專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療結(jié)核桿菌感染的基因工程合成多肽藥物制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
-
本發(fā)明提供一種合成抗菌肽藥物及其制備方法，用于治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌的感 染，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
(一) 多耐藥結(jié)核病現(xiàn)狀
結(jié)核病是對(duì)人類(lèi)健康威脅最大的傳染性疾病之一 。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球約有20億人口感染結(jié)核 桿菌，每年新發(fā)病例達(dá)800萬(wàn)左右，死亡人數(shù)約3百萬(wàn)，占人口死亡率的7%。結(jié)核病發(fā)病率及死亡率上 升的最主要原因之一就是結(jié)核桿菌耐藥株的出現(xiàn)和傳播。據(jù)報(bào)道，全球結(jié)核病人中約有36%感染了耐藥 菌，這種現(xiàn)象在發(fā)展中國(guó)家及AIDS病人中尤為重要。此外，全球五大洲35個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告的各常用 抗結(jié)核藥原發(fā)耐藥率為異煙肼(7.3%),鏈霉素(7.3%),利福平(1.8%)，乙胺丁醇(1.0%)，而獲 得性耐藥率還原高于此值。因此，研發(fā)一種新型的治療多耐藥結(jié)核桿菌感染的藥物有著十分重要的意義。
(二) 抗菌肽的應(yīng)用
抗菌肽(antimicrobialpeptides)是生物體中經(jīng)誘導(dǎo)而合成的一種內(nèi)源性多肽，在機(jī)體抵抗病原微生物 的入侵方面起著重要的作用，更被認(rèn)為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕牡淖饔脵C(jī)理 與常用的抗生素明顯不同，它主要通過(guò)在細(xì)胞膜表面形成離子通道來(lái)殺死細(xì)菌，現(xiàn)在有報(bào)道廣泛被研究 應(yīng)用于抗菌、抗結(jié)核、抗癌。在目前結(jié)核菌的耐藥性明顯增強(qiáng)，而尋找新的抗生素又極為困難的情況下， 尋找一種新的抗結(jié)核菌多肽藥物具有非常重要意義。
(三) 兩棲類(lèi)動(dòng)物提取中藥研究現(xiàn)狀 兩棲類(lèi)動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍、大蹼鈴蟾、黑斑蛙、沼蛙和
澤蛙。這些兩棲類(lèi)動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報(bào)道的有廣譜抗微生物作用、 抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用。
在國(guó)外，從兩棲類(lèi)動(dòng)物尋求藥理活性單體化合物已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)，國(guó)外報(bào)道，從爪蟾皮膚分泌 液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，； Magainin制藥公司宣布，他們生產(chǎn)的爪蟾皮膚抗菌肽Magainin類(lèi)似物MSI-78用于治療糖尿病患者足部 潰瘍與ofloxacin有同樣的效果，但產(chǎn)生更小的副作用。國(guó)外學(xué)者也已報(bào)道從東方鈴蟾和花鈴蟾中分離出 若干具廣譜抗微生物活性的多肽類(lèi)物質(zhì)，如Bombinin和BLP-like多肽。
我國(guó)對(duì)兩棲類(lèi)藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等， 有機(jī)小分子多肽類(lèi)物質(zhì)的研究還較少。
天龍屬爬行綱，蜥蝎目，壁虎科，其又名守宮、壁虎等，現(xiàn)代醫(yī)藥書(shū)籍或雜志上收載品種為無(wú)蹼壁虎(Gekko swinhonis Gunther)和多痣壁虎(多疣壁虎G.japonicus)及其它幾種壁虎的干燥全體。壁虎，咸 寒有小毒，入心、肝經(jīng)，具有補(bǔ)肺腎、養(yǎng)精血、止咳平喘、祛風(fēng)定驚、解毒通絡(luò)散結(jié)等功效。早在1978 年，駱和生等人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明天龍對(duì)結(jié)核桿菌有抑制作用，對(duì)致病性真菌有抑制作用，此后關(guān)于天龍?jiān)谂R 床結(jié)核病的應(yīng)用日漸增多，并顯示出很好的療效。主要用于肺結(jié)核、脊柱結(jié)核、胸腰椎結(jié)核、淋巴結(jié)核、 頸淋巴結(jié)核或腫大以及骨與關(guān)節(jié)結(jié)核(骨癆)等。如焦起周等用回生膏外敷加服復(fù)方中藥湯劑治療結(jié)核 病355例；李守信等用攻瘰丹、化離散加消核膏埋入或外貼治療淋巴結(jié)核1239:例，治愈率98.3%總有效 率99.9%。于立君等人的專(zhuān)利申請(qǐng)"治療結(jié)核病的中藥及其制作方法"(專(zhuān)利號(hào)03132605.6)報(bào)道了天龍 用于治療瘰疬結(jié)核，雖然天龍治療結(jié)核有效，但是關(guān)于天龍抗結(jié)核的藥理活性成分未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種抗多耐藥結(jié)核桿菌的抗菌多肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述抗菌肽用于但不限于結(jié)核分枝桿菌的抑制。 本發(fā)明所述抗菌肽用于但不限于多耐藥結(jié)核菌感染的治療。
本發(fā)明所述天龍抗菌肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。 使用本發(fā)明所述的天龍抗菌肽，對(duì)于結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)有抑制作用。
本發(fā)明所述的抗菌肽、多耐藥結(jié)核病、結(jié)核分枝桿菌，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，現(xiàn)代的醫(yī)學(xué) 書(shū)籍中有其準(zhǔn)確的定義。
通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的天龍抗菌肽的制備和應(yīng)用進(jìn)行描述。需說(shuō)明的是，下述實(shí)施例只是用來(lái) 說(shuō)明而非限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他常用制備方法及其他引起結(jié)核病的分支桿菌均在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例一天龍抗菌肽的制備方法
將天龍干藥材粉碎過(guò)80目篩，稱(chēng)取2500g藥粉，用4500ml用蒸餾水混勻泡脹，4度冰箱靜置24hr, 低溫高速離心得上清800ml， 0.45um膜過(guò)濾即得到天龍抗菌肽粗提液，將粗提液過(guò)固相萃取柱ODS -SPE (C18，封端)，分別用水和甲醇洗脫，凍干得到水溶部分和醇溶部分，經(jīng)HPLC色譜分析(ODS C18柱， SHIMADZU 150L*4.6),甲醇溶部分經(jīng)凝膠過(guò)濾柱層析，透析脫鹽和反相高壓液相色譜分離純化即得多肽。 其中
凝膠過(guò)濾柱層析為將收集的天龍凍干粉溶于蒸餾水后上樣于S印hadex G-50凝膠過(guò)濾柱，凝膠過(guò)濾 柱長(zhǎng)1000mm,直徑26mm,用0.01MNa2HPO4—NaH2PO4 pH6.5緩沖液洗脫,收集70分鐘以后的峰。
反相高壓液相色譜為:凝膠過(guò)濾柱層析得到的活性成分峰上樣于經(jīng)含0.1%三氟醋酸的超純水平衡的 C18反相柱,柱長(zhǎng)250mm直徑10mm，用含0.1%三氟醋酸的甲醇從10%到100%的梯度洗脫,收集時(shí)間為 16.2分鐘處的峰。
然后用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
在上述制備所得的天然提取抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，即得到一種合成抗菌肽， 肽一級(jí)全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸一半胱氨酸一谷氨酸一組氨酸一異亮氨酸一組氨酸一亮氨酸一異亮氨酸一精氨酸一甘氨酸一亮氨酸一半胱氨酸一 組氨酸一組氨酸一亮氨酸一甲硫氨酸一組氨酸一半胱氨酸一酪 氨酸一異亮氨酸一賴(lài)氮酸 一精氨酸(NH2-VCEHIHLIRGLCHHLMHCYIKR-COOH)
天然抗菌肽衍生物的制備過(guò)程包括首先設(shè)計(jì)合成編碼抗菌肽基因，將抗菌肽的編碼基因克隆到載 體pPIC9載體中，然后轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。有關(guān)的DNA分離、純化、PCR擴(kuò)增、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J(rèn).沙穆克魯克等編著的《分子克隆試驗(yàn)指南》 進(jìn)行。
實(shí)施例二抗菌肽對(duì)分支桿菌的抑菌作用研究
1. 培養(yǎng)基
7H9瓊脂半流培養(yǎng)基Middlebrook 7H9干粉(SIGMA M0178) 4. 7g，丙三醇4ml，瓊脂粉0. 5g，加 蒸餾水至900ml， 15磅121。C高壓滅菌10分鐘，冷卻后加入0ADC至1000ml，待用。 蘇通半流體培養(yǎng)基稱(chēng)取谷氨酸鈉4.0 g,枸櫞酸1 g, K2HP040.25 g， MgS04 7H20 0.25 g，枸櫞酸 鐵銨0.025 g,甘油15ml,瓊脂粉0.25 g,加入蒸餾水后加熱使其完全溶解，冷卻后以8% Na0H調(diào) pH至7.2，用蒸餾水定容至500ml,分裝，121'C高壓滅菌20分鐘，待用。
2. 藥物對(duì)照藥品為異煙肼；測(cè)試藥品為天龍抗菌肽。
3. 菌株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株6)fyco6a"eWuffl z^6ercwiosi's H37Rv, ATCC 27294);金色分枝桿菌 況at/27碼^ rc^^6e;;耐異煙肼結(jié)核桿菌株；多耐藥結(jié)核桿菌株:耐利福平結(jié)核桿菌株
4. 藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)肉眼觀察各個(gè)培養(yǎng)管中分支桿菌的生長(zhǎng)，并同麥?zhǔn)媳葷峁?號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)比 濁，無(wú)分支桿菌生長(zhǎng)表示有分支桿菌生長(zhǎng)并同1號(hào)比濁管相近表示"+";同2號(hào)比濁管相近 表示"++"，依次類(lèi)推,其中+號(hào)的多少反映出分支桿菌相對(duì)生長(zhǎng)的多少。
操作步驟
將藥液倍比稀釋為3個(gè)梯度，分別為20ng/ml ， 1(Hig/ml , 5ng/ml， 2.5pg/ml, 1.25ng/m。 接種菌株取分枝桿菌新鮮分支桿菌，加0.5先Tween-80生理鹽水磨菌稀釋?zhuān)c1號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔?成lmg/ml菌液上述新鮮菌落，稀釋成10—3ntg/ml菌液，每管培養(yǎng)基接種0. lml。最終接種量為10 4mg。 37'C溫箱孵育15天觀察結(jié)核菌生長(zhǎng)
實(shí)驗(yàn)為雙管平行操作，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，取平均值，結(jié)果如表一
表一天龍抗菌肽抑制結(jié)核菌生長(zhǎng)的作用
最小抑菌濃度(ug/ml)
菌株
天龍抗菌肽結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv2. 5
金色分枝桿菌
5.0
耐異煙肼結(jié)核桿菌株10.0
耐利福平結(jié)核桿菌株10.0
多耐藥結(jié)核桿菌株10.0實(shí)施例三
女，41歲，2000年時(shí)因咳嗽、咳痰，拍片檢査診斷為肺結(jié)核，用異煙肼、利復(fù)平、吡嗪酰胺、乙胺 丁醇治療后病情無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，藥敏試驗(yàn)為多耐藥難治性結(jié)核(耐異煙肼、利復(fù)平)，咳嗽、咳痰，痰菌 陽(yáng)性，且肺上有空洞。口服所述抗菌肽20mg, tid，維持3周，空洞閉合，痰菌陰轉(zhuǎn)，臨床癥狀消失，遂 停藥。
實(shí)施例四
男，59歲。2001年時(shí)因咳嗽、咳痰、乏力不適，拍片檢査發(fā)現(xiàn)患空洞型肺結(jié)核，用異煙肼、利福平、 乙胺丁醇等抗結(jié)核治療，病情無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，經(jīng)?？人?、咳痰、盜汗、納差，痰菌3(+),且藥敏試驗(yàn)為多耐 藥難治性結(jié)核，胸片顯示兩肺繼發(fā)型肺結(jié)核伴空洞。2004年用天龍抗菌肽40mg， tid,治療4周，患者無(wú) 不適癥狀，痰菌陰轉(zhuǎn)，空洞閉合，胸片上病灶穩(wěn)定，遂停藥。序列表
<110>工鶴堯
< 120〉 ■-種治療結(jié)核桿齒感染的基W 丁程合成多肽藥物制備和應(yīng)用 <丄60〉 I <400〉 J
Vai Cys Glu Arg I,eu Arg Val Va.l Arg Ala 1 5 10
I-euCys ArgArg Va'lMet Arg Trp Val His
15 20
Arg
<210> 1 <211〉 21 <213>人T.序列 <220〉
<221> Cf腦
權(quán)利要求
1.一種合成抗菌肽，其特征在于該抗菌肽是依據(jù)天龍中天然分離多肽而衍生合成得到的一種單鏈多肽。
2. 權(quán)利要求1所述多肽全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸一半胱氨酸一谷氨酸一組氨酸一異亮氨酸一組氨酸一亮 氨酸一異亮氨酸一精氨酸一甘氨酸一亮氨酸一半胱氨酸一組氨酸一組氨酸一亮氨酸一甲硫氨酸一組 氨酸一半胱氨酸一酪氨酸一異亮氨酸一賴(lài)氨酸一精氨酸(NH2-VCEHIHLIRGLCH肌MHC YIKR-COOH )。
3. 權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽在治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽在制備治療多耐藥結(jié)核桿菌包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染 疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供一種天龍抗菌肽衍生物制備方法，用于治療結(jié)核桿菌的感染。天龍抗菌肽衍生物，為依據(jù)中國(guó)兩棲類(lèi)動(dòng)物天龍中分離得到的天然多肽而合成的一種單鏈多肽，多肽一級(jí)全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸—半胱氨酸—谷氨酸—組氨酸—異亮氨酸—組氨酸—亮氨酸—異亮氨酸—精氨酸—甘氨酸—亮氨酸—半胱氨酸—組氨酸—組氨酸—亮氨酸—甲硫氨酸—組氨酸—半胱氨酸—酪氨酸—異亮氨酸—賴(lài)氨酸—精氨酸(NH2-VCEHIHLIRGLCHHLMHCYIKR-COOH)。天龍抗菌肽衍生物藥物可顯著抑制包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌生長(zhǎng)，可應(yīng)用于治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101293928SQ20071009728
公開(kāi)日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者孔繁翠, 王鶴堯, 葵 邱, 鄭文婕, 昊 顧 申請(qǐng)人:王鶴堯;鄭文婕