專利名稱：：表達(dá)具有免疫激活功能的單鏈rna的dna疫苗載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因免疫領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于提高DNA疫苗免疫原性的表達(dá)載體、具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：DNA疫苗又稱基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA。該類疫苗通過(guò)把抗原基因?qū)塍w內(nèi)表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防或治療疾病的目的，因此也被稱為基因免疫。DNA疫苗既可以誘導(dǎo)抗原特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，又可以誘導(dǎo)抗原特異的體液免疫反應(yīng)，具有安全、模擬天然抗原呈遞過(guò)程、構(gòu)建周期短、生產(chǎn)簡(jiǎn)單、成本低、載體本身無(wú)免疫原性、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、無(wú)需冷鏈等諸多優(yōu)點(diǎn)。作為一種新的疫苗形式，DNA疫苗的前景己經(jīng)逐步得到肯定，不但在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出非常好的潛力(HaigwoodNL，Immunollett，1999，66(1-3):183-188;ShiverJM，JPharmScU996，85(16):1317-1324)，而且在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的安全性，受試者對(duì)DNA疫苗的耐受性也非常好。目前DNA疫苗面臨的主要問(wèn)題是免疫原性較弱，通常很難單獨(dú)誘導(dǎo)出保護(hù)性免疫反應(yīng)。多年來(lái)，疫苗學(xué)家一直在嘗試不同的策略，期望能夠提高DNA疫苗的免疫效果，并為此進(jìn)行了許多努力和嘗試。DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)需要抗原呈遞細(xì)胞獲取足夠的抗原并將其有效呈遞，在這一過(guò)程中，協(xié)同刺激信號(hào)、炎癥信號(hào)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生是誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)所必需的。研究表明，細(xì)胞凋亡能夠提供這類信號(hào)(AlbertML,Nature.1998，392(6671):86-9)。DNA疫苗誘導(dǎo)的凋亡能夠有效地促進(jìn)APC對(duì)抗原的攝取與呈遞，提高DNA疫苗的免疫效果(SasakiS,etc,NatBiotechnol.2001，19(6):543-7)。近年來(lái)，甲病毒載體為代表的復(fù)制型載體成為疫苗載體研究的熱點(diǎn)。以甲病毒復(fù)制子載體為代表的DNA疫苗設(shè)計(jì)思路很好的模擬了病毒感染的過(guò)程，能夠全面誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和免疫激活，但龐大的載體和復(fù)雜的作用機(jī)制限制了這類載體的發(fā)展。一些以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為目的DNA疫苗載體設(shè)計(jì)雖然取得了一定的成功，卻忽略了病毒感染這一復(fù)雜事件所引發(fā)的其它免疫激活機(jī)制。如何利用簡(jiǎn)單的刺激信號(hào)誘導(dǎo)凋亡并激活更廣泛的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，這成為提高DNA疫苗免疫原性的關(guān)鍵之一。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的單鏈RNA(ssRNA)的DNA序在另一方面，本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包含一種表達(dá)載體和插入所述表達(dá)載體中的編碼抗原的外源基因，其中所述載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的單鏈RNA的DNA序列。在另一方面，本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含如上所述的本發(fā)明的表達(dá)載體或者本發(fā)明的重組質(zhì)粒。在另一方面，本發(fā)明提供一種具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗，其包含如上所述的本發(fā)明的重組質(zhì)粒。在另一方面，本發(fā)明提供一種提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含將編碼抗原的外源基因克隆到本發(fā)明的表達(dá)載體中以構(gòu)建DNA疫苗。此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的表達(dá)載體在制備具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗中的應(yīng)用。圖l為單鏈RNA(ssRNA)表達(dá)盒結(jié)構(gòu)示意圖，U6promoter表示鼠U6啟動(dòng)子，Transcriptiontermination表示ssRNA表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。圖2為載體pDRVI3.0構(gòu)建流程圖，通過(guò)將ssRNA表達(dá)盒克隆入載體pDRVISVl.O的BGHpA下游，構(gòu)建成新的DNA疫苗載體pDRVI3.0。ssRNA表示單鏈RNA編碼序列。polyT表示ssRNA轉(zhuǎn)錄終止序列。pU6表示鼠U6啟動(dòng)子。BGHPolyA表示牛生長(zhǎng)激素基因的多聚腺苷加尾信號(hào)，MCS表示供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)。ExonA-IntronA表示人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因(Humancytomegalovirusmajorimmediate-earlyproteingene)外顯子1禾n內(nèi)含子1。pCMV表示人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列。圖3為載體pDRVISVl.O、pDRVI3.0結(jié)構(gòu)示意圖。載體元件說(shuō)明見圖1說(shuō)明。Kan表示卡那霉素抗性基因，ColEl表示ColEl復(fù)制起始區(qū)，BGHPoiyA表示牛生長(zhǎng)激素基因的多聚腺苷加尾信號(hào)，MCS表示供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，ExonA-IntronA表示人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因外顯子l和內(nèi)含子l，pCMV表示人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期蛋白基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列，pU6表示鼠U6啟動(dòng)子，ssRNA表示可激活PKR的單鏈RNA的基因，pT表示ssRNA表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。圖4為pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag結(jié)構(gòu)示意圖。載體元件說(shuō)明見圖2和圖3說(shuō)明。圖5為PCR擴(kuò)增ssRNA表達(dá)盒片段電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ssRNA表達(dá)盒，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖6為PCR擴(kuò)增BGHpA片段電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BGHpA片段，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖7為PCR擴(kuò)增BGHpA-ssRNA表達(dá)盒片段電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BGHpA-ssRNA表達(dá)盒，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖8為pDRVI3.0的五coRV和酶切鑒定圖，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1為pDRVI3.0的EcoRV和Z&al酶切產(chǎn)物。圖9為pDRVI3.0-gag的EcoRV和^Y&"I酶切鑒定圖，M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1為pDRVI3.0-gag的五coRV和lal酶切產(chǎn)物。圖10為pDRVI3.0-gag的和EcoiV酶切鑒定圖，Ml泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000,M2泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000，1為pDRVI3.0-gag的&ZI和五coiV酶切產(chǎn)物。圖11為DNA疫苗質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48小時(shí)后Western印跡檢測(cè)Gag表達(dá)的PVDF膜掃描圖。M為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-170KD)，樣品1為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的Hela細(xì)胞，2為pDRVISVl.O-gagtm轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，3為pDRVI3.0-gag轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞。圖12為DNA疫苗質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48小時(shí)后，AnnexinV-FITC抗體染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(細(xì)胞凋亡)結(jié)果。圖13為以DNA疫苗免疫Balb/cH-2d小鼠的免疫時(shí)間及劑量示意圖。DNA疫苗質(zhì)粒分兩個(gè)劑量組分別免疫，免疫時(shí)間點(diǎn)為第O、2、4周，免疫后第6周進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)檢測(cè)。圖14為表示pDRVISVl.O-gagtm和pDRVI3.0-gag在100|ig劑量誘導(dǎo)的Gag特異性IgG抗體按終末稀釋法進(jìn)行ELISA檢測(cè)的結(jié)果，抗體滴度為一組小鼠抗體滴度的幾何均值，其中pDRVISVl.O-gagtm誘導(dǎo)的抗體滴度為1:24018.9，pDRVI3.0-gag誘導(dǎo)的抗體滴度為1:47504.6。圖15為表示pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag在IO嗎劑量誘導(dǎo)的Gag特異性IgG抗體按終末稀釋法進(jìn)行ELISA檢測(cè)的結(jié)果，抗體滴度為一組小鼠抗體滴度的幾何均值，其中pDRVISVl.O-gagtm誘導(dǎo)的抗體滴度為1:380，pDRVI3.0-gag誘導(dǎo)的抗體滴度為1:6320。圖16為表示pVRC2000-gag和pDRVISVl.O-gagtm在100|ig誘導(dǎo)的IgG亞類滴度，A為劑量誘導(dǎo)的IgG亞類滴度，其中IgG2a/IgGl的比值為pDRVISVl.O-gagtm:1.31，pDRVI3.0-gag:1.08;B為在IO嗎劑量誘導(dǎo)的IgG亞類滴度，其中IgG2a/IgGl的比值為pDRVISV1.0-gagtm:1.25;pDRVI3.0陽(yáng)gag:1.13。圖17為ELISPOT法檢測(cè)HIV-1CN54Gag特異性細(xì)胞免疫的結(jié)果。細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果用Gag特異肽庫(kù)剌激小鼠脾細(xì)胞后分泌IFN-y的細(xì)胞數(shù)量表示。圖表1、3分別為pDRVISV1.0-gagtm在IOO昭和10)ag免疫劑量誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，2、4分別為pDRVI3.0-gag在IOO昭和IO嗎免疫劑量誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，5、6為對(duì)照載體pDRVISV1.0和pDRVI3.0誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，7為未接種任何質(zhì)粒的空白小鼠對(duì)照。分泌IFN-y的淋巴細(xì)胞數(shù)為(SFU/106細(xì)胞)pDRVISV1.0-gagtm100(ig免疫劑量1013.5;pDRVI3.0-gagIOO嗎免疫劑量1586.5;pDRVISV1.0-gagtmIO叱免疫劑量550;pDRVI3.0-gagIO昭免疫劑量959。圖18表示細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)HIV-1CN54Gag特異性細(xì)胞免疫的結(jié)果。細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果用Gag特異肽庫(kù)刺激小鼠脾細(xì)胞后分泌IFN-y的淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例(％)表示。1、3分別為pDRVISV1.0-gagtm在IOO嗎和IO嗎免疫劑量誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，2、4分別為pDRVI3.0-gag在,g和IO嗎免疫劑量誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，5、6為對(duì)照載體pDRVISVl.O和pDRVI3.0誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，7為未接種任何質(zhì)粒的空白小鼠對(duì)照。其中HIV-1CN54Gag特異性CD8+T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞總數(shù)的比例分別為(％):pDRVISV1.0-gagtmIOO嗎免疫劑量1.17;pDRVI3.0-gagIOO嗎免疫劑量1.68;pDRVISV1.0-gagtmIO嗎免疫劑量0.302;pDRVI3.0-gagIO嗎免疫劑量0.872。圖19所示為鼠源U6啟動(dòng)子的序列。圖20所示為本申請(qǐng)的實(shí)施例1-6中所構(gòu)建的或者使用的本發(fā)明的載體中所含的編碼ssRNA的DNA序列。圖21所示為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的單鏈RNA(ssRNA)的DNA序列。術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"在本發(fā)明中是指兩種核苷酸序列是物理上或功能上相關(guān)聯(lián)的，例如一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域與一個(gè)核苷酸序列以這種方式連接，由此核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄由該啟動(dòng)子區(qū)域控制和調(diào)節(jié)。術(shù)語(yǔ)"具有免疫激活功能"在本發(fā)明中是指物質(zhì)能夠激活免疫系統(tǒng)或使免疫系統(tǒng)活性提高的功能，例如，本發(fā)明的載體所表達(dá)的單鏈RNA能夠引發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)DNA疫苗所產(chǎn)生的抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。例如，本發(fā)明的表達(dá)載體所編碼的單鏈RNA可通過(guò)激活蛋白激酶R(PKR)而發(fā)揮免疫激活功能。蛋白激酶R(PKR)可識(shí)別病毒雙鏈RNA(dsRNA)并介導(dǎo)干擾素應(yīng)答和細(xì)胞凋亡。己知一些RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)如TNF-a/|3mRNA5'UTR、dsRNA以及一些具有特征性高級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA能夠特異性激活PKR(RaymondKaempfer.EMBOreports4，1043—1047(2003);XiaofengZhengandPhilipC，RNA(2004)，10:1934-1945)，并能激活細(xì)胞的抗病毒機(jī)制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，具有特殊發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ssRNA也能夠有效地激活PKR(PhilipCetc,所oc/zem^^y1998，37，6303-6316)。本發(fā)明的表達(dá)載體可產(chǎn)生能夠特異性激活PKR的ssRNA，此類ssRNA可用作分子佐劑，用于DNA疫苗，以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。例如，可在現(xiàn)有的DNA疫苗載體上插入ssRNA表達(dá)盒，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可在抗原表達(dá)細(xì)胞中產(chǎn)生ssRNA分子，由此誘導(dǎo)包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的廣泛免疫激活機(jī)制?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于鼠U6啟動(dòng)子、人U6啟動(dòng)子及人H1啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，表達(dá)載體中的啟動(dòng)子是鼠U6啟動(dòng)子。在本發(fā)明的表達(dá)載體的優(yōu)選實(shí)施方式中，所產(chǎn)生的單鏈RNA可具有選自如下一組的序列序列號(hào)SEQIDNO:l單鏈RNA序列GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCCAUGAGGUCUAUCACUGCAUCGACAGCUAGGCGGACAAUGCUUAAGCCAGAGGUCGAUGGAUC(CLONE2)SEqIDNO:2GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCGUAAGGGUUCACUCUGCAUCGACAACUGGACUUAAGCCAGAGGUCGAUGGAUC(CLONE14)有關(guān)文獻(xiàn)PhilipC.Bevilacqua,CyrilX.BindingoftheProteinKinasePKRtoRNAswithSecondaryStructureDefects:RoleoftheTandemA-GMismatchandNoncontiguousHelixes.5,'oc/7e"〃'W''_y1998,37,6303-6316SEQIDNO:3GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUCGGAGGUGGUUCAGCUCUGCAUCGACAGUUGGCCUUAAGCCAGAGGUCGAUGGAUC(CLONE11)GGGAGAGAGGUCACUGACUAAGUUGGUGAAAUCUUGAUUUAUCAGUGACAAGAAGGAAGGGAUC(C26(9'15))XIAOFENGZHENGandPHILIPC.BEVILACQUA,ActivationoftheproteinkinasePKRbyshortdouble-strandedRNAswithsingle-strandedtails.^RAC4(2004)，10:1934—1945根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的表達(dá)載體是如圖3所示的pDRVI3.0。該載體是通過(guò)將編碼SEQIDNO:l的單鏈RNA的DNA序列克隆入載體pDRVISVl.O的BGHpA(牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷加尾信號(hào))下游而獲得。本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，其包含本發(fā)明的表達(dá)載體和插入所述表達(dá)載體中的編碼抗原的外源基因。本發(fā)明的重組質(zhì)粒中的"外源基因"包括但不限于編碼微生物例如病毒或者細(xì)菌的抗原性蛋白質(zhì)或者多肽的基因、以及編碼腫瘤抗原的基因。例如，所述外源基因是HIV-1CN54gflg基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組質(zhì)粒中的外源基因是來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.1003的DH5a/pCRScript-gpnef中的HIV-1CN54gag基因。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組質(zhì)粒是如圖4所示的pDRVI3.0-gag的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的表達(dá)載體或者重組質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌，例如ToplO。本發(fā)明還提供了一種具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗，其包含本發(fā)明的重組質(zhì)粒，其中在現(xiàn)有的DNA疫苗載體上插入了ssRNA表達(dá)盒。此類DNA疫苗經(jīng)接種于動(dòng)物后可在靶細(xì)胞中產(chǎn)生ssRNA分子并表達(dá)DNA疫苗所編碼的抗原，由此通過(guò)ssRNA分子誘導(dǎo)包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的廣泛免疫激活機(jī)制而增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)所述抗原而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明同時(shí)提供了一種提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含將編碼抗原的外源基因克隆到本發(fā)明的表達(dá)載體中以構(gòu)建DNA疫苗。此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的表達(dá)載體在制備具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗中的應(yīng)用。以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，下述實(shí)施例的意圖是解釋本發(fā)明，而不應(yīng)以任何形式理解為意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)材料pDRVISV1.0是由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室構(gòu)建的DNA疫苗載體，其結(jié)構(gòu)見圖2?？砂凑誄N1560259A(中國(guó)專利申請(qǐng)專利申請(qǐng)?zhí)?00410028280.3)所述的方法構(gòu)建載體pDRVISVl.O，在此通過(guò)引用將CN1560259A并入本文。攜帶遺傳密碼優(yōu)化的HIVB7C重組毒株CN54gag基因的質(zhì)粒pCRScript-gpnef由本實(shí)驗(yàn)室和德國(guó)雷根斯堡大學(xué)微生物研究所共同構(gòu)建，轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒的大腸桿菌DH5ot/pCRScript-gpnef已于2003年9月11日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(中國(guó)，北京，中關(guān)村)，保藏號(hào)為1003。攜帶pDRVISV1.0-gagtm的大腸桿菌Top10/pDRVISV1.0-gagtm已于2003年9月11日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCq(中國(guó)，北京，中關(guān)村)，保藏號(hào)為1002。PyrobestDNAPolymerase高可信度擴(kuò)增酶為Takam公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶、T4DNA連接酶為NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶均為Takara和NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品。DNA分子量Marker為寶生物公司和鼎國(guó)公司產(chǎn)品；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)為Amersham公司產(chǎn)品，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為Gibco和MBI公司產(chǎn)品。瓊脂糖(Agarose)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、十二烷基硫酸鈉(SDS)均為GIBCOBRL公司產(chǎn)品。酵母粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；巰基乙醇ME、丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺為Fluka公司產(chǎn)品。Tris堿、X-gal、高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Promega公司產(chǎn)品；IPTG、DTT、dNTPs為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭毁|(zhì)粒小量提取試劑盒E.Z.N.A.PlasmidMiniprepKitI質(zhì)粒、凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.GelExtractionKit、純化試劑盒E.Z.N.ACycle-PureKit為Omega公司產(chǎn)品，制備無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA白勺EndofreePlasmidGigaKit為Qiagen公司產(chǎn)品；Lipofectamine2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；MouseIFN-yELISPOT檢測(cè)試劑盒為UC-Tech公司產(chǎn)品。大腸桿菌ToplO購(gòu)自Invitrogen公司；PGEMT-easyVectorSystemI購(gòu)自Invitrogen公司；BHK-21細(xì)胞(BabyHamsterkidneycells,ATCCNumber:CCL-10)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室保存，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、ly。青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中37。C5%(:02培養(yǎng)，培養(yǎng)液均由由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所配液室提供。培養(yǎng)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司?？笻IV-1陽(yáng)性血清來(lái)性病艾滋病預(yù)防控制中心參比室；堿性磷酸酶AP標(biāo)記羊抗人IgG、辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中山公司；來(lái)源于B7C重組亞型HIV-1CN54毒株gag的合成肽庫(kù)用于GaglFNi分析，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究參比試劑項(xiàng)目(NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgram)饋贈(zèng)；ELISA檢測(cè)所用HIV-1p55抗原由性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室提供；流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色所需熒光抗體CD3-cy5、CD8-PE、IFN卞FITC和凋亡檢測(cè)抗體AnnexinV-FITC為Pharmingen公司產(chǎn)品；Laborzentrifogen臺(tái)式冷凍離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品，BeckmanJ2-MC高速冷凍離心機(jī)；GeneAmpPCRSystem9700PCR儀為PE公司產(chǎn)品；恒壓恒流電泳儀HoeferEPS2A200,PowerPAC300、PowerPAC1000垂直蛋白電泳儀和TRANS-BLOTSDSEMI-DRYTRANSFERCELL電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品；HPS280恒溫生化培養(yǎng)箱HZQX100振蕩培養(yǎng)箱為哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司產(chǎn)品；JY92II型超聲波破碎儀為寧波新技術(shù)公司產(chǎn)品；PVDF膜為Amersham公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱為SANYO公司產(chǎn)品；ELISPOT讀板儀為BIOSIS公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6-8周齡BALB/cH-2d雌性小鼠體重18-25克購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁殖中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。實(shí)施例1:DNA疫苗載體pDRVI3.0和DNA疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建為了使DNA疫苗質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ssRNA分子，以激活蛋白激酶R(PKR)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，我們利用U6啟動(dòng)子介導(dǎo)ssRNA(SEQIDNO:l)的轉(zhuǎn)錄(圖1)。利用人工合成的寡核苷酸，通過(guò)基因合成的方式人工合成ssRNA表達(dá)盒，并將其插入DNA疫苗載體pDRVISVl.OBGHpA元件的下游(圖2和3)，得到DNA疫苗載體pDRVI3.0。(1)OverlapingPCR合成U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ssRNA表達(dá)盒(mUC)寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成引物名稱;l物序列TTTG-3，;，-GTACAAGAAAGCTGGGTCTAG-3';,-GTGCGAGGGGGCCGGCGCGGGCCTAGAGATGGCGGCGTCGGATC-3';，-CACGCTTCCGCTCTCCCCAAACAAGGCTTTTCTCCAAG-3';，-TGATAGACCTCATGGGCCCAGCACGCTTCCGCTCTCCCCAAAC-3'反應(yīng)條件無(wú)菌ddH2012^1，10xPCRBuffer2.5^1(含MgCl2)，2.5mMdNTP1^1，上述18條引物各0.5^(20jiM)，混勻后在GeneAmp2400PCR擴(kuò)增儀中94t:變性5分鐘，加入Pyrobest酶0.5^1(5U)。按下列條件進(jìn)行基因合成94°C變性20sec56°C退火20sec72°C延伸30sec共10個(gè)循環(huán)72°C延伸5min。(2)PCR獲取ssRNA表達(dá)盒mUC引物設(shè)計(jì)引物名稱引物序列mU6up5,-GATCCGACGCCGCCATCTCTAG-3，U6down5，-GTACAAGAAAGCTGGGTCTAG-3'反應(yīng)條件無(wú)菌ddH2038(il，10xPCRBuffer5(il(含MgCl2)，2.5mMdNTP4pl，上述基因合成產(chǎn)物0.5^，引物各1i!l(20jaM)，混勻后在GeneAmp2400PCR擴(kuò)增儀中94匸變性5分鐘，加入Pyrobest酶0.5pl(5U)。按下列條件進(jìn)行基因合成94°C變性20sec60。C退火20sec72°C延伸40sec，共25個(gè)循環(huán)72°C延伸8min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖5)。(3)PCR獲取BGHpA加尾信號(hào)引物設(shè)計(jì)引物名稱引物序列BGHupBGHdown5，-TGCAGGATATCTGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3，5'-TAGGTTTGGTTTGGTGGGCTGATG-3'反應(yīng)條件無(wú)菌ddH2038^1，10xPCRBuffer5(!l(含MgCl2)，2.5mMdNTP4(il，pDRVISVl.O質(zhì)粒l)il(200ng)，引物各1^1(20nM)，混勻后在GeneAmp2400PCR擴(kuò)增儀中94。C變性5分鐘，加入Pyrobest酶0.5(il(5U)。按下列條件進(jìn)行基因合成94°C變性30sec60°C退火30sec72°C延伸40sec，共25個(gè)循環(huán)72°C延伸8min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖6)。(4)mUC與BGHpA的拼接(pA-mUC)引物設(shè)計(jì):引物名稱弓物序列BGHup5，-TGCAGGATATCTGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3'U6down5，-GTACAAGAAAGCTGGGTCTAG-3'Ovei'kpingPCR反應(yīng)條件無(wú)菌ddH206.5^1，10xPCRBuffer1^1(含MgCl2)，2.5mMdNTP1^1，人源的ssRNA表達(dá)盒基因與BGHpA片段各(20^M)，混勻后在GeneAmp2400PCR擴(kuò)增儀中94。C變性5分鐘，72°C延伸10min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件無(wú)菌ddH2038pl，lOxPCRBuffer5[il(含MgCl2)，2.5mMdNTP4jil，加入拼接反應(yīng)產(chǎn)物lpl，引物各"1(20fiM)，混勻后在GeneAmp2400PCR擴(kuò)增儀中94°C變性5分鐘，加入Pyrobest酶0.5pl(5U)。按下列條件進(jìn)行基因合成94°C變性30sec60°C退火30sec72°C延伸60sec，共25個(gè)循環(huán)72°C延伸8min。結(jié)果獲得了特異性的目的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖7)。(5)質(zhì)粒構(gòu)建將純化后的pA-mUC片段用&0RV酶切6h，膠回收后后備用。pDRVISVl.O載體、pDRVISV1.0-gagtm質(zhì)粒用AT/wI酶切，純化后用T4DNA聚合酶磨平3，端(37°C30min)，產(chǎn)物純化后再用EcoRV單切。膠回收后載體與片段4。C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)菌并挑取克隆，&oRV和力d雙酶切進(jìn)行鑒定。酶切反應(yīng)體系10xBuffer5(il內(nèi)切酶各lpl質(zhì)?；蚱?5^1ddH20補(bǔ)足至50nl。酶切鑒定反應(yīng)體系10xBuffer2^1內(nèi)切酶l各1W質(zhì)粒5plddH20補(bǔ)足至20jil。DNA末端平端化反應(yīng)體系10xBuffer5^dT4DNAPolymerase1pidNTPlul酶切后的質(zhì)粒30^1ddH20補(bǔ)足至50^1。結(jié)果載體pDRVI3.0和DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.0-gag構(gòu)建正確。pDRVI3.0酶切鑒定結(jié)果見圖8，pDRVI3.0-gag酶切鑒定結(jié)果見圖9和圖10。實(shí)施例2.體外抗原表達(dá)分析(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞接入六孔板，培養(yǎng)至卯％單層，用Lipofectamine2000分別將實(shí)施例1制備的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(方法見Lipofectamine2000protocol,Invitrogen)，質(zhì)粒用量2叱/孔，DMEM維持液(2%FBS、1%PS、l%Gln)0.5%C0237。C培養(yǎng)48小時(shí)。(2)Western印跡目的蛋白的收獲質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48h后細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞，離心后重懸細(xì)胞沉淀，加入等體積的2X上樣緩沖液混勻煮沸5min。電泳配制10%聚丙烯酰胺凝膠，加入上述處理后的樣品，120V的電壓電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，切下分離膠。電轉(zhuǎn)移甲醇預(yù)處理PVDF膜15sec，去離子水清洗后浸泡于正極液。按順序安裝電轉(zhuǎn)移裝置，3mA/cm2電轉(zhuǎn)50min。電轉(zhuǎn)移完成后，甲醇處理PVDF膜15sec，干燥15min。5%脫脂奶稀釋一抗，一抗為HIV-1陽(yáng)性病人血清。PBS洗膜3次，每次10min。加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(5%脫脂奶按1:2000稀釋)室溫孵育lh。PBS洗膜4次，每次IOmin。加入DAB顯色底物顯色后蒸餾水漂洗終止反應(yīng)。結(jié)果(圖ll)表明，pDRVISV1.0-gagtm禾口pDRVI3.0-gag所表達(dá)的Gag蛋白能夠與HIV感染者的血清發(fā)生特異的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，表明表達(dá)產(chǎn)物具有與天然抗原相似的抗原性。從表達(dá)量來(lái)看，pDRVI3.0-gag旳表達(dá)水平略低于pDRVISV1.0-gagtm的表達(dá)水平，這可能是由于pDRVI3.0-gag在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ssRNA誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞的凋亡。實(shí)施例3.細(xì)胞凋亡檢測(cè)DNA疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，AnnexinV-FITC染色后流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比例。步驟l:DNA疫苗質(zhì)粒用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，質(zhì)粒用量2jiig/孔，以DMEM維持液(2%FBS、1%PS、l%Gln)在0.5%C0237"C條件下培養(yǎng)48小時(shí)，并用不含質(zhì)粒的PBS作為陰性對(duì)照，以絲裂酶素禾口LPS(刺激6h)作為陽(yáng)性對(duì)照。步驟2:清洗并收集細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞(結(jié)合緩沖液10mMHepes、140mMNaCl、2.5mMCaCl2，PH7.4)，1000rpm離心5min收集細(xì)胞。步驟3:用100^結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5plAnnexinV-FITC(25嗎/ml)，37。C避光放置20min。步驟4:以結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，1000rpm離心5min收集細(xì)胞。結(jié)合緩沖液重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)數(shù)10000點(diǎn)，分析凋亡細(xì)胞比例(％)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果(圖12):pDRVISV1.0-gagtm、pDRVI3.0-gag誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的比例分別為9.72%和25.3%;陰性對(duì)照的細(xì)胞凋亡比例為0.92%。結(jié)果表明，攜帶ssRNA表達(dá)盒的新型DNA疫苗載體pDRVI3.0所構(gòu)建的DNA疫苗能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例4.DNA疫苗免疫小鼠動(dòng)物分組35只小鼠分為7組，每組5只，清潔級(jí)飼養(yǎng)。質(zhì)粒DNA免疫小鼠，pDRVISV1.0-gagtm和pDRVD.0-gag設(shè)10jig和IOO叱兩個(gè)免疫劑量。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>免疫方式用QIAGEN公司的EndoFreePlasmidGigaKit制備質(zhì)粒pDRVISV1.0-gagtm、pDRVI3.0-gag、pDRVISVl.O禾卩pDRVI3.0，分別溶于生理鹽水，配成濃度為lpg4il或0.1pg/jil的質(zhì)粒溶液。實(shí)驗(yàn)組每組5只小鼠(n=5)，并設(shè)空載體對(duì)照和空白對(duì)照每組各5只。采用雙側(cè)后腿脛骨前肌注射方法，DNA疫苗免疫組和載體對(duì)照組小鼠注射質(zhì)粒DNA(10(Hd/只)，空白對(duì)照組注射生理鹽水。初次免疫后間隔2周以同樣劑量加強(qiáng)免疫2次(圖13)。實(shí)施例5.體液免疫檢測(cè)第0、2、4周各以DNA疫苗免疫1次，第2、4周尾靜脈取血分離血清，第6周殺鼠取血清，ELISA檢測(cè)第2、4、6周Gag特異性IgG結(jié)合抗體滴度。步驟l:用純度大于卯。/。的重組Gagp55抗原蛋白(31)包被酶標(biāo)板(0.1pg/ml)，每孔加0.1ml，4"C過(guò)夜。次日洗滌緩沖液洗滌3次，甩盡殘余液體。以抗體稀釋液封閉60min，洗滌緩沖液洗漆3次，甩干后作檢測(cè)，或晾干后4t:保存。步驟2:加一定抗體稀釋液稀釋的待檢樣品(從1:100開始，倍比稀釋至l:51200)O.lml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37。C孵育60min，洗滌8次(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)。步驟3:于反應(yīng)孔中，加入新鮮l:5000抗體稀釋液稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37。C孵育60min，洗滌8次，最后一遍用DDW洗滌。步驟4:加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液O.lml，37"C避光反應(yīng)10min。終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入50jil2M硫酸0.05ml。步驟5:結(jié)果判定在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處(620為參考波長(zhǎng))，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。結(jié)果如圖14、圖15和圖16所示。實(shí)施例6.細(xì)胞免疫檢測(cè)(1)脾淋巴細(xì)胞的制備1)小鼠眼眶采血，血樣標(biāo)記后4。C過(guò)夜，第二天收集血清-2(TC保存。2)處死小鼠后取脾，在5mlHanks洗液中以紗布研磨分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpm離心5min。3)棄上清，利用約100)il殘留液體重懸細(xì)胞后，加入2ml紅細(xì)胞裂解液，從第一管開始計(jì)時(shí)，作用4min后，每管加入5ml1640洗液終止裂解，1000rpm離心5min。4)棄上清，重懸細(xì)胞后，每管加入5ml1640洗液洗細(xì)胞，1000rpm離心5min。5)棄上清，重懸細(xì)胞后，每管加入2ml1640完全培養(yǎng)液，混勻后取50pil細(xì)胞懸液以PBS稀釋10倍后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度到lxl07/ml。(2)ELISPOT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞反應(yīng)水平1)包被:在ELISPOT板中每孔加入包被抗體50^1，用PBS補(bǔ)充體積至每孔100^1。ELISPOT板用adhesivecoverslip蓋上以防蒸發(fā)，37°C2h。2)ELISPOT板的封閉3)取出已包被過(guò)的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。4)無(wú)菌條件下用PBST洗滌6次300|il排槍。5)在ELISPOT板中，每孔加入200)il含1%BSA(或Blockbuffer)的PBS，37°Clh。6)取出37匸下封閉lh的ELISPOT板，吸棄每孔中的封閉液。(不要洗板！)7)在ELISPOT板中，加入lOOpl多肽(先加肽再加細(xì)胞)，最后加入100pl淋巴細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)為lxi06)，總體積到200pl(每條多肽的終濃度為5昭/ml，細(xì)胞的終濃度為lxl07/ml，即每孔細(xì)胞總數(shù)為lxio6)。陰性對(duì)照不加多肽，加100plR1640完全培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照不加多肽，加入PMA2.5^1(25ng/ml)，Innomycin(l嗎/ml)。免疫組各設(shè)2個(gè)復(fù)孔。8)蓋好ELISPOT板，放入37"CO2孵箱培養(yǎng)30h。9)培養(yǎng)30h后，取出ELISPOT板。甩去細(xì)胞后，每孔加入200pl冰冷的去離子水。把ELISPOT板放置在冰浴中IO分鐘。10)用PBST洗滌8次洗板機(jī)。11)每孔加入lOO(il生物素化的detectorAb。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37°C孵箱中孵育lh。12)取出ELISPOT板，倒去detectorAb溶液，用PBST洗滌8次。13)每孔加入50plGABA溶液。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37。C孵箱中孵育lh。14)取出ELISPOT板，倒去GABA溶液。用PBST洗滌8次。洗滌完畢后，在吸水紙上輕輕拍干ELISPOT板。15)每孔加入30^Activator溶液。在暗處、室溫下孵育(1540分鐘)。16)出現(xiàn)斑點(diǎn)后，用蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。17)室溫下避光干燥，讀板儀檢測(cè)。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTL反應(yīng)水平1)在96孔板中每孔加入加入100pl多肽(先加肽再加細(xì)胞)，最后加入100pl淋巴細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)為lxl06)，總體積到200(il(每條多肽的終濃度為5嗎/ml，細(xì)胞的終濃度為lxl07/ml，即每孔細(xì)胞總數(shù)為lxl06)。陰性對(duì)照不加多肽，加10(^1R1640完全培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照不加多肽，加入PMA5^1(25ng/ml)，Innomycin2pl(l昭/ml)，放入37°C0)2孵箱培養(yǎng)17h。2)將培養(yǎng)的96孔板1500卬m離心5min，迅速一次性甩去培養(yǎng)基，振蕩利用殘余液體重懸細(xì)胞，加入lOOiil染色緩沖液(PBS+2%FCS+2%NaN3)洗滌細(xì)胞后，將96孔板1500rpm離心5min，迅速甩去液體。3)加入100jil的ReagentA重懸細(xì)胞，室溫避光放置15min，加入100pl染色緩沖液，將96孔板1500rpm離心5min，迅速甩去液體。4)重懸于50^il含CD3-cy5、CD8-PE、IFN個(gè)FITC標(biāo)記抗體的ReagentB，其中抗體含量為lpl/we11，室溫避光放置25min。5)加入100W染色緩沖液洗滌細(xì)胞后，將96孔板1500rpm離心5min，迅速甩去液體。6)用500pl的固定液FACSbuffer+P/。甲酸重懸細(xì)胞準(zhǔn)備檢測(cè)。7)流式儀檢測(cè)FACS計(jì)數(shù)IOO，000點(diǎn)。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ssRNA表達(dá)盒元件顯著增強(qiáng)了DNA疫苗的免疫原性，可以作為優(yōu)化DNA疫苗的元件。10序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心<120>表達(dá)具有免疫激活功能的單鏈RNA的DNA疫苗載體及其用途<130>I200601644CB<160>26<170>Patentlnversion3.315<210><211><212><213>87RNAArtificial2025<220><223>CL0NE2<400>1gggagagcggaagcgugcugggcccaugaggucuaucacugcaucgacagcuaggcggac60aaugcuuaagccagaggucgauggauc8730<210><211><212><213>277RNAArtificial354045<220><223>CLONE"<400>2gggagagcggaagcgugcugggccguaaggguucacucugcaucgacaacuggacuuaag60ccagaggucgauggauc77<210><211><212><213><220><223>381RNAArtificialCLONE11<400>350gggagagcggaagcgugcugggccucggaggugguucagcucugcaucgacaguuggccu60uaagccagaggucgauggauc8155<210>4<211>64<212>RNA<213>Artificial60<220>23<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>1015202530354045505560<220><223>m窗5<400>9taaattattattttasaaaacagcacaaaaggaaactcaccctsactg48<210>10<211>56<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificial<220><223>mU6F6<400>10taaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttg56<210><211><212><213>1143DNAArtificial<220><223>mU6F7<400>11ctgggcccatgaggtctatcactgcatcgacagctaggcggac43<210>12<211>49<212>DNA<213>Artificial<220><223>mU6F8<400>12cttaagccagaggtcgatggatctttttctagacccagctttcttgtac49<210><211><212><213>1321DNAArtificial<220><223>mU6Rl<400>13gtacaagaaagctgggtctag21<210>14<211>47<212>DNA<213>Artificial<220><223>mU6R2<400>14ctcaaaacac3caattactttacagttagggtgagtttccttttgtg4710<210><211><212><213>1548DNAArtificial15<220><223>mU6R3<400>15ctgttttttaaastaataatttagtatttgtatctcttatagaastcc482025<210><211><212><213>1647DNAArtificial<220><223>mU6R4<400>1630aagcctatcatgtaaaatgtagctagtattaaaaagaacagattat(4735<210><211><212><213>1747DNAArtificial40<220><223>mU6R5<400>17tgtcttttatcgcacattaagcctctatagttactaggaaatattat4745<210><211><212><213>1846DNAArtificial50<220><223>mU6R655<400>18caaattaaccggggcaggggagtagccgagcttctcccacaagtct4660<210>19<211>44<212>DNA<213>Artificial<220><223>mU6R7<400>19gtgcgagggggccggcgcgggcctagagatggcggcgtcggate44<210>2010<211>38<212>DNA<213>Artificial15<220><223>mU6R82025<400>20cscgcttccgctctccccssacsaggcttttctccaag38<210><211><212><213>2143DNAArtificial<220〉<223>mU6R930<400>21tgatagacctcatgggcccagcscgcttccgctctccccaaac4335<210><211><212><213>2249DNAArtificial40<220><223>mU6R10<400>22gatccatcgacctctggcttaagcattgtccgcctagctgtcgatgcag4945<210><211><212><213>2322DNAArtificial5055<220><223〉mU6up<400>23gatccgacgccgccatctctag2260<210>24<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>U6down<400>24gtacaagaaagctgggtctag2110<210><211><212><213>2533DNAArtificial15<220><223>BGHup<400>25tgcaggatatctgctgtgccttctagttgccag332025<210><211><212><213><220><223>2624DNAArtificialBGHdown<400>2630tsggtttggtttggtgggctgatg2權(quán)利要求1.一種表達(dá)載體，其包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的單鏈RNA(ssRNA)的DNA序列。2.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子是U6啟動(dòng)子。3.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述單鏈RNA可激活蛋白激酶R(PKR)。4.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述單鏈RNA具有選自SEQIDNO:l-4的序列。5.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其是圖3所示的pDRVI3.0。6.—種重組質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的表達(dá)載體和插入所述表達(dá)載體中的編碼抗原的外源基因。7.權(quán)利要求6的重組質(zhì)粒，其中HIV-1CN54gag基因來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.1003的DH5a/pCRScript-gpnef。8.權(quán)利要求7的重組質(zhì)粒，其是圖4所示的pDRVI3.0-gag。9.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的表達(dá)載體或者權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)的重組質(zhì)粒。10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。11.一種具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗，其包含權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的重組質(zhì)粒。12.—種提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含將編碼抗原的外源基因克隆到權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的表達(dá)載體中以構(gòu)建DNA疫苗。13.權(quán)利要求12的方法，其中HIV-1CN54gag基因來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.1003的DH5a/pCRScript-gpnef。14.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的表達(dá)載體在制備具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于提高DNA疫苗免疫原性的表達(dá)載體，該載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的單鏈RNA(ssRNA)的DNA序列。本發(fā)明還公開了一種重組質(zhì)粒，其包含上述表達(dá)載體和插入所述表達(dá)載體中的編碼抗原的外源基因。本發(fā)明同時(shí)公開了具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗及其制備方法。文檔編號(hào)A61K48/00GK101270363SQ20071008873公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2007年3月20日優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日發(fā)明者勇劉,張玉偉,李鼎鋒,邵一鳴申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心