專利名稱：護膚組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種護膚組合物及其用途。尤其涉及用于改善膚質(zhì)、減少皺紋、防御紫外線以及抗老化的皮膚護理的組合物及其用途。

背景技術(shù)：
本發(fā)明是關(guān)于護膚的組合物及其用途，特別是利用黃耆(Astragalusmembranaceus)的以水萃取或醇萃取所得水不溶部分、有機溶劑部分或活性成分用于護膚的組合物及及其用途。
黃耆來自于學(xué)名為Astragalus membranaceus的植物的根部黃茋，其它的別名有黃茋(Milk Vetch root，指在美國生長的品種)及Huang-Qi。黃耆經(jīng)常被傳統(tǒng)中醫(yī)師用于增強或調(diào)節(jié)身體的整體活力，促進消化及滋補強化脾臟功能。許多研究也證實黃耆含有具有療效的活性成分，包括可刺激免疫系統(tǒng)的多醣。
一研究顯示末期癌癥患者即使的受試者在給予黃耆后，其免疫反應(yīng)可增強兩至三倍。另一篇研究顯示，在以免疫抑制劑一環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)治療的動物中，黃耆仍然具有補強(boost)免疫反應(yīng)的效果。在中國，癌癥病人于線服用黃耆抗癌藥物或放射治療之后，以補強免疫力，因為它有助于保護體內(nèi)的細(xì)胞對抗重金屬及化學(xué)毒素的傷害。
然而，尚未有研究指出黃耆萃取物或黃耆皂苷可用于護膚。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種護膚組合物及其用途，其包含用于改善膚質(zhì)、減少皺紋、防御紫外線以及抗老化有效量的由黃耆(Astragalus membranaceus)以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分。根據(jù)本發(fā)明的具體實例，其中黃耆該水不溶部分，系通過包括下列步驟的方法而被制得 以醇類或水的溶劑萃取黃耆，得到醇類或水萃取物；再以少量水洗滌該醇類或水萃取物，而得到該水不溶部分。
同時根據(jù)本發(fā)明，提一種用于皮膚護理的組合物及其用途，包含用于抗老化及防御紫外線有效量的式(I)的環(huán)木菠蘿烷醇型(cycloartanol)化合物。

式(I) 其中R1由下列組成的群中選出氫(H)、羥基(OH)、O-乙?；?O-acetyl)，O-木哌喃糖基(O-xylopyranosyl)、O-(2-乙酰木哌喃糖基)(O-(2-acetylxylopyranosyl))、O-(3-乙酰木哌喃糖基)(O-(3-acetylxylopyranosyl))、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)(O-(2，3-diacetylxylopyranosyl))、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)(O-(2，4-diacetylxylopyranosyl))、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基(O-xylopyranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosyl)、及O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基(O-xylopyranosyl-(1-2)-α-arabinopyranosyl)； R2由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；-葡萄哌喃糖基(O-glucopyranosyl)、及O-木哌喃糖基； R3由下列組成的群中選出氫、羥基及O-乙?；灰约? R4由下列組成的群中選出

本發(fā)明的其它特色和優(yōu)點將在下文說明中提出，可由該說明顯而易見，或可通過實施本發(fā)明而得知。本發(fā)明的特色和優(yōu)點將通過所述的組件和組合而了解和達成。
應(yīng)了解前述的發(fā)明內(nèi)容和下列實施方式僅為例示和說明，并非為本發(fā)明的限制。



參照附圖，將更能了解前述的發(fā)明內(nèi)容以及實施方式。
在圖中 圖1為顯示在以黃耆皂苷處理的人類HDF細(xì)胞中MMP-1表現(xiàn)量的抑制度的SDS-PAGE凝膠電泳圖。

具體實施例方式 本發(fā)明詳細(xì)說明如下。在本發(fā)明中，參考文獻的資料將詳列于實施例中。為更佳了解本發(fā)明，本文中所使用的術(shù)語將另加以詳細(xì)說明。
本文中所使用的術(shù)語「一」是指一或多于一，也就是至少一個的數(shù)量，在本文中為文法受詞，除非在文中清楚指明為特殊用法，僅代表單數(shù)意涵。
本文中所使用的術(shù)語「有效量」是指可提供抗老化效果，防御紫外線或兩者于需要的受試者的劑量。對于具通常知識者，「有效量」如同投予的劑量與頻率，根據(jù)本發(fā)明所公開的內(nèi)容，可憑借一般實驗的知識與標(biāo)準(zhǔn)方法輕易確知。
本發(fā)明提供了一種用于皮膚護理的組合物及其用途，其包含用于改善膚質(zhì)、減少皺紋、防御紫外線以及抗老化有效量的由黃耆(Astragalusmembranaceus)以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分。根據(jù)本發(fā)明的具體實例，其中黃耆該水不溶部分，是通過包括下列步驟的方法而被制得 以醇類或水之溶劑萃取黃耆，得到醇類或水萃取物；再以少量水洗滌該醇類或水萃取物，而得到該水不溶部分。
根據(jù)本發(fā)明的具體實例，其中黃耆該水不溶部分包含式(I)的環(huán)木菠蘿烷醇型(cycloananol)化合物
式(I) 其中R1，由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙酰基、O-木哌喃糖基、O-(2-乙酰木哌喃糖基)、O-(3-乙酰木哌喃糖基)、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖-(1-2)-a阿拉伯哌喃糖基； R2由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙酰基、O-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖基； R3由下列組成的群中選出氫、羥基及O-乙酰基；以及 R4由下列組成的群中選出
在其中的本發(fā)明額具體實例，其中黃耆該水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物
式(II) 其中RA、、RB，RC及RD由下列組成的群中選出乙?；?、氫、及葡萄哌喃糖基(Glc)。
在本發(fā)明的較佳具體實施例中，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物，其中RA為乙?；琑B為乙?；?，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黃耆皂苷I。
根據(jù)本發(fā)明的另一較佳具體實施例，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物，其中RA為乙酰基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黃耆皂苷II。
根據(jù)本發(fā)明的較佳具體實施例，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物，其中RA為葡萄哌喃糖基(Glc)，RB為氫，RC為氫，RD為氫；例如黃耆皂苷III。
根據(jù)本發(fā)明的較佳具體實施例，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物，其中RA為氫，RB為氫，Rc為氫及RD為葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黃耆皂苷IV。
根據(jù)本發(fā)明的一較佳具體實施例，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷，其中RA為葡萄哌喃糖基(Glc)，RB為氫，RC為氫，RD為葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黃耆皂苷VI。
根據(jù)本發(fā)明的較佳具體實施例，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物，其中RA為乙?；?，RB為氫，RC為乙?；癛D為葡萄哌喃糖基(Glc)；例如異黃耆皂苷I。
根據(jù)本發(fā)明的較佳具體實施例，黃耆的水不溶部分包含式(II)的黃耆皂苷化合物，其中RA為氫，RB為乙酰基，RC為氫，RD為葡萄哌喃糖基(Glc)；例如異黃耆皂苷II。
在本發(fā)明的另一實例中，黃耆的水不溶部分包含式(I)的黃耆皂苷化合物，其中R1為羥基，R2為O-葡萄哌喃糖基，R3為羥基，R4為

例如環(huán)黃耆皂(cycloastragenol)-6-O-β-D-葡萄哌喃糖苷(簡稱AA)，為黃耆皂苷IV經(jīng)柚皮苷酶(Naringinase)水解的產(chǎn)物。
如同本發(fā)明中實驗的結(jié)果，該水不溶部分的投與可增強膠原蛋白I及III在細(xì)胞中的表現(xiàn)與分泌，促進葡萄糖胺與脯胺酸的攝取(uptake)，調(diào)升透明質(zhì)酸(HA)的表現(xiàn)量，降低基質(zhì)金屬蛋白酵素(MMPs)的表現(xiàn)量與蛋白分解活性。在本發(fā)明的具體實施例中，以約0.25至40μg/mL之劑量的該水不溶部分處理細(xì)胞，可以得到上述的良好效果。
另一方面，本發(fā)明提供一種護膚組合物及其用途，該護膚組合物包含抗老化與防御紫外線有效量的式(I)的黃耆皂苷化合物。取代基的定義如上所述。
在本發(fā)明的具體實施例中，該黃耆皂苷化合物包含式(II)的黃耆皂苷化合物，取代基及較佳具體實施例則如上所述。
在本發(fā)明的具體實施例中，該黃耆皂苷化合物包含結(jié)構(gòu)如式(I)的環(huán)木菠蘿烷醇型(cycloartanol)化合物，其中R1為羥基，R2為O-葡萄哌喃糖基，R3為羥基，以及R4為

例如環(huán)黃耆皂-6-O-β-D-葡萄哌喃糖苷(cycloastragenol-6-O-β-D-glucopyranoside)。
相同地，如本發(fā)明所進行的實驗結(jié)果，當(dāng)投與0.01至10μM劑量的本發(fā)明黃耆皂苷化合物時，可增強膠原蛋白I及膠原蛋白III在細(xì)胞中的表現(xiàn)，促進葡萄糖胺與脯胺酸的攝取(uptake)，調(diào)升透明質(zhì)酸的表現(xiàn)量，降低基質(zhì)金屬蛋白酵素的表現(xiàn)量與蛋白分解活性。對于受到紫外線輻射激發(fā)而增加的基質(zhì)金屬蛋白酵素表現(xiàn)量，也具有抑制的效果。此結(jié)果顯示該化合物可保護膠原蛋白，避免基質(zhì)金屬蛋白酵素引發(fā)的分解作用。結(jié)構(gòu)如式(I)及式(II)的黃耆皂苷化合物，與黃耆萃取物水不溶部分可作為預(yù)防及治療皮膚老化與提供皮膚防御紫外線的藥劑。
在本發(fā)明的另一具體實施例中，當(dāng)將含有黃耆水不溶部分的化妝用乳霜涂抹于受試者的皮膚時，如以紅斑及黑色素作為參數(shù)測量，看起來較為容光煥發(fā)及白皙。同時，臉部皮膚的pH值也下降至可防止微生物生長的程度。而且，受試者臉部有皺紋的區(qū)域也明顯減少。
黃耆萃取物的水不溶部分可通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法或所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或常用的方法制備。例如，黃耆萃取物的水不溶部分可通過下述步驟得到提供黃耆，尤其是粉末狀，以醇萃取得到醇萃取物，然后以水萃取該醇萃取物，得到水不溶部分。在一較佳具體實施例中，醇萃取物是利用醇(如95％酒精或甲醇)萃取所得的醇部分。然而，應(yīng)了解該醇萃取物并不限于以上所述方法所得的黃耆水不溶部分及醇萃取部分。
本發(fā)明也提供一種化妝用乳霜，其包含黃耆萃取物的水不溶部分，或依照本發(fā)明的黃耆皂苷化合物。該化妝用乳霜可添加用于制造基本乳霜的其它成份配制。例如，上述這些成分可包括但不限于水、異壬酸異壬酯、丁二醇、三異辛酸甘油酯(Triethylhexanoin)、山萮醇、PEG-100氫化蓖麻油、硬脂酸甘油酯SE、二甲硅油(dimethicone)、澳洲胡桃油、荷荷芭油、氫化卵磷脂、對羥苯甲酸甲酯、DL-α-乙酸生育酚酯、對羥基苯甲酸丁酯、苯氧基乙醇及香料。
應(yīng)注意的是，本發(fā)明并不只限于化妝品方面的應(yīng)用；其它藥學(xué)上的應(yīng)用，例如治療病患與缺乏膠原蛋白I、膠原蛋白III、葡萄糖胺、脯胺酸或透明質(zhì)酸，以及基質(zhì)金屬蛋白酵素表現(xiàn)或活化增強相關(guān)的疾病，也屬于本發(fā)明應(yīng)用的范圍。
本發(fā)明更特定地通過下列實例加以解釋。然而，應(yīng)了解本發(fā)明不應(yīng)以任何方式受限于上述這些實例。
實例1黃耆萃取物的水不溶部分的制備 1.0公斤的黃耆根部粉末(來自Formosa Kingstone BioproductInternational Co.Ltd.)，在50℃下以95％酒精萃取兩小時，共三次。將合并的萃取物在真空中濃縮，得到約127.8克的酒精萃取物。
該127.8克的酒精萃取物以蒸餾水清洗三次，獲得33.9克水不溶部分及93.9克水可溶部分。將100.0克的酒精萃取物分溶于蒸餾水與正丁醇(該二溶劑比為1∶1)中，得到63.0克的(正)丁醇可溶部分。
實例2黃耆萃取物的水不溶部分及黃耆皂苷在人類HaCaT細(xì)胞及HDF細(xì)胞中對于膠原蛋白表現(xiàn)的影響 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) 將經(jīng)自發(fā)性轉(zhuǎn)型的人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞，于濕化培養(yǎng)箱中，于37℃及5％二氧化碳及95％空氣的環(huán)境下，在添加有10％牛胎血清(FBS)、100IU/mL盤尼西林、100μg/mL鏈霉素、2mM丙酮酸鈉和1％非必須氨基酸(NEAA)的Dulbecco氏修飾Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。該培養(yǎng)基每兩天更換一次。待細(xì)胞長滿后，于胰蛋白酶處理后進行繼代培養(yǎng)。為了進行繼代培養(yǎng)，在以0.1％胰蛋白酶(Trypsin)/乙二胺四乙酸(EDTA)溶液短暫處理后，收集細(xì)胞并以1∶10的稀釋比例接種。
使用于研究中的細(xì)胞，代數(shù)介于12至45代之間。接種及培育細(xì)胞24小時后，以黃耆皂苷化合物處理24小時。對照培養(yǎng)物維持在添加有載劑(0.1％的DMSO)的培養(yǎng)基中。在此培養(yǎng)條件下，未觀察到DMSO對于生長與分化的影響。
HDF細(xì)胞培養(yǎng) 初始人類皮膚纖維母細(xì)胞(HDF)購自Cascade Biologics(Portland，OR，USA)，并于添加有10％牛胎血清、100IU/mL盤尼西林、100μg/mL鏈霉素之106號培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用于研究中的細(xì)胞，代數(shù)介于4至10代之間。該培養(yǎng)基每兩天更換一次。待細(xì)胞長滿后，于胰蛋白酶處理后進行繼代培養(yǎng)。為了進行繼代培養(yǎng)，在以0.1％胰蛋白酶/EDTA溶液短暫處理后，收集細(xì)胞并以1∶10的稀釋比例接種。在6孔培養(yǎng)盤中接種1x105個細(xì)胞并培養(yǎng)24小時后，以黃耆皂苷化合物或粗萃取物，例如黃耆的丁醇可溶部分及水不溶部分處理指定的時間。
將對照培養(yǎng)物維持于添加有載劑(0.1％的DMSO)的培養(yǎng)基中。在此培養(yǎng)條件下，未觀察到DMSO對于生長與分化的作用。
黃耆皂苷化合物的處理 細(xì)胞以0-10μM濃度的純化合物處理，該純化合物例如為黃耆皂苷I(AS1)、黃耆皂苷II(AS2)、黃耆皂苷III(AS3)、黃耆皂苷IV(AS4)、黃耆皂苷VI(AS6)、異黃耆皂苷I(isoAS1)、異黃耆皂苷II(isoAS2)，及環(huán)黃耆皂-6-O-β-D-葡萄哌喃糖苷(AA)。或者，細(xì)胞以濃度為0、1、10及40μg/mL的黃耆粗萃取物如丁醇可溶部分及水不溶部分處理。細(xì)胞以所指示的化合物或粗萃取物處理24小時后，收集細(xì)胞，分析檢定全細(xì)胞萃取液中所表現(xiàn)的膠原蛋白I及III或分泌于培養(yǎng)基中的膠原蛋白I及III。
西方墨點法 對于培養(yǎng)后的培養(yǎng)基及細(xì)胞溶析產(chǎn)物實施西方墨點分析。在進行處理之前24小時，將細(xì)胞以1x106細(xì)胞/培養(yǎng)皿之密度接種于6公分培養(yǎng)皿中，24小時后以指定濃度的指定黃耆皂苷化合物再處理48小時。將該條件培養(yǎng)基離心，濃縮兩倍后收集之，用于分析分泌至培養(yǎng)基中的膠原蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酵素。將細(xì)胞清洗及在4℃下，于0.2 mL的溶析(lysis)緩沖液(含有1％NP-40、50mM Tris-HCl(pH7.4)、180mM氯化鈉、1mMEDTA、1 mM PMSF、1 mM氟化鈉、10 mM釩酸鈉)中進行溶析30分鐘。以17,500g離心15分鐘后，收集細(xì)胞溶析產(chǎn)物的上清液。利用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白質(zhì)檢定套組，根據(jù)制造商的使用方法(Pierce，Rockford，IL，USA)測量樣品中的蛋白質(zhì)濃度。將取自濃縮條件培養(yǎng)基(100μg)或細(xì)胞溶析產(chǎn)物的上清液(50μg)的等量蛋白質(zhì)樣品與適當(dāng)體積的4xSDS取樣緩沖液混合，再以8％SDS-PAGE膠分離。將8％SDS-PAGE膠上分離的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。被轉(zhuǎn)印的PVDF膜以新鮮配制之含有0.1％Tween-20及7％脫脂奶粉的Tris-緩沖食鹽水(TBS)清洗兩次，并在室溫下封阻兩小時。將PVDF膜再與對抗膠原蛋白I及III或管家蛋白α-微管蛋白(Santa Cruz Biotecnology，Santa Cruz，CA)的任一抗體于4℃共同培育18小時。使用結(jié)合有山葵過氧化酵素(horseradishperoxiase)的抗山羊抗體作為二級抗體。信號通過加強化學(xué)發(fā)光套組(Clontech，Palo Alto，CA，USA)顯現(xiàn)，繼而在X光底片上曝光。
以下結(jié)果為西方點墨法分析之量化數(shù)據(jù)。一般而言，如表1A所示，在以不同劑量(0.01，0.1及1μM)的黃耆皂苷化合物如AS1、AS2、isoAS1、isoAS2及AA處理的人類HaCaT細(xì)胞中膠原蛋白I會超量表現(xiàn)。在以40μg/mL的黃耆皂苷萃取物處理的人類HaCaT細(xì)胞中膠原蛋白I也會超量表現(xiàn)。
表1A 在以不同劑量(0.01，0.1及1μM)的黃耆皂苷化合物如AS1、AS2、AS3處理的人類HaCaT細(xì)胞中膠原蛋白III會超量表現(xiàn)。同樣地，如表1B所示，在以不同劑量(1，10及40μg/mL)的粗萃取物處理之人類HaCaT細(xì)胞中膠原蛋白III也會超量表現(xiàn)。另一方面，測量膠原蛋白III被分泌到培養(yǎng)基中的量，以測知黃耆皂苷對于細(xì)胞釋放膠原蛋白III的影響。在表1B中，當(dāng)人類HaCaT細(xì)胞以不同劑量(0.01，0.1及1μM)的黃耆皂苷化合物如AS4、AS6、isoAS1處理時，膠原蛋白III在細(xì)胞培養(yǎng)基中會超量表現(xiàn)。
表1B 人類HDF細(xì)胞中的膠原蛋白表現(xiàn)也同樣被測定。根據(jù)表2A所列出的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在以黃耆皂苷化合物如AS2、AS4、AS6、isoAS1及AA處理的人類HDF細(xì)胞中膠原蛋白I會超量表現(xiàn)。在以不同劑量(1，10及40μg/mL)的黃耆粗萃取物，如黃耆的丁醇可溶部分與水不溶部分，處理的HDF細(xì)胞中膠原蛋白I也會超量表現(xiàn)。另外，也觀察到在培養(yǎng)基中出現(xiàn)膠原蛋白I的量，此顯示當(dāng)細(xì)胞以黃耆皂苷化合物或粗萃取物處理時，增加量的膠原蛋白I分泌到培養(yǎng)基中。
表2A 此外，如下表2B所示，當(dāng)人類HDF細(xì)胞以不同劑量的粗萃取物處理時，于細(xì)胞中與培養(yǎng)基中皆觀察到膠原蛋白III的表現(xiàn)。因此，西方墨點法分析的結(jié)果大致上顯示膠原蛋白I及膠原蛋白III在人類HaCaT細(xì)胞及HDF細(xì)胞中皆超量表現(xiàn)，以及其被釋放到培養(yǎng)基中的量皆增加。
表2B 實例3在人類HaCaT細(xì)胞中黃耆皂苷對脯胺酸攝取的影響 脯胺酸攝取分析 脯胺酸攝取分析乃如文獻(Biochim BiophysActa.1104283-292，1992)所述進行。簡單的說，將HaCaT細(xì)胞以3x104細(xì)胞/培養(yǎng)孔的密度接種于24孔盤中，培養(yǎng)24小時。將細(xì)胞在不存在(溶劑對照組)或存在各種濃度的黃耆皂苷化合物或黃耆的粗萃取物下再處理48小時。處理后的細(xì)胞以PBS清洗一次后，在不含氨基酸的培養(yǎng)基(AAFM)中再培養(yǎng)30分鐘。將處理后的細(xì)胞改用新鮮的AAFM培養(yǎng)，該AAFM含有50μg/mL抗壞血酸鹽(ascorbate)及總濃度0.5mM且含1μCi[3H]的L-脯胺酸(AmericanRadiolabelled Chemicals Inc，ARC，St.Louis，MO，USA)。以指定的時間間隔用含有未標(biāo)示的脯胺酸的AAFM清洗，并以200μL的2％SDS溶析細(xì)胞。將細(xì)胞溶析產(chǎn)物以15,000g離心15分鐘。通過將10μL的細(xì)胞溶析產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至底部設(shè)有過濾器的UniFilter盤(Perkin-Elmer)中計數(shù)，即可測出細(xì)胞所攝取的脯胺酸。樣本中的蛋白質(zhì)濃度，可利用上述的BCA蛋白質(zhì)檢定套組測定。計算出累積在細(xì)胞內(nèi)的脯胺酸及將其標(biāo)準(zhǔn)化成蛋白質(zhì)濃度，攝取速率以每分鐘每毫克細(xì)胞蛋白質(zhì)的L-脯胺酸的納摩爾數(shù)(nmol/min/mg)來表示。
表3 從表3顯示的結(jié)果看來，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)粗萃取物與對照組相比，在人類HaCaT細(xì)胞中使脯胺酸的攝取上升達到105.56％，119.2％及108.62％，此顯示粗萃取物具有促進細(xì)胞攝取脯胺酸的效果。
實例4在人類HaCaT細(xì)胞中黃耆皂苷對透明質(zhì)酸(HA)表現(xiàn)的影響 透明質(zhì)酸測量 透明質(zhì)酸測量乃根據(jù)文獻中的所述方法實施(BBRC 2004,316.348-355)。簡單來說，將HaCaT或HDF細(xì)胞接種于24孔盤中，等待其長滿。于即將進行實驗前，將細(xì)胞以不含血清的培養(yǎng)液清洗兩次，以完全去除細(xì)胞生長時所累積的透明質(zhì)酸。接著細(xì)胞在0.5mL不含或含有不同化合物的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時。經(jīng)過指定的時間后，取出培養(yǎng)基的等分試樣，在15000g離心5分鐘，以酵素鍵連的免疫吸附測定(ELISA)套組(Echelon Bioscience，Salt Lake，UT)分析上清液中的透明質(zhì)酸含量。
所列結(jié)果以在HaCaT細(xì)胞中黃耆皂苷所引發(fā)的透明質(zhì)酸表現(xiàn)的倍數(shù)來表示。所用黃耆皂苷的濃度(若無其它特別指示)，就黃耆皂苷純化合物而言為0、1、10μM；就丁醇可溶部分而言為0、0.5、1、2.5、5、10、40μg/mL；就水不溶部分而言為0、1、10、40μg/mL。將細(xì)胞以指定的化合物處理24小時，然后收集細(xì)胞并利用HA-ELISA套組分析分泌在培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸。
以1μM或10μM黃耆皂苷化合物AS1，AS2，AS4，AS6處理的細(xì)胞均顯示細(xì)胞分泌的透明質(zhì)酸有增加的現(xiàn)象，此可由培養(yǎng)基中透明質(zhì)酸量增加證明。在人類HaCaT細(xì)胞中，不同劑量(1、10及40μg/mL)的粗萃取物也有促進細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸到培養(yǎng)基中的能力，如表4A所示。
表4A 透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)轉(zhuǎn)錄之定量分析 以實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)測定出HaCaT細(xì)胞中HAS2的相對表現(xiàn)量。利用TRIzol試劑(Invitrogen，Irvine，CA，USA)，從培養(yǎng)的人類細(xì)胞分離出總RNAs。取1μg RNA在37℃下，于20μL的轉(zhuǎn)錄混合液中進行反轉(zhuǎn)錄60分鐘，其中該轉(zhuǎn)錄混合液含有0.5mM dNTP、0.1μg oligo-dT、10單位RNasin，1xPCR緩沖液(含pH值8.3的20mMTris-HCl；2.5mM氯化鎂；50mM氯化鉀)及100單位的莫洛尼鼠類白血病病毒轉(zhuǎn)錄酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase；Invitrogen)。cDNA產(chǎn)物以苯酚萃取，酒精沉淀后，再懸浮于20μLTE(含pH值8.0的20mM Tris-HCl及1mM EDTA)。qRT-PCR以應(yīng)用生物7300系統(tǒng)(Applied Biosystem 7300 System)及預(yù)定制之Taqman基因表現(xiàn)檢定套組(pre-developed Taqman Gene Expression Assays)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)進行。該反應(yīng)混合液(總體積20μL)包含2μL經(jīng)連續(xù)稀釋的cDNA、10μLTaqman Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)以及1μL人類HAS-2基因(檢定編號Hs00193435_ml，AppliedBiosystems)，或GAPDH引子混合物(檢定編號Hs99999905_ml，AppliedBiosystems)。擴增反應(yīng)以下列條件進行50℃反應(yīng)2分鐘，95℃反應(yīng)10分鐘，接著以95℃反應(yīng)1分鐘、65℃反應(yīng)1分鐘進行40個循環(huán)。對于每個選定的基因皆進行兩次獨立的實驗，各實驗復(fù)制3份，相對定量的結(jié)果可利用7300軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)計算得出，每個樣本中的HAS-2表現(xiàn)量標(biāo)準(zhǔn)化成相對于GAPDH的表現(xiàn)量。
如表4B所示，在人類HaCaT細(xì)胞中，不論該細(xì)胞以0.1μM的黃耆皂苷化合物如AS2、AS4、isoAS1或isoAS2處理，或以2.5μg/mL、5.0μg/mL的黃耆的丁醇可溶部分處理，或以40μg/mL的黃耆的水不溶部分處理，HAS-2皆會超量表現(xiàn)。因此，表4A及4B的結(jié)果顯示黃耆皂苷化合物或粗萃取物具有促進人類HaCaT細(xì)胞表現(xiàn)透明質(zhì)酸的功效。
表4B 實例5黃耆皂苷在人類HaCaT細(xì)胞中對葡萄糖胺攝取的影響 葡萄糖胺攝取分析 葡萄糖胺是透明質(zhì)酸的主要組成單元，因此，測量細(xì)胞所攝取的葡萄糖胺可推測在人類細(xì)胞中透明質(zhì)酸的合成。
在葡萄糖胺攝取測試中，將HaCaT細(xì)胞以3x104細(xì)胞/培養(yǎng)孔的密度接種于24孔盤中，培養(yǎng)24小時。將細(xì)胞在不存在(溶劑對照組)或存在各種濃度的黃耆皂苷下再培養(yǎng)48小時。處理后的細(xì)胞以PBS清洗兩次后，于不含葡萄糖及氨基酸的培養(yǎng)基(GSFM)中培養(yǎng)。2小時后，將細(xì)胞改以含0.2μCi之[14C]-葡萄糖胺(American Radiolabelled Chemicals Inc，ARC，St.Louis，MO，USA)之新鮮GSFM培養(yǎng)。以指定的時間間隔，將細(xì)胞以含有未標(biāo)示的葡萄糖胺的GSFM清洗兩次，并以200μL的2％SDS溶析細(xì)胞。將細(xì)胞溶析產(chǎn)物以15000g離心15分鐘。通過將10μL的細(xì)胞溶析產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至底部設(shè)有過濾器的UniFilter盤(Perkin-Elmer)中計數(shù)，即可測出細(xì)胞所攝取的葡萄糖胺。樣本中的蛋白質(zhì)濃度，可利用上述的BCA蛋白質(zhì)檢定套組測定。計算出累積在細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖胺并將其標(biāo)準(zhǔn)化成蛋白質(zhì)濃度，攝取速率以每分鐘每毫克細(xì)胞蛋白質(zhì)的計數(shù)(cpm/min/μg)來表示。
如表5所示，當(dāng)細(xì)胞以0.1μM的黃耆皂苷化合物如AS1、AS2、AS3、isoAS1及isoAS2處理時，葡萄糖胺的攝取速率增加，此顯示黃耆皂苷對葡萄糖胺有促進功效。
表5 實例6在人類HaCaT-1與HDF-1細(xì)胞中黃耆皂苷對基質(zhì)金屬蛋白酵素(MMPs)表現(xiàn)的影響 基質(zhì)金屬蛋白酵素-1(MMP-1)是一種分解間質(zhì)膠原蛋白及其它細(xì)胞外基質(zhì)大分子的酵素。基質(zhì)金屬蛋白酵素-1為主要的膠原蛋白酶。因此，基質(zhì)金屬蛋白酵素-1的存在或其蛋白分解活性增加表示膠原蛋白量減少。反過來說，當(dāng)基質(zhì)金屬蛋白酵素-1的活性或表現(xiàn)減少時，則表示細(xì)胞中的膠原蛋白量可能豐富。
紫外線照射 為得知黃耆皂苷在人類細(xì)胞中對MMPs的表現(xiàn)量的影響，首先將HDF或HaCaT細(xì)胞以不含或含有各種濃度的黃耆皂苷處理24小時。細(xì)胞以磷酸鹽-緩沖食鹽水(PBS)清洗后，用紫外光照射器(UVItec unlimited，Cambridge，England)，以10-100 mJ/cm2的UV-B(波長312nm)分別照射HDF-1及HaCaT細(xì)胞。在收集細(xì)胞以進行檢定前，將細(xì)胞以不含血清的培養(yǎng)基清洗并培養(yǎng)24小時。以西方墨點法分析黃耆皂苷對MMPs的表現(xiàn)量的影響，并以酶譜(zymography)分析MMPs的活性。以全反式維生素A酸(atRA)做為抑制UV-B所引起的MMPs的活化與表現(xiàn)的陽性對照組。
將人類HDF細(xì)胞以表中所示濃度的黃耆的水不溶部分處理24小時，再進行50mJ/cm2的UV-B照射。24小時后，收集細(xì)胞進行西方墨點法分析。如圖1所示，在未接受UV照射的細(xì)胞中MMP-1的表現(xiàn)量為基礎(chǔ)值(泳道1，對照組)，在HDF細(xì)胞中UV照射引發(fā)的MMP-1表現(xiàn)(泳道2)，全反式RA(atRA)阻斷UV照射所引發(fā)的MMP-1表現(xiàn)(泳道3，陽性對照組)，而在以0.1、1、10、40μM黃耆之水不溶部分預(yù)處理的細(xì)胞中UV照射所引發(fā)的MMP-1表現(xiàn)受到抑制(泳道4至7)。結(jié)果證明黃耆之水不溶部分能有效地阻斷UV照射所引起之MMP-1表現(xiàn)，此顯示該化合物能保護膠原蛋白I而避免被MMP-1分解。所以黃耆的水不溶部分有作為預(yù)防及治療皮膚因紫外線照射而老化的藥劑的潛力。
酶譜分析法 在HaCaT及HDF細(xì)胞中MMPs的蛋白分解活性，基本上是根據(jù)參考文獻所描述的方式測定(Circ Res，1999；85906-911)。細(xì)胞于接種后24小時，再以各種濃度的黃耆皂苷處理48小時。將條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)離心，濃縮兩倍后保存，以供檢定被分泌至培養(yǎng)基的膠原蛋白及MMPs。將細(xì)胞以溶析緩沖液(含有1％表面活性劑Triton，pH值7.4的50mM Tris-HCl，180mM氯化鈉，1mM EDTA)溶析，樣本中的蛋白質(zhì)濃度，可利用上述的二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)檢定套組測定。將濃縮條件培養(yǎng)基的樣本及細(xì)胞溶析產(chǎn)物與非還原性電泳加載緩沖液混合，以及在非還原狀態(tài)下進行電泳，其中電泳在與2 mg/mL明膠(gelatin)或酪蛋白(Sigma，St.Louis，MO.USA)共聚的10％SDS-PAGE上進行。為了進行MMP-2前驅(qū)物與活化MMP-2的酶譜分析，總計使用20μg的培養(yǎng)基進行電泳。電泳完成后，通過將凝膠以25g/L的Triton X-100于室溫浸泡2次，每次各10分鐘，以使蛋白復(fù)性。繼而將該凝膠在含0.2M氯化鈉、0.02％Brij35及10mM氯化鈣的50mM Tris-HCl(pH7.5)中，于37℃處理18小時。凝膠以考馬斯亮藍R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)染色及退染后，蛋白分解活性的區(qū)域在染色后的凝膠中以透明帶顯現(xiàn)。為獲得更高的靈敏度，再將凝膠片以1％Triton X-100溶液進一步退染1至2小時，此步驟可增加信號/噪聲比，而允許于92,125，甚至大于200kDa處顯現(xiàn)微弱的明膠酶帶。酶譜使用附有凝膠成像軟件(Image Quant軟件)之計算器化激光密度計(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA，USA)讀取。
MMP-1轉(zhuǎn)錄之定量分析 以實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)來測定HDF細(xì)胞中MMP-1的相對表現(xiàn)量。全RNA及cDNA的制備方法如前段敘述進行。qRT-PCR以應(yīng)用生物7300系統(tǒng)(Applied Biosystem 7300 System)及預(yù)定制之Taqman基因表現(xiàn)檢定套組( pre-developed Taqman Gene ExpressionAssays)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)進行。除了使用人類MMP-1(檢定IDHS00233958_ml，Applied Biosystems)與GAPDH(檢定IDHs99999905 ml，Applied Biosystems)之混合引子外，該反應(yīng)如前段所述進行。
表6A中的結(jié)果代表HaCaT細(xì)胞中MMP-2蛋白質(zhì)的酶譜分析的量化數(shù)據(jù)，以及HDF細(xì)胞中MMP-1的qRT-PCR結(jié)果。所用濃度(若無其它指示)，就純化合物而言，為0、0.01、0.1、1μM；就粗萃取物而言，為0、1、10、40μg/mL。將細(xì)胞以指示的化合物處理24小時，然后收取細(xì)胞以分析全細(xì)胞萃取液中的MMP-2前驅(qū)物及活化MMP-2。使用50μg的細(xì)胞萃取液樣本進行電泳。
根據(jù)表6A的結(jié)果，當(dāng)細(xì)胞以各種劑量(0.01、0.1、1mM)的黃耆皂苷化合物如AS1、AS2、AS3及AS6處理時，在條件培養(yǎng)基中MMP-2的蛋白分解活性會被降低或減弱，此表示在人類HaCaT細(xì)胞中膠原蛋白頗為豐富。
表6A 如表6B所示，在以0.1μM黃耆皂苷化合物AS1、AS2、isoAS1、isoAS2及AA處理之HDF細(xì)胞中，MMP-1Mrna的表現(xiàn)量下降。另外，當(dāng)細(xì)胞以各種劑量(1及10μg/mL)的粗萃取物處理時，MMP-1mRNA的表現(xiàn)量減少。因此，表6A及6B的結(jié)果均顯示有效量的黃耆皂苷化合物或粗萃取物能減少MMP-1的表現(xiàn)且抑制此酵素所引起的膠原蛋白分解。
表6B 實例7制備含黃耆的粗萃取物的化妝乳霜 該化妝乳霜可通過將配制基本乳霜的成分與就作為化妝乳霜的活性成分而言為有效量的黃耆皂干萃取物混合而制備。配制基本乳霜的成分包括但不限于各種量的水、異壬酸異壬酯、丁二醇、三異辛酸甘油酯、山萮醇、PEG-100氫化蓖麻油、硬脂酸甘油酯SE、二甲硅油、澳洲胡桃油、荷荷芭油、氫化卵磷脂、對羥苯甲酸甲酯、DL-α-乙酸生育酚酯、對羥基苯甲酸丁酯、苯氧基乙醇及香料，如表7所示。
表7 實例8臨床試驗 受試者測試 二十五位年齡為35歲或35歲以上的健康自愿者(20位女性及5位男性)在經(jīng)本人同意下納入本臨床試驗。在整個試驗期間，受試者被要求不得在臉上使用任何其它的化妝品。清潔受試者臉部后30分鐘，評估受試者的皮膚物理性質(zhì)(皮膚pH值，皮膚水分含量，通過表皮的水分流失，皮膚表面脂肪，膚色及明亮度，皮膚彈性與皮膚粗糙程度)，以提供基礎(chǔ)測量值。接著，取適量(約花生大小)含有本發(fā)明萃取物的化妝乳霜均勻地涂抹于右臉，并取等量的基本乳霜涂抹于左臉以供對照，30分鐘后，對受試者的臉部做相同之測試，以作為短期效力的數(shù)據(jù)。所有測試皆在約24℃至28℃的室溫及50％至60％的相對濕度下進行。每項測試的每次測量皆在受試者臉部任一側(cè)所選定的三個測試區(qū)(前額，眼角與上臉頰)取直徑約2公分的測試點進行。
皮膚pH值 以具備安裝有感測組件的探針的

PH 905(Courage+Khazaka electronic)進行測量。探針頭部的平面設(shè)計允許接觸皮膚直接測量 膚色及明亮度(紅斑指數(shù)與黑色素指數(shù)) 測量是根據(jù)光線的吸收及反射。

MX l8(Courage+Khazaka electronic)的探針發(fā)出三種具特殊光波長的光。接收器可測量由皮膚反射的光，發(fā)光器與接收器的位置能確保只有漫射及散射光被量測到。當(dāng)發(fā)射光的量固定，就能計算出皮膚吸收光的量。黑色素通過選擇對應(yīng)于不同的色素吸光速率的特殊波長而測量。選擇與血色素的光譜吸收峰對應(yīng)的特殊波長進行紅斑的測量，以避免其它有色物質(zhì)(例如膽紅素)的干擾。上述兩個參數(shù)的結(jié)果以指數(shù)表示。
皮膚粗E糙度 皮膚的粗糙度以皮膚檢視儀(Skin Visiometer SV)(Courage+KhazakaElectronic，

Germany)測量，該皮膚檢視儀是基于光傳導(dǎo)經(jīng)過含有染為藍色的兩成分硅酮(其之光吸收率為已知)的復(fù)制薄片。將復(fù)制薄片插入改裝幻燈機，直接來自霓虹燈的光穿透復(fù)制薄層而被吸收，吸光量視硅酮材料的厚度而定。利用視訊傳感器電荷偶合裝置及分辨率為640x480像素的黑白(b/w)CMOS-相機測量局部光傳導(dǎo)量，并根據(jù)吸光的朗伯。比爾定律(Lamber't and Beer's Law)計算光的強度。
取自治療三十天后15位年齡為38至58歲的受試者的皮膚平均測量值列于表8。
表8 根據(jù)表8中的結(jié)果，受試者右側(cè)皮膚的平均pH值下降11.19％。所以，當(dāng)皮膚以本發(fā)明的含有黃耆的水不溶部分的化妝乳霜處理時，可預(yù)期皮膚將維持健康狀態(tài)，且由于為微酸環(huán)境，微生物生長將減至最低。鑒于紅斑指數(shù)為0.22，且受試者的右側(cè)臉紅斑比左側(cè)更明顯，顯示右側(cè)臉的血液循環(huán)較好。右臉?biāo)鶞y得的黑色素指數(shù)顯示黑色素減少27.17％。同時，以L值表示的皮膚明亮度與紅斑指數(shù)及黑色素指數(shù)一起評估。L值下降1.18％，表示使用該化妝乳霜一個月后，皮膚看起來更明亮。由此可知，受試者的右臉比左臉整體看起來更白且容光煥發(fā)。
測量皺折的表面積，以測定受試者臉部皮膚的皺紋。如表8所示，于受試者的右臉使用該化妝乳霜一個月后，平均表面積減少4.77％，此顯示皮膚皺紋減少。體積(相對于皮膚表面區(qū)域的皮膚體積)則下降7.77％。該結(jié)果顯示皺紋的深度及數(shù)量均減少。
該化合物可用于需要護膚者，使用頻率為每天數(shù)次或較少之頻率，例如一天一次，一周一次，兩周一次，或一個月一次。使用頻率為所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所顯而易知者且視許多因素，例如(但不限于)受試者的年齡等而定。
所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，在不悖離其廣泛的發(fā)明概念下，上述具體實施例可做改變。因此應(yīng)了解，本發(fā)明并不受限于本文中所揭示的特定具體實施例，而意欲涵蓋在權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范疇內(nèi)的修改。
權(quán)利要求
1.一種黃耆以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分用于制造護膚組合物的用途，其特征在于該護膚組合物用于改善膚質(zhì)、減少皺紋、防御紫外線以及抗老化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于該黃耆的水不溶部分是通過包括下列步驟的方法而制得
以醇類或水的溶劑萃取黃耆，得到醇類或水萃取物；再以少量水洗滌該醇類或水萃取物，而得到該水不溶部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于該黃耆的水不溶部分可局部用于需要的皮膚區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于該黃耆的水不溶部分包括式(I)的環(huán)木菠蘿烷醇型化合物
式(I)
其中R1由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；-木哌喃糖基、O-(2-乙酰木哌喃糖基)、O-(3-乙酰木哌喃糖基)、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基；
R2由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖基；
R3由下列組成的群中選出氫、羥基及O-乙?；灰约?br> R4由下列組成的群中選出
及
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于該黃耆的水不溶部分包括式(II)的黃耆皂苷化合物
式(II)
其中RA、RB、RC及RD由下列組成的群中選出乙酰基、氫及葡萄哌喃糖基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為乙?；?，RB為乙酰基，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為乙酰基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為氫。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為氫，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為乙?；琑B為氫，RC為乙?；癛D為葡萄哌喃糖基。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于RA為氫，RB為乙酰基，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于R1為羥基，R2為O-葡萄哌喃糖基，R3為羥基及R4為
14.一種黃耆皂苷化合物用于制造護膚組合物的用途，其特征在于該護膚組合物用于抗老化與防御紫外線；黃耆皂苷化合物為式(I)化合物
式(I)
其中R1由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙酰基、O-木哌喃糖基、O-(2-乙酰木哌喃糖基)、O-(3-乙酰木哌喃糖基)、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基；
R2由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙酰基、O-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖基；
R3由下列組成的群中選出氫、羥基及O-乙?；?br> R4由下列組成的群中選出
及
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于該黃耆皂苷化合物包括式(II)化合物
式(II)
其中RA、RB、RC及RD由下列組成的群中選出乙?；?、氫及葡萄哌喃糖基。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為乙?；琑B為乙?；?，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為乙酰基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為氫。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為氫，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為乙?；琑B為氫，RC為乙?；癛D為葡萄哌喃糖基。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于RA為氫，RB為乙?；?，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于R1為羥基，R2為O-葡萄哌喃糖基，R3為羥基及R4為
24.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于該黃耆皂苷化合物為經(jīng)口服給予。
25.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于該黃耆皂苷化合物為局部用于需要其的皮膚區(qū)域。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于該黃耆皂苷化合物為經(jīng)口服給予。
27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于該黃耆皂苷化合物局部用于需要其的皮膚區(qū)域。
28.一種護膚組合物，其特征在于包含就改善膚質(zhì)、減少皺紋、防御紫外線以及抗老化而言為有效量的黃耆以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于該黃耆的水不溶部分通過包括下列步驟的方法而制得
以醇萃取黃耆，得到醇萃取物；
以水萃取該醇萃取物，得到水不溶部分。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于該黃耆的水不溶部分可局部用于需要其的皮膚區(qū)域。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于該黃耆的水不溶部分包括式(I)的環(huán)木菠蘿烷醇型化合物
式(I)
其中R1由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；?、O-木哌喃糖基、O-(2-乙酰木哌喃糖基)、O-(3-乙酰木哌喃糖基)、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基、O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基；
R2由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；-葡萄哌喃糖基、O-木哌喃糖基；
R3由下列組成的群中選出氫、羥基及O-乙酰基；以及
R4由下列組成的群中選出
及
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于該黃耆的水不溶部分包括式(II)的黃耆皂苷化合物
式(II)
其中RA、RB、RC及RD由下列組成的群中選出乙?；浼捌咸堰哙腔?。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為乙?；?，RB為乙酰基，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為乙?；琑B為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為氫。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為氫，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為乙?；?，RB為氫，RC為乙?；癛D為葡萄哌喃糖基。
39.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于RA為氫，RB為乙?；?，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
40.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于R1為羥基，R2為O-葡萄哌喃糖基，R3為羥基及R4為
41.一種護膚組合物，其特征在于包含就抗老化與防御紫外線而言為有效量的式(I)的黃耆皂苷化合物
式(I)
其中R1由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；?、O-木哌喃糖基、O-(2-乙酰木哌喃糖基)、O-(3-乙酰木哌喃糖基)、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基、O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基；
R2由下列組成的群中選出氫、羥基、O-乙?；?、O-葡萄哌喃糖基、O-木哌喃糖基；
R3由下列組成的群中選出氫、羥基及O-乙酰基；以及
R4由下列組成的群中選出
及
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其特征在于該黃耆皂苷化合物包括式(II)化合物
式(II)
其中RA、RB、RC及RD由下列組成的群中選出乙酰基、氫及葡萄哌喃糖基。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為乙酰基，RB為乙?；?，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為乙?；?，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為氫。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為氫，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
47.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為葡萄哌喃糖基，RB為氫，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
48.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為乙?；琑B為氫，RC為乙?；癛D為葡萄哌喃糖基。
49.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于RA為氫，RB為乙酰基，RC為氫及RD為葡萄哌喃糖基。
50.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其特征在于R1為羥基，R2為O-葡萄哌喃糖基，R3為羥基及R4為
51.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于該黃耆皂苷化合物為經(jīng)口服給予。
52.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于該黃耆皂苷化合物為局部用于需要其的皮膚區(qū)域。
53.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于該黃耆皂苷化合物為經(jīng)口服給予。
54.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于該黃耆皂苷化合物為局部用于需要其的皮膚區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明提供一種護膚組合物及其用途，其包含用于改善膚質(zhì)、減少皺紋、防御紫外線以及抗老化有效量的由黃耆(Astragalus membranaceus)以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分或黃耆皂苷(Astraglosides)化合物。
文檔編號A61K8/97GK101134009SQ20071008958
公開日2008年3月5日 申請日期2007年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日
發(fā)明者張溫良, 張自忠, 林漢欽, 淵 楊 申請人:仲華健康事業(yè)股份有限公司