專利名稱：黑柄炭角菌發(fā)酵液粉及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黑柄炭角菌發(fā)酵液粉及其制備與應用。
(二)
背景技術：
黑柄炭角菌(Xylaria nigripes (Kl.) Sacc )，我國民間稱烏靈參、雞樅蛋。屬 于子嚢菌亞門、炭角菌目Xylariales,炭角菌科Xylariaceae，炭角菌屬Xylaria。 黑柄炭角菌生長在黑翅土白蟻的廢巢中，是一種中溫性真菌，味甘，入心、腎、 膀胱三經，具補氣固腎、健脾除濕、鎮(zhèn)靜安神之功效。是我國老中醫(yī)治療疑難 雜癥時經常組藥入方的一味滋補中藥。
黑柄炭角菌作為珍惜物種在我國分布雖廣但產量極少，天然的子實體售價 堪比黃金。慶幸的是目前市場上已經有人工培養(yǎng)的黑柄炭角菌產品銷售。這些 產品均是通過采集天然黑柄炭角菌,分離得到黑柄炭角菌的菌種，采用人工發(fā) 酵培養(yǎng)的方法獲得菌絲體。比如浙江佐力藥業(yè)股份有限公司的"烏靈膠嚢，，就 是由黑柄炭角菌菌種液體發(fā)酵獲得的黑柄炭角菌菌絲體加工而成，湖北真浩生 物工程有限公司的"輕松睡眠寶"的原料也是黑柄炭角菌菌絲體。黑柄炭角菌 人工發(fā)酵培養(yǎng)的成功緩解了天然黑柄炭角菌的產量不足，使其可以工業(yè)化生產 滿足社會需要。但是，目前的生產工藝均是收集發(fā)酵菌絲體,對于發(fā)酵液卻沒 有能夠利用。液體發(fā)酵的過程中黑柄炭角菌在合成有機物質作為自身生長以外 還向發(fā)酵液中分泌大量的代謝產物，這些代謝產物也都是黑柄炭角菌的活性成 分，活性和含量甚至高于黑柄炭角菌菌絲體，本發(fā)明提供一種發(fā)酵液中活性成 分的提取方法，并公開了提取后的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉在制備免疫調節(jié)、改善 睡眠、抗焦慮、抗抑郁、治療偏頭痛、鎮(zhèn)咳、治療肺結核、抗炎、治療乙肝、200710070008.5
說明書第2/8頁
前列腺炎、抗腫瘤、女性痛經及治療糖尿病藥物、保健品及食品中的應用。
國內目前對黑柄炭角菌的研究主要集中在藥理作用方面，對于生產工藝研
究不多。有關生產工藝方面的中國專利共4個，3個是液體發(fā)酵工藝獲得菌絲體 專利，l個是菌種的專利。和本發(fā)明關系相對較密切的是專利"黑柄炭角菌發(fā)酵 工藝"專利號96106492.7。此專利公開了黑柄炭角菌菌絲體的培養(yǎng)方法，權利 要求書均是針對培養(yǎng)方法，但是在說明書曾提到"并且研制出了采用人工生成 發(fā)酵該菌林的工藝，得到了與野生菌具相同藥理作用的菌絲體，并且獲得了含 豐富營養(yǎng)價值的代謝產物的發(fā)酵液"，在說明書"3.后處理"中提到"發(fā)酵液內 含大量的代謝產物包括多糖，維生素，氨基酸，利用上述產物和水分子量的懸 殊，通過膜給予分離、干燥、備用。"對于這份在先文件雖然提到了發(fā)酵液，但 是與本發(fā)明的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉是完全不同的，體現(xiàn)在下面幾點
1、 成分不同。對比文件是發(fā)酵液全液，僅僅是除去水分的發(fā)酵液，而本發(fā) 明是發(fā)酵液的提取物，剔除了發(fā)酵液中的單糖、氨基酸、微量元素及無機鹽等 小分子物質。
2、 工藝不同。雖然本發(fā)明提取方法和對比文件都采用了膜，但是膜本身由 本質區(qū)別。在先文件采用的膜只能使水分子透過，按分子量計算膜截留孔徑應 該在100道爾頓以下；本發(fā)明釆用的膜不僅使水分子通過，而且使單糖、氨基 酸、無機鹽等透過，按分子量計算膜截留孔徑應該至少在300道爾頓以上；膜 孔徑的不同直接導致了成分的差異。
3、 毒性不同。對比文件中對發(fā)酵液僅僅通過膜濃縮后直接進行干燥，保留 了發(fā)酵液中所有的成分，這使得發(fā)酵液副反應加大，比如發(fā)酵液中的硫酸鎂本 身就是瀉藥，若直接服不經提取的發(fā)酵液會導致腹瀉；而本發(fā)明通過適當的膜 孔徑將無機鹽、單糖、氨基酸及微量元素等成分統(tǒng)統(tǒng)除去，從而保證了本發(fā)明
產品的安全性。
4、用途不同。對比文件中提到"并且研制出了采用人工生成發(fā)酵該菌株的 工藝，得到了與野生菌具相同藥理作用的菌絲體，并且獲得了含豐富營養(yǎng)價值 的代謝產物的發(fā)酵液，，，從這句話中可以看出對比文件認為菌絲體是有藥理活性 的，而發(fā)酵液僅具有"豐富的營養(yǎng)價值"，而本發(fā)明中認為從發(fā)酵液中提取的黑 柄炭角菌發(fā)酵液粉具有免疫調節(jié)、改善睡眠、抗焦慮、抗抑郁、治療偏頭痛、 鎮(zhèn)咳、治療肺結核、抗炎、治療乙肝、前列腺炎、抗肺瘤、女性痛經及治療糖 尿病等多種活性，不單單是營養(yǎng)價值。
發(fā)明內容
本發(fā)明公開的是黑柄炭角菌發(fā)酵液粉及其制備與應用。
黑柄炭角菌發(fā)酵液粉是黑柄炭角菌發(fā)酵液的提取物干燥而成的粉末，不含 菌絲體，并且去除了發(fā)酵液中的無機鹽、單糖及氨基酸等成分。具體的講分為 以下幾個步驟
(1) 、發(fā)酵液的獲得。將黑柄炭角菌菌種接入種子罐培養(yǎng)，而后按一定接 種量轉入發(fā)酵罐培養(yǎng)，待菌絲長到一定程度后終止發(fā)酵。將發(fā)酵所得的產物通 過板框壓濾或者離心的方式分離得到菌絲體和發(fā)酵液。至于發(fā)酵的具體條件可 根據不同菌4朱略有變動，中國專利96106492. 7、 200410030328. 4和90100231. 3 都提供了 一種獨自的發(fā)酵工藝條件。
(2) 、發(fā)酵液的提取。將黑柄炭角菌發(fā)酵液用超濾膜提取。除去了發(fā)酵液 中的大量無機鹽、單糖和氨基酸等成分，保留了發(fā)酵液中的主要活性成分如黑 柄炭角菌多糖等。超濾膜的選擇應保證其孔徑至少能過濾掉無機鹽、單糖和氨 基酸等小分子物質，按照分子量計算超濾膜的孔徑應不小于300道爾頓。
(3) 、提取物的干燥。發(fā)酵液經過超濾膜的充分提取得到提取液，提取液 采用噴霧干燥法干燥得到粉末狀固體，提取液也可以直接烘干，也可以采取微 波干燥、真空干燥、紅外干燥等方法干燥提取物，干燥后固體粉碎得到黑柄炭
角菌發(fā)酵液粉。
黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的制備工藝和黑柄炭角菌發(fā)酵液的來源無關，比如此 種下的不同菌林或者不同的發(fā)酵工藝得到的發(fā)酵液制備黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的 工藝一致。因為工藝中的膜分離、干燥等步驟和物料性質無關，不管什么樣的 工藝得到的發(fā)酵液通過相應的膜均使小分子的氨基酸、葡萄糖透過，保留大分 子的蛋白質多糖等。
用本法獲得的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉可以用作制備免疫調節(jié)、改善睡眠、抗 焦慮、抗抑郁、治療偏頭痛、鎮(zhèn)咳、治療肺結核、抗炎、治療乙肝、前列腺炎、 抗腫瘤、女性痛經及治療糖尿病藥物、保健品及食品的原料。 具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不
僅限于此
實施例l:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的制備
取黑柄炭角菌菌種按5 %的接種量接種于種子罐中，種子罐培養(yǎng)液配方為葡 萄糖30克，玉米粉20克，黃豆粉15克，硫酸鎂O. 8克，水1000毫升，pH5. 6， 培養(yǎng)溫度25度，125轉/分的轉速攪拌。培養(yǎng)時間約4天，待培養(yǎng)液中充滿菌絲 體后轉移至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐中培養(yǎng)液配方為葡萄糖25克，玉米粉25克， 黃豆粉20克，硫酸鎂Q. 8克，檸檬酸O. 6克，水1000毫升，pH5. 8，培養(yǎng)溫度 22度，培養(yǎng)時間約4-6天，待培養(yǎng)液中充滿菌絲體時即可終止發(fā)酵。將發(fā)酵所 得產物用板框分離得到菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用分子量截留300的膜進行分 離提取，待提取液經膜分離變?yōu)樵瓉戆l(fā)酵液體積的1/5時，添加純化水至原體
積，繼續(xù)提取并反復三次以便充分的使發(fā)酵液中的硫酸鎂、檸檬酸、氨基酸、 葡萄糖等透過，將經過膜提取后的發(fā)酵液進行噴霧干燥，得到黑柄炭角菌發(fā)酵 液粉。
實施例2:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的制備
取黑柄炭角菌菌種按10%的接種量接種于種子罐中，種子罐培養(yǎng)液配方為 葡萄糖15克，玉米粉10克，黃豆粉35克，硫酸鎂0.6克，硫酸鋅0.5克，水 1000毫升，pH5. 6，培養(yǎng)溫度25度，100轉/分的轉速攪拌。培養(yǎng)時間約4~6 天，待培養(yǎng)液中充滿菌絲體后轉移至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐中培養(yǎng)液配方為葡 萄糖25克，玉米粉45克，黃豆粉10克，硫酸鎂O. 8克，硫酸鋅0.4克，檸檬 酸O. 6克，水1000毫升，pH5. 8，培養(yǎng)溫度23度，培養(yǎng)時間約4-6天，待培 養(yǎng)液中充滿菌絲體時即可終止發(fā)酵。將發(fā)酵所得產物用離心機分離得到菌絲體 和發(fā)酵液，發(fā)酵液用分子量截留6000的膜進行分離提取，待提取液經膜分離變 為原來發(fā)酵液體積的1/6時，添加純化水至原體積，繼續(xù)提取并反復二次以便 充分的使發(fā)酵液中的硫酸鎂、檸檬酸、氨基酸、葡萄糖等透過，將經過膜提取 后的發(fā)酵液真空干燥后粉碎即得到黑柄炭角菌發(fā)酵液粉。 實施例3:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉在制備糖尿病藥物方面的應用
取小鼠36只，分為3組，每組12只，分別為模型組，空白組，黑柄炭角 菌發(fā)酵液粉組。模型組和黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組尾部經脈注射四氧嘧啶水溶液 90mg/kg， 72h后所有小鼠空腹21h，眼眶取血O. 3ml，葡萄糖氧化酶法測血糖為 給藥前小鼠血糖水平，制得標準糖尿病小鼠模型。而后黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組 灌胃黑柄炭角菌發(fā)酵液粉，劑量2g/kg，每天2次，連續(xù)3天，空白組和模型組 對照組以同樣方法給生理鹽水。3天后，所有小鼠空腹12h,斷頭取血O. 5ml， 測定血糖。結果表明黑柄炭角菌發(fā)酵液粉降糖率達到65.6%，與模型組比有顯
著性差異，提示黑柄炭角菌發(fā)酵液粉可以用作制備治療糖尿病的藥物、保健品 和食品。
實施例4:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉在制備抗炎藥物方面的應用
取ICR小鼠48只，分為4組，每組12只，分別為4莫型組，陽性對照組， 空白組，黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組。黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組致炎前每天灌胃給藥1 次(生理鹽水稀釋)，劑量3g/kg/d，空白組不做處理，模型組同比用生理鹽水 灌胃，每天1次，連續(xù)5天，陽性對照藥地塞米松每天腹腔注射1次，連續(xù)5 天，劑量lmg/kg/d。小鼠在第4次給藥前致炎，空白組不做處理，模型組、陽 性對照組、黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組均腹腔注射Sephadex G200，劑量2mg/kg。 致炎48h后用頸推脫臼法處死小鼠。每只小鼠腹腔注射灌洗液5ml，輕揉片刻后 吸出腹腔灌洗液。對灌洗液進行白細胞總數和分類計數。結果表明黑柄炭角菌 發(fā)酵液粉及地塞米松對小鼠腹腔白細胞總數、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞聚集 有明顯的抑制作用，統(tǒng)計學結果表明與模型組均有顯著性差異黑柄炭角菌發(fā)酵 液粉組P<0. 05,地塞米松組P<0. 01。提示黑柄炭角菌發(fā)酵液粉可以用作制備治 療炎癥引發(fā)的或者伴隨有炎癥產生的疾病的藥物、保健品和食品。 實施例5:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的護肝功效
取ICR小鼠，黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組灌胃7天(生理鹽水稀釋)，每天2次， 劑量2g/kg，空白組灌胃生理鹽水，末次灌胃lh后，模型組和黑柄炭角菌發(fā)酵 液粉組分別注射脂多糖(lmg/kg)和D-氨基半乳糖(700mg/kg), 24h后摘眼球 取血，測定一氧化氮、 一氧化氮合成酶和丙氨酸氨基轉移酶水平，肝臟組織用 福爾馬林固定，染色后作組織學檢查，預先灌胃黑柄炭角菌發(fā)酵液粉(生理鹽 水稀釋)可減輕小鼠對脂多糖引起的致死性毒性的反應，防止肝組織進行性損 傷，降低脂多糖和D-氨基半乳糖所致肝炎小鼠血清一氧化氮和一氧化氮合成酶
活性，降低血清中丙氨酸氨基轉移酶水平。提示可以將黑柄炭角菌發(fā)酵液粉開 發(fā)成治療肝炎和肝硬化等方面的藥物、保健品和食品。
實施例6:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的抗腫瘤作用實驗
取昆明小鼠36只，隨機分成3組空白組、模型組和給藥組。模型組接種 H22腫瘤細胞。接種腫瘤細胞后第3天開始給藥，空白組灌胃生理鹽水，0. 5ml/d, 給藥組灌胃黑柄炭角菌發(fā)酵液粉(生理鹽水稀釋成0.5ml)，劑量是2g/kg，連 續(xù)2周，每天記錄小鼠生長情況及腫瘤大小，第15天小鼠眼球放血后頸推脫臼 處死，解剖并觀察腫瘤大小及總量，計算肺瘤生長抑制率。分離獲得腫瘤浸潤 淋巴細胞，測定給藥組對T淋巴細胞亞群的影響。結果表明給藥組對肺瘤生長 抑制率為61.8%，與模型組比較有顯著性差異，另外黑柄炭角菌發(fā)酵液粉還可 提高荷瘤小鼠的胸腺質量和指數，對胸腺具有一定的保護作用。模型組T淋巴 細胞明顯減少，而給藥組CD4+、 CD8+T淋巴細胞這恢復明顯，與模型組之間比 較有顯著性差異，說明黑柄炭角菌發(fā)酵液粉可促進CD4+、 CD8+T淋巴細胞的增 值與活化，直接殺傷腫瘤細胞或通過其分泌細胞銀子輔助殺傷腫瘤細胞，從而 產生抗腫瘤的效應。根據黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的抗腫瘤活性，可以將其開發(fā)成 治療腫瘤、前列腺癌、肝硬化和調節(jié)免疫等方面的藥物、保健品和食品。 實施例7:黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的小鼠急性毒性實驗
黑柄炭角菌發(fā)酵液用專利96106492.7中提及的方法濃縮后干燥得黑柄炭角 菌發(fā)酵液浸膏。取昆明小鼠24只，分兩組，一組灌胃黑柄炭角菌發(fā)酵液粉，另 一組灌胃黑柄炭角菌發(fā)酵液浸膏，劑量均為24g/kg， 一天三次，觀察7天，給 藥前禁食12小時，結果黑柄炭角菌發(fā)酵液粉組小鼠均未見毒副反應，體重有所 增加；黑柄炭角菌發(fā)酵液浸膏組小鼠死亡6只，其余6只均出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，體 重下降。
實施例8:制備含黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的藥物
將本發(fā)明的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉，采用公知的方法，加入公知的常用的輔 料，制成各種劑型如膠嚢劑、顆粒劑、口服液、片劑、散劑、糖漿劑、丸劑、 酒劑、茶劑等。
權利要求
1、黑柄炭角菌發(fā)酵液粉，其特征在于由黑柄炭角菌發(fā)酵液提取干燥而成的粉末，不含黑柄炭角菌菌絲體和發(fā)酵液中的無機鹽、單糖及氨基酸等成分。
2、 如權利要求l所述的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉的制備方法，其特征在于將 黑柄炭角菌進行液體發(fā)酵后，通過固液分離得到菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用適 當孔徑的超濾膜過濾掉單糖和氨基酸等小分子有機化合物和無機鹽后干燥、粉 碎即得。
3、 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于超濾膜的孔徑應當適中， 該孔徑能夠濾過單糖、氨基酸和無機鹽等小分子并截留多糖、蛋白質、甾體、 皂甙和黃酮等分子量較大的化合物。
4、 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于干燥方法可以采取噴霧干 燥，也可以采取烘干后粉碎或者冷凍干燥等方法。
5、 如權利要求l所述的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉在制備免疫調節(jié)、改善睡眠、 抗焦慮、抗抑郁、治療偏頭痛及女性痛經方面的藥物、保健品及食品中的應用， 其特征在于所制備藥物的主要原料或者主要原料之一為黑柄炭角菌發(fā)酵液粉。
6、 如權利要求l所述的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉在制備滇咳、治療肺結核、抗 炎、治療乙肝、肝硬化和前列腺炎藥物、保健品及食品中的應用，其特征在于 所制備藥物的主要原料或者主要原料之一為黑柄炭角菌發(fā)酵液粉。
7、 如權利要求1所述的黑柄炭角菌發(fā)酵液粉在制備治療糖尿病藥物和抗腫 瘤藥物、保健品及食品中的應用，其特征在于所制備藥物的主要原料或者主要 原料之一為黑柄炭角菌發(fā)酵液粉。
8、 如權利要求5 7所述的應用，其特征是在應用時可以直接使用黑柄炭角 菌發(fā)酵液粉的原粉，也可以將其制成膠嚢劑、顆粒劑、口服液、片劑、散劑、 糖漿劑、丸劑、酒劑、茶劑等制劑形式后使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了黑柄炭角菌發(fā)酵液粉及其制備與應用。黑柄炭角菌發(fā)酵液粉是將黑柄炭角菌進行液體發(fā)酵后，通過固液分離得到菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用超濾膜過濾掉單糖和氨基酸等小分子有機化合物和無機鹽后干燥、粉碎即得。其特征是不含菌絲體，并且除去了發(fā)酵液中的大量無機鹽、單糖和氨基酸等成分，保留了發(fā)酵液中的主要活性成分如黑柄炭角菌多糖等。所得黑柄炭角菌發(fā)酵液粉可以用作制備免疫調節(jié)、改善睡眠、抗焦慮、抗抑郁、治療偏頭痛、鎮(zhèn)咳、治療肺結核、抗炎、治療乙肝、前列腺炎、抗腫瘤、女性痛經及治療糖尿病藥物、保健品及食品。
文檔編號A61P11/00GK101347465SQ200710070008
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月16日 優(yōu)先權日2007年7月16日
發(fā)明者萍 張, 楊勇杰, 楊國良 申請人:楊國良;楊勇杰