專利名稱：：封管用枸櫞酸鈉注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、飲料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是涉及一種封管液的配方及其制備方法和用途，更具體地說是涉及一種枸櫞酸鈉注射液的配方及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：(一)血液透析中抗凝劑應(yīng)用的有關(guān)情況在血液透析過程中，血液經(jīng)過透析器、血路管及中央靜脈留置導(dǎo)管時易發(fā)生凝血現(xiàn)象，常需要抗凝處理?，F(xiàn)已有多種方法用于血液透析時抗凝，以保持管路通暢，如小劑量肝素法、低分子量肝素法、魚精蛋白中和肝素的局部肝素法、無肝素的鹽水沖洗法、前列環(huán)素抗凝法、重組水蛭素抗凝法等。但上述方法都有各自的局限性，如肝素法的全身抗凝作用可導(dǎo)致出血，是引起出血并發(fā)癥的重要原因(MoritzML，VatsA，EllisD.Systemicanticoagulationandbleedinginchildrenwithhemodialysiscatheters.iW/afriVep/ra/，2003，18(1):68—70;禾卩KaraaslanH,PeyronnetP，BeneventD，etal.Riskofheparinlock-relatedbleedingwhenusingindwellingvenouscatheterinhaemodialysis.iVep/ira/D/a/Traw5p/aw/，2001,16(10):2072-2074);局部肝素法中的魚精蛋白的精確用量較難控制；無肝素鹽水沖洗法流量高，會增加容量負荷，血液動力學(xué)不穩(wěn)定的危重病人難以耐受；前列環(huán)素法的全身擴血管作用可引起嚴重的低血壓；重組水蛭素法的價格昂貴(傅曉，劉慎微，劉曉城.局部枸櫞酸抗凝在不同血液凈化方式的應(yīng)用.國外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊，2005，25(1):139一143)等等。近年來，枸櫞酸鈉抗凝方法在血液透析方面的應(yīng)用研究已越來越受到關(guān)注。由于枸櫞酸鈉用于血液透析患者具有更加安全、可靠的特性，因此，枸櫞酸鈉注射液被用于血液透析中有明顯出血傾向、凝血功能障礙及使用肝素過敏的透析患者的抗凝。另外，高濃度枸櫞酸鈉兼有抗凝血和抗感染的作用，亦被用于靜脈留置導(dǎo)管的封管。通過査閱近年來在CBM、PUBMED和國外公司網(wǎng)站中報道的高濃度枸櫞酸鈉注射液相關(guān)文獻，對所得數(shù)據(jù)進行匯總分析，發(fā)現(xiàn)目前已有20%、23%、30%、46.7%(47%)等多種高濃度的枸櫞酸鈉注射液應(yīng)用于血液透析方面，但多為研究者自配自用的，僅有46.7%枸櫞酸鈉注射液一個品種在國外有上市產(chǎn)品，中國國內(nèi)并未見其蹤影。(二)高濃度枸櫞酸鈉注射液在血液透析應(yīng)用的研究*高濃度枸櫞酸鈉注射液兼有抗凝和抗感染的特性，在血液透析及相關(guān)臨床方面有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景?，F(xiàn)將高濃度枸櫞酸鈉注射液在血液透析中用于體外局部抗凝和靜脈留置導(dǎo)管封管的作用特點、臨床應(yīng)用、安全性及世界各地品種開發(fā)等方面的情況作一匯總。1.在體外局部抗凝方面的應(yīng)用1.1作用特點枸櫞酸鈉是通過螯合血液中可促進凝血活素、凝血酶和纖維蛋白形成的游離鈣離子，來阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化成為凝血酶，起到抗凝血作用。枸櫞酸鈉在體外局部抗凝的方法為將一定濃度的枸櫞酸鈉注射液從血液透析機體外循環(huán)部分的通路動脈端(離心部分)滴入，防止血液在透析器和血管路凝血。由于枸櫞酸鈉是人體正常生理代謝的中間產(chǎn)物，并且可以通過透析器清除，即使進入體內(nèi)也會立即進入三羧酸循環(huán)很快被代謝成為碳酸根離子，而無任何殘留，不會產(chǎn)生全身性抗凝血作用，可以減少出血并發(fā)癥的發(fā)生率。正常情況下，應(yīng)用枸櫞酸鈉做局部抗凝是非常安全的，只有其進入機體速度超過患者的代謝速度時才可能出現(xiàn)枸櫞酸鈉中毒現(xiàn)象，枸櫞酸鈉中毒的主要癥狀為低血鈣引起的口唇麻木和畏寒。實驗證明，枸櫞酸鹽可以避免由于肝素的副作用和系統(tǒng)肝素化引起的出血并發(fā)癥(KaraaslanH,PeyronnetP，BeneventD，etal.Riskofheparinlock-relatedbleedingwhenusingindwellingvenouscatheterinhaemodialysis.NephrolDialTransplant,2001,16(10):2072-2074)。1.2臨床研究1961年，Morita[4]等(4MoritaY，JohnsonRW,DronRE,etal.Regionalanticoagulationduringhemodialysisusingcitrate.Jw/Afet/5W，1961，Jul,242:32-43)首次在血液透析中應(yīng)用枸櫞酸進行局部抗凝；1982年，Pinnick等(PinnickRV，WiegmannTB，DiederichDA.Regionalcitrateanticoagulationforhemodialysisinthepatientsathighriskforbleeding.iV五"g/JM^/，1983，308(5):258-261)對高危出血患者行局部枸櫞酸抗凝，取得了滿意的療效。中國使用高濃度枸櫞酸鈉注射液的報道較晚、也較少。1997年，上海中山醫(yī)院報道了使用高濃度枸櫞酸鈉注射液用于體外抗凝；1998年，上海華山醫(yī)院吳云生等人報道了將30%高濃度枸櫞酸鈉用來體外局部抗凝，對19例患者行86例次血液透析，取得了滿意的效果，86例次透析中無因體外循環(huán)凝血致透析中止或透析效果下降。此后，溫州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、南京軍區(qū)南京總院和上海長征醫(yī)院也報道應(yīng)用高濃度枸櫞酸鈉注射液來進行血液透析的體外局部抗凝。毛志國等(毛志國，葉朝陽，陳靜等.高濃度枸櫞酸鈉抗凝及聯(lián)機預(yù)制置換液在連續(xù)腎臟替代治療中的應(yīng)用.上海醫(yī)學(xué)，2003，26(11):801—804)對25位患者行連續(xù)靜脈一靜脈血液透析濾過(CVVHDF)38例次，其中20例次采用30%高濃度枸櫞酸鈉局部抗凝，18例次采用小劑量普通肝素抗凝，枸櫞酸鈉組在治療過程中未觀察到出血或原有出血加劇征象，2例治療34h時出現(xiàn)輕微的低血鈣癥狀，肝素組9例次發(fā)生出血或原有出血加劇。同年，龔德華等報道對40例需要行連續(xù)性血液凈化(簡稱CBP)治療并伴出血傾向的患者行枸櫞酸鈉抗凝，治療后無一例患者出現(xiàn)出血加重情況(龔德華,季大璽，徐斌等.枸櫞酸鈉抗凝在重?；颊哌B續(xù)性血液凈化治療中的應(yīng)用.中華內(nèi)科雜志，2003，42(2):121—122)。1.3枸櫞酸鈉用于局部抗凝的產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用情況目前，國外文獻中已有多種濃度枸櫞酸鈉溶液進行實驗室及臨床研究的報道，但僅有46.7%枸櫞酸鈉注射液一個品種在歐洲有上市產(chǎn)品。中國尚無用于局部抗凝的枸橡酸鈉產(chǎn)品上市，但在上海、南京、溫州等地區(qū)的醫(yī)院使用自制的醫(yī)院制劑用于血液透析體外局部抗凝，其濃度有30%的枸櫞酸鈉注射液，規(guī)格為250毫升/袋和500毫升/瓶。2.在靜脈留置導(dǎo)管封管方面的應(yīng)用2.1作用特點對于需要長期透析的患者，為減少每次插管的不便和疼痛，常在股靜脈、頸靜脈或鎖骨下靜脈處插入單針雙腔導(dǎo)管，建立臨時的血管通路，多年的臨床應(yīng)用表明凝血和感染是血液透析留置導(dǎo)管面臨的主要問題。微生物可以附著在血液透析中所用的導(dǎo)管內(nèi)壁，并且不斷的集聚，形成多糖蛋白質(zhì)生物膜，能阻止抗生素和白細胞的浸入，臨床上常因感染引發(fā)菌血癥而不得不拔除導(dǎo)管。凝血和感染分別會引起導(dǎo)管阻塞和菌血癥的發(fā)生，縮短導(dǎo)管使用壽命，患者要經(jīng)常更換導(dǎo)管才可以保持血液透析通路的暢通。選擇良好的封管液可以有效的減少上述情況的發(fā)生。高濃度枸櫞酸鹽可在導(dǎo)管中發(fā)揮很好的抗感染作用。由于高濃度枸櫞酸鈉注射液在血液透析中兼有抗凝血和抗感染的作用，所以用其進行封管相對于其他封管液具有獨特的優(yōu)勢。研究表明，當枸櫞酸鈉的濃度大于20%時就成為具有抑菌活性的抗凝血劑，用做封管液可以減少導(dǎo)管感染、閉塞及延長導(dǎo)管壽命(DograGK，HersonH，HutchisonB，etal.Preventionoftunneledhemodialysiscatheter-relatedinfectionsusingcatheter-restrictedfillingwithgentamicinandcitrate:Arandomizedcontrolledstudy.J爿mSociVep/ux>/，2002，13(8):2133-2139)。枸櫞酸鹽的濃度越高，其封管液的抗感染效果越好，而目前臨床上所用枸櫞酸鈉的最高濃度為47%(46.7%)，已接近枸櫞酸鈉的飽和濃度。2002年，Weijmer等報道將2.2%、7.5%、15%和30%四種濃度的枸櫞酸鈉溶液與5000IU/ml的肝素溶液對血液透析中發(fā)生感染時常見的五種菌株(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌)抑菌能力進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鈉溶液隨著濃度的增大，抑菌作用增強，其中30%的枸櫞酸鈉溶液可以完全殺滅金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌，并且可以明顯抑制白色念珠菌的生長；而肝素沒有任何抑菌作用(9WeijmerMC，Debets-OssenkoppYJ，vandeVondervoortFJ，etal.Superiorantimicrobialactivityoftrisodiumcitrateoverheparinforcatheterlocking.jVep/ro/D^/rra"^p/朋"2002，17(12):2189—2195)。2.2臨床研究Ash認為23%濃度的枸櫞酸鈉是最理想的封管液(AshSR，MankusRA，SuttonJM,etal.ConcentratedSodiumCitrate(23%)forCatheterLock.股,血/戸、/"^rm^'o"a/，2000，(4):22-31);Weijmer則認為30%是封管液最佳濃度(WeijmerMC，VandenDorpelMA,VandeVenPJG,etal.Randomized,ClinicalTrialComparisonofTrisodiumCitrate30%andHeparinasCatheter-LockingSolutioninHemodialysisPatients./JmS0ciV印/2ra/，2005，16(9):2769-2777)。1998年Buturovic等做了肝素和枸櫞酸鹽的抗凝血對比實驗，使用肝素和4%枸櫞酸鹽作為封管液的導(dǎo)管使用時間分別為23土24days、51士36days;凝血容積分別為0.052±0.035ml和0.059±0.032ml，實驗證明了枸櫞酸鹽比肝素更適于做封管液(ButurovicJ，PonikvarR,KandusA，etal.Fillinghemodialysiscathetersintheinterdialyticperiod:heparinversuscitrateversuspolygeline:aprospectiverandomizedstudy.爿/""/6Vga/w,，1998，22(11):945-947)。Ash等曾間隔3~4個月相繼使用①肝素注射液，10%枸櫞酸鈉注射液聯(lián)合3mg/ml慶大霉素注射液，③20。/。枸櫞酸鈉注射液聯(lián)合3mg/ml慶大霉素注射液，47%枸櫞酸鈉注射液，⑤肝素注射液，23%枸櫞酸鈉注射液作為封管液封管，觀察菌血癥發(fā)生率的變化。實驗結(jié)果顯示，肝素沒有抑菌作用，而不同濃度的枸櫞酸鈉具有不同程度的抑菌作用。雖然高濃度枸櫞酸鹽具有輕微的腐蝕作用，但是正是這種腐蝕作用可以幫助溶解細胞和凝塊，阻止生物膜的形成(AshSR，MankusRA，SuttonJM，etal.ConcentratedSodiumCitrate(230/o)forCatheterLock.T/ewoWa/jw^/"^r"flriowa/，2000，(4):22-31)。目前許多醫(yī)院為防止插管部位感染，通常在一些封管液中加入抗生素，但該抗生素可通過導(dǎo)管滲漏入血，使患者暴露于抗生素中，如果長期使用，會產(chǎn)生細菌耐藥，更加容易弓l發(fā)感染(DograGK，HersonH，HutchisonB，etal.Preventionoftunneledhemodialysiscatheter-relatedinfectionsusingcatheter-restrictedfillingwithgentamicinandcitrate:Arandomizedcontrolledstudy.J為SociV—m/，2002，13(8):2133-2139;禾口SaxenaAK，PanhotraBR，NaguibM.Suddenirreversiblesensory-neuralhearinglossinapatientwithdiabetesreceivingamikacinasanantibiotic-heparinlock./Vwr/w"co/^A2/7>>，2002，22(1):105-108)。2003年，Weijmer等報道，在9所荷蘭透析中心和1所比利時透析中心做了多中心隨機雙盲實驗，用來比較肝素注射液和30%枸櫞酸鈉注射液抗凝血和抗感染的效果。雖然由于出現(xiàn)各種不同程度導(dǎo)管相關(guān)的感染并發(fā)癥而終止實驗，但是已經(jīng)得到的數(shù)據(jù)充分證明了使用30%枸櫞酸鈉注射液封管相對于使用肝素注射液封管能減少出血并發(fā)癥和感染的發(fā)生率，高濃度枸櫞酸鈉可以代替肝素作為封管液封管，并具有更好的抗凝血和抗感染作用(P《0.01)(WeijmerMC，VandenDorpelMA，VanGeelenJACA，etal.Reductionofbleedingcomplicationswithhighconcentrationtrisodiumcitrateforhemodialysiscatheterlocking;Aprospectivemulticenterdouble-blindrandomizedcontrolledtrial.Nieuwsbriefvandenfn6EJaargang，2003，NR,1;和WeijmerMC，VandenDorpelMA，VanGeelenJACA，etal.Substantialreductionofinfectiouscomplicationsinhemodialysiscatheterswithtrisodiumcitrate30%forcatheterlocking;Aprospectivemulticenterdouble-blindrandomizedcontrolledtrial.Nieuwsbriefvandenfn6EJaargang,2003，NR，1)。2.3安全性分析Ash等觀察了四組使用不同封管液的不良反應(yīng)情況，聯(lián)合使用3mg/ml慶大霉素的10%和20%枸櫞酸鈉注射液，與單獨使用23%枸櫞酸鈉注射液的患者都未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)；而在使用47%枸櫞酸鈉注射液的患者中，10%的患者感覺口中有金屬味，并且手指有刺痛感(AshSR，MankusRA，SuttonJM，etal.ConcentratedSodiumCitrate(23%)forCatheterLock.//ewo^'a/"^/w/w"a//o""/，2000，(4):22-31)。Weijmer等在210位血液透析患者中，分別用肝素注射液和30%枸櫞酸鈉注射液作封管液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于導(dǎo)管相關(guān)菌血癥所引發(fā)的死亡人數(shù)分別為5人與0人；封管后立即有異常感覺的人數(shù)分別為9人與4人(WeijmerMC，VandenDorpelMA，VanGeelenJACA，etal.Reductionofbleedingcomplicationswithhighconcentrationtrisodiumcitrateforhemodialysiscatheterlocking;Aprospectivemulticenterdouble-blindrandomizedcontrolledtrial.Nieuwsbriefvandenfn6EJaargang,2003，NR,1;和WeijmerMC，VandenDorpelMA，VanGeelenJACA，etal.Substantialreductionofinfectiouscomplicationsinhemodialysiscatheterswithtrisodiumcitrate30%forcatheterlocking;Aprospectivemulticenterdouble-blindrandomizedcontrolledtrial.Nieuwsbriefvandenfn6EJaargang,2003，NR,1)。上述不良反應(yīng)主要是因為沒有控制好注入量的原因，當注入量超過管腔標注容量時就容易入血引起不良反應(yīng)。高濃度枸櫞酸鈉進入血液后可引起低鈣血癥，一但發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時進行糾正，有人建議規(guī)定必須由技術(shù)熟練、經(jīng)驗豐富的專職人員操作。2.4枸櫞酸鈉用于導(dǎo)管封管的產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用情況2.4.1國外情況目前，僅有歐洲的Dirinco公司生產(chǎn)供應(yīng)用于留置導(dǎo)管封管的枸櫞酸鈉注射液(濃度為46.7%)。Dirinco公司在荷蘭和比利時分別有DirincoBV公司和BirincoBVBA公司，上市的枸櫞酸鈉注射液(Dirinco)規(guī)格為3ml和5ml，，用于留置導(dǎo)管封管。網(wǎng)上報價的最低價格分別為81.186(12X3ml)和67.65€(10X5ml)。美國Medcomp公司也生產(chǎn)供應(yīng)46.7。/。枸櫞酸鈉注射液(商品名Tricitrasol,規(guī)格為30ml)，但不是FDA批準的正式藥品，被限用于體外粒細胞分離，并不用于留置導(dǎo)管封管。2.4.2中國情況目前尚未見中國臨床應(yīng)用高濃度枸櫞酸鈉作留置導(dǎo)管封管的報道，也未見高濃度枸櫞酸鈉產(chǎn)品在中國正式上市供應(yīng)。中國臨床多應(yīng)用肝素、肝素或低濃度枸櫞酸鈉聯(lián)合抗生素(慶大霉素)進行封管。綜上所述，高濃度枸櫞酸鈉相對于其他抗凝劑兼有抗凝血和抗感染的特性，在臨床上使用安全有效，尤其適用于有高度出血危險、凝血功能障礙及使用肝素過敏的透析患者，對機體全身抗凝血功能無影響，可以完全避免抗凝所致的出血并發(fā)癥。此外，高濃度枸櫞酸鈉注射液具有很強的抑菌作用，減少菌血癥的發(fā)生，避免了因使用抗生素引起的細菌耐受性。目前國外僅有一種高濃度枸櫞酸鈉注射液品種上市，中國尚無正式此類商品。血液透析患者非常需要安全和有效的高濃度枸櫞酸鈉注射液。2001年有統(tǒng)計數(shù)字顯示，在美國，每一百萬人中就有卯0人需要用血液透析治療終末期腎臟病，并在2010年前以每年7.1%的速度增長，全球有100萬以上終末期腎病患者，每年以8%的速度增長，中國約占十分之一(XueJL，MaJZ,LouisTA，etal.Forecastofthenumberofpatientswithend-stagerenaldiseaseintheUnitedStatestotheyear2010.J^淤S0ciVep/7n/,2001，12(12):2753—2758;禾口USRenalDataSystem:2003AnnualDataReport:AtlasofEndStageRenalDiseaseintheUnitedStates,Bethesda,NationalInstitutesofHealth,NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases,2003)。由于腎臟移植的腎源有限，對終末期腎病患者來說，血液透析療法仍是主要治療手段。高濃度枸櫞酸鈉注射液在血液透析方面具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景，因此，在中國開發(fā)與應(yīng)用此類藥品迫在眉睫，以便滿足臨床的需求。目前己查詢至UPCT專禾!j《Methodofenhancingcatheterpatencyusingacitratesaltcatheterlocksolution》，專利申請?zhí)柺荘CT/US99/19307。(三)體外血管插管仿真裝置的研究ift^對于需要長期透析的患者，為減少每次插管的不便和疼痛，常在股靜脈、頸靜脈或鎖骨下靜脈處插入單針雙腔導(dǎo)管，建立臨時的血管通路，但在不做血液透析治療時需將留置導(dǎo)管用封管液進行封管，待下一次透析治療時再啟用留置導(dǎo)管。一種好的封管液應(yīng)具有抗凝血和抗感染作用，并能在一定時間里保持其有效和安全。體外血管插管仿真裝置可為研究封管液在留置導(dǎo)管中的滯留情況，進行封管液處方篩選等藥物臨床前研究提供良好的實驗平臺。經(jīng)文獻檢索，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有任何對封管液研究的體外模型裝置以及新的枸櫞酸鈉注射液配方及制備方法和新用途等方面的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是公開了一種新的枸櫞酸鈉注射液配方及制備方法和新用途，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。也就是說，本發(fā)明意在于明確一種新的枸櫞酸鈉注射液的配方及其制備方法和新的用途；即本發(fā)明涉及一種枸櫞酸鈉注射液配方及其制備方法和雙重作用的用途。所述的封管用產(chǎn)品是指用于包括留置導(dǎo)管的能夠同時抗凝血和抗感染及相關(guān)病癥的產(chǎn)品；其中，所述的封管用產(chǎn)品是包括抗凝血與抗感染藥物、抗凝血與抗感染試劑、抗凝血與抗感染食品或抗凝血與抗感染飲料等中的一種或多種，優(yōu)選抗凝血與抗感染藥物。(一)技術(shù)構(gòu)思自主開發(fā)創(chuàng)新藥物是中國目前的一項緊迫任務(wù)。中國醫(yī)藥學(xué)具有悠久的歷史，在預(yù)防和治療疾病方面積累了豐富的經(jīng)驗，發(fā)揮中國藥物研制的優(yōu)勢，進行藥物的開發(fā)利用是一條有效的途徑，對現(xiàn)有劑型進行開發(fā)也大有作為，將具有重大應(yīng)用需求和臨床前景。發(fā)明人對臨床靜脈留置導(dǎo)管的使用現(xiàn)狀進行了深入的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)靜脈留置導(dǎo)管在使用過程中常因被血塊等堵塞而更換，或發(fā)生感染導(dǎo)致患者出現(xiàn)敗血癥等不良反應(yīng)，造成不必要的經(jīng)濟負擔(dān)(僅每只靜脈留置導(dǎo)管需1000元人民幣左右)，甚至危及生命。究其原因，主要與留置導(dǎo)管的封管液有關(guān)。目前，臨床采用的肝素鈉注射液或肝素鈉注射液與抗生素配伍應(yīng)用作封管液，但是對于有嚴重出血傾向、凝血功能障礙及肝素過敏的患者不宜使用，而且長期應(yīng)用帶有抗生素的封管液封管由于抗生素滲漏入血會產(chǎn)生耐藥性從而更易弓I發(fā)感染。發(fā)明人根據(jù)國外研究者的報道，結(jié)合實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度枸櫞酸鈉溶液兼有抗凝血和抗感染雙重作用，用其作封管也可以完全改善靜脈留置導(dǎo)管的使用現(xiàn)狀，使其使用壽命延長，減少患者經(jīng)濟負擔(dān)等。發(fā)明人為了方便篩選封管液新配方，自行設(shè)計了一個仿真的體外中心靜脈插管裝置，利用虹吸原理和蠕動泵來作為系統(tǒng)的動力裝置，模擬血液流動和留置導(dǎo)管工作狀態(tài)，并對封管液進行滯留期觀察。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人結(jié)合枸櫞酸鈉的水溶液的溶液度情況，通過研究和實驗篩選，發(fā)現(xiàn)近飽和濃度(47%)來配制封管用枸櫞酸鈉注射液，具有抗凝和抗感染的雙重作用，并能夠使其發(fā)揮至最佳效果。(二)一種枸櫞酸鈉注射液配方的組成發(fā)明人通過對封管用枸櫞酸鈉注射液進行系統(tǒng)的實驗研究和理論探索，包括處方篩選、制備工藝研究、穩(wěn)定性試驗、體外藥效學(xué)試驗、體外安全性試驗等的研究和分析，發(fā)現(xiàn)研制的封管用枸櫞酸鈉注射液性質(zhì)穩(wěn)定，制備工藝簡單，安全有效，并適合工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)藥理實驗證明，本發(fā)明的封管用枸櫞酸鈉注射液對中心靜脈插管常出現(xiàn)的兩大問題——凝血和感染均具有顯著的雙重防治作用，能夠用于留置導(dǎo)管的封管。該封管用枸櫞酸鈉注射液(簡稱該封管液)的組成為枸櫞酸鈉35.0%~50.0%pH調(diào)節(jié)劑0.1%~4.0%增稠劑0.0%~20.0%溶劑加至1000ml所述的枸櫞酸鈉為原料藥，直接投料；按照該配方配制的封管用枸櫞酸鈉注射液的濃度為35.0%~50.0%，優(yōu)選45.0%~50.0%，進一步優(yōu)選47.0%或49.0%。所述的pH調(diào)節(jié)劑是為了使該配方的pH值范圍為6.4~7.5而添加的組分，是包括枸櫞酸、醋酸、酒石酸或乳酸等中的一種或多種，優(yōu)選枸櫞酸或酒石酸中的一種或多種；進一步優(yōu)選枸櫞酸作為該配方中的pH調(diào)節(jié)劑，含量范圍是0.1%~4.0%，優(yōu)選0.3%，因為枸櫞酸鈉與枸櫞酸能構(gòu)成緩沖離子對，且有不引入其他離子的特點。發(fā)明人通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，選用枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)劑，其中的枸櫞酸還起到了助溶的作用，使枸櫞酸鈉的溶解度超過了一般狀態(tài)下的人們常見的常規(guī)飽和濃度46.7%,達到了50.0%的濃度，因此該封管用枸櫞酸鈉注射液的濃度優(yōu)選為47.0%禾卩49.0%。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在近飽和濃度46.7%時，該封管用枸櫞酸鈉注射液具有一定的黏度，在封管中可以存在一定的時間；且在超過這一常規(guī)的飽和濃度的情況下，枸櫞酸鈉兼有抗凝血與抗感染的雙重作用；該配方配制的產(chǎn)品劑量準確，澄明度好；穩(wěn)定性研究也表明其穩(wěn)定性好，質(zhì)量符合有關(guān)規(guī)定，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。按照以上配方配制的枸櫞酸鈉注射液的濃度為47.0%或49.0%,該濃度超過了一般狀態(tài)下的人們常見的枸櫞酸鈉的常規(guī)飽和濃度。所述的溶劑是包括水溶劑和非水溶劑，水溶劑主要是注射用水，非水溶劑是包括丙二醇、聚乙二醇或甘油等中的一種或多種；優(yōu)選水溶劑作為該配方中的溶劑，進一步優(yōu)選注射用水作為該配方中的溶劑。需要強調(diào)的是，如果選用聚乙二醇或甘油作為溶劑，那么聚乙二醇或甘油還能夠起到增稠劑的作用。本發(fā)明能夠根據(jù)需要再額外增加增稠劑。所述的可用于注射劑的增稠劑是包括甘油、聚乙二醇或泊洛沙姆F68等中的一種或多種，優(yōu)選5%~20%以內(nèi)的甘油，進一步優(yōu)選含15%的甘油。在滿足枸櫞酸鈉溶解度要求的基礎(chǔ)上，根據(jù)增稠劑的溶解情況能夠確定其可以加入的劑量范圍，一般是需要依據(jù)泊肅葉方程進行均勻設(shè)計對處方進行優(yōu)化，以選擇黏度最為合適的處方。例如，單獨選擇其中的甘油作為增稠劑，其含量以小于20%為宜；單獨選擇其中的聚乙二醇300作為增稠劑，其含量以小于6%為宜；單獨選擇其中的泊洛沙姆F68作為增稠劑，其在注射液中的最大用量為0.6%;當增稠劑的濃度為0%時，則表示該配方不含增稠劑，這也是本發(fā)明所述配方的優(yōu)選方案，因為根據(jù)安全性原則，加入成分種類越少，相對來說越安全，所以最后發(fā)明人選用不加增稠劑的處方作為最優(yōu)化的配方。由于本發(fā)明的配方中未加入特殊物質(zhì)，故生產(chǎn)該注射劑的一般工藝即可滿足該配方的制備要求。例如最優(yōu)選方案l(不加增稠劑的處方):枸櫞酸鈉467g枸櫞酸3g注射用水加至1000ml最優(yōu)選方案2(加入增稠劑的處方):枸櫞酸鈉467g枸櫞酸3g甘油150g注射用水加至1000ml最優(yōu)選方案3(非水溶劑處方)枸櫞酸鈉467g枸櫞酸3g乙醇加至1000ml根據(jù)臨床上的使用要求，對患者進行封管時要求按照標注容量將封管液注滿管腔，通常留置導(dǎo)管的標注容量為A腔l.Oml、V腔l.lml，A腔l.lml、V腔1.2ml，或者是A腔1.3ml、V腔1.4ml，兩腔總量小于3ml;為使用方便，本發(fā)明確定封管用枸櫞酸鈉注射液的裝量優(yōu)選為3ml:1.4g。(三)該枸櫞酸鈉注射液的配方研究及其制備方法枸櫞酸鈉為傳統(tǒng)的體外抗凝劑，通過與血液中的鈣離子螯合，阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化成為凝血酶而起到抗凝作用。近幾年的研究表明，高濃度的枸櫞酸鈉溶液兼有抑菌活性，可用做留置導(dǎo)管的封管液，具有減少導(dǎo)管感染及堵塞、延長導(dǎo)管壽命的作用。本發(fā)明研究了封管用枸櫞酸鈉注射液的處方及工藝，包括對pH值及黏度進行單因素考察；建立插管體外仿真血液流動模型進行驗證；通過影響因素試驗對穩(wěn)定性進行初步考察，從而篩選出了封管用枸櫞酸鈉注射液最優(yōu)化的處方與工藝。1.儀器與試劑1.1儀器Waters高效液相色譜系統(tǒng)Waters600色譜泵，Waters996PDA紫外檢測儀，Millennium32色譜工作站；梅特勒-托利多320型pH計(梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司)；梅特勒-托利多AE240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器<上?！涤邢薰?；SB2200型超聲清洗器(上海市BRANSON超聲儀器有限公司)；SHB-III型循環(huán)水多用真空泵(河南太康教材儀器廠)；YB-2型澄明度檢測儀(天津大學(xué)精密儀器廠)；熱壓滅菌器(天津大學(xué)無線電廠)；NDJ-1旋轉(zhuǎn)式粘度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。1.2試劑枸櫞酸鈉(湖南華日制藥有限公司，批號20051012);枸櫞酸(廣東省臺山市新寧制藥廠，批號20050303);甘油(上海運佳黃浦制藥有限公司，批號20051011);聚乙二醇300(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，批號20011126);磷酸二氫鉀(湖南華日制藥有限公司，批號20040422);甲醇(上?；瘜W(xué)試劑研究所，批號20060301，色譜純)，注射用水(自制)。2.方法和結(jié)果2.1處方與制備工藝2.1.1劑量確定依據(jù)參照歐洲D(zhuǎn)irinco公司生產(chǎn)供應(yīng)用于留置導(dǎo)管封管的枸櫞酸鈉注射液(濃度為46.7%)，該濃度為枸櫞酸鈉近飽和濃度，在這一濃度下枸櫞酸鈉兼有抗凝血與抗感染的作用，另根據(jù)臨床使用方法，對病人進行封管時要求按照標注容量將封管液注滿管腔，通常留置導(dǎo)管的標注容量為A腔1.0ml，V腔Uml;A腔l,lml，V腔1.2ml;A腔1.3ml，V腔l,4ml，兩腔總量小于3ml，為使用方便，確定封管用枸櫞酸鈉注射液的裝量定為3ml:1.4g。2丄2處方依據(jù)及研制封管用枸櫞酸鈉注射液的處方是在借鑒文獻和歐洲D(zhuǎn)irinco公司生產(chǎn)的citm-lock的基礎(chǔ)上，以枸櫞酸鈉原料藥直接投料，并經(jīng)初步試驗研究、加速試驗、留樣觀察、安全性試驗等基礎(chǔ)上確定的，分別對處方組成中的pH調(diào)節(jié)劑、增稠劑的種類及用量進行了考察。2.1.2.1原料來源枸櫞酸鈉原料藥購自湖南華日制藥有限公司，其各項理化性質(zhì)均符合《中國藥典》2005年版要求。本品為無色結(jié)晶或白色潔晶性粉末，在水中的溶解度為l:1.5，在沸水中的溶解度為l:0.6，熔點為15(TC。2.1.2.2pH調(diào)節(jié)劑的種類及用量為適應(yīng)人體生理需要，同時考慮藥液中枸櫞酸鈉的溶解度，在配液時需要對藥液的pH值進行適當調(diào)整。根據(jù)枸櫞酸鈉與枸櫞酸能構(gòu)成緩沖離子對，不引入其他離子的特點，首先考慮以枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)劑，并對其用量進行研究。分別按照含枸櫞酸0.1%、0.2%、0.3%、0.4%處方量投料，在適量注射用水中加熱溶解，冷卻至室溫，定容。測定pH值，試驗結(jié)果見表l。表1、封管用枸櫞酸鈉注射液pH調(diào)節(jié)劑用量的篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)以上結(jié)果，在枸櫞酸鈉達到溶解度要求的基礎(chǔ)上，結(jié)合注射劑的pH值要求與血液相等或接近的原則，同時參照Dirinco公司的產(chǎn)品pH值范圍6.47.5，最后確定該制劑的pH值范圍為6.57.5,處方中枸櫞酸含量為0.3%。2.1.2.3增稠劑的種類及用量封管液在管腔中療效的發(fā)揮依賴于其在管腔中的滯留時間，根據(jù)泊肅葉方程e=『^^=-i生r12^&A8pdx，液體在管腔中的流速與其黏度成反比，故設(shè)想加入增稠劑以增加其黏度，延長在管腔中的滯留時間，更好的發(fā)揮抗凝血與抗感染的作用?？捎糜谧⑸鋭┑脑龀韯┩ǔＳ懈视?，聚乙二醇，泊洛沙姆F68等，根據(jù)溶解情況確定其可以加入的劑量范圍，進行均勻設(shè)計選擇黏度最為合適的處方。在原處方基礎(chǔ)上配制含10%、20%、30%甘油的封管液密閉靜置一天，結(jié)果含20%、30%甘油的均出現(xiàn)可見性析出，故甘油含量以小于20%為宜。在原處方基礎(chǔ)上配制含2%、4%、6%聚乙二醇300的封管液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含6%聚乙二醇300的處方溶液在超聲后分層，故聚乙二醇含量以小于6%為宜。泊洛沙姆F68在注射液中的最大用量為0.6%。應(yīng)用均勻設(shè)計方法對處方中的增稠劑進行優(yōu)化------------------試驗基本信息-----------指標數(shù)1，因素個數(shù)3，運行次數(shù)9試驗設(shè)計選用均勻設(shè)計表119*(94)各因素水平數(shù)相等指標名稱黏度單位厘泊因素l名稱甘油單位含量因素2名稱PEG300單位含量因素3名稱F68單位含量——...........多元回歸分析.............——--回歸分析采用逐步回歸法，顯著性水平a二0.05弓l入變量的臨界值Fa二5.591剔除變量的臨界值Fe-5.318擬建立回歸方程yb(O)+b(l)*X(1)+b(2)*X(2)+b(3)*X(3)+b(4)*X(1)*X(2)+b(5)*X(1)*X(3)+b(6)*X(2)*X(3)第l步，引入變量各項的判別值(升序排列)Vx(3)=8.05e-2Vx(5)二0.211Vx(4)=0.356Vx(6)=0.549Vx(2)=0.779Vx(l)=0.779未引入項中，第l項[X(l)]Vx值(》0)的絕對值最大，引入檢驗值Fa(l)二24.68，引入臨界值Fa二5.591，F(xiàn)a(l)>Fa，引入第1項，已引入項數(shù)二1。第2步，引入變量各項的判別值(升序排列)Vx(l)=-0.779Vx(0)=0.00Vx(4)=L54e-5Vx(6)=5.96e-2Vx(3)=8.05e-2Vx(5)=8.44e-2未引入項中，第5項[X(1)*X(3)]Vx值(》0)的絕對值最大，弓I入檢驗值Fa(5)=3.707，引入臨界值Fa二5.591，F(xiàn)a(5)《Fa，不能引入第5項，已引入項數(shù)=1。變量篩選結(jié)果檢驗項數(shù)=6，預(yù)期引入項數(shù)=0，實際引入項數(shù)==1，實際引入項數(shù)^預(yù)期引入項數(shù)回歸方程y=b(0)+b(l)*X(l)回歸系數(shù)b(i):b(0)=9.70b(l)=0.536標準回歸系數(shù)B(i):B(l)=0.883復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.8827決定系數(shù)RA2=0.7791修正的決定系數(shù)RA2a=0.7791變量分析表2、變量分析表變異來源平方和自由度均方均方比回歸U-52,8K=1U/K==52.8F=24.68乘lj余Q=15.0N—1—K=7Q/(N——1一K)=2.14總和L=67.8N—1=8樣本容量N二9，顯著性水平a=0.05,檢驗值Ft二24.68，臨界值F(0.05,1，7)二5.591剩余標準差s=1.46回歸系數(shù)檢驗值t檢驗值(df二7):t(l)=4細F檢驗值(dfl二l，dfi=7):F(l)=24.68偏回歸平方和U(i):U(l)=52.8偏相關(guān)系數(shù)P(i):P1,=0.8827各方程項對回歸的貢獻(按偏回歸平方和降序排列)U(l)=52.8，U(l)/U=100%殘差分析表3、殘差分析表觀測值回歸值觀測值一回歸值(回歸值一觀測值)/觀測值x100(%)112.612.10.500-3.97213.614.9-1.309.56316.617.7-1.106.6349.3011.2-1.9020.4512.814.0-1.209.37618.416.81.60-8,70711.210.21.00-8.93814.613,11.50-10.3916.815.90.900-5.36回歸分析結(jié)束試驗條件優(yōu)化---------------試驗優(yōu)化方法:網(wǎng)格嘗試法表4、條件優(yōu)化設(shè)置列表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表5、優(yōu)化的試驗條件<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>------------------試驗優(yōu)化結(jié)束------------------根據(jù)以上結(jié)果，在枸櫞酸鈉達到溶解度要求的基礎(chǔ)上，最優(yōu)的處方為含甘油15%處方。2.1.2.4封管用枸櫞酸鈉注射液不加增稠劑的處方為枸櫞酸鈉467g，枸櫞酸3g，注射用水加至1000ml;加入增稠劑的處方為枸櫞酸鈉467g，枸櫞酸3g，甘油15g，注射用水加至1000ml。2丄2.5插管體外仿真血液流動模型的建立本發(fā)明以體外中心靜脈插管仿真裝置為例。利用虹吸原理將純化水導(dǎo)入已調(diào)節(jié)溫度為(37±0.5)。C的水浴鍋中，再通過恒流泵(可根據(jù)需要調(diào)節(jié)流速)用直徑為6mm的硅膠管從水浴鍋中將已預(yù)熱的水泵出，硅膠管的另一側(cè)插入留置導(dǎo)管，插管體外仿真血液流動模型的示意圖見圖1。注入封管液在不同時間點抽取導(dǎo)管腔內(nèi)下端溶液測枸櫞酸鈉含量。2.1.2.6含量測定方法的建立色譜條件色譜柱迪馬DiamonsilTMd8柱(250mmx4.6mm，5nm)，流動相甲醇-磷酸二氫鉀水溶液(50mmol/L，磷酸調(diào)pH至2.5~2.8)(5:95)，流速1.0mL/min，檢測波長210nm，柱溫23±2°C，進樣量20iU。溶液的配制對照品溶液的配制精密稱取枸櫞酸鈉999.9mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。供試品溶液的配制精密量取封管用枸櫞酸鈉注射液l.Oml，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。線性關(guān)系考察精密量取對照品儲備液0.5，1.0，2.0,4.0，6.0ml分別置于5個10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml與6mg/ml濃度的系列對照品溶液。在2.1色譜條件下，吸取20ul，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。以枸櫞酸鹽峰面積Y為縱坐標，枸櫞酸鹽濃度C為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線為Y=636%9.05X-9945.24，(r=0.9999,w=5)，線性范圍0.5~6mg/ml。精密度試驗取4mg/ml濃度的對照品溶液連續(xù)進樣5次，測得日內(nèi)RSD=0.79%("=5);將該溶液放置3天，每天進樣一次，測得日間RSD4.48。/。("=3)。2丄2.7將不加增稠劑與加入增稠劑兩種處方的注射液分別加入至模型中封管，循環(huán)72h，拔除導(dǎo)管，抽取導(dǎo)管下端液體，用HPLC測其枸櫞酸鈉含量。結(jié)果為0.225mg/ml與0.689mg/ml。2.1.3制備工藝2.1.3.1操作步驟(1)稱量根據(jù)處方，按稱量SOP稱取原料。(2)取適量熱注射用水，加入枸櫞酸鈉、枸櫞酸攪拌溶解，加注射用水至全量，攪勻。(3)濾過脫炭過濾用板框過濾器，濾材為微孔濾膜，孔徑1.2um、0.8ixm;終端過濾用微孔濾盤，濾材為微孔濾膜，孔徑0.65um;中間品質(zhì)控含量含量為標示量的97.0%-103.0%，pH值6.87.5。(4)灌裝自動定量灌裝，灌裝過程中，檢查封口。(5)滅菌按安瓿要求進行，溫度11(TC，時間20分鐘，熱壓滅菌。(6)燈檢置安瓿于光照度20003000LX的澄明度檢測議前，用目檢視，按澄明度檢査要求進行，燈檢人員視力應(yīng)為5.0以上，無色盲。檢漏，剔除有藥液滲漏、漏氣及有異物的產(chǎn)品，成品澄明度應(yīng)符合藥典規(guī)定。(7)包裝合格的檢品按要求貼簽并裝入5支裝紙盒，點檢裝箱。2.1.3.2工藝流程稱量一配制一濾過一灌裝一滅菌一燈檢一包裝2.1.4處方中輔料的作用枸櫞酸為pH調(diào)節(jié)劑，注射用水為溶劑。2.2三批中試試驗結(jié)果按上述確定的制備工藝制備，三批中試試驗結(jié)果見表6。表6、三批封管用枸櫞酸鈉注射液中試試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.3影響因素試驗2.3.1髙溫試驗取封管用枸櫞酸鈉注射液置烘箱中，于4(TC溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，按照本制劑質(zhì)量標準(草案)進行分析，考察結(jié)果見表7。表7、初步穩(wěn)定性考察(高溫4(TC)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)果表明4(TC溫度放置5天與IO天后其含量與O天相比基本保持不變，未見有關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生。2.3.2強光照射試驗取封管用枸櫞酸鈉注射液置光照箱中照射，照射度為4500士500LX，放置時間10天，于第5天和第10天取樣，按照本制劑質(zhì)量標準(草案)進行分析，考察結(jié)果見表8。表8、初步穩(wěn)定性考察(光照4500±500LX)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)果表明40'C溫度放置5天與10天后其含量與0天相比基本保持不變，未見有關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生。通過影響因素實驗表明，本處方工藝條件下制得的封管用枸櫞酸鈉注射液在高溫和光照條件下，各項指標均未發(fā)生較大改變，因此，本處方工藝克用于封管用枸櫞酸鈉注射液的生產(chǎn)。3討論與小結(jié)3.1該注射劑用途為封管，大部分留滯在導(dǎo)管內(nèi)，但仍有少部分入血，應(yīng)與血液有很好的相容性，所以本試驗選用pH值范圍為6.4~7.5。3.2根據(jù)泊肅葉方程采用均勻設(shè)計對處方進行優(yōu)化，結(jié)果顯示甘油對其黏度起著決定性作用，在滿足枸櫞酸鈉溶解度要求的基礎(chǔ)上，含甘油15%的處方為最優(yōu)處方。3.3由于該處方未加入特殊物質(zhì)，故生產(chǎn)注射劑的一般工藝既可滿足該封管液的制備要求。3.4從以上結(jié)果可以看出不加增稠劑的處方在封管3天后下端剩余量仍可以測出，根據(jù)安全性原則，加入成分種類越少相對來說越安全，所以最后我們選用不加增稠劑的處方作為最后處方。3.5本試驗通過篩選得到的處方枸櫞酸鈉467g，枸櫞酸3g，注射用水加至1000ml。其中枸櫞酸在處方中為pH調(diào)節(jié)劑，注射用水為溶劑。因其濃度為近飽和濃度，具有一定的黏度，在封管中可以存在一定的時間，該制劑在上述工藝條件下，產(chǎn)品劑量準確，澄明度好。經(jīng)穩(wěn)定性研究表明，所得注射液穩(wěn)定性好，質(zhì)量符合有關(guān)規(guī)定，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。(四)體外血管插管仿真裝置的建立及封管液滯留期的觀察以上所述的插管體外仿真血液流動模型的有關(guān)詳細情況在這里進一步闡述。建立體外中心靜脈插管仿真裝置的目的是為了研究封管液在留置導(dǎo)管中的滯留情況。以純化水、硅膠管及橡膠管模擬血液與血管，利用虹吸原理及恒流泵來做為仿真血液流動的驅(qū)動力，在硅膠管上插入靜脈留置導(dǎo)管，建立起體外血管插管仿真裝置；往留置導(dǎo)管腔內(nèi)注入封管用枸櫞酸鈉注射液，在不同時間點抽取導(dǎo)管腔下端液體，測定其枸櫞酸鈉含量，考察其裝置的穩(wěn)定性以及封管液滯留期。測得3天內(nèi)不同時間點樣品的含量與滯留時間成負相關(guān)，得回歸方程為丫=-0.0136乂+1.0875(r=0.9055)，連續(xù)多次測得lh、2h和4h時間點在留置導(dǎo)管側(cè)孔處枸櫞酸鈉殘留量的RSD(n=5)分別為9.03%、9.82%與11.43%;封管用枸櫞酸鈉注射液在體外模型留置導(dǎo)管中可至少滯留3天以上。該裝置在一定程度上能夠模擬靜脈血液流動，具有一定的仿真性，適用于封管液的體外滯留期的考察，為封管液臨床前研究提供了試驗平臺。對于腎衰患者需要進行長期的血液透析，通常以深靜脈導(dǎo)管作為留置導(dǎo)管建立血液透析通路，封管液對導(dǎo)管的堵塞及感染至關(guān)重要，然而尚未有任何對封管液研究的體外模型裝置的相關(guān)報道。本試驗為封管液臨床前研究建立了體外血管插管仿真裝置，并以此研究了封管用枸櫞酸鈉注射液在留置導(dǎo)管中的滯留情況。1.材料與方法1.1材料插管體外仿真血液流動模型(或稱體外血管插管仿真裝置)是包括容器1、導(dǎo)管2、流量調(diào)節(jié)器3、水浴鍋4、燒杯5、導(dǎo)管6、恒流泵7、夾子8、三通接頭9和留置導(dǎo)管10，以體外中心靜脈插管仿真裝置為例，導(dǎo)管(2)選用橡膠管，通過恒流泵(7)的導(dǎo)管(6)選用硅膠管；容器(1)選擇塑料桶塑料桶(容量40L);橡膠管(內(nèi)徑6mm);流量調(diào)節(jié)器；硅膠管(內(nèi)徑6mm);大燒杯(容量1000ml);水浴鍋(HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司)；恒流泵(HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器廠)；三通接頭；夾子；靜脈留置導(dǎo)管(A1.0mlVl.lml，德國)；純化水(自制)；生理鹽水(自制)；封管用枸櫞酸鈉注射液(自制，批號20051024)。1.2體外血管插管仿真裝置的組成見圖l。1.3體外血管插管仿真裝置的工作原理1.3.1體外血管插管仿真裝置的驅(qū)動力該裝置利用虹吸原理及蠕動裝置完成模型的一系列驅(qū)動。首先利用虹吸原理，通過橡膠管將處于稍高處塑料桶中的液體導(dǎo)出至水浴鍋內(nèi)大燒杯中加熱，然后通過恒流泵將大燒杯中經(jīng)加熱后的液體以恒速泵出，完成流動過程。1.3.2體外血管插管仿真裝置的模擬系統(tǒng)該裝置中的水浴鍋可以加熱從塑料桶導(dǎo)出的液體以模擬血液的溫度，恒流泵可以控制液體流出的速度，從而模擬血液流速，通過選擇合適的液體可以模擬血液的黏度，改變插管處橡膠管的內(nèi)徑可以模擬不同部位的靜脈。1.4模擬試驗為了驗證體外血管插管仿真裝置的實際效果，選用封管用枸櫞酸鈉注射液進行滯留期觀察試驗及該裝置性能穩(wěn)定性考察。1.4.1試驗方法在已啟動的體外血管插管仿真裝置中(溫度37°C，流速16ml/min)，將封管用枸櫞酸鈉注射液按照管腔標示量注入靜脈留置導(dǎo)管中，在模擬血液恒溫恒速流動的條件下，于相應(yīng)時間點自導(dǎo)管兩腔下端各取樣100nl，用HPLC法測定其枸櫞酸鈉含量[1]，并以取樣時間作橫坐標，枸櫞酸鈉含量為縱坐標進行回歸計算。1.4.2試驗步驟(1)調(diào)節(jié)流量調(diào)節(jié)器，使流速與恒流泵所設(shè)流速一致；(2)將水浴鍋溫度調(diào)至37.5。C，大燒杯內(nèi)加滿液體，預(yù)熱10min;(3)開啟恒流泵，排除各部分連接導(dǎo)管內(nèi)的空氣；(4)從留置導(dǎo)管動靜脈腔分別注滿生理鹽水，以排除留置導(dǎo)管內(nèi)空氣；(5)以注射器將封管用枸櫞酸鈉注射液按照導(dǎo)管標示量勻速注入管腔，夾好導(dǎo)管夾，旋緊導(dǎo)管帽；(6)按要求在不同時間點拔除導(dǎo)管，從導(dǎo)管下端側(cè)孔處抽取液體各100P1，用HPLC法測定枸櫞酸鈉含量(王雯佶，張純，秦小雷等。用RP-HPLC法測定高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤-II保存液中三種成分的含量，藥學(xué)服務(wù)與研究，2006，6(4):297-298)。1.4.3性能穩(wěn)定性試驗參照上述試驗方法和步驟，重復(fù)操作5次，分別lh、2h與4h時間點取樣測枸櫞酸鈉含量，計算各時間點含量的RSD(n=5)。1.4.4滯留期考察參照上述試驗方法和步驟，分別在lh、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h時間點取樣測枸櫞酸鈉含量，考察封管用枸櫞酸鈉注射液在體外血管插管的滯留期。2.結(jié)果2.1體外中心靜脈插管仿真裝置穩(wěn)定性試驗的結(jié)果見表9。2.2封管用枸櫞酸鈉注射液在體外模型留置導(dǎo)管中可至少滯留3天(72h)以上，測定結(jié)果見表10。以取樣時間與所測得樣品含量做線性回歸，得回歸方程為y=-0.0136X+1.0875(r=0.9055)。表9、體外中心靜脈插管仿真裝置穩(wěn)定性試驗測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表io、封管用枸櫞酸鈉注射液在體外中心靜脈插管仿真裝置中各時間點的枸櫞酸鈉含量(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>3.討論與小結(jié)3.1裝置材料的選擇封管液在靜脈留置導(dǎo)管中起到抗凝和抗感染的作用，為了了解封管液在留置導(dǎo)管中的滯留情況，篩選新型封管液配方，建立合適的體外試驗?zāi)Ｐ头浅１匾１驹囼灢捎靡话愕墓懿暮秃唵卧O(shè)備，設(shè)計了體外中心靜脈插管仿真裝置，為封管液的臨床前研究提供了試驗平臺。圖1中編號的各部件按順序連接，其中2號部分導(dǎo)管選用的是橡膠管，因為其彈性大，流量調(diào)節(jié)器可以很好的控制流速，插入靜脈留置導(dǎo)管后在插入口處可以很好的閉合，控制空氣的進入；通過恒流泵部分的導(dǎo)管6則選用硅膠管，因該部分易磨損，而硅膠管具有良好的韌性，經(jīng)久耐用，內(nèi)徑的選擇可根據(jù)需要自行調(diào)整；容器l應(yīng)足夠大，最小容量應(yīng)滿足夜間流量；5號大燒杯的容量應(yīng)盡量大，以保證在液體從上一容器導(dǎo)入后能與其中已加熱后的液體迅速混合后沒有明顯的溫度變化；恒流泵應(yīng)具有合適的流速范圍以滿足需要；流動的液體可以根據(jù)需要自行配制。本試驗裝置是基于本試驗室現(xiàn)有材料基礎(chǔ)上搭建，塑料桶的容量與恒流泵的最大流速16ml/min。3.2模型的確立在研制本裝置過程中曾嘗試過建立閉合式循環(huán)裝置，但該試驗藥物枸櫞酸鈉在體內(nèi)可通過酶被迅速代謝，不會被循環(huán)利用；而在體外閉合式循環(huán)裝置中的枸櫞酸鈉不會迅速代謝，能被循環(huán)利用，仿真效果不佳。故本裝置選用開放式，可以避免上述情況的發(fā)生。3.3影響試驗的因素從裝置穩(wěn)定性試驗結(jié)果來看，本裝置測試封管用枸櫞酸鈉的重現(xiàn)性較好，RSD均在10。/。左右。影響該裝置穩(wěn)定性的因素主要有以下幾點①在試驗過程中裝置連接導(dǎo)管中的氣泡對封管液的滯留時間有很大影響，可導(dǎo)致到達規(guī)定時間后在導(dǎo)管下端抽得液體量減少甚至無液體，故嚴禁氣泡產(chǎn)生；②插入留置導(dǎo)管部分的橡膠管擺放位置不同，由于重力作用原因?qū)Y(jié)果也會有影響(Hans-DietrichPolaschegg.Lossofcatheterlockingsolutioncausedbyfluiddensity.ASAIOjournal,2005,51(3):230-235);③人工操作中注入封管液的速度對試驗結(jié)果有一定影響。3.4本試驗根據(jù)目前臨床封管液一般滯留期不超過3天(血液透析患者通常每周需要透析23次)來設(shè)計，取樣時間分別為lh、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h，能基本反映封管液在留置導(dǎo)管的滯留情況。從封管液滯留期考察結(jié)果來看，封管用枸櫞酸鈉注射液在體外模型留置導(dǎo)管3天(72h)時仍有滯留，已能滿足臨床需要。該裝置材料易得，搭建簡單，操作方便，與體內(nèi)血液流動情況有一定的相關(guān)性，具有一定的仿真性，其試驗數(shù)據(jù)可以用作封管液臨床前研究的參考，為臨床研究提供了一定的試驗基礎(chǔ)。(五)該枸櫞酸鈉注射液中枸櫞酸鹽的含量測定本發(fā)明建立了封管用枸櫞酸鈉注射液中枸櫞酸鹽的含量測定方法。本發(fā)明選用HPLC法，選用迪馬Diamonsild8色譜柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀(pH調(diào)至2.5~2.8)(5:95，v:v)為流動相，流速為1.0ml/min,紫外檢測波長210nm。枸櫞酸鹽在0.5mg/ml~6mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，0=0.9999，"=5);平均加樣回收率為98.79%(RSD=1.08%);三批封管用枸櫞酸鈉注射液中的枸櫞酸鹽標示含量分別為100.51%、98.22%、97.78%。本方法操作簡便、快速，結(jié)果準確、可靠，適用于該制劑中枸櫞酸鹽的含量測定。封管用枸櫞酸鈉注射液為本院自制制劑，專用于靜脈留置導(dǎo)管封管。枸櫞酸鹽的含量測定方法有非水滴定法(中國藥典2005年版二部)，離子交換法(中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品檢驗所編.藥品檢驗，1979，186)、紫外分光光度法(李之林.枸櫞酸鹽兩種測定方法的比較[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20(2):122)、高效液相色譜法(董曉東，孫靜，何影.高效液相色譜法測定紅細胞保存液中枸櫞酸及其鈉鹽總量[J].色譜，2003，21(1):46-48)等。本實驗采用高效液相色譜法測定封管用枸櫞酸鈉注射液中枸櫞酸鹽的含量，并與經(jīng)典的非水滴定法進行比較。1.儀器與試藥Waters高效液相色譜系統(tǒng)Waters600色譜泵，Waters996PDA紫外檢測儀，Millennium32色譜工作站；梅特勒-托利多320型pH計(梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司)；梅特勒-托利多AE240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司)；101-2型電熱鼓風(fēng)箱(上海市上?？h實驗儀器廠)。封管用枸櫞酸鈉注射液(3ml:1.4g，自制，批號20040727，20050120，20050221)，枸櫞酸鈉(湖南華日制藥有限公司，批號20051012)，枸櫞酸(廣東省臺山市新寧制藥廠，批號20050303)，磷酸二氫鉀(湖南華日制藥有限公司，批號20040422);冰醋酸(上海埃彼化學(xué)試劑公司，批號F20050725);醋酐(上海醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，批號F20021018);甲醇(上?；瘜W(xué)試劑研究所，批號20060301，色譜純)，注射用水(自制)。2.方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱迪馬DiamonsilTMds柱(250mmx4.6mm，5nm)，流動相甲醇-磷酸二氫鉀水溶液(50mmol/L，磷酸調(diào)pH至2.52.8)(5:95)，流速1.0mL/min，檢測波長210nm，柱溫23±2°C,進樣量20ul。2.2溶液的配制對照品溶液的配制精密稱取枸櫞酸鈉999.9mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。供試品溶液的配制精密量取封管用枸櫞酸鈉注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。2.3線性關(guān)系考察精密量取對照品儲備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0ml分別置于5個10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml與6mg/ml濃度的系列對照品溶液。在2.1色譜條件下，吸取20iU，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。以枸櫞酸鹽峰面積Y為縱坐標，枸櫞酸鹽濃度C為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線為Y=636969.05X-9945.24,0=0.9999，"=5)，線性范圍0.5~6mg/ml。2.4精密度試驗取4mg/ml濃度的對照品溶液連續(xù)進樣5次，測得日內(nèi)RSD=0.79%(w=5);將該溶液放置3天，每天進樣一次，測得日間RSD-1.48n/。(w=3)。2.5加樣回收率試驗取已知含量的樣品，先用水稀釋4倍，精密量取稀釋樣品l.Oml，置100ml量瓶中，再加入一定量的枸櫞酸鈉，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取20yl注入高效液相色譜儀中，測定含量，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.79%,RSD=1.08%(w=9)。詳細結(jié)果見表ll。2.6樣品測定分別取封管用枸櫞酸鈉注射液三批(批號20040727，20050120，20050221)，按照2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件下進行測定，采用外標法定量，測得3批樣品中的枸櫞酸鹽的標示含量分別為100.51%、98.55%、97.78%，色譜圖見圖2(枸櫞酸鹽HPLC圖譜，F(xiàn)ig2HPLCchromatogramofcitrate)。表ll、加樣回收率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>2.7與非水滴定法比較精密量取3批樣品各2.0ml，分別置50ml容量瓶中，加水定容，精密量取3.0ml至錐形瓶中，置水浴上蒸干后，再在105'C烘箱中干燥lh，放冷，加冰醋酸20ml，加熱溶解后，放冷，加醋酐2ml與結(jié)晶紫指示液l滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯藍綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每lml高氯酸滴定液(O.lmol/L)相當于9.803mg的C6H5Na307*2H20。3批樣品的測定結(jié)果分別為其標示量的99.71%、97.96%、96.75%。與上述高效液相色譜法的測定結(jié)果比較無顯著差異。3討論3.1從與非水滴定法比較試驗結(jié)果可以看出，高效液相色譜法測定該制劑中的枸櫞酸鹽含量的準確度與非水滴定法沒有顯著性差別，但其操作簡便，快速，數(shù)分鐘內(nèi)就可以測定一個樣品；而非水滴定法的操作較繁瑣，費時，測定一個樣品至少花半天時間。另外，高氯酸非水滴定法僅能測定制劑中的枸櫞酸鈉含量，對含枸櫞酸較多的枸櫞酸鈉制劑的測定結(jié)果往往會偏低。3.2本法改進了流動相為甲醇一磷酸二氫鉀水溶液(pH至2.52.8)(5:95)，與已有報道的用1718mmol/L磷酸溶液(pH2,0~2.5)作為流動相高效液相色譜法[4]測定枸櫞酸鹽條件相比，具有更好的枸櫞酸鹽峰形，能改善其拖尾現(xiàn)象。3.3本法測定封管用枸櫞酸鈉注射液中枸櫞酸鹽的含量操作簡便、快速，結(jié)果準確、可靠，適用于該制劑中枸櫞酸鹽的含量測定，尤其適合于制劑中間品的質(zhì)控及制劑穩(wěn)定性研究。(六)該枸櫞酸鈉注射液的用途1、概述臨床長期的封管實踐表明凝血與感染是常見的兩大難題。隨著腎臟病中末期患者數(shù)目的逐年增多，而腎源有限，故血液透析療法是治療的主要手段，2001年有統(tǒng)計數(shù)字顯示，在美國，每一百萬人中就有900人需要用血液透析治療終末期腎臟病，并在2010年前以每年7.1%的速度增長，全球有100萬以上終末期腎病患者，每年以8%的速度增長，中國約占十分之一(XueJL，MaJZ,LouisTA，etal、Forecastofthenumberofpatientswithend-stagerenaldiseaseintheUnitedStatestotheyear2010."附SbciVe//jra/，2001，12(12):2753—2758.，和USRenalDataSystem:2003AnnualDataReport:AtlasofEndStageRenalDiseaseintheUnitedStates,Bethesda,NationalInstitutesofHealth,NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases，2003)。以上的實驗研究證明該封管用枸櫞酸鈉注射液具有顯著的藥理活性，發(fā)明人因此認定該封管用枸櫞酸鈉注射液具有良好的抗凝血與抗感染作用，應(yīng)主要是通過封管來發(fā)揮作用的。本發(fā)明所指的該封管用枸橡酸鈉注射液主要由枸櫞酸鈉與枸櫞酸組成，能與血液中的鈣離子螯合生成可溶難解離的枸櫞酸鈣，從而減少鈣離子的濃度起到抗凝作用，本發(fā)明的實驗結(jié)果顯示該封管用枸櫞酸鈉注射液有較好的療效，上述實驗表明該封管用枸櫞酸鈉注射液臨床用于封管，對常見的凝血和感染具有很好的抑制作用。2、該封管用枸櫞酸鈉注射液的使用方法與要求本發(fā)明應(yīng)嚴格按照導(dǎo)管標示量注入導(dǎo)管，在下一次血液透析前將其抽出導(dǎo)管。本發(fā)明該封管用枸櫞酸鈉注射液可以單獨或與其它活性組分聯(lián)合使用，包括用于制備用于診斷、檢測、預(yù)防、保護、治療或研究相關(guān)疾病的產(chǎn)品，包括藥物、試劑、食品或飲料等，尤其是藥物。在具體使用方面，本發(fā)明所述的該封管用枸櫞酸鈉注射液能夠單獨使用，還能夠與其他許多化學(xué)物質(zhì)一起使用。無論這些化學(xué)物質(zhì)是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，包括輔助功能如協(xié)同放大作用、拮抗或緩解該枸櫞酸鈉注射液的副作用等，這些化學(xué)物質(zhì)是包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體、食品、天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物或人類用藥等中的一種或多種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或者食品等中的一種或多種；進一步優(yōu)選醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。所述的有活性的化學(xué)物質(zhì)是包括有治療作用的化學(xué)物質(zhì)，或者是對治療有輔助作用的化學(xué)物質(zhì)等中的一種或多種。本文使用的"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇等等及其組合物中的一種或多種。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體還可以包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等中的一種或多種，它們增強了該枸櫞酸鈉注射液的有效期或效力。從具體的分類上看，所說的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體是指醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括賦形劑，如淀粉或水等中的一種或多種；潤滑劑，如甘油或硬脂酸鎂等中的一種或多種；崩解劑，如微晶纖維素等；填充劑，如淀粉或乳糖等中的一種或多種；粘接劑，如預(yù)膠化淀粉、糊精、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等中的一種或多種；滲透壓調(diào)節(jié)劑，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一種或多種；稀釋劑，如水等；崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉等中的一種或多種；吸收促進劑，如季銨化合物等；表面活性劑，如十六烷醇等；吸附載體，如高嶺土或皂粘土等中的一種或多種；潤滑劑，如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇等中的一種或多種；另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑或甜味劑等中的一種或多種。例如，將活性組分該枸櫞酸鈉注射液溶解、混懸或乳化于適宜的水性溶劑中(例如，蒸餾水、生理鹽水或格林溶液等中的一種或多種)或油性溶劑中(例如，植物油例如橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一種或多種)中，即可制得注射制劑，其中溶劑中可含有分散劑(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一種或多種)、滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如，氯化鈉、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一種或多種)。在這種情況下，如有必要，可加入添加劑，例如增溶劑(例如，水楊酸鈉或醋酸鈉等中的一種或多種)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白等)、止痛劑(例如，苯甲醇等)等。本發(fā)明所述及的該枸櫞酸鈉注射液還可以以組合物的形式聯(lián)合使用，特別是與用其它化學(xué)物質(zhì)如藥物對動物尤其是哺乳動物包括人或其他動物進行治療所用的組合物或者是類似的組合物。所述哺乳動物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、豬、馬、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、獼猴或恒河猴等中的一種或多種。例如，可以將本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液加入適于給與受治療者的藥用組合物中。通常，該藥用組合物包含本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液和藥學(xué)上可接受的載體。該枸櫞酸鈉注射液的組合物特別是藥物組合物可以有各種形式，包括例如液體、半固體等劑量形式中的一種或多種；其中所說的藥物組合物包括治療有效量的該枸櫞酸鈉注射液為活性成分，以及一種或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。該枸櫞酸鈉注射液的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)生產(chǎn)方法制成部分劑型，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述的劑型包括混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑或注射劑等中的一種或多種，采取注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種)、粘膜透析等中的一種或多種給藥途徑進行抗凝、抗感染及相關(guān)病癥的診斷、檢測、治療或科學(xué)研究。藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.5~99%的活性成分該枸櫞酸鈉注射液，進一步優(yōu)選含有重量比為1~95%的活性成分該枸櫞酸鈉注射液，最優(yōu)選含有重量比為5~90%的活性成分該枸櫞酸鈉注射液。該枸櫞酸鈉注射液的藥物組合物一般必須無菌且在生產(chǎn)儲存條^^下穩(wěn)定?？梢詫⒃摻M合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將所需量的該枸櫞酸鈉注射液與所需上述成分的一種或組合一起加入適當?shù)娜軇┲胁⒔又M行除菌過濾制備無菌注射液。一般而言，通過將該枸櫞酸鈉注射液加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥劑。例如，通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當流動性。通過在該組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽或明膠)可以達到注射組合物的延長吸收。用于患者時，本發(fā)明所述的該枸櫞酸鈉注射液劑量為540mg/kg，d，該劑量或用量通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液及其藥用組合物可以包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液。"治療有效量"是指在必要的劑量和時間下有效達到所需治療效果的量。該枸櫞酸鈉注射液的治療有效量可以根據(jù)諸如個體的病況、年齡、性別和體重以及該枸櫞酸鈉注射液在該個體引起所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦指該枸櫞酸鈉注射液的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量。"預(yù)防有效量"是指在必要劑量和時間下有效達到所需預(yù)防效果的量。因為預(yù)防劑量用于患病前或疾病早期的受治療者，預(yù)防有效量通常小于治療有效量。本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液的治療或預(yù)防有效量的典型的非限制性范圍是540mg/kg，更優(yōu)選為30~40mg/kg。應(yīng)注意，劑量值將根據(jù)欲減輕的疾病類型和嚴重性變化，也就是說用于患者時，本發(fā)明所述的該枸櫞酸鈉注射液的劑量或用量，通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。另外，應(yīng)理解，對于任何特定受治療者，應(yīng)隨著時間根據(jù)個體需要和給與或監(jiān)督給與所述組合物的人的專業(yè)判斷調(diào)整特定劑量制度，并且本文設(shè)定的劑量范圍僅為例證性的，并不會限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵺`。也就是說，需要根據(jù)治療的對象、給藥途徑、所治療疾病和狀況等，變化本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液的每次和/或每日的劑量或用量。例如，經(jīng)靜脈給予哺乳動物，尤其是成年人(如體重60kg)，所述該枸櫞酸鈉注射液的單劑量約為5~40mg，優(yōu)選約40mg，優(yōu)選每周給藥1~3次?？梢哉{(diào)整劑量單位，以提拱最佳所需反應(yīng)(例如治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如，可以單次大劑量給藥，可以在一段時間內(nèi)給予幾個均分量或根據(jù)治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配制易于給藥和劑量統(tǒng)一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式，指適于欲治療的哺乳動物受治療者的單元劑量的物理分離單位；每個單位含有預(yù)定量的計算用于與所需藥用載體一同產(chǎn)生所需治療效果的活性物該枸櫞酸鈉注射液。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格，由以下確定并直接取決于以下(a)該枸櫞酸鈉注射液的獨特特征和欲達到的特定治療或預(yù)防效果，和(b)在混合這種用于治療個體敏感性該枸櫞酸鈉注射液的技術(shù)中的內(nèi)在限制。3、該枸櫞酸鈉注射液的藥物劑型和給藥途徑本發(fā)明所述的該封管用枸櫞酸鈉注射液能夠有效的抑制血液凝固與感染，該枸櫞酸鈉注射液能夠制備封管用產(chǎn)品，其中按照飲料、食品
技術(shù)領(lǐng)域：
的要求制備的產(chǎn)品能夠診斷、檢測、預(yù)防、保護、治療或研究凝血、感染及其并發(fā)癥；按照醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的要求制備的產(chǎn)品能夠用于患者的治療或保健，既能夠單獨直接用于制備治療或保健的藥物，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進行混合或組合，直接或間接用于制備治療或保健的藥物；特別是按照醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的要求制備的產(chǎn)品能夠用于患者的留置導(dǎo)管封管。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。在本發(fā)明中，所需物料包括本發(fā)明的原料、上述配套使用的化學(xué)物質(zhì)等，均應(yīng)根據(jù)實際情況和需要，采用藥用級的物料。本發(fā)明所述的該封管用枸櫞酸鈉注射液，在使用領(lǐng)域中優(yōu)選以注射劑形式往留置導(dǎo)管中推注使用。本發(fā)明所述的該封管用枸櫞酸鈉注射液，優(yōu)選是用注射器按照導(dǎo)管標示量注入留置導(dǎo)管，其使用量方面應(yīng)嚴格按照導(dǎo)管標示量。本發(fā)明所述的該枸櫞酸鈉注射液，可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥。但是，技術(shù)人員會理解給藥途徑/給藥方式隨所需的結(jié)果而變化。在某些具體實施中，該活性化合物可以與保護該化合物免于快速釋放的載體一同制備例如空釋制劑，包括移植物傳遞系統(tǒng)、透皮貼傳遞系統(tǒng)或微囊傳遞系統(tǒng)等中的一種或多種。此外，還可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一種或多種。制備這種制劑的許多方法均已申請專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(參見例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson編輯，MarcelDekker，inc"紐約，1978)。本發(fā)明所述的該枸櫞酸鈉注射液，通常通過腸胃外給藥等中的一種或多種方式，施用于需要這種治療的患者。為了以非腸道給藥之外給予本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液，可能需要用防止其失活的材料對該枸櫞酸鈉注射液包衣或與該枸櫞酸鈉注射液一同給予。亦可以將補充的活性化合物加入該組合物中。在具體實施時，將本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液與一種或多種可以用于治療疾病的其它治療藥物共配制和/或共給予。這種聯(lián)合使用，可以優(yōu)越地利用較低劑量的該給予的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。制成液體制劑如水劑、油懸浮劑或其它液體制劑中的一種或多種；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液劑、水劑或油性懸浮劑等中的一種或多種。此外，該枸櫞酸鈉注射液所使用的藥材原料在某些情況下也能夠單獨直接用于制備封管用產(chǎn)品，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進行混合或組合，以組合物的形式直接或間接用于制備封管用產(chǎn)品。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。綜上所述，本發(fā)明該枸櫞酸鈉注射液可用于制備封管用產(chǎn)品，優(yōu)選藥物和食品，進一步優(yōu)選藥物。(七)技術(shù)特長本發(fā)明有針對性地研究一種封管用枸櫞酸鈉注射液配方，該原料使用安全，互為兼顧，一物多用，最大限度地發(fā)揮了作用，容易推廣應(yīng)用，能夠在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。本發(fā)明的研究結(jié)果表明該產(chǎn)品具有療效確切、毒副作用低的優(yōu)點，與同類產(chǎn)品相比具有顯著的優(yōu)勢。也就是說，本發(fā)明的研究結(jié)果能夠被進一步深入開發(fā)為具有臨床應(yīng)用前景的防治凝血和抗感染雙重作用的產(chǎn)品尤其是新藥。隨著中末期腎衰患者數(shù)目的逐年增多，血液透析的需求量也會隨之上升，因此，本發(fā)明能夠產(chǎn)生更大的經(jīng)濟效益和社會效益。經(jīng)過長期的藥理學(xué)試驗，一種封管用枸櫞酸鈉注射液配方具有抗凝及抗感染的活性，直接使用一種封管用枸櫞酸鈉注射液配方，作用更理想，從而克服了封管中凝血與感染兩大難題，避免了抗生素給患者帶來的不良影響；而且該封管用枸櫞酸鈉注射液藥理作用較強，其原料來源豐富，制備工藝簡單。本發(fā)明的制備方法簡單，可行性強，重復(fù)性高，所生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量合格，且穩(wěn)定性好，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明中的體外中心靜脈插管仿真裝置采用一般的管材和簡單設(shè)備，利用虹吸原理及蠕動裝置完成模型的一系列驅(qū)動，可以模擬血液的溫度，黏度，流速及不同部位的靜脈，具有一定的仿真性，可以作為體外篩選封管液的試驗裝置，為封管液的臨床前研究提供了試驗平臺。目前國內(nèi)外尚未有該裝置的報道?？傊?，本發(fā)明積極適應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)療和科研領(lǐng)域的工作需要和人性化服務(wù)的需要，是用于留置導(dǎo)管封管的理想封管液。圖l表示插管體外仿真血液流動模型的示意圖，其中，1:塑料桶；2:橡膠管；3:流量調(diào)節(jié)器；4:水浴鍋；5:燒杯；6:硅膠管；7:恒流泵；8:夾子；9:三通接頭；10:留置導(dǎo)管；圖2表示枸櫞酸鹽HPLC圖譜(HPLCchromatogramofcitrate),其中，A:對照品(reference)色譜圖；B:供試品(sample)色譜圖3表示枸櫞酸鈉對照品HPLC圖4表示供試品HPLC圖5表示封管用枸櫞酸鈉注射液(25°C±2°C，12個月)HPLC圖。具體實施例方式本發(fā)明研究了一種新的枸櫞酸鈉注射液配方及其制備方法和新用途，提供了一種能夠用于制備抗凝、抗感染及其并發(fā)癥產(chǎn)品如藥物的原料，便于醫(yī)療行業(yè)和相關(guān)行業(yè)如食品、飲料等領(lǐng)域的安全使用，包括疾病治療、科學(xué)研究等。下面以該枸櫞酸鈉注射液的有關(guān)藥理實驗為例，詳細闡述該枸櫞酸鈉注射液的抗凝作用。觀察封管用枸櫞酸鈉注射液的體外抗凝效果。取兔心臟血液，制備血漿，分別加入封管用枸櫞酸鈉注射液和不同濃度的肝素鈉注射液，采用血液凝聚儀測定血小板最大聚集率PAG(M)、部分凝血活酶時間(簡稱APTT)、凝血酶原時間(簡稱PT)及凝血酶時間(簡稱TT)。封管用枸櫞酸鈉注射液能明顯延長APTT、PT及TT，完全抑制血小板的凝聚，其抗凝聚作用優(yōu)于肝素注射液。封管用枸櫞酸鈉注射液具有良好的體外抗凝作用。目前臨床上用于留置導(dǎo)管封管主要采用不同濃度的肝素鈉溶液，肝素鈉主要通過與抗凝血酶結(jié)合，抑制其活化凝血因子而起到抗凝作用。但由于大劑量應(yīng)用肝素鈉可致自發(fā)性出血傾向，因而對于有明顯出血傾向、凝血功能障礙及使用肝素鈉過敏的透析患者來說，應(yīng)選擇其他更為安全的抗凝劑。枸櫞酸鈉通過螯合血液中可促進凝血活素、凝血酶和纖維蛋白形成的游離鈣離子，阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化成為凝血酶，從而發(fā)揮抗凝血作用，并可以避免肝素鈉封管帶來的副作用，較肝素鈉安全可靠，而且高濃度的枸櫞酸鈉具有很好的抗菌效果，也是留置導(dǎo)管封管必需的。本試驗旨在研究封管用枸櫞酸鈉注射液的體外抗凝作用，并與肝素鈉注射液進行比較。1.材料與方法1.1試驗對象新西蘭大白兔3只，雌雄不限，2.5土0.5kg，購于第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心。1.2受試藥物封管用枸櫞酸鈉注射液(3ml:1.4g,自制，批號20051024);肝素鈉注射液(2ml:12500單位，常州千紅生化制藥有限公司，批號060608)。1.3試劑與儀器部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)及凝血酶時間(TT)試劑盒均為上海鷹躍生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號060307;枸櫞酸鈉(湖南華日制藥有限公司，批號20051012);生理鹽水(自制)；氯化鈣(北京市燕京制藥廠，批號041122);ADP(Sigma公司，進口分裝)；Anke80-2C離心沉淀機(上海飛鴿牌)；TYXN-96多功能智能血液凝聚儀(上海通用機電技術(shù)研究所研制)。1.4實驗方法1.4.1血漿的制備取新西蘭大白兔心臟新鮮血液9ml，用lml3.28。/。枸櫞酸鈉溶液抗凝，混勻后離心(10min，700r/min，37°C)，上清液即為富含血小板血漿(PRP)。剩余液體再次離心(10min，2000r/min,37°C)，上清液即為貧血小板血漿(PPP)。1.4.2肝素鈉溶液的制備取肝素鈉注射液lml，按照對半稀釋法以生理鹽水配成50mg/ml~1.5625mg/ml(125單位相當于lmg,即肝素鈉注射液規(guī)格為2ml:lOOmg)6個濃度的肝素鈉溶液。1.4.3血小板最大凝聚率PAG(M)的測定以200u1PRP力卩10不同受試藥物，37。C預(yù)溫5min，加入6ulADP誘導(dǎo)，測定血小板凝聚率。1.4.4APTT、PT與TT的測定分別以100u1PPP力卩10u1不同受試藥物，37。C預(yù)溫5min，按照儀器提示時間分別加入部分凝血活酶、凝血酶原及凝血酶，測定APTT、PT與TT。1.5統(tǒng)計學(xué)處理所用實驗數(shù)據(jù)均采用成組設(shè)計的方差分析，用PEMS軟件進行處理，結(jié)果均以S士s表示。2結(jié)果2.1封管用枸櫞酸鈉注射液對PAG(M)的影響封管用枸櫞酸鈉注射液能完全抑制兔體外血小板的凝聚(同空白組比有非常顯著差異，PO.Ol)，而6個濃度的肝素鈉溶液對血小板凝聚率有影響(同空白組比有顯著差異，P<0.05，但各組間無顯著性差別(P>0.05)，結(jié)果詳見表12。2.2封管用枸櫞酸鈉注射液對APTT、PT及TT的影響封管用枸櫞酸鈉注射液與6個濃度的肝素鈉均可以明顯延長兔體外APTT與TT;封管用枸櫞酸鈉注射液相對于除肝素鈉原液以外的5個濃度溶液對PT更顯著的延長作用，結(jié)果見表13。表12、封管用枸櫞酸鈉注射液與不同濃度肝素鈉對血小板最大凝聚率的影響(n=3)組別PAG(M)(%)空白血漿組76.5±3.0枸櫞酸鈉O.O土O.(T肝素鈉(50mg/ml)57.5±3.6*肝素鈉(25mg/ml)59.5±2.6'肝素鈉(12.5mg/ml)56.6土4.3*肝素鈉(6.25mg/ml)63,9±6.7*肝素鈉(3.125mg/ml)58.6土6.4'肝素鈉(1.5625mg/ml)63.8±2.4*注**P<0.01VS空白血漿組，*P<0.05VS空白血漿組。表13、封管用枸櫞酸鈉注射液與不同濃度肝素鈉對APTT、PT及TT的影響(n=3)組別APTT(s)PT(s)TT(s)空白血漿組39.8±2.412.7±0.415.6±2.1枸櫞酸鈉120.0±0.0*80.0±0.0**80.0±0.0*肝素鈉(50mg/ml)120.0±0.0*80.0±0.0**80.0±0.0*肝素鈉(25mg/mi;)120,0±0.0*39.2±1.2**80.0±0.0*肝素鈉(12.5mg/ml)120.0±0.0*28.3±3.6**80.0土0.0*肝素鈉(6.25mg/ml)120.0±0.0*26.1±5.3**80.0±0.0*肝素鈉(3.125mg/ml)120.0±0.0*24.1±1.5**80.0±0.0*肝素鈉(1.5625mg/ml)120.0±0.0*24.3±0.6**80.0±0.0*注承APTT欄中的120s與TT欄中的80s均為儀器顯示的極限值；**P<0.01VS空白血漿。3.討論肝素鈉與枸櫞酸鈉的作用機理不同，前者主要是通過激活對凝血酶及凝血因子XIIa、IXa、Xa、Xla具有滅活作用的抗凝血酶m(ATm)來實現(xiàn)的。因肝素鈉含有大量負電荷，能與ATm分子上帶正電的賴氨酸結(jié)合，使ATm分子構(gòu)型發(fā)生變化，精氨酸活性部位被暴露，易與凝血因子中的絲氨酸結(jié)合，生成無活性的ATm凝血因子復(fù)合物，使凝血因子受抑制而產(chǎn)生抗凝作用。而枸櫞酸鈉是通過枸櫞酸根離子與血中鈣離子生成難解離的可溶性絡(luò)合物枸櫞酸鈣，使血中鈣離子減少，從而抑制凝血過程、阻止血液凝固(李端，藥理學(xué)(第5版)，人民衛(wèi)生出版社，2003，8)。從表12的結(jié)果可以看出，封管用枸橡酸鈉注射液對血小板凝聚的抑制率高于肝素鈉溶液，各濃度肝素鈉溶液對血小板的抑制率之間沒有顯著性差異。這可能是與血漿中的凝血酶量有關(guān)，即本試驗中的最低濃度的肝素鈉溶液就可以與凝血酶完全發(fā)生作用。表13的結(jié)果顯示，封管用枸櫞酸鈉注射液與肝素鈉對兔體外APTT、PT和TT均有顯著的延長作用。對于靜脈留置導(dǎo)管的封管，臨床上多采用2mg/ml濃度的肝素鈉溶液進行封管，有時根據(jù)病人的個體情況進行適當調(diào)整用量(李保春，蘇紅，崔若蘭。應(yīng)用帶滌綸環(huán)雙腔導(dǎo)管經(jīng)鎖骨下靜脈建立長期血透通路，生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2001，5(1):2728)，有時最高可達50mg/ml。雖然高濃度肝素鈉具有很好的抗凝作用，但是對于肝素鈉過敏、有自發(fā)出血傾向、血液凝固遲緩者及嚴重肝功能不全者不適用，而枸櫞酸鈉一般在三羧酸循環(huán)中可以完全氧化代謝，一旦出現(xiàn)低血鈣癥狀可以靜注葡萄糖酸鈣及時糾正，且從本試驗結(jié)果可以看出封管用枸櫞酸鈉注射液的體外抗凝效果總體上優(yōu)于肝素鈉注射液。另外，封管用枸櫞酸鈉注射液為高濃度枸櫞酸鈉溶液，本身有較好抗菌作用(DograGK，HersonH，HutchisonB，etal.Preventionoftunneledhemodialysiscatheter-relatedinfectionsusingcatheter-restrictedfillingwithgentamicinandcitrate:Arandomizedcontrolledstudy.JAmSocNephrol,2002，13:2133-2139)。因此，封管用枸櫞酸鈉注射液更適合于靜脈留置導(dǎo)管的封管。下面以該枸櫞酸鈉注射液的有關(guān)藥理實驗為例，詳細闡述該枸櫞酸鈉注射液的抑菌作用。評價封管用枸櫞酸鈉注射液的體外抑菌作用，并與肝素鈉注射液作用進行比較。采用瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法測定封管用枸櫞酸鈉注射液對204株標準及臨床分離菌的最低抑菌濃度(簡稱MIC)，以瓊脂打洞擴散法與目前臨床使用的肝素鈉封管液進行抑菌效果比較。封管用枸櫞酸鈉注射液對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及白色念珠球菌的MIC范圍分別為3.6~29.2mg/ml、3.614.6mg/ml、116.8~233.5mg/ml、58.4~116.8mg/ml及29.2~58.4mg/ml;抑菌圈直徑分別為2.6cm、2.8cm、1.2cm、4.4cm及2.4cm,而肝素?zé)o抑菌圈。封管用枸櫞酸鈉注射液對留置導(dǎo)管感染常見病原菌具有良好的抑菌作用，有望成為替代肝素的新一代理想封管液。枸櫞酸鈉一直被人們只當作抗凝劑在臨床中使用，而有研究表明，當枸櫞酸鈉的濃度大于20%時就成為具有抑菌活性的抗凝血劑，用做封管液可以減少導(dǎo)管感染、閉塞及延長導(dǎo)管壽命(DograGK，HersonH，HutchisonB，etal.Preventionoftunneledhemodialysiscatheter-relatedinfectionsusingcatheter-restrictedfillingwithgentamicinandcitrate:Arandomizedcontrolledstudy.JAmSocNephrol,2002,13(8):2133—2139)。導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥的主要病原菌為革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌與真菌(陳秀蘋，任葦，項領(lǐng)，導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥臨床及病原學(xué)分析，中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16(2):159-160)，我們從中挑選了金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及白色念珠球菌5種較為常見的病原菌作為試驗對象，對封管用枸櫞酸鈉注射液進行了體外抑菌試驗，報道如下。1.材料與方法1.1試驗菌株金黃色葡萄球菌標準株(ATCC25923)，大腸桿菌標準株(ATCC25922)，綠膿桿菌標準株(ATCC27853)，金黃色葡萄球菌47株(臨床分離菌株)，表皮葡萄球菌48株(臨床分離菌株)，大腸桿菌47株(臨床分離株)，綠膿桿菌34株(臨床分離株)，以上菌株均由長征醫(yī)院呼吸科實驗室提供；白色念珠球菌25株(臨床分離菌株)，由長征醫(yī)院皮膚科實驗室提供。1.2培養(yǎng)基MH瓊脂(上海市疾病預(yù)防控制中心，中國腹瀉病控制上海試劑供應(yīng)研究中心，批號20060515)，MH肉湯(上海市疾病預(yù)防控制中心，中國腹瀉病控制上海試劑供應(yīng)研究中心)。1.3實驗儀器恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，麥氏比濁管(法國梅里埃公司)。1.4實驗藥品封管用枸櫞酸鈉注射液Gml:1.4g，自制，批號20051024)，肝素鈉注射液(2ml:12500單位，常州千紅生化制藥有限公司，批號060608)。1.5菌液的制備經(jīng)麥氏管比濁，用生理鹽水將菌苔配成lXl()Scfu/ml。1.6實驗方法1.6.1最低抑菌濃度(簡稱MIC)測定采用瓊脂稀釋法與肉湯稀釋法結(jié)合測定MIC(葉應(yīng)嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].南京東南大學(xué)出版社，1997，562-564;周庭銀，趙虎.臨床微生物學(xué)診斷與圖解.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001，34-35)。1.6.1.1瓊脂稀釋法將用蒸餾水對藥物進行對倍稀釋后的滅菌藥液加入融化并經(jīng)121。C高壓滅菌15min，冷至50。C左右的定量MH瓊脂中，制成含藥量分別為116.8，58.4，29.2，14.6，7.3，3.7，1.8，0.91，0.45，0.24mg/ml不同遞減濃度藥物的平板，接種待測菌，35'C孵育24h，無細菌生長的最低藥物濃度為測試菌的MIC。1.6.1.2肉湯稀釋法在肉湯中將藥物進行對倍稀釋后，制成含藥量分別為233.5，116.8mg/ml等一系列的無菌藥物培養(yǎng)基，每管中加入待檢菌菌液100y1，35"C培養(yǎng)箱中孵育24h，藥物最低濃度管無細菌生長者即為待檢菌的最低抑菌濃度。1.6.2瓊脂打洞擴散法用無菌棉拭蘸取校正后的試驗菌菌液(lX108cfu/ml)，在試管壁上擠壓幾次，壓去多余的菌液，分別均勻密集涂布于瓊脂平板，反復(fù)數(shù)次，每次旋轉(zhuǎn)平板6(T，使整個平板涂布均勻，用無菌8mm孔徑打孔器打孔，然后每孔各加受試物200pl，平放于35'C溫箱中培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，以孔周圍完全不長菌區(qū)測量抑菌圈直徑，記錄抑菌圈直徑的平均值。2結(jié)果2.1封管用枸櫞酸鈉注射液對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及白色念珠球菌的MIC范圍分別為58.47.3mg/ml、29.2~7.3mg/ml、233..5-116.8mg/ml、233.5~58.4mg/ml與58.429.2mg/ml。其詳細分布見表14。表14、封管用枸櫞酸鈉注射液對204株實驗病原菌的MIC分布(mg/ml)菌株數(shù)MIC233.5116.858.429.214.67.3金黃色葡萄球菌(標準株)11金黃色葡萄球菌(臨床分離株)47113312表皮葡萄球菌(臨床分離株)4833132大腸桿菌(標準株)11大腸桿菌(臨床分離株)47839綠膿桿菌(標準株)11綠膿桿菌(臨床分離株)342302白色念珠球菌(臨床分離株)253222.2封管用枸櫞酸鈉注射液在金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及白色念珠球菌的平皿上均有較大的抑菌圈，而肝素鈉注射液無抑菌圈。抑菌圈直徑詳見表15。表15、封管用枸櫞酸鈉注射液與肝素鈉注射液抑菌效果比較抑菌圈直徑(cm)封管用枸櫞酸鈉注射液肝素鈉注射液金黃色葡萄球菌(標準株)2.60金黃色葡萄球菌(臨床分離株)2.60表皮葡萄球菌(臨床分離株)2.80大腸桿菌(標準株)1.20大腸桿菌(臨床分離株)1.20綠膿桿菌(標準株)4.40綠膿桿菌(臨床分離株)4,40白色念珠球菌(臨床分離株)2.403.討論枸櫞酸鈉雖然有抑菌作用但是不同于抗生素，只有當其濃度較高時才有抑菌作用，本試驗中測定MIC的方法參照細菌對抗菌藥物的敏感試驗方法，但由于枸櫞酸鈉含量較高的瓊脂平板會出現(xiàn)沉淀，所以對于MIC較高的大腸桿菌和綠膿桿菌采用肉湯稀釋法進行測定。從本試驗結(jié)果可以看出，48株金黃色葡萄球菌中有68.8y。的菌株MIC為14.6mg/m1,48株表皮葡萄球菌中有70.8。/。的菌株MIC為29.2mg/ml，48株大腸桿菌中有83.3。/。的菌株MIC為116.8mg/ml，35株綠膿桿菌中有88.6n/。的菌株MIC為116.8mg/ml，25株白色念珠球菌中有88。/。的菌株MIC為29.2mg/ml;封管用枸櫞酸鈉注射液在上述5種菌的平皿上均有較大的抑菌圈，而肝素鈉注射液無抑菌圈，表明封管用枸櫞酸鈉注射液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的標準菌株及臨床分離菌株，表皮葡萄球菌與白色念珠球菌的臨床分離菌株生長均有良好的抑制作用而肝素鈉注射液無抑菌作用，這一結(jié)果與國外文獻(WeijmerMC，Debets-OssenkoppYJ，vandeVondervoortFJ，etal.Superiorantimicrobialactivityoftrisodiumcitrateoverheparinforcatheterlocking.N印hrolDialTransplant,2002，17(12):2189—2195)報道一致。對于需要長期透析的患者，經(jīng)常采用插入靜脈留置導(dǎo)管的方法避免每次透析的不便，然而導(dǎo)管感染成為了重要障礙，一旦發(fā)生感染就易引發(fā)菌血癥。本試驗選用的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌與白色念珠球菌為留置導(dǎo)管感染中革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌中最為常見病原菌代表。目前臨床上常用的肝素鈉注射液沒有抑菌作用，許多醫(yī)院為防止插管感染，在封管液中加入抗生素，但是抗生素可通過導(dǎo)管滲漏入血，如長期使用使患者暴露于抗生素中會產(chǎn)生細菌耐藥。而封管用枸櫞酸鈉注射液可以有效抑制上述細菌的生長，即使有少量滲漏于血液中也會通過三羧酸循環(huán)代謝至正常水平，故封管用枸櫞酸鈉注射液相對于肝素鈉注射液安全有效，可以作為新一代封管液更好的服務(wù)于臨床。下面通過該枸櫞酸鈉注射液的溶血性試驗，探討該枸櫞酸鈉注射液的安全性。觀察兩種配方封管用枸櫞酸鈉注射液在體外對新西蘭大白兔有無溶血、凝集作用。依照《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，取規(guī)定量受試藥加入2%兔血生理鹽水混懸液中，觀察溶血和凝集情況，并用分光光度計測定吸光度值，計算溶血率。I型封管用枸櫞酸鈉注射液(含枸櫞酸0.3%)與II型封管用枸櫞酸鈉注射液(含枸櫞酸4%)在藥物濃度10%時的溶血率分別為3.3%與13.4%,在藥物濃度2%時的溶血率分別為1.1%與8.3%。含枸櫞酸0.3%的封管用枸櫞酸鈉注射液對兔紅細胞無明顯溶血和凝集現(xiàn)象，溶血率小于5%，符合注射劑要求；而含枸櫞酸4%的封管用枸櫞酸鈉注射液的溶血率大于5%，靜脈注射會有溶血傾向。封管用枸櫞酸鈉注射液在臨床上用于靜脈留置導(dǎo)管的封管，會有少量藥液流入患者靜脈內(nèi)。本文依照《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(國家食品藥品監(jiān)督管理局《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組，《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，2005年3月)，對兩種封管用枸橡酸鈉注射液進行溶血性試驗。1.材料與方法1.1試驗對象新西蘭大白兔，雌雄不限，2.5土0.5kg，購于第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心。1.2受試藥物I型封管用枸櫞酸鈉注射液(3ml:1.4g，含枸櫞酸0.3%，pH7.0，自諾ij，批號20051024)，II型封管用枸櫞酸鈉注射液(3ml:1.4g，含枸櫞酸4%，pH5.6，自制，批號20060823)。1.3儀器離心沉淀機(上海飛鴿牌Anke80-2C);DK-8AD型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)；UV1100分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。表16、封管用枸櫞酸鈉注射液溶血試驗加藥一覽表試管編號12345672n/。紅細胞懸液(ml)2.52.52.52.52.52.52.5生理鹽水(ml)2.02.12.22.32.42.5蒸餾水(ml)2.5受試物(ml)0.50.40.30.20.1表17、溶血判斷標準結(jié)果表現(xiàn)全溶血溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留部分溶血溶液呈澄明紅色或棕色，管底有少量紅細胞殘留無溶血紅細胞全部下沉，上清液體無色澄明凝集溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散1.4實驗步驟取新西蘭大白兔3只，每只心臟穿刺取血lOml，分別置燒杯中用玻璃棒攪拌去除纖維蛋白，然后加入10倍量的生理鹽水，搖勻，離心15min(1000r/min)，去除上清液，沉淀的紅細胞再加入生理鹽水按照上述方法洗滌2次，上清液不顯紅色。將所得紅細胞按其容積，用生理鹽水稀釋成2%的混懸液，供試驗用。取潔凈試管14支，分成兩組，按照17順序編號，15號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按表16所示依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉溶液或蒸餾水，混勻后，立即置37土0.2。C的恒溫箱中進行溫育，分別于第15min、30min、45min、lh、2h和3h觀察各試管是否有溶血或凝集現(xiàn)象，判斷標準見表17。2.結(jié)果1號~6號管溶液中紅細胞全部下沉，上層液體無色澄明，表明封管用枸櫞酸鈉注射液和生理鹽水無溶血及紅細胞凝集現(xiàn)象，而7號管內(nèi)液體紅色澄明，管底無細胞殘留，表明全部溶血，結(jié)果詳見表18。表18、封管用枸櫞酸鈉注射液溶血試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表中一無溶血+全溶血。陰性對照為生理鹽水；陽性對照為蒸餾水。將各管溶液置入干燥離心管中離心10min(1500r/min)，取上清液在分光光度計545nm處，以蒸餾水為空白，測定吸光度，按照下面公式計算溶血率，結(jié)果詳見表19。溶血率(％)=(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)(ODt為試驗管吸光度；ODnc為陰性對照管吸光度；ODpc為陽性對照管吸光度)表19、封管用枸櫞酸鈉注射液1~5號管溶血率(％)(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>3.討論正常情況下人的血液pH值為7.357.45，理論上近中性制劑與血液具有良好的相容性。由于枸櫞酸鈉溶液呈堿性(pH10，47%)，因此采用枸櫞酸來調(diào)節(jié)枸櫞酸鈉注射液的pH值。本研究對兩種pH的枸櫞酸鈉注射液的溶血性進行比較，含枸櫞酸0.3%的枸櫞酸鈉注射液(pH7.0)近中性，含枸櫞酸4%的枸櫞酸鈉注射液(pH5.6)呈酸性。試驗采用體外兔血法對比兩種枸櫞酸鈉注射液的溶血和凝集作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含枸櫞酸4%的枸櫞酸鈉注射液的溶血率高于含枸櫞酸0.3%的枸櫞酸鈉注射液，表明枸櫞酸鈉注射液在pH偏酸性時有溶血率傾向。為進一步證實上述推斷，另設(shè)計試驗比較4%枸櫞酸溶液與4%枸櫞酸鈉溶液的溶血情況，結(jié)果肉眼觀察到4%枸櫞酸溶液15號管溶液呈棕色，表示部分溶血，而4%枸櫞酸鈉溶液1~5號管溶液無溶血。因此，枸櫞酸鈉注射液的pH擬調(diào)至近中性，以增加制劑的安全性。本試驗中I型封管用枸櫞酸鈉注射液對兔紅細胞無明顯溶血和凝集現(xiàn)象，溶血率小于5%，符合注射劑要求；而11型封管用枸櫞酸鈉注射液的溶血率大于5%，靜脈注射有溶血傾向。下面以該枸櫞酸鈉注射液的幾個典型配方為例，詳細闡述該枸櫞酸鈉注射液的穩(wěn)定性。1、依據(jù)中國藥典2005年版二部附錄藥物穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則。2、儀器pHS-3型酸度計(上海第二分析儀器廠);DZF-1型真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；DZ-60型電熱恒溫真空干燥箱(上海療器械七廠)；DG-1多功能恒溫箱；Waters高效液相色譜系統(tǒng)(600Epump,600controllor,996PDA,Millennium32軟件系統(tǒng))；申江SC680一B型澄明檢測儀(上海黃海藥檢儀器廠)。3、材料及試藥醫(yī)藥用安瓿(上海宜錦玻璃廠，生產(chǎn)批號021022);三批46.7%封管用枸櫞酸鈉注射液(玻璃安瓿，自制，3ml，批號分別為040727、050120、050221)4、方法長期試驗將三批制劑置于溫度25X:土2'C條件下放置12個月，分別于O、3、6、12個月取樣檢測。5、考察項目性狀、含量、pH值、可見異物、有關(guān)物質(zhì)、無菌。6、含量測定方法精密稱取枸櫞酸鈉23.35mg至50ml容量瓶中，加水至全量作為對照品溶液；精密量取樣品lml至100ml容量瓶中，加水至全量作為供試品溶液；采用HPLC方法測定枸櫞酸鈉含量。色譜條件固定相WatersSYMMETRYCi8柱(250mmx4.6mm5nm);流動相O.01mmol/L磷酸二氫鉀-甲醇(95:5)，流速l.Oml/min;檢測波長210nm;柱溫23。C;進樣量20ul。見圖3(枸櫞酸鈉對照品HPLC圖)、圖4(供試品HPLC圖)。7、結(jié)果長期試驗結(jié)果經(jīng)室溫條件下6個月考察，三批制劑的性狀均未發(fā)生改變，仍為無色澄明液體；無菌檢測均合格；微粒檢測均合格；從封管用枸櫞酸鈉注射液(25°C±2°C，12個月)HPLC色譜圖上(見圖5)看未見有關(guān)物質(zhì)；pH值與含量詳見表20。表20、三批制劑長期試驗中各項目考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>8、討論①封管用枸櫞酸鈉注射液的穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，封管用枸櫞酸鈉注射液穩(wěn)定性良好，對光反應(yīng)不敏感，其安瓿制劑可以不用避光保存，12個月內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。②從長期試驗情況看，安瓿封管用枸櫞酸鈉注射液在25'C土2。C儲存12個月內(nèi)穩(wěn)定。③本試驗結(jié)果表明，封管用枸櫞酸鈉注射液(玻璃安瓿)在室溫下保存12個月是穩(wěn)定的。下面以幾個典型的劑型為例，詳細闡述該枸櫞酸鈉注射液各種劑型的具體制備方法。本發(fā)明制備粉針劑一般采用常規(guī)的冷凍干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取該枸櫞酸鈉注射液，加入賦形劑，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，灌裝，半軋塞，冷凍干燥，壓塞軋蓋即可。所用的賦形劑選自甘露醇、水解明膠、葡萄糖、乳糖或右旋糖苷等中的一種或幾種。每瓶含該枸櫞酸鈉注射液10~100mg。本發(fā)明制備粉針劑也可采用噴霧干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取該枸櫞酸鈉注射液，加或不加賦形劑(賦形劑同上)，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，噴霧干燥，無菌分裝，壓塞軋蓋即可。每瓶含該枸櫞酸鈉注射液10~100mg。本發(fā)明制備小針劑時，以注射用水作為溶媒配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸節(jié)酯或二甲基乙酰胺等中的一種或幾種。每支含該枸櫞酸鈉注射液10~100mg。該枸櫞酸鈉注射液的急性毒性試驗(枸櫞酸鈉注射液尾靜脈注射對小鼠的急性毒性試驗)本試驗通過以1:0.85的等比梯度給小鼠尾靜脈注射給予4.50%、3.83%、3.25%、2.76%、2.35%、2.00。/。枸櫞酸鈉注射液10ml/kg體重，觀察其對小鼠的急性毒性。試驗結(jié)果表明，以1:0.85的等比梯度給小鼠尾靜脈注射給予4.50%、3.83%、3.25%、2.76%、2.35%、2.00%枸櫞酸鈉注射液10ml/kg體重后,十四天內(nèi)的死亡率分別為100%、80%、70%、30%、10%、0。因此，小鼠對枸櫞酸鈉注射液的半數(shù)致死量(LD5Q)為0.305g/kg體重。試驗?zāi)康挠^察枸櫞酸鈉注射液給小鼠尾靜脈注射后產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及其嚴重程度，并觀察小鼠在給藥后14天內(nèi)的死亡情況，考察枸櫞酸鈉注射液對小鼠的急性毒性，為臨床安全用藥及監(jiān)測提供參考，也為該制劑其它毒性試驗的劑量選擇提供依據(jù)。設(shè)計依據(jù)試驗嚴格按照2005年國家藥品監(jiān)督管理局新審定的化學(xué)藥物急性毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則進行。根據(jù)枸櫞酸鈉注射液在臨床應(yīng)用的給藥途徑為靜脈注射，試驗選擇對小鼠進行尾靜脈注射給藥。小鼠給藥后觀察14天，記錄其毒性反應(yīng)、體重變化及死亡情況。受試藥物名稱47%枸櫞酸鈉注射液批號050125理化性質(zhì)無色透明溶液貯存條件室溫避光密閉保存質(zhì)量250ml包裝輸液袋提供單位上海長征醫(yī)院配制方法生理鹽水稀釋至所需濃度試驗動物種屬遠交系ICR小鼠性別雌雄各半年齡6~8周體重18-22克數(shù)量60只，雌雄各半來源上海第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，清潔級，動物合格證號SCXK(滬)2002—0006;飼養(yǎng)上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院動物房，合格證號醫(yī)動字第02—64號；給藥前12小時禁食，自由飲水；給藥后2小時自由飲食。試驗方法給藥途徑尾靜脈注射容量10ml/kg體重劑量共分為六組，以1:0.85的等比梯度給小鼠單次尾靜脈注射4.50%、3.83%、3.25%、2.76%、2.35%、2.00。/。枸櫞酸鈉注射液10ml/kg體重。觀察指標觀察給藥后14天內(nèi)小鼠的中毒及死亡情況，未死亡小鼠于第14天稱重后處死，解剖，肉眼及顯微鏡檢査各臟器是否有病變。統(tǒng)計方法LD50求算軟件(bliss法)結(jié)果ICR小鼠單次尾靜脈注射給予4.50%、3.83%、3.25%、2.76%、2.35%、2.00%枸櫞酸鈉注射液10ml/kg體重后，十四天內(nèi)的死亡率分別為100%、80%、70%、30%、10%、0(表21)，14天后解剖給藥小鼠，肉眼檢査未見臟器有明顯病理改變。表21、ICR小鼠單次尾靜脈注射給予不同濃度枸櫞酸鈉注射液10ml后死亡情況<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>結(jié)論60只ICR小鼠尾靜脈注射給予4.50。/。、3.83%、3.25%、2.76%、2.35%、2.00%枸櫞酸鈉注射液10ml/kg后，十四天內(nèi)的死亡率分別為100%、80%、70%、30%、10%、0。因此，小鼠對枸櫞鈉注射液尾靜脈注射的半數(shù)致死量(LD5Q)為0.305g/kg體重，LD5Q(Feiller校正)95。/。的可信限^.2790.334g/kg體重。該枸櫞酸鈉注射液對大鼠的長期毒性試驗根據(jù)美國化學(xué)會在2001年6月20日對美國高產(chǎn)量化學(xué)品評估資料中顯示，枸櫞酸鈉對哺乳類動物行單劑量多次給藥，沒有不利的副作用發(fā)生。此外，發(fā)明人已研究該封管用枸櫞酸鈉注射液多年，且本發(fā)明在臨床使用2年多時間、約500人次，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，未見明顯不良反應(yīng)。以上都證明和證實了本發(fā)明用于血液透析中的體外局部抗凝是安全的。在本發(fā)明中，以上所述的具體實施方式和以下所述的實例均是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制發(fā)明的范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作詳細描述。實施例i、該封管用枸櫞酸鈉注射液的制備根據(jù)處方，按稱量SOP稱取原料；取適量熱注射用水，加入枸櫞酸鈉、枸櫞酸攪拌溶解，加注射用水至全量，攪勻；脫炭過濾用板框過濾器，濾材為微孔濾膜，孔徑1.2nm、0.8ym;終端過濾用微孔濾盤，濾材為微孔濾膜，孔徑0.65um;中間品質(zhì)控含量含量為標示量的97.0%-103.0%，pH值6.8-7.5;灌裝；檢査封口;溫度110。C，時間20分鐘，熱壓滅菌；置安瓿于光照度2000-3000LX的澄明度檢測議前，用目檢視，按澄明度檢査要求進行，燈檢人員視力應(yīng)為5.0以上,無色盲；檢漏，剔除有藥液滲漏、漏氣及有異物的產(chǎn)品，成品澄明度應(yīng)符合藥典規(guī)定；包裝合格的檢品按要求貼簽并裝入5支裝紙盒，點檢裝箱。實施例2、該封管用枸櫞酸鈉注射液臨床應(yīng)用1研究47%枸櫞酸鈉溶液對血液透析患者長期留置導(dǎo)管封管的效果。選擇尿毒癥維持透析長期留置導(dǎo)管患者40例，隨機分為枸櫞酸試驗組20例，肝素對照組20例。每次透析結(jié)束后試驗組以47%枸櫞酸鈉溶液封管，對照組以肝素鈉溶液封管，均連續(xù)使用6月，記錄用藥前6月及用藥6月導(dǎo)管通暢情況，觀察導(dǎo)管相關(guān)感染情況。在用藥前和用藥l月、3月及6月末，抽取動、靜脈端封管液進行細菌培養(yǎng)。測定患者用藥前、及用藥2周及6月后透前電解質(zhì)。試驗組導(dǎo)管不通暢率和導(dǎo)管感染率均顯著低于用藥前及對照組(p0.05)。用藥前后兩組電解質(zhì)均無顯著變化。試驗組用藥后1月血培養(yǎng)陽性率即開始下降，3月后顯著低于用藥前及對照組。封管用枸櫞酸鈉溶液對長期留置導(dǎo)管進行封管可提高導(dǎo)管通暢率，降低導(dǎo)管相關(guān)感染率，不良反應(yīng)少，操作方便，適合長期使用。o試驗?zāi)康难芯?7%枸櫞酸鈉溶液對血液透析患者長期留置導(dǎo)管封管的效果，并與肝素鈉溶封管作對比觀察。D—般資料及病例選擇選擇尿毒癥維持透析長期留置導(dǎo)管患者40例，男性16例，女性24例，年齡30S5歲，透析齡1145月，導(dǎo)管留置時間1月5年，既往均以肝素封管。隨機分為枸櫞酸試驗組20例，肝素對照組20例。D試驗方法1、給藥方法和劑量試驗組每次透析結(jié)束后以47%枸櫞酸鈉溶液(自制)按照管腔容量注入留置導(dǎo)管動脈端和靜脈端管腔。對照組每次透析結(jié)束后以肝素鈉溶液(2mg/ml)按照管腔容量注入留置導(dǎo)管動脈端和靜脈端管腔。兩組均連續(xù)使用6月。2、臨床觀察指標記錄患者用藥前6月及用藥6月每次血透導(dǎo)管通暢情況，觀察導(dǎo)管相關(guān)感染情況。在用藥前和用藥l月、3月及6月末，抽取動、靜脈端封管液進行細菌培養(yǎng)。測定患者用藥前、及用藥2周、6月后透前電解質(zhì)?？诮y(tǒng)計學(xué)方法計量資料以；士s表示，采用,檢驗，計數(shù)資料采用f檢驗。n試驗結(jié)果1、療效分析試驗組和對照組患者的性別、年齡、透析齡、導(dǎo)管留置時間經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢査均無顯著性(P>0.05)，表明兩組構(gòu)成均衡，具有可比性。試驗組用藥前6月共行血透1440例次，用藥后6月共行血透1448例次，對照組用藥前6月共行血透1466例次，用藥后6月共行血透1462例次。試驗組導(dǎo)管不通暢例次和導(dǎo)管感染次數(shù)均顯著低于用藥前及對照組用藥后(p<0.05)。用藥前后兩組電解質(zhì)均無顯著變化。試驗組用藥后1月血培養(yǎng)陽性率即開始下降，顯著低于用藥前及對照組，6月后全陰性。主要觀察結(jié)果見表22、表23。2.藥物的不良反應(yīng)試驗組中有28例次(1.93%)用藥后出現(xiàn)不同程度口唇麻木癥狀，其中20例次數(shù)分鐘后自行緩解，8例次給予10。/。葡萄糖酸鈣10ml靜推后緩解。無其他嚴重不良反應(yīng)。表22、用藥前后各觀察指標變化試驗組對照組用藥前用藥后用藥前用藥后導(dǎo)管不通暢例次(％)206(14.3)95(6.6)*A196(13,4)182(12.4)導(dǎo)管感染次數(shù)(％)7(35)1(5)*A6(30)5(25)血清鈉(mmol/L)139.6±3,8141.5±2.6137.9±3.1140.1±3.5血清轉(zhuǎn)(mmol/L)2.35士0.172.31±0.202.29士0.212.33±0.18C02CP(mmol/L)21.7±2.923.6±3.422.8±4.222.1±3.3*/K0.05ra試驗組用藥前；A戶0.05w對照組用藥后表23、血培養(yǎng)陽性率治療前(％)用藥1月(％)用藥3月(％)用藥6月(％)試驗組5(25)1(5)*△1(5)*△。*△對照組5(25)5(25)6(30)4(20)*/<0.05w用藥前；A/K0.05w對照組d討論在血液透析血管通路中，長期留置導(dǎo)管是血管條件差而無法建立內(nèi)瘺患者較好的替代方法。隨著插管及護理技術(shù)的成熟，長期留置導(dǎo)管的使用壽命不斷延長，并發(fā)癥逐漸減少，但仍存在血栓或纖維蛋白鞘導(dǎo)致的導(dǎo)管不通暢及導(dǎo)管感染等問題，嚴重時可影響患者透析效果及導(dǎo)管使用期限。留置導(dǎo)管傳統(tǒng)的封管方法采用肝素溶液，這種方法對部分高凝狀態(tài)患者導(dǎo)管抗凝效果差，并且無預(yù)防感染作用。本研究采用47%枸櫞酸鈉溶液對長期留置導(dǎo)管進行封管，觀察其抗凝及預(yù)防感染作用，取得了較好療效。枸櫞酸鈉可結(jié)合血中的鈣離子，起到抗凝作用，目前在血液透析的抗凝中得到了深入開展。此外，枸櫞酸鈉是一種強堿，具有一定的抗菌作用。20世紀90年代末期歐洲學(xué)者開始將低濃度(3%~10%)枸櫞酸鈉溶液聯(lián)合或不聯(lián)合抗生素應(yīng)用于透析導(dǎo)管的封管并取得了一定效果(SodemannK,PolascheggHD，F(xiàn)eldmerB.Twoyears'experiencewithDialockandCLS(anewantimicrobiallocksolution).BloodPurif,2001,19(2):251254;MeeusQKuypersDR,ClaesK,etal.Aprospective,randomized,double-blindcrossoverstudyontheuseof5%citratelockversus10%citratelockinpermanenthemodialysiscatheters.BloodPurif,2005，23(2):101~105)，通暢率提高，導(dǎo)管相關(guān)感染率下降。本研究采用高濃度枸櫞酸鈉溶液封管，觀察到導(dǎo)管不通率從14.3%下降至6.6%，導(dǎo)管相關(guān)感染率從35%下降至5%,療效顯著。由于枸櫞酸鈉溶液可結(jié)合鈣離子，故可引起患者發(fā)生低鈣血癥，出現(xiàn)麻木、抽搐、心律失常等癥狀。文獻報道應(yīng)用枸櫞酸封管不良反應(yīng)發(fā)生率較低(DograGK,HersonH,HutchisonB,etal.Preventionoftunneledhemodialysiscatheter-relatedinfectionsusingcatheter-restrictedfillingwithgentamicinandcitrate:arandomizedcontrolledstudy.JAmSocNephrol,2002,13(8):2133~2139)。本研究中試驗組不良反應(yīng)發(fā)生率為1.93%,均為不同程度的口唇麻木癥狀，大部分患者可自行緩解，少部分患者補充鈣劑后亦很快緩解，逐步減少封管液用量或減慢推注速度后均未再發(fā)生。無一例發(fā)生抽搐、心律失常等嚴重癥狀。電解質(zhì)測定顯示用藥后血鈉、血鈣、C02CP等無明顯改變。故47%枸櫞酸鈉溶液用于長期導(dǎo)管封管具有較佳的安全性，適合患者長期使用。o結(jié)論47%枸櫞酸鈉溶液對長期留置導(dǎo)管進行封管可提高導(dǎo)管通暢率，降低導(dǎo)管相關(guān)感染率，不良反應(yīng)少，操作方便，適合長期使用。實施例3、該封管用枸櫞酸鈉注射液臨床應(yīng)用2研究應(yīng)用30%枸櫞酸鈉注射液體外局部抗凝的安全可行性和效果，并與普通肝素抗凝對比觀察。選擇院內(nèi)有高危出血危相的血液透析患者60例，隨機分成兩組，分別用30%枸櫞酸鈉注射液和肝素注射液行體外局部抗凝，進行對照試驗。觀察比較其血液凈化效果和不良反應(yīng)。結(jié)果，肝素抗凝組有出血或原有出血加劇現(xiàn)象發(fā)生；枸櫞酸鈉組均順利完成治療單元，未觀察到出血或原有出血加劇征象。兩組患者平均血流速、總超濾量、置換量和透析器壽命的差異均無顯著性。枸櫞酸鈉組治療結(jié)束后，血清鈉、pH值高于對照組(P<0.05)，但均在正常范圍內(nèi)；其余生化指標在治療前后的差異無顯著性。結(jié)論高濃度枸櫞酸鈉抗凝對于搶救高出血風(fēng)險的危重患者具有很好的推廣應(yīng)用價值。o試驗?zāi)康难芯繎?yīng)用30%枸櫞酸鈉注射液體外局部抗凝的安全可行性和效果，并與肝素注射液作抗凝對比觀察。n—般資料及病例選擇在某醫(yī)院腎內(nèi)科選擇有高危出血危相的血液透析患者62例，隨機分成兩組，分別用30%枸櫞酸鈉和普通肝素體外局部抗凝，進行對照試驗。62例患者中，男性36例，女性26例，平均年齡為48.6歲。病因慢性腎小球腎炎20例，高血壓4例，糖尿病4例，多囊腎4例，類風(fēng)關(guān)2例，急進性腎炎并^^部感染、咯血性痰3例，肝移植術(shù)后3例，骨髓瘤化療后全血細胞減少3例，急性淋巴細胞性白血病化療后2例，腎綜合征出血熱2例，心肌梗死經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)后急性腎功能衰竭l例，腹主動脈瘤術(shù)后失血性休克l例，嗜鉻細胞瘤術(shù)后膿胸l例，多發(fā)傷1例，其他3例。高危出血情況內(nèi)瘺術(shù)后10例，腎移植和腎切除術(shù)后8例，消化道出血7例，多臟器衰竭4例，腦出血3例，月經(jīng)過多2例，慢性腎功能衰竭合并顱內(nèi)出血7例，急性腎功能衰竭17例，其他手術(shù)后4例。n試驗方法1.給藥方法和劑量抗凝劑從Prisma床旁血濾機配套管路的抗凝管輸入。血液凈化參數(shù)設(shè)置血流量120180ml/min，透析液流速10001500ml/h，置換液流速15002000ml/h。根據(jù)患者的病情、液體平衡情況來決定超濾率，變動范圍較大(50~500ml/h)。CVVHDF治療以72h為一個治療單元。試驗組采用30%枸櫞酸鈉注射液作抗凝劑，應(yīng)用微量輸液泵精確控制30%枸櫞酸鈉溶液的流速，根據(jù)血液流速、患者血紅蛋白含量等因素進行調(diào)節(jié)，流速維持于2030mmol/h。同時在患者外周靜脈持續(xù)輸入葡萄糖酸鈣溶液，流速約為4mmol/h，并根據(jù)血鈣濃度調(diào)節(jié)流速。對照組采用肝素注射液抗凝劑，使用機器原有的肝素泵，初始劑量為7501500U，維持劑量為375750U。2.臨床觀察指標(1)臨床指標監(jiān)測患者血壓、脈搏、呼吸及原有病情的變化、出血情況，記錄透析參數(shù)。每12小時以生理鹽水沖管路1次，注意血濾器有無凝血，對有輕微紅細胞聚積者給予加強沖洗。(2)凝血指標測血濾器前與患者體內(nèi)血標本的APTT值。枸櫞酸鈉組血濾器前APTT值控制在較正?；A(chǔ)值延長40%~180%，肝素抗凝組控制在較正?；A(chǔ)值延長40%120%。根據(jù)抗凝的目標值調(diào)整抗凝劑的劑量。(3)血生化指標在CVVHDF治療前及治療中，每4小時測定1次患者的腎功能、血清電解質(zhì)、動脈血氣分析。根據(jù)血生化指標的情況，調(diào)節(jié)各種電解質(zhì)、酸堿的補充速度?？谠囼灲Y(jié)果60例患者治療過程中生命體征平穩(wěn)，未發(fā)生明顯低血壓、休克。肝素抗凝組在治療中共有18例次發(fā)生出血或原有出血加劇，進一步減少肝素用量后，仍有10例出血癥狀無改善，予魚精蛋白中和后退出肝素抗凝組，其中6例改用高濃度枸櫞酸鈉抗凝。枸櫞酸鈉組均順利完成治療單元(包括6例小劑量肝素抗凝不能耐受而轉(zhuǎn)行枸櫞酸鈉抗凝的患者)，治療過程中未觀察到出血或原有出血加劇征象。4例患者治療34h時訴指尖、嘴唇麻木，測血鈣偏低，予加快補鈣速度后迅速緩解。兩組患者平均血流速、超濾量、置換量和透析器壽命的差異均無顯著性(P〉0.05)，見表24。定期生理鹽水沖洗管路過程中，可見枸櫞酸鈉組在血濾器的兩端、壓力壺等部位較易形成細片狀的紅細胞集聚，通過加強沖洗后可明顯減輕紅細胞集聚程度，對透析器的壽命和透析效率亦無明顯影響。兩組患者透析過程中，血濾器前血標本APTT平均值分別為(42.1士2.5)和(45.8士2.4)S，體內(nèi)血標本的APTT平均值分別為(42.4士4.3)和(31.5土3.3)S，正常對照為(31.0士1.5)S。兩組患者透析前、后的血清生化指標比較見表25。表24、兩組CVVHDF參數(shù)和血濾器壽命比較<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表25、兩組血生化指標比較<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>與同組治療前比較，<0.01,，<0.05;與肝素抗凝組治療后比較P<0.05口討論本研究為高出血風(fēng)險的危重患者行CVVHDF治療中使用30。/。高^i度枸櫞酸鈉抗凝，并與邊緣肝素化抗凝的患者進行比較，結(jié)果顯示枸櫞酸鈉組患者在安全性方面占優(yōu)勢，體外抗凝效果理想且不增加體內(nèi)出血的風(fēng)險。肝素抗凝組中有發(fā)生出血或原有出血加劇現(xiàn)象，而枸櫞酸鈉組無一例發(fā)生出血，其中包括肝素抗凝出血退出治療的患者。檢測的客觀凝血指標滿意，血濾器前APTT值較基礎(chǔ)值延長45.4%，而體內(nèi)APTT值無明顯延長。透析器壽命、透析對毒素的清除效果也與肝素抗凝相似。高濃度枸櫞酸鈉(30%)與低濃度枸櫞酸鈉(多為4%左右)相比，其優(yōu)點為所需的抗凝劑容積較小，可減少大量抗凝劑輸入帶來的超濾壓力，也適應(yīng)商品化CRRT機較精細的抗凝劑管路。CVVHDF治療具有時間長、輸入的枸櫞酸鈉總量大、理論上更容易出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥的特點。為避免長時間枸櫞酸鈉抗凝造成的高鈉和代謝性堿中毒，使用低鈉、低碳酸氫根的透析液和置換液，用大置換量血液透析濾過模式來加強交換、促進鈉離子和碳酸氫根離子的清除。透析后枸櫞酸鈉組患者的血Na+、HCO—、pH值水平均較肝素抗凝組高，但均控制在正常范圍內(nèi)。同時，大置換量血液透析濾過模式可清除外周血中細胞因子等炎癥介質(zhì)，也有利于改善危重患者的整體病情。治療中監(jiān)測到部分患者血清鈣出現(xiàn)下降趨勢，通過加快外周血補鈣的速率仍可將血鈣控制在理想范圍。口結(jié)論對高危出血患者應(yīng)用高濃度枸櫞酸鈉在含鈣透析液中行常規(guī)血液透析是可行和安全的，可替代肝素起到抗凝作用，同時又可以避免由肝素帶來的不良反應(yīng)，具有很好的臨床推廣及應(yīng)用價值。權(quán)利要求1.封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，該封管用枸櫞酸鈉注射液包括枸櫞酸鈉35.0％～50.0％、pH調(diào)節(jié)劑0.1％～4.0％和增稠劑0.0％～20.0％，加溶劑至1000ml；其中，所述的pH調(diào)節(jié)劑是包括枸櫞酸、醋酸、酒石酸或乳酸中的一種或多種；所述的溶劑是包括水溶劑和非水溶劑中的一種；水溶劑主要是注射用水，非水溶劑是包括丙二醇、聚乙二醇或甘油中的一種或多種；所述的可用于注射劑的增稠劑是包括甘油、聚乙二醇或泊洛沙姆F68中的一種或多種，加入增稠劑的劑量范圍需要依據(jù)泊肅葉方程進行優(yōu)化和計算。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液中含枸櫞酸鈉45.0%50.0%;所述的pH調(diào)節(jié)劑是枸櫞酸或酒石酸中的一種或多種；所述的溶劑是水溶劑；所述的非水溶劑是包括丙二醇、聚乙二醇或甘油中的一種或多種；所述的可用于注射劑的增稠劑是甘油。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液中含枸櫞酸鈉49.0%或50.0%。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液中所述的pH調(diào)節(jié)劑是0.3%的枸櫞酸；所述的水溶劑是注射用水；所述的非水溶劑是聚乙二醇或甘油中的一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液中所述的可用于注射劑的增稠劑是15%的甘油。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液的配方與制備方法是枸櫞酸鈉467g、枸櫞酸3g，加注射用水至1000ml。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液的配方與制備方法是枸櫞酸鈉467g、枸櫞酸3g、甘油150g，加注射用水至1000ml。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液的配方與制備方法是枸櫞酸鈉467g、枸櫞酸3g，加乙醇至1000ml。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液篩選所使用的插管體外仿真血液流動模型是包括容器(1)、導(dǎo)管(2)、流量調(diào)節(jié)器(3)、水浴鍋(4)、燒杯(5)、導(dǎo)管(6)、恒流泵(7)、夾子(8)、三通接頭(9)和留置導(dǎo)管(10)，各部件按順序連接。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液篩選所使用的插管體外仿真血液流動模型中的導(dǎo)管(2)選用橡膠管，通過恒流泵(7)的導(dǎo)管(6)選用硅膠管；容器(1)是塑料桶，應(yīng)足夠大，最小容量應(yīng)滿足夜間流量；大燒杯(5)的容量應(yīng)盡量大，以保證在液體從上一容器導(dǎo)入后能與其中已加熱后的液體迅速混合后沒有明顯的溫度變化；恒流泵應(yīng)具有合適的流速范圍，塑料桶的容量與恒流泵的最大流速16ml/mm。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的封管用枸櫞酸鈉注射液，其特征在于，所述的該封管液篩選所使用的插管體外仿真血液流動模型中的塑料桶容量40L、橡膠管內(nèi)徑6mm、硅膠管內(nèi)徑6mm、大燒杯容量1000ml、靜脈留置導(dǎo)管(A1.0mlVl.lml)。12.封管用枸櫞酸鈉注射液在制備封管用產(chǎn)品中的應(yīng)用。13.封管用枸櫞酸鈉注射液的組合物在制備封管用產(chǎn)品中的應(yīng)用。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的封管用枸櫞酸鈉注射液的應(yīng)用，其特征在于，所述的封管用產(chǎn)品是指用于包括留置導(dǎo)管的能夠同時抗凝血和抗感染及相關(guān)病癥的產(chǎn)品；其中，所述的封管用產(chǎn)品是包括抗凝血與抗感染藥物、抗凝血與抗感染試劑、抗凝血與抗感染食品或抗凝血與抗感染飲料中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明涉及一種封管液枸櫞酸鈉注射液的配方及其制備方法和用途。本發(fā)明設(shè)計的體外中心靜脈插管仿真裝置設(shè)備簡單、成本低、仿真性好，為封管液的臨床前研究提供了體外篩選封管液的試驗裝置。篩選的該封管液具有防治凝血和抗感染雙重作用，藥理作用較強，療效確切，性質(zhì)穩(wěn)定，安全低毒，質(zhì)量可控，直接使用，作用更理想，克服了封管中凝血與感染兩大難題，避免了抗生素給患者帶來的不良影響，與同類產(chǎn)品相比具有顯著的優(yōu)勢。且原料來源豐富，制備工藝簡單，可行性強，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，易推廣應(yīng)用。隨著中末期腎衰患者數(shù)目的逐年增多，血液透析的需求量也會隨之上升，因此，本發(fā)明能夠在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。文檔編號A61L33/04GK101112627SQ200710093838公開日2008年1月30日申請日期2007年5月29日優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日發(fā)明者葉朝陽,純張,蓉樊,陳萬生申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)