專利名稱：與作為基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的rna相互補(bǔ)的寡核苷酸的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與作為基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA相互補(bǔ)的寡核苷酸的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在抗癌藥劑的傳統(tǒng)臨床研究中，首先是在I期臨床研究中確定該藥劑的毒性概況和最大推薦劑量，然后在II期臨床研究中應(yīng)用腫瘤縮小率作為效力標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)反應(yīng)率對(duì)該藥劑作為藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)。與此同時(shí)，隨著近幾年來癌生物學(xué)的研究進(jìn)展，具有抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和血管形成等新穎作用機(jī)理的藥物正處于被積極地探索和開發(fā)的過程中。對(duì)于這些新穎的抗癌藥劑，有可能不必要給予接近毒性劑量的最大推薦劑量。并且預(yù)計(jì)，通過應(yīng)用與腫瘤生長抑制有關(guān)的QOL(生命質(zhì)量)改善或生命延長而不是用腫瘤縮小作為指標(biāo)，可以更恰當(dāng)?shù)嘏袛嗨幮АＴ谶@種情況下，為了更合理更明確地證實(shí)其藥效，理想的是利用與腫瘤生長抑制機(jī)制密切相關(guān)的生物標(biāo)志的改變作為一種替代性標(biāo)志。
總的來說，在抗癌治療的過程中，當(dāng)給予一種抗癌藥劑時(shí)，生命機(jī)體的反應(yīng)性主要取決于作為藥劑靶標(biāo)的腫瘤細(xì)胞對(duì)該藥劑的敏感性。腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的這種敏感性，對(duì)于各種類型的腫瘤細(xì)胞通常都有明顯的改變。這種敏感性的差異可歸因于藥物靶分子或與這些分子相關(guān)的因子的數(shù)量或者質(zhì)量差異，以及藥物抗性的獲得等因素?？紤]到這種基本情況，如果當(dāng)作為靶標(biāo)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)某種藥物的敏感性而特異性引起的腫瘤細(xì)胞改變，可以通過使用由活組織檢查等方法得到的腫瘤組織來測定，將是非常有用的，因?yàn)橥ㄟ^應(yīng)用這種改變作為替代性標(biāo)志，使較早地確定藥效、建立治療方法或者選擇新的治療方法等成為可能。而且，如果在治療前從按常規(guī)方式通過活組織檢查等方法得到的腫瘤組織分離出腫瘤細(xì)胞，然后用藥物處理，并根據(jù)上述替代性標(biāo)志的改變確定這種腫瘤細(xì)胞是否對(duì)該藥物敏感，這樣就有可能初步預(yù)測使用該藥物的治療是否有效，這在臨床實(shí)踐中是十分有用的。重要的是這種替代性標(biāo)志的改變對(duì)于抗腫瘤作用應(yīng)該是特異性的，并且對(duì)這種改變足以進(jìn)行高靈敏度的檢測。更具體地說，定量測定對(duì)藥物抗腫瘤作用具有特異性的基因表達(dá)改變，分析與基因表述改變同時(shí)發(fā)生的蛋白質(zhì)量的改變，以及分析與這些改變相關(guān)的功能性改變等都可以被用作替代性標(biāo)志。
E7070(N-(3-氯-7-吲哚基)-1，4-苯二磺酰胺)是一種以細(xì)胞周期G1期為靶標(biāo)的，具有抗腫瘤作用的化合物，正在被臨床開發(fā)研究中(Takashi Owa，Hiroshi Yoshino，Tatsuo Okauchi，KentaroYoshimatsu，Yoichi Ozawa，Naoko Hata Sugi，Takeshi Nagasu，Nozomu Koyanagi and Kyosuke Kitoh，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志1999，42，3789-3799)。
這種化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長抑制作用的強(qiáng)度頻譜與任何現(xiàn)存的抗癌藥劑都不同，預(yù)期這種化合物具有作為抗癌藥劑的作用，并具有一種新穎的作用機(jī)制。為了加速對(duì)這種藥物的臨床開發(fā)研究并盡快地建立一種臨床治療方法，以及根據(jù)所確定的治療方法，通過有效地促進(jìn)治療來幫助改善病人的QOL，期望發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用一種可以被特定地用于該藥物給藥的替代性標(biāo)志。
在最近幾年，已經(jīng)建立了使用不同的DNA微陣列(microarrays)同時(shí)測定大量基因表達(dá)水平的方法并廣泛地被應(yīng)用(schena M，shalonD，Davis RW，Brown PO，科學(xué)1995，270，467-70；Lockhart，D.J.，Dong H.，Byren M.C.，F(xiàn)ollettie M.T.，Gallo M.V.，Chee M.S.，Mittmann M.，Wang C.，Kobayashi，M.，Horton H.，Brown E.L.，自然生物技術(shù)，1996，14，1675-1680)。
在癌癥研究領(lǐng)域，應(yīng)用此類DNA微陣列的研究也正在積極地進(jìn)行。例如，在通過使用DNA微陣列的表達(dá)分析對(duì)擴(kuò)散性大B-細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)進(jìn)行的研究中，根據(jù)基因表述表觀的差異，DLBCL已被分類成二種不同的類型，并且表明，這種分類可指導(dǎo)對(duì)預(yù)后的推測(Alizadeh AA，Eisen MB，Davis RE，Ma C，Lossos IS，RosenwaldA，Boldrick JC，Sabet H，Tran T，Yu X，Powell Ji，Yang 1，MartiGE，Moore T，Hudson J Jr，Lu L，Lewis DB，Tibshirani R，SherlockG，Chan WC，Greiner TC，Weisenburger DD，Armitage JO，WarnkeR，Staudt LM，等，自然，2000，403，503-11)。此外，在一篇報(bào)導(dǎo)中通過分析來自美國國家癌癥研究所的60種類型癌細(xì)胞系的一種鑲嵌板(panel)的基因表達(dá)表觀，對(duì)這些細(xì)胞系作了重新分類，并且檢測了它們的特征(Ross DT，Scherf U，Eisen MB，Perou CM，ReesC，Spellman P，Iyer V，Jeffrey SS，Van de Rijn M，Waltham M，Pergamenschikov A，Lee JC，Lashkari D，Shalon D，Myers TG，Weinstein JN，Botstein D，Brown PO，自然遺傳，2000，24，227-35)，另一篇報(bào)導(dǎo)論述了這60種類型癌細(xì)胞系鑲嵌板的基因表達(dá)表觀的相互關(guān)系，以及每個(gè)細(xì)胞系對(duì)不同抗癌藥劑的敏感性(Scherf U，Ross Dt，Waltham M，Smith LH，Lee JK，Tanabe L，Kohn KW，Reinhold WC，Myers TG，Andrews DT，Scudiero DA，Eisen MB，Sausville EA，Pommier Y，Botstein D，Brown PO，Weinstein JN，自然遺傳，2000，24，236-44)，還有其它報(bào)導(dǎo)。
并且還有幾篇報(bào)導(dǎo)，通過類似地使用一種DNA微陣列(部分是使用濾膜的大型陣列)檢測了使抗癌藥劑對(duì)腫瘤細(xì)胞起作用時(shí)出現(xiàn)的基因表達(dá)改變(Rhee CH，Ruan S，Chen S，Chenchik A，Levin VA，YungAW，F(xiàn)uller GN，Zhang W，腫瘤學(xué)報(bào)導(dǎo)，1999，6，393-401；Zimmermann J，Erdmann D，Lalande，Grossenbacher R，NooraniM，F(xiàn)urst P，癌基因，2000，19，2913-20；Kudoh K，Ramanna M，Ravatn R，Elkahloun AG，Bittner ML，Meltzer PS，Trent JM，Dalton WS，Chin KV，癌研究，2000，4161-6)。這些報(bào)導(dǎo)表明，在比較二個(gè)或更多細(xì)胞群的特征時(shí)，以及在以分子水平綜合研究藥物治療等因素引起的細(xì)胞生物學(xué)改變時(shí)，分析基因表達(dá)變異是非常有用的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，在使E7070及其相關(guān)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞起作用的情況下，為這些化合物的抗腫瘤作用提供替代性標(biāo)志。
本發(fā)明人借助于DNA微陣列法，分析了在使E7070及其相關(guān)化合物作用于對(duì)這些抗癌藥劑敏感的腫瘤細(xì)胞時(shí)引起的基因表達(dá)改變，并發(fā)現(xiàn)了由這些抗癌藥劑共同引起的基因表達(dá)改變。
進(jìn)而他們還發(fā)現(xiàn)，在這些基因中，存在顯示出三種癌共有的表達(dá)改變的基因，并發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)改變，可以為E7070及其相關(guān)化合物的抗腫瘤作用用作替代性標(biāo)志，至此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了如下內(nèi)容。
1.一種試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞對(duì)于抗癌藥劑敏感性的方法，它包括1)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平，該腫瘤細(xì)胞是從以如下通式(I)表示的抗癌藥劑治療的癌癥病人采集的 其中A代表單環(huán)或雙環(huán)芳香族環(huán)，它可被取代，B代表6元不飽和烴環(huán)，或者是含有1個(gè)氮原子作為雜原子的6元不飽和雜環(huán)，此二種環(huán)都可被取代，C代表含有1個(gè)或2個(gè)氮原子的5元雜環(huán)，它可被取代，W代表一個(gè)單鍵或-CH-CH-，X代表-N(R1)-或氧原子，Y代表碳原子或氮原子，Z代表-N(R2)-或氮原子，以及R1和R2可以相同或者不同，各代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基，以及2)與用該抗癌藥劑治療前從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞中基因的表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或幾種基因的表達(dá)水平提高時(shí)，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，可確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌藥劑是敏感的。
2.一種試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞對(duì)于抗癌藥劑敏感性的方法，它包括1)使抗癌藥劑作用于從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，該抗癌藥劑可用如下通式(I)表示
其中A代表單環(huán)或雙環(huán)芳香族環(huán)，它可被取代，B代表6元不飽和烴環(huán)，或者是含有1個(gè)氮原子作為雜原子的6元不飽和雜環(huán)，此二種環(huán)都可被取代，C代表含有1個(gè)或2個(gè)氮原子的5元雜環(huán)，它可被取代，W代表一個(gè)單鍵或-CH＝CH-，X代表-N(R1)-或氧原子，Y代表碳原子或氮原子，Z代表-N(R2)-或氮原子，以及R1和R2可以相同或者不同，備代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基，2)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平，以及3)與未被處理的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或幾種基因的表達(dá)水平提高時(shí)，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，可確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌藥劑是敏感的。
3.根據(jù)1或2的方法，其中是使用DNA微陣列，通過定量一種或幾種RNA來測定一種或幾種基因的表達(dá)水平，此RNA是該一種或幾種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
4.根據(jù)1或2的方法，其中是借助于定量PCR法，通過定量一種或幾種RNA來測定一種或幾種基因的表達(dá)水平，此RNA是該一種或幾種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
5.一種用于定量RNA的試劑，該RNA在4中規(guī)定的方法中使用，所述試劑包含與此RNA互補(bǔ)的寡核苷酸作為成分。
6.根據(jù)1或2的方法，其中是借助于免疫化學(xué)方法，通過定量一種或幾種蛋白質(zhì)來測定一種或幾種基因的表達(dá)水平，此蛋白質(zhì)是該一種或幾種基因的基因產(chǎn)物。
7.根據(jù)6的方法，其中是借助于酶聯(lián)免疫吸附測定法，通過定量一種或幾種蛋白質(zhì)來測定一種或幾種基因的表達(dá)水平，此蛋白質(zhì)是該一種或幾種基因的基因產(chǎn)物。
8.根據(jù)6的方法，其中是借助于蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)，通過定量一種或幾種蛋白質(zhì)來測定一種或幾種基因的表達(dá)水平，此蛋白質(zhì)是該一種或幾種基因的基因產(chǎn)物。
9.一種用于在6中所規(guī)定方法的免疫檢測試劑，它包含一種針對(duì)所述蛋白質(zhì)的抗體作為成分。
10.根據(jù)1或2的方法，其中A代表可被取代的苯或吡啶，B代表可被取代的苯，C代表可被取代的吡咯，W代表一個(gè)單鍵，以及X和Z都代表-NH-。
附圖簡述
圖1顯示使用E7070得到的，細(xì)胞株HCT116-C9，HCT116-C9-C1，LX-1和LX-1-E2的細(xì)胞生長抑制曲線。
圖2顯示借助于定量PCR法對(duì)E7070敏感株HCT116-C9的基因表達(dá)變異的分析結(jié)果。
圖3顯示借助于定量PCR法對(duì)E7070敏感株LX-1的基因表達(dá)變異的分析結(jié)果。
圖4顯示借助于定量PCR法對(duì)E7070抗性株HCT116-C9-C1的基因表達(dá)變異的分析結(jié)果。
圖5顯示借助于定量PCR法對(duì)E7070抗性株LX-1-E2的基因表述變異的分析結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式隨后將詳細(xì)論述本發(fā)明的實(shí)施方案。
本發(fā)明的試驗(yàn)方法其特征在于，當(dāng)腫瘤細(xì)胞以體內(nèi)或體外試驗(yàn)被暴露于抗癌藥劑時(shí)，將所引起的腫瘤細(xì)胞中基因的表達(dá)水平改變用作該腫瘤細(xì)胞對(duì)該抗癌藥劑敏感性的指標(biāo)。
因此，本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方案的試驗(yàn)方法包括如下步驟，1)測定選自列舉于表3和表4中腫瘤細(xì)胞的一種或幾種基因的表述水平，該腫瘤細(xì)胞是從以通式(I)表示的抗癌藥劑治療的癌癥病人采集的，以及2)與用該抗癌藥劑治療前從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或幾種基因的表達(dá)水平提高時(shí)，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，可確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌藥劑是敏感的。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明第二實(shí)施方案的試驗(yàn)方法包括如下步驟，1)使以通式(I)表示的抗癌藥劑作用于從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，2)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平，以及3)與未被治療的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或幾種基因的表達(dá)水平提高時(shí)，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，可確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌藥劑是敏感的。
用于本發(fā)明的抗癌藥劑是一種以通式(I)表示的磺酰胺衍生物或磺酸酯衍生物。
通式(I)中，以A表示的“可被取代的單環(huán)或雙環(huán)的芳香族環(huán)”是芳香烴環(huán)或者是含有至少一個(gè)氮、氧和硫原子的芳香雜環(huán)，其每種環(huán)上可有1-3個(gè)取代基。包含在環(huán)A中的這類芳香族環(huán)的實(shí)例包括吡咯、吡唑、咪唑、噻吩、呋喃、噻唑、唑、苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、萘、喹啉、異喹啉、2，3-二氮雜萘、1，5-二氮雜萘、喹喔啉、喹唑啉、內(nèi)啉、吲哚、異吲哚、中氮茚、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并咪唑、苯并吡唑、苯并噻唑等等。它們可有1-3個(gè)取代基。當(dāng)存在二個(gè)以上取代基時(shí)，它們可以相同或不同。取代基的實(shí)例包括可被低級(jí)烷基或低級(jí)環(huán)烷基取代的氨基；低級(jí)烷基；低級(jí)烷氧基；羥基；硝基；巰基；氰基；低級(jí)硫代烷基；鹵素；以化學(xué)式-a-b表示的基團(tuán)[其中a代表單鍵，-(CH2)k-，-O-(CH2)k-，-S-(CH2)k-或-N(R3)-(CH2)k-(k是1-5的整數(shù)，R3代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基)，b代表-CH2-d(其中d代表可被低級(jí)烷基取代的氨基，鹵素，羥基，低級(jí)硫代烷基，氰基或低級(jí)烷氧基)]；以化學(xué)式-a-e-f表示的基團(tuán)[其中a具有同上規(guī)定的含義，e代表-S(O)-或-S(O)2-，f代表可被低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基取代的氨基，低級(jí)烷基，三氟甲基，-(CH2)a-b或-N(R4)-(CH2)a-b(其中b具有同上規(guī)定的含義，R4代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基，m是1-5的整數(shù))]；以化學(xué)式-a-g-h表示的基團(tuán)[其中a具有同上規(guī)定的含義，g代表-C(O)-或-C(S)-，h代表可被低級(jí)烷基取代的氨基，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，-(CH2)u-b或-N(R5)-(CH2)n-b(其中b具有同上規(guī)定的含義，R5代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基，n是1-5的整數(shù))]；以化學(xué)式-a-N(R6)-g-i表示的基團(tuán)[其中a和g具有同上規(guī)定的含義，R6代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基，i代表一個(gè)氫原子，低級(jí)烷氧基或f(f具有同上規(guī)定的含義)]；以化學(xué)式-a-N(R7)-e-f表示的基團(tuán)(其中a，e和f具有同上規(guī)定的含義，R7代表一個(gè)氫原子或低級(jí)烷基)；以及以化學(xué)式-(CH2)p-j-(CH2)q-b表示的基團(tuán)(其中j代表一個(gè)氧原子或硫原子，b具有同上規(guī)定的含義，p和q可以相同或不同，各代表1-5的整數(shù))等等。
當(dāng)取代基是一個(gè)以二個(gè)烷基取代的氨基時(shí)，此二個(gè)烷基可能結(jié)合形成5-或6-元環(huán)。并且，為A是帶有羥基或巰基的含氮雜環(huán)時(shí)，這些基因通過共振可能以氧代基團(tuán)或硫代基團(tuán)的形式存在。
以B表示的“可被取代的6-元不飽和烴環(huán)或含有1個(gè)氮原子作雜原子的6-元不飽和雜環(huán)”，指的是可被部分氫化的苯或吡啶。在這種環(huán)上可有1個(gè)或2個(gè)取代基，當(dāng)存在二個(gè)取代基時(shí)，它們可以相同或不同。
以C表示的“可被取代的含有1個(gè)或2個(gè)氮原子的5-元雜環(huán)”，指的是可被部分氫化的吡咯，吡唑或咪唑。在這種環(huán)上可有1個(gè)或2個(gè)取代基，當(dāng)存在二個(gè)取代基時(shí)，它們可以相同或不同。
環(huán)B和C可能具有的取代基包括例如鹵素；氰基；低級(jí)烷基；低級(jí)烷氧基；羥基；氧基；以化學(xué)式-C(O)-r表示的基團(tuán)(其中r代表氫原子，可被低級(jí)烷基取代的氨基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基或羥基)；被低級(jí)烷基取代的氨基；以及三氟甲基等。
在通式(I)，以R1和R2限定的低級(jí)烷基以及環(huán)A、B和C可具有的取代基，指的是具有1-6個(gè)碳原子的線性或支鏈烷基，其例子包括甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，異戊基，新戊基，叔戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，1，2-二甲基丙基，正己基，異己基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，以及1-乙基-2-甲基丙基等。其中優(yōu)選的是甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基和異丁基，而最優(yōu)選的是甲基，乙基，正丙基和異丙基。
在A環(huán)可能具有的取代基限定中所敘述的低級(jí)環(huán)烷基，指的是具有3-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其實(shí)例包括環(huán)丙基，環(huán)戊基和環(huán)己基等。
在A，B和C環(huán)可能具有的取代基限定中所敘述的低級(jí)烷氧基，指的是從上述低級(jí)烷基衍生的烷氧基，例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，正丁氧基，異丁氧基和叔丁氧基。其中甲氧基和乙氧基是最優(yōu)選的。低級(jí)硫代烷基指的是從上述低級(jí)烷基衍生的硫代烷基。此外，鹵素的實(shí)例包括氟、氯和溴等。
以通式(I)表示的磺酰胺衍生物或磺酸酯衍生物可同酸或堿形成鹽。用于本發(fā)明的抗癌藥劑也包括以通式(I)表示的化合物的鹽。與酸所形成鹽的實(shí)例包括與無機(jī)酸的鹽例如鹽酸鹽，氫溴酸鹽和硫酸鹽，與有機(jī)酸例如乙酸，乳酸，琥珀酸，富馬酸，馬來酸，檸檬酸，苯甲酸，甲磺酸和對(duì)甲苯磺酸的鹽，與堿所形成鹽的實(shí)例包括與無機(jī)堿的鹽例如鈉鹽，鉀鹽和鈣鹽，以及與有機(jī)堿例如三乙胺，精氨酸和賴氨酸的鹽。
不用說，該化合物包括這些化合物的水合物和光學(xué)異構(gòu)體，如果它們存在。用于本發(fā)明的抗癌藥劑顯示出高度抗腫瘤活性，并且該抗癌藥劑還包括在體內(nèi)經(jīng)過代謝作用如氧化，還原，水解和共軛結(jié)合而表現(xiàn)出抗腫瘤活性的化合物。此外，用于本發(fā)明的抗癌藥劑還包括在體內(nèi)經(jīng)過代謝作用如氧化、還原和水解而形成以通式(I)所表示化合物的那些化合物。
測定其敏感性的腫瘤細(xì)胞并不特別局限，只要它們對(duì)以通式(I)表示的抗癌藥劑是敏感的。其實(shí)例包括從如下腫瘤獲得的腫瘤細(xì)胞結(jié)腸癌，肺癌，乳腺癌，白血病，胰腺癌，腎癌，黑素瘤，惡性淋巴瘤，頭部和頸部癌，以及胃癌等。
從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，包括包含在從該癌癥病人分離出的癌組織中的腫瘤細(xì)胞。
在第一實(shí)施方案的試驗(yàn)方法中，從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，可以是從用通式(I)表示的抗癌藥劑治療的癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，在此是用可以測定該腫瘤細(xì)胞敏感性的劑量進(jìn)行治療。通常使用從以100-1500mg劑量治療1-14天的癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞。
在第二實(shí)施方案的試驗(yàn)方法中，只要可以測定腫瘤細(xì)胞的敏感性，用于使通式(I)表示的抗癌藥劑作用于從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞的條件不受限制，通常在含有0.01-10μM濃度該抗癌藥劑的培養(yǎng)基中實(shí)施培養(yǎng)6-72小時(shí)。
通過定量作為基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA或者定量作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，可以測定基因表達(dá)水平。通常，通過從腫瘤細(xì)胞中提取RNA或蛋白質(zhì)并定量測定提取物中的RNA或蛋白質(zhì)，可以對(duì)此RNA或蛋白質(zhì)作定量分析。隨后，如下實(shí)例1.RNA或蛋白質(zhì)的提取，2.RNA的定量，3.蛋白質(zhì)的定量，將按此順序加以詳細(xì)說明。
1.RNA或蛋白質(zhì)的提取1)從以通式(I)表示的抗癌藥劑治療的病人癌組織中提取RNA或蛋白質(zhì)。
通過活組織檢查或類似方法從以通式(I)表示的抗癌藥劑治療的病人采集癌組織，然后通過下述方法從癌組織中提取RNA或蛋白質(zhì)。
可按照通常的RNA提取法提取RNA。例如，可通過使用TRIZOL試劑(東方生命技術(shù)公司)或類似試劑，按照所附的操作手冊(cè)進(jìn)行提取。具體地說，以每50-100mg癌組織/1ml TRIZOL試劑，用Teflon勻漿器將癌組織作成勻漿。離心此混合液(4℃，12000xg，10分鐘)，將所得到的上清液在室溫下放置5分鐘，然后對(duì)每1ml所使用的TRIZOL試劑加入氯仿0.2ml。通過震搖強(qiáng)烈地?cái)嚢杷纬傻娜芤?5秒，在室溫下放置2-3分鐘，然后離心(4℃，12000xg，15分鐘)。離心之后將含水層轉(zhuǎn)移至另一試管，并對(duì)每1ml所使用的TRIZOL試劑加入異丙醇0.5ml。將此混合液在室溫下放置10分鐘后離心(4℃，12000xg，10分鐘)。用75％乙醇洗滌所得到的沉淀物，空氣干燥后可作為總RNA用于隨后的操作。
可按照在如下著作中所敘述的方法從癌組織中提取蛋白質(zhì)Bollag.D.M.，Rozycki，M.D，Edelstein S.J，蛋白質(zhì)方法，1996，Wiley-Liss，公司New York，U.S.A；Walker，J.M，蛋白質(zhì)手冊(cè)，1996，Humana出版社，New Jersey，USA，；以及其它。
2)從存在通式(I)所表示的抗癌藥劑時(shí)培養(yǎng)的癌細(xì)胞中提取RNA或蛋白質(zhì)。
按常規(guī)方法通過活組織檢查或類似途徑從病人獲得的癌組織中分離出癌細(xì)胞(腫癌細(xì)胞)。例如，按照Hamburger等的方法(HamburgerA，Salmon S.E，Kim M.B，Trent J.m，Soehnlen B.J，Alberts D.S和Schmidt H.T.癌研究38，3438-3443，1978)，先無菌絞碎獲得的組織，然后通過使用不銹鋼網(wǎng)，注射針，尼龍網(wǎng)等制備細(xì)胞懸液。將獲得的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如含有10-15％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640，MEM，McCoy培養(yǎng)基等)中培養(yǎng)。在5％CO2的條件下，在有通式(I)所表示的抗癌藥劑存在時(shí)，將獲得的癌細(xì)胞37℃培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，優(yōu)選的是3，6，12或24小時(shí)，更優(yōu)選的是12小時(shí)，然后通過下述方法提取RNA或蛋白質(zhì)。并且還可以通過采用軟瓊脂培養(yǎng)法，只從借助活組織檢查或類似途徑獲得的組織中特異性地分離出癌細(xì)胞供使用(Hamburger A，和Salmon S.E.科學(xué)197，461-463，1977；Hamburger A，和Salmon S.E.臨床研究雜志60，84 6-854，1977；VonHoff D.D.和Johnson.G.E，美國癌癥研究協(xié)會(huì)報(bào)告20，51，1979)。
可以按照通常的RNA提取法，像從癌組織中提取RNA一樣從癌細(xì)胞中提取RNA。例如，當(dāng)使用TRIZOL試劑(東方生命技術(shù)公司)時(shí)，可按照所附的操作手冊(cè)進(jìn)行提取。具體地說，每5-10×106個(gè)癌細(xì)胞加入1ml TRIZOL試劑，然后可以像從癌組織中提取RNA一樣進(jìn)行同樣的操作。
也可以按照文獻(xiàn)中所述的方法，像從癌組織中提取一樣實(shí)施從癌細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。
2.RNA的定量借助于RNA印跡分析，DNA微陣列分析，RT-PCR和定量PCR等技術(shù)可對(duì)RNA作定量分析。優(yōu)選的是使用DNA微陣列或定量PCR。下面將對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行說明，但是本發(fā)明并不局限于這些技術(shù)。
按如下所述通過使用DNA微陣列進(jìn)行定量。首先，通過使用所獲得的RNA作模板，并使用SuperScript選擇系(東方生命技術(shù)公司)和T7-d(T)24引物合成雙鏈cDNA。隨后，通過使用此cDNA作模板合成生物素化的cRNA。
更具體地說，首先通過使用T7-d(T)24引物從所獲得的RNA合成單鏈DNA。然后對(duì)其加入dNTP，DNA連接酶，DNA聚合酶I和RNA酶H，使它們起反應(yīng)，并且對(duì)其再加入T4 DNA聚合酶I以便完成雙鏈cDNA的合成。先純化所獲得的cDNA，然后通過使用RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒(Enzo診斷試劑)加入生物素化的UTP和CTP，使之進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。純化此反應(yīng)產(chǎn)物，在200mM Tris/乙酸(PH8.1)，150mM乙酸鎂，50mM乙酸鉀內(nèi)94℃加熱35分鐘，以便獲得成為片段的cRNA。
使此成為片段的cRNA與Gene Chip(基因芯片)Hu6800(Affymetrix)或更新產(chǎn)物雜交，例如，在100mM MES，1M鈉鹽，20mM EDTA，0.01％吐溫20內(nèi)45℃雜交16小時(shí)。雜交之后，洗滌此基因芯片并按照聯(lián)接在Affymetrix流控技術(shù)站(Affymetrix FluidicsStation)的EUKGE-WS2方案染色。鏈霉親和素-藻紅素以及生物素化羊抗鏈霉親和素抗體被用于染色?？赏ㄟ^使用HP氬離子激光共聚焦掃描儀(Hewlett packard)掃描被染色的基因芯片來測定其熒光強(qiáng)度。當(dāng)使用這種熒光染料時(shí)，通過使用488nm激發(fā)光在570nm測定熒光。
優(yōu)選的是應(yīng)用基因芯片軟件(Affymetrix)作定量數(shù)據(jù)分析處理。為了定量分析RNA，對(duì)于每個(gè)探針系列可得到一個(gè)“差異[(完美匹配雜交信號(hào))一錯(cuò)配信號(hào)]”的平均值。當(dāng)此值為50或高于50時(shí)，并且在二種狀態(tài)下獲得的RNA定量值發(fā)生偏離，優(yōu)選地是當(dāng)它們偏離1.8倍或更多時(shí)，則可確定該基因表達(dá)已顯著“提高”或“降低”。
當(dāng)列舉于表3中的一種或幾種基因的RNA水平提高時(shí)，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或幾種基因的RNA水平降低時(shí)，則可確定此腫瘤細(xì)胞對(duì)該抗癌藥劑是敏感的。
此外，通過使用SYBR Green和ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)(Perkim Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))按如下所述實(shí)施定量PCR。
按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)二步進(jìn)行操作。通過對(duì)所獲得的RNA加入dNTP，寡d(T)16引物，RNA酶抑制劑混合物和多錄逆轉(zhuǎn)錄酶(Perkim-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))，將此混合物保持在25℃10分鐘，然后在48℃加熱混合物30分鐘，這樣就實(shí)施了作為第一步的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在95℃加熱5分鐘使反應(yīng)終止。
使獲得的cDNA進(jìn)行作為第二步的PCR反應(yīng)。例如，在由如下成分組成的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行此PCR反應(yīng)4ng cDNA，1×SYBR PCR緩沖液，3mM MgCl2，dATP，dCTP和dGTP各200μM，400μM dUTP，200nm引物對(duì)0.01U/μl AmpEr酶UNG。以及0.025U/μl AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))。例如，可按如下程序?qū)嵤┐薖CR反應(yīng)，先在50℃反應(yīng)2分鐘，在95℃反應(yīng)10分鐘，隨后進(jìn)行95℃20秒，55℃20秒和72℃30秒的反應(yīng)循環(huán)，循環(huán)重復(fù)40次。例如，可通過使用Primer Expression(Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))來設(shè)計(jì)引物和探針。為了比較二個(gè)或更多的樣品，對(duì)于每個(gè)樣品都通過應(yīng)用持家基因的mRNA水平將定量值校正成為轉(zhuǎn)錄量后再使用，這種基因表現(xiàn)出很小的轉(zhuǎn)錄量變異，優(yōu)選地是應(yīng)用GAPDH的mRNA水平。
當(dāng)列舉于表3中的一個(gè)或幾個(gè)基因的RNA水平提高，或者列舉于表4中的一個(gè)或幾個(gè)基因的RNA水平降低時(shí)，可確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌藥劑是敏感的。
本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明試驗(yàn)方法中使用的定量RNA的試劑，它包含互補(bǔ)于一種RNA的寡核苷酸作為一種成分，此RNA是其表達(dá)水平將被測定的一種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。作為成分包含的這種寡核苷酸是用于定量PCR的引物和/或探針，并且可以如上所述被設(shè)計(jì)。除了上述寡核苷酸之外，本發(fā)明的RNA-定量試劑還可以包含常規(guī)用于普通定量試劑的成分。
3.蛋白質(zhì)的定量雖然基于其活性或抗原性都可以定量分析蛋白質(zhì)，但優(yōu)選的是基于抗原性的定量法，即免疫化學(xué)定量法，免疫化學(xué)定量法可被方便、廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)。
至于針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體，根據(jù)Parker等的報(bào)導(dǎo)(parker.J.M.R，Guo D，Hodges R.S，生物化學(xué)25，5425，1986)或Karplus等的報(bào)導(dǎo)(Karplus P.A，Schulz G.E，Naturwissenchaften72，212，1985)，從氨基酸序列可預(yù)測抗原決定簇來合成肽。另一方面是融合蛋白，例如，可表達(dá)與谷胱甘肽合成酶(GST)的融合蛋白，并可通過使用谷胱甘肽柱純化來產(chǎn)生抗原，然后用獲得的抗原免疫家兔或小鼠等動(dòng)物來產(chǎn)生多克隆抗體或優(yōu)選地產(chǎn)生單克隆抗體(Harlow E，Lane D，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，1988，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約)。并且，當(dāng)有市場上能買到的抗體可利用時(shí)，在證實(shí)了它們的特異性之后也可以使用。
通過使用所獲得的抗體，可實(shí)施酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定(RIA)來定量蛋白質(zhì)，例如借助于酶免疫測定法(IshikawaE等，Igakushoin，1982)或在Ishikawa E，Kawai T，Miyai K，酶免疫測定，Igekushoin，Tokyo，New York，1981中所述的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是從腫癌細(xì)胞分泌出時(shí)，可以不用從腫瘤細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)而定量培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。
當(dāng)列舉于表3中的一種或幾種基因的蛋白質(zhì)水平提高，或者列舉于表4中的一種或幾種基因的蛋白質(zhì)水平降低時(shí)，可確定該腫癌細(xì)胞對(duì)此抗癌藥劑是敏感的。
本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明試驗(yàn)方法的免疫測定試劑，它包含一種針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體作為成分。用作成分的抗體可如上所述獲得。除了上述抗體之外，本發(fā)明的免疫測定試劑還可含有常規(guī)用于普通的免疫測定試劑中的成分。
實(shí)施例此后，將參照下面特定的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更具體的說明。但是，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 E7070敏感株和E7070-抗性株的培養(yǎng)以及RNA的提取所有的細(xì)胞都是在補(bǔ)充了10％胎牛血清，100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中5％CO2之下37℃培養(yǎng)。
將E7070或者如下所示結(jié)構(gòu)式表示的ER-35748或ER-68487以8μM的濃度加到E7070-敏感株HCT116-C9和E7070-抗性株HCT116-C9-C1的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)這些細(xì)胞。然后在0、3、6和12小時(shí)之后收獲細(xì)胞。而且還在不加入藥物時(shí)將這些細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)，并收獲細(xì)胞。
從這些細(xì)胞中提取出總RNA，并隨后對(duì)此RNA進(jìn)行分析。應(yīng)用實(shí)施例2中所述的DNA微陣列法，將從與藥物共同培養(yǎng)12小時(shí)的細(xì)胞中提取的RNA，以及從不加入藥物培養(yǎng)12小時(shí)的細(xì)胞中提取的RNA用于基因表達(dá)分析。HCT116-C9是從來源于人結(jié)腸癌的HCT116中分離出的亞株(美國模式菌種保藏中心)，而HCT116-C9-C1是E7070抗性亞株，是通過在有逐漸增加濃度的E7070存在時(shí)培養(yǎng)這種HCT116-C9得到的。
類似地，將 E7070以8μM的濃度加到E7070-敏感株LX-1和E7070-抗性株LX-1-E2的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)這些細(xì)胞。在0，3，6和12小時(shí)之后收獲細(xì)胞。從這些細(xì)胞中提取出總RNA，并隨后對(duì)此RNA進(jìn)行分析。LX-1(日本癌研究基地化學(xué)治療中心，日本東京)是來源于人小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞，而LX-1-E2是E7070-抗性亞株，是通過在有逐漸增加濃度的E7070存在時(shí)培養(yǎng)這種LX-1得到的。
將這些有效的細(xì)胞株HCT-116-C9，HCT116-C9-C1，LX-1和LX-1-E2加入E7070培養(yǎng)72小時(shí)。借助于MTT法(Mosmann T.免疫學(xué)方法雜志65，55(1983))測定的細(xì)胞生長抑制曲線被顯示在圖1中。實(shí)際操作是通過應(yīng)用96孔滴定板非放射性細(xì)胞增殖測定法(Promeg，Madison.WI)，按照所附的操作手冊(cè)進(jìn)行。
總RNA是通過使用TRIZOL試劑(東方生命技術(shù)公司)，按照所附的操作手冊(cè)從收獲的細(xì)胞中提取出。
實(shí)施例2 使用DNA微陣列作基因表達(dá)分析1)合成cDNA并以生物素標(biāo)記將實(shí)施例1中獲得的每種RNA溶解于以二乙基焦碳酸鹽(DEPC)處理的無菌水100μl中，并通過使用Rneasy柱(QIAGEN)作進(jìn)一步純化，而且通過使用Superscript選擇系統(tǒng)(東方生命技術(shù)公司)和T7-d(T)24引物合成了雙鏈cDNA。
首先，將5μM T7-d(T)24引物，1X第一鏈緩沖液，10mM DTT，500μM dNTP混合物和20單位/μl Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶加到10μg RNA中，使此混合物在42℃反應(yīng)1小時(shí)以便合成單鏈DNA。隨后，對(duì)此DNA加入1X第二鏈緩沖液，200μM dNTP混合物，67U/ml DNA連接酶，270U/ml DNA聚合酶I和13U/ml RNA酶H，使此混合物在16℃反應(yīng)2小時(shí)以便合成雙鏈cDNA。進(jìn)而，對(duì)此cDNA加入67U/ml T4DNA聚合酶I，并使該混合物在16℃反應(yīng)5分鐘，然后加入10μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。
用酚/氯仿純化獲得的cDNA，并通過使用RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒(Enzo診斷)，按照所附的操作手冊(cè)以生物素化的UTP和CTP實(shí)施標(biāo)記反應(yīng)。用Rneasy柱純化此反應(yīng)產(chǎn)物，并在200mM Tris/乙酸鹽緩沖液(PH8.1)，150mM乙酸鎂，50mM乙酸鉀中94℃加熱35分鐘以便獲得cRNA片段。
2)與DNA微陣列(基因芯片)雜交并進(jìn)行測定在100mM MES，1M鈉鹽，20mM EDTA和0.01％吐溫20中使已經(jīng)成為片段的cRNA與基因芯片Hu6800(Affymetrix)45℃雜交16小時(shí)。雜交之后，洗滌此基因芯片并按照聯(lián)接在Affymetrix流控技術(shù)站的EuKGE-WS2方案染色。鏈霉親和素-藻紅素以及生物素化羊抗鏈霉親和素抗體被用于染色。通過使用HP氬離于激光共聚焦掃描儀(HewlettPackard)掃描被染色的基因芯片以便測定其熒光強(qiáng)度。使用488nm激發(fā)光在570nm測定熒光。
通過使用基因芯片軟件(Affymetrix)進(jìn)行全部定量數(shù)據(jù)分析。為了定量分析RNA，對(duì)于每個(gè)探針系列獲得了一個(gè)“差異[(完美匹配雜交信號(hào))-錯(cuò)配信號(hào))]”的平均值。當(dāng)此值為50或高于50時(shí)，并在二種狀態(tài)下測定的RNA定量值發(fā)生偏離，優(yōu)選地是它們偏離了1.8倍或更多時(shí)，可確定該基因表達(dá)已顯著“提高”或“降低”。
以8μM的濃度將E7070或者ER-35748或ER-68487，加到用于HCT116-C9的培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)。將從培養(yǎng)12小時(shí)的這種細(xì)胞中提取的RNA通過使用基因芯片的分析結(jié)果，同除了不加入藥物之外其余以相同方式獲得的HCT116-C9細(xì)胞的RNA分析結(jié)果作了比較。結(jié)果，通過以3種類型的藥物，E7070，ER-35748和ER-68487處理，其表達(dá)水平都提高的基因名單被顯示在表1中(基因庫注冊(cè)號(hào)也被顯示(相同的情況將用于在下面顯示的其它表格中))。類似地，通過以此3種類型藥物處理，其表達(dá)水平都降低的基因名單被顯示在表2中。
表1
表2
表2(續(xù))
表2(續(xù))
表2(續(xù))
表2(續(xù))
表2(續(xù))
表2(續(xù))
對(duì)二種E7070抗性株(C9-C1和另一種用與C9-C1相同的方法獲得的抗性株(C9-C4))，按與上述相同的方式用8μM E7070處理12小時(shí)，然后通過使用基因芯片對(duì)列舉于表1和表2中的基因分析其基因表達(dá)的變異。結(jié)果，在此二株細(xì)胞中沒有觀察到提高或降低1.8倍或更多一點(diǎn)的基因。
根據(jù)上述結(jié)果，顯然，通過檢測它們每種基因的改變或者它們的二種或更多組合的改變，可以將以這三種類型抗癌藥劑處理其表達(dá)水平都發(fā)生改變的基因，用作E7070及其相關(guān)化合物抗腫瘤作用的替代性標(biāo)志。
實(shí)施例3 借助于定量PCR的基因表達(dá)分析為了證實(shí)實(shí)施例2中得到的基因表達(dá)變異反映了腫瘤細(xì)胞對(duì)E7070的敏感性，使用實(shí)施例1中顯示的RNA以及SYBR Green和ABI引物7700序列檢測系統(tǒng)(Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))，通過定量PCR測定了E7070-敏感細(xì)胞和E7070-抗性細(xì)胞基因表達(dá)的改變。
操作按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)二步進(jìn)行。通過如下操作實(shí)施作為第一步驟的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)先對(duì)1μg總RNA加入1×TaqMan RT緩沖液，5.5mM MgCl2，500μM dNTP混合物，2.5μM寡d(T)16引物，0.4U/μlRNA酶抑制劑和1.25U/μl多錄逆轉(zhuǎn)錄酶(Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))，將此混合物在25℃保持10分鐘，然后在48℃加熱30分鐘。通過在95℃加熱5分鐘終止反應(yīng)。
使所獲得的cDNA進(jìn)行作為第二步驟的PCR反應(yīng)，在由如下組成的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)4ng cDNA，1×SYBR PCR緩沖液，3mM MgCl2，dATP、dCTP和dGTP各200μM，400μM dUTP，200nM引物對(duì)，0.01U/μl AmpEr酶UNG以及0.025U/μl AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng))。按如下程序?qū)嵤┐薖CR反應(yīng)，先在50℃反應(yīng)2分鐘，在95℃反應(yīng)10分鐘，隨后進(jìn)行95℃20秒，55℃20秒和72℃30秒的反應(yīng)循環(huán)，循環(huán)重復(fù)40次。作為其引物，具有SEQID NOS1和2核苷酸序列的寡核苷酸被用于GAPDH，SEQ ID NOS3和4核苷酸序列被用于S80343，SEQ ID NOS5和6核苷酸序列被用于U07919，SEQ ID NOS7和8核苷酸序列被用于U11791，SEQ ID NOS9和10核苷酸序列被用于M95809，SEQ ID NOS11和12核苷酸序列被用于U18291，SEQ ID NOS13和14核苷酸序列被用于U63743，以及SEQ ID NOS15和16核苷酸序列被用于M61764。
通過測定熒光強(qiáng)度定量分析了每個(gè)樣品中的mRNA水平。為了比較二個(gè)或更多的樣品，根據(jù)每個(gè)樣品中GAPDH的mRNA水平對(duì)定量值作了校正。在圖2-圖5顯示出藥物處理時(shí)間與各mRNA水平之間的相互關(guān)系，圖中藥物處理后0小時(shí)的定量值被用作對(duì)照(100％)。在具有最高敏感性的HCT 116-C9中，其基因顯示出最大的表達(dá)變異(圖2)，而在敏感株LX-1中，除S80343外的所有基因都顯示出表達(dá)變異，盡管其變異量小于HCT 116-C9中的變異量(圖3)。另一方面，對(duì)于抗性株HCT 116-C9-C1未觀察到表達(dá)變異(圖4)，而在抗性株LX-1-E2中，U11791顯示出表達(dá)改變，M95809和U18291顯示出輕微的表達(dá)改變(圖5)，此細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中在8μM藥物濃度下顯示出某些生長抑制作用。
在實(shí)施例2中取回的基因，其表達(dá)變異與對(duì)E7070的敏感性相關(guān)連，并且證實(shí)，實(shí)施例2中取回的基因可被單獨(dú)或組合地用作E7070及其相關(guān)化合物抗腫瘤作用的替代性標(biāo)志。
實(shí)施例4 用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分析借助于已被報(bào)導(dǎo)的ELISA法，檢測了在列舉于實(shí)施例2表2的基因中X51956(對(duì)于神經(jīng)元特異性(r)烯醇酶的人ENO2基因)的表達(dá)水平，已報(bào)導(dǎo)此基因從細(xì)胞中被分泌出(Duncan M.E，MeAleese S.M，Booth N.A，Melvin W.T，和Fothergill J.E，免疫學(xué)方法雜志151，227-236，1992；Yamaguchi K Aoyagi K，UrQkami K，F(xiàn)ukutaniT.，Maki N.，Yamamoto S，Otsubo K，Miyake Y，和Kodama T.日本癌研究雜志，86，698-705，1995)。通過使用Eiken Chemical(東京)生產(chǎn)的NSE ELISA試劑盒，按照所附的參考資料進(jìn)行實(shí)際檢測。
實(shí)施例5 三種癌中的基因表達(dá)分析通過使用基因芯片，按照與實(shí)施例2中相同的方式檢測了由E7070引起的(以8μM處理12小時(shí))，HCT 116-C9(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)，MDA-MB-435(人乳癌細(xì)胞株)和MDLT-4(人T淋巴母細(xì)胞的血病細(xì)胞株)三種癌細(xì)胞中基因表達(dá)的改變。
在此三種癌細(xì)胞中其表達(dá)都提高了1.8倍或更多的基因名單被顯示在表3中。并且，在此三種癌細(xì)胞中其表達(dá)都被抑制了1.8倍或更多的基因名單被顯示在表4中。因?yàn)?，在從具有完全不同遺傳背景的癌癥病人建立的這三種癌細(xì)胞株中，其表達(dá)都發(fā)生改變(增強(qiáng)或減弱)的基因很可能與對(duì)腫瘤細(xì)胞所共有的E7070抗腫瘤作用機(jī)制較密切地相聯(lián)系，所以認(rèn)為，在測定腫瘤細(xì)胞對(duì)E7070及其相關(guān)化合物的敏感性時(shí)可以將它們用作有效的標(biāo)記。
表3
表4
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
產(chǎn)業(yè)可應(yīng)用性按照本發(fā)明，通過測定腫瘤細(xì)胞中列舉于表3和表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平，其中該腫瘤細(xì)胞是從以通式(I)表示的抗癌藥劑治療的癌癥病人采集的，或者通過使以通式(I)表示的抗癌藥劑作用于從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，然后測定列舉于表3和表4中的一種或幾種基因的表達(dá)水平，都可以檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)這種抗癌藥劑的敏感性。
序列表<110>衛(wèi)材株式會(huì)社<120>試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞對(duì)于抗癌藥劑敏感性的方法<130>0124WOOP1251<150>JP 2000-357398<151>2000-11-24<160>16<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gaaggtgaag gtcggagtc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gaagatggtg atgggatttc 20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3gcattttacg gttccctgag at 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>4gatacgccac atgttcacct tc22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cagaatcaat agcccagaga gctt 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gttgtggcgt tagaagattg gatc 24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gtcattctgc tgagcttgca ctta 24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gagagattct accaggtcgt catca25<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>9ccaagttacg aagctctgtc cat 23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10tgtaggctgt ctggagcatc tct 23<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>13atctcaccag gcataagctc ct 22<210>14
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14acagttcctc ctcttccttg gat 23<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15ctcaagaggc tgacgcagaa t 21<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16ctggctgaca tgatggtaga cac 2權(quán)利要求
1.與作為列舉于表3和表4中的一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一種或多種RNA相互補(bǔ)的寡核苷酸在制備用于檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌劑敏感性的試劑方面的應(yīng)用，其包括1)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平，該腫瘤細(xì)胞是從經(jīng)如下通式表示的抗癌劑治療的癌癥病人采集的 其中RA是氰基或亞磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或異丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，以及2)與用該抗癌劑治療前從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞中基因的表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或多種基因的表達(dá)水平提高，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，能確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌劑是敏感的。
2.與作為列舉于表3和表4中的一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一種或多種RNA相互補(bǔ)的寡核苷酸在制備用于檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌劑敏感性的試劑方面的應(yīng)用，其包括1)使抗癌劑作用于從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，所述抗癌劑由如下通式表示 其中RA是氰基或亞磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或異丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，2)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平，以及3)與未被處理的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或多種基因的表達(dá)水平提高，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，能確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌劑是敏感的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中使用DNA微陣列，通過定量作為列于表3和表4中的一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一種或多種RNA來測定所述的一種或多種基因的表達(dá)水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中借助于定量PCR法，通過定量作為列于表3和表4中的一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一種或多種RNA來測定所述的一種或多種基因的表達(dá)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述的抗癌劑是N-(3-氯-7-吲哚基)-1，4-苯二磺酰胺。
6.針對(duì)列舉于表3和表4中的一種或多種基因所編碼蛋白的抗體在制備用于檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌劑敏感性的試劑中的應(yīng)用，其包括1)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平，該腫瘤細(xì)胞是從經(jīng)以如下通式表示的抗癌劑治療的癌癥病人采集的 其中RA是氰基或亞磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或異丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，以及2)與用該抗癌劑治療前從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞中基因的表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或多種基因的表達(dá)水平提高，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，能確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌劑是敏感的。
7.針對(duì)列舉于表3和表4中的一種或多種基因所編碼蛋白的抗體在制備用于檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌劑敏感性的試劑方面的應(yīng)用，其包括1)使抗癌劑作用于從癌癥病人采集的腫瘤細(xì)胞，所述抗癌劑由如下通式表示 其中RA是氰基或亞磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或異丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，2)測定腫瘤細(xì)胞中選自列舉于表3和表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平，以及3)與未被處理的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)水平相比較，當(dāng)列舉于表3中的一種或多種基因的表達(dá)水平提高，或者當(dāng)列舉于表4中的一種或多種基因的表達(dá)水平降低時(shí)，能確定該腫瘤細(xì)胞對(duì)此抗癌劑是敏感的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其中借助于免疫化學(xué)方法，通過定量列于表3和表4中的一種或多種基因所編碼的一種或多種蛋白質(zhì)來測定所述的一種或多種基因的表達(dá)水平。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中借助于酶聯(lián)免疫吸附測定法，通過定量列于表3和表4中的一種或多種基因所編碼的一種或多種蛋白質(zhì)來測定所述的一種或多種基因的表達(dá)水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中借助于蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)，通過定量列于表3和表4中的一種或多種基因所編碼的一種或多種蛋白質(zhì)來測定所述的一種或多種基因的表達(dá)水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其中，所述的抗癌劑是N-(3-氯-7-吲哚基)-1，4-苯二磺酰胺。
全文摘要
從給予了抗癌藥劑(E7070及類似的化合物)的癌癥病人取出腫瘤細(xì)胞，然后測定列舉于表3和表4中基因的表達(dá)量。按另一種方式是，用抗癌藥劑處理從癌癥病人取出的腫瘤細(xì)胞，然后測定列舉于表3和表4中基因的表達(dá)量。在列舉于表3中基因的表達(dá)量增加，或者列舉于表4中基因的表達(dá)量減少的情況下，可判定此相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞對(duì)相應(yīng)的抗癌藥劑是敏感的。因此，可檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗癌藥劑的敏感性。
文檔編號(hào)A61K31/404GK101054604SQ20071009669
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2001年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月24日
發(fā)明者大和隆志, 橫井晃, 黑光淳郎, 河合隆利, 加藤弘之, 長洲毅志 申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司