩釋劑組防治球蟲病成本比口服西藥組低5.3％，比口服中草藥散劑組低91.8％。如果中草藥原料來自批發(fā)市場，中草藥原料成本將可下降1/3～1/2；如果再增加有機溶劑回收工藝，成本還可進一步降低，因此中西藥聯(lián)合緩釋劑產(chǎn)品的最終價格也許可以做到與西藥競爭。
在2個月的試驗期，注射中西藥聯(lián)合緩釋劑僅需2ml，所需中草藥原料約為2g，即使算上各環(huán)節(jié)的損耗，也不會超過4g；而采用口服中草藥散劑的方式，每只兔每天至少要消耗100g飼料，中草藥散劑按1％配比，共消耗60g中草藥原料(不計損耗)，即中西藥聯(lián)合緩釋劑所消耗的中草藥原料不到口服中草藥散劑的90％。如果該項技術(shù)成果能得到推廣應(yīng)用，將可以節(jié)約大量的中草藥資源，減少中草藥的采挖，這對于保護我們的生態(tài)環(huán)境也將起到有益的作用。
權(quán)利要求
1.防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑，其特征在于該緩釋注射劑的組分與各組分的重量份為青蒿3～6份，苦參3～6份，白頭翁2～5份，仙鶴草2～5份，柴胡1～3份，地榆1～3份，黃芪1～3份，伯氨喹啉0.06～0.35份，包合劑β-環(huán)糊精2～4份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩釋注射劑，其特征在于該緩釋注射劑的組分與各組分的重量份為青蒿4份，苦參4份，白頭翁3.5份、仙鶴草3.5份，柴胡1份，地榆2份，黃芪3份，伯氨喹啉0.147份，β-環(huán)糊精3份。
3.制備權(quán)利要求1所述緩釋注射劑的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)按配方稱取中草原料藥青蒿、苦參、白頭翁、仙鶴草、柴胡、地榆、黃芪，各在45～50℃下烘干、粉碎、混合，備用；(2)將步驟(1)混合藥粉，加95％乙醇浸泡提取兩次，每次加乙醇量為沒過藥面1～2cm，每次浸泡時間2～3天，分離并合并兩次乙醇提取液，以冷熱交替法除去該液中鞣質(zhì)后得暗綠色乙醇提取物上清液，備用；(3)將步驟(2)第二次乙醇提取分離所剩藥渣，加蒸餾水浸泡提取2次，每次加水量為剛沒過藥面，每次浸泡時間2～3天，分離并合并兩次水提取液，以冷熱交替法除去該液中鞣質(zhì)后得暗褐色水提取物上清液，備用；(4)按配方稱取伯氨喹啉，溶解于4～5倍量的蒸餾水中，備用；(5)按配方稱取β-環(huán)糊精，加入少量蒸餾水濕潤環(huán)糊精，再加入步驟(4)伯氨喹啉水溶液，研磨15分鐘，并在室溫下讓水份蒸發(fā)至包合物呈稠糊狀；(6)在步驟(5)稠糊狀包合物中，加入步驟(2)乙醇提取物上清液，研磨15分鐘，以后每天研磨2～4次，15分鐘/每次，在潔凈的室內(nèi)讓乙醇揮發(fā)至包合物呈膏糊狀；(7)在步驟(6)膏糊狀包合物中，加入步驟(3)水提取物上清液，研磨至成勻質(zhì)懸濁狀藥液；(8)將步驟(7)勻質(zhì)懸濁狀藥液，以在室溫下讓水分蒸發(fā)或補充消毒生理鹽水的方法調(diào)控該藥液的體積，以使其每毫升藥液中含有相當(dāng)于1克中草藥生藥和0.003～0.015克伯氨喹啉；并按需要量分裝、滅菌，即成注射劑產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了防治兔球蟲病中西藥聯(lián)合緩釋注射劑及其制備方法，屬于畜禽寄生蟲藥物防治技術(shù)領(lǐng)域。該注射劑的組分與各組分的重量份為青蒿3～6份，苦參3～6份，白頭翁2～5份，仙鶴草2～5份，柴胡1～3份，地榆1～3份，黃芪1～3份，伯氨喹啉0.06～0.35份，β－環(huán)糊精2～4份。經(jīng)過原藥烘干、粉碎、混合；乙醇提??；水提??；除去雜質(zhì)；提取液與伯氨喹啉及β－環(huán)糊精的混合、研磨、包合；藥液體積調(diào)整等步驟制備而成。具有使用方便，防治期長，按每只兔1.5－2m1的用量，病兔球蟲卵囊減卵率為96.4％和98.4％，均超過了口服中草藥散劑組和西藥組，成本低廉，安全性、貯藏性好等特點，可在養(yǎng)兔業(yè)與養(yǎng)雞(1－1.5ml/kg)業(yè)中推廣應(yīng)用。
文檔編號A61P33/02GK101085076SQ20071006964
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者盧福莊, 張雪娟, 季敬余, 付媛, 馮尚連, 汪承相, 程菊芬, 周永學(xué), 陳學(xué)智, 徐海風(fēng) 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院