專利名稱：草珊瑚提取方法、提取物及其藥物組合物與用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai中獲取能保護肝損傷的提取物，這種提取物的制備方法，含有這種提取物的藥物組合物，以及這種提取物和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是制備保護肝損傷藥物的應用。
背景技術：
草珊瑚是是金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai的全草，能清熱解毒、祛風活血、消腫止痛、抗菌消炎。主治流行性感冒、流行性乙型腦炎、肺炎、闌尾炎、盆腔炎、跌打損傷、風濕關節(jié)痛、閉經、創(chuàng)口感染、痢疾等。近十多年，乙肝在我國蔓延甚廣，乙肝病毒攜帶率平均為10％，每年約有30萬人死于慢性肝病，占全國死亡人數(shù)的3.65％。目前肝炎仍存在很大的治療問題，因此需要尋找毒性小而有特效的新藥。中藥在抗病毒、改善和恢復肝功能、調節(jié)免疫以及抗肝纖維化等方面顯示出極大的療效。從中藥中尋找抗肝炎藥物是新藥開發(fā)研究的重要途徑之一。但目前臨床上用的中藥復方制劑有效成分不明確、作用機理不清楚，療效不穩(wěn)定，嚴重影響了臨床上的使用以及中藥進入國際主流市場，因此從傳統(tǒng)藥物和天然資源中尋我特效抗肝炎藥物是醫(yī)藥科研工作者今后相當長時間內的迫切任務。
在我們的研究中首次發(fā)現(xiàn)草珊瑚提取物具有保護肝損傷的作用，草珊瑚來源于天然，而且能夠大量栽培，生產成本低，有望開發(fā)成具有競爭力的治療肝炎的中藥新藥，故申請草珊瑚提取物的制造方法和保肝作用專利。

發(fā)明內容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從草珊瑚中提取的提取物。
本發(fā)明的另一目的在于提供多種制備這種提取物的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種藥物組合物，包括作為活性成分的本發(fā)明草珊瑚提取物及制藥領域中常用的載體。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種草珊瑚和/或提取物，或含有草珊瑚和/或提取物的組合物在制備保肝藥物中的應用。
為了完成本發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下的技術方案草珊瑚原藥材經干燥并適當?shù)姆鬯?，以利增大與溶劑的接觸面積提高效率。
原藥材的提取溶劑使用水、醇類、或水與醇類的混合物。優(yōu)選的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，最優(yōu)選的是乙醇，乙醇濃度為體積比50～100％；優(yōu)選的濃度為體積比70～95％。提取時溶劑量為原藥重量的4～14倍。提取可以在靜態(tài)或動態(tài)下，優(yōu)選在動態(tài)條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如20℃)到溶劑回流溫度的范圍內，優(yōu)選在回流的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進行，間歇提取時可重復2～5次。提取時間是1小時到4小時，優(yōu)選為2.5到3小時。
上步結束后，合并濾液，濾去藥渣。濾液在動態(tài)狀態(tài)下，在常壓或減壓加熱濃縮成膏狀，優(yōu)選減壓濃縮。膏狀物進行純化，通過萃取、大孔樹脂柱層析，得到的有效部位。萃取劑為水和常用有機溶劑(如石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等等)；洗脫劑是水、醇類、水與醇類的混合物。
提取液也可以直接用交換柱和膜技術進行精制濃縮后，再成浸膏或干粉?？梢允褂玫慕粨Q柱包括大孔樹脂、聚酰胺、葡聚糖凝膠等；優(yōu)選大孔樹脂、聚酰胺。
提取物可經冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可把濃縮液體直接噴霧干燥成干粉進行各種制劑成型。
本發(fā)明還涉及以本發(fā)明提取物作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據本領域公知的方法制備。可通過將本發(fā)明提取物與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，制成適于人或動物使用的任何劑型。本發(fā)明提取物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。
本發(fā)明提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。
為了將本發(fā)明提取物制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將本發(fā)明提取物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明提取物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明提取物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。
為將本發(fā)明提取物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領域常用的增溶劑、助溶劑、pH調劑劑、滲透壓調節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH調劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。
根據本發(fā)明的思路，草珊瑚提取物進行了與保護肝損傷有關的藥理試驗。D-GalN，CCl4，ConA是近年來許多國內外學者倡導的肝損傷動物模型誘導劑。許多研究均認為D-GalN，CCl4，ConA復制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現(xiàn)出來的癥狀、肝功能檢測指標、肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性。雖然病因不同，但病理解剖、病理生理諸方面改變與病毒性肝炎接近。在我國衛(wèi)生部頒布的《中藥藥理實驗指導原則》中明確指定應用D-GalN，CCl4，ConA肝損傷動物模型進行保肝降酶新藥的藥理實驗。應用D-GalN，CCl4，ConA復制肝損傷動物模型條件要求低、技術易于掌握，可靠性強、重復性好，都是其它任何肝損傷動物模型無法比擬的?；谝陨显?，故目前研究抗肝損傷新藥常采用D-GalN，CCl4，ConA復制動物模型。
我們發(fā)現(xiàn)草珊瑚提取物在四氯化碳(CCl4)，刀豆蛋白A(ConA)，D-GalN(半乳糖胺)誘導小鼠肝損傷模型中顯示出優(yōu)良的肝保護作用。
陽性對照藥物為雙環(huán)醇(bicyclol)，雙環(huán)醇是中國醫(yī)學科學院藥物研究所研究開發(fā)的新一代抗肝炎藥，對多種化學毒物和致癌物引起的肝損傷均有明顯的保護作用。
草珊瑚提取物對ConA引起小鼠肝損傷的保護作用研究中，將動物隨機分為正常對照組，ConA模型組，雙環(huán)醇對照組(200mg/10ml/kg)和給藥組。除正常對照組和模型組外，各給藥組和雙環(huán)醇組分別于給ConA前24小時，8小時和1小時分別口服給藥一次，對照組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組均靜脈注射ConA，劑量為26mg/kg，體積20ml/kg。禁食過夜。給予ConA 16小時后將動物斷頭處死，取血，測定血清中丙谷轉氨酶(ALT)的含量。實驗結果表明，95％乙醇提取物(草珊瑚A)及其經萃取的氯仿部分(草珊瑚B)、水提醇沉提取物上大孔樹脂的95％乙醇洗脫部分(草珊瑚C)和70％乙醇提取物上大孔樹脂洗脫的70％乙醇洗脫部分(草珊瑚D)對肝損傷有明顯的保護作用。
草珊瑚提取物對CCl4引起小鼠肝損傷的保護作用研究中，將動物隨機分為正常對照組，CCl4模型組，雙環(huán)醇對照組和給藥組。給藥組在給予CCl4前24小時，8小時和1小時分別口服受試藥三次，正常對照組和CCl4模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組動物均于末次給藥后1小時腹腔注射0.13％CCl4花生油溶液，體積為10ml/kg，禁食過夜。給予CCl416小時后將動物斷頭處死，取血并分離血清，測定血清中ALT的含量。實驗結果表明，水提醇沉提取物(草珊瑚E)對肝損傷有明顯的保護作用。
草珊瑚提取物對D-GalN引起肝細胞損傷的保護作用研究中，用含3％小牛血清，penicillin(100 units/ml)，streptomycin(100μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基配制成1×104/ml細胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內接種，每孔200ul，置37℃，5％CO2溫箱內培養(yǎng)24小時后加入受試樣品(5μg/ml或1×10-4M)和雙環(huán)醇，溫孵1小時后加入40mM D-GalN或25mM APAP，設空白對照組，再溫孵24小時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.5mg/ml)，37℃孵育3.5小時。棄上清液，每孔加入DMSO 150ul，溶解Fomazan顆粒，輕度振蕩后，在檢測波長492nm下測定OD值。結果顯示70％乙醇部位保肝活性顯著。
為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明提取物藥物組合物的給藥劑量依照所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明提取物的每天的合適劑量范圍為0.001-250mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-200mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-100mg/Kg體重，最優(yōu)選為20-80mg/Kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。
本發(fā)明的提取物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對癥藥物合并使用。當本發(fā)明的提取物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時，應根據實際情況調整它的劑量。
具體實施例方式
下面的實施例及藥物活性實驗用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
提取實驗實施例1 95％乙醇提取物草珊瑚1kg，粉碎后，95％乙醇回流3次(3Kg 95％乙醇/次)，每次2小時，減壓濃縮得到浸膏，提取率8％。此浸膏用水稀釋并用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到了氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分，經藥理篩選，95％乙醇提取物(草珊瑚A)，氯仿部分(草珊瑚B)具有保肝作用。
實施例2 水提取物草珊瑚1kg，粉碎后，水回流3次(3Kg水/次)，每次2小時，減壓濃縮至小體積，隨后加95％乙醇至溶液中的乙醇濃度達到70％(草珊瑚E)，過濾，濾液減壓濃縮得到草珊瑚提取物。隨后提取物上大孔樹脂，分別用30％，50％，95％乙醇洗脫，經藥理篩選95％乙醇洗脫部分(草珊瑚C)具有抗肝炎作用。
實施例3 70％乙醇提取物草珊瑚1kg，粉碎后，70％乙醇回流3次(3Kg 70％乙醇/次)，每次2小時，減壓濃縮得到浸膏，提取率10％。此浸膏用水稀釋，然后上大孔樹脂，分別用30％，70％，95％乙醇洗脫，經藥理篩選70％乙醇洗脫部分(草珊瑚D)具有抗肝炎作用。
藥理實驗試驗材料 1、受試藥本發(fā)明的各種提取物。2、陽性對照藥雙環(huán)醇，有北京協(xié)和藥廠提供，HPLC檢測純度＞98％。3、實驗動物ICR小鼠，雄性，體重18～22克，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCDK(京)2002-0003。4、D-GalN，ConA美國sigma公司生產，CCl4購自北京化工廠。
實驗例1 草珊瑚提取物對ConA引起小鼠肝損傷的保護作用研究將動物隨機分為正常對照組，ConA模型組，雙環(huán)醇對照組(200mg/10ml/kg)和給藥組。除正常對照組和模型組外，各給藥組和雙環(huán)醇組分別于給ConA前24小時，8小時和1小時分別口服給藥一次，對照組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組均靜脈注射ConA，劑量為26mg/kg，體積20ml/kg。禁食過夜。給予ConA 16小時后將動物斷頭處死，取血，測定血清中ALT的含量。

與對照組比較***P＜0.001

與對照組比較**P＜0.01，***P＜0.001

與對照組比較**P＜0.01，實驗例2 草珊瑚提取物對CCl4引起小鼠急性肝損傷的保護作用研究草珊瑚提取物對CCl4引起小鼠急性肝損傷的保護作用研究中，將動物隨機分為正常對照組，CCl4模型組，雙環(huán)醇對照組和給藥組。給藥組在給予CCl4前24小時，8小時和1小時分別口服受試藥三次，正常對照組和CCl4模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組動物均于末次給藥后1小時腹腔注射0.13％CCl4花生油溶液，體積為10ml/kg，禁食過夜。給予CCl416小時后將動物斷頭處死，取血并分離血清，測定血清中ALT和AST的含量。

與對照組比較**P＜0.01，***P＜0.001
實驗例3 草珊瑚提取物對D-GalN引起肝細胞損傷的保護作用研究用含3％小牛血清，penicillin(100units/ml)，streptomycin(100μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基配制成1×104/ml細胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內接種，每孔200ul，置37℃，5％CO2溫箱內培養(yǎng)24小時后加入受試樣品(5μg/ml或1×10-4M)和雙環(huán)醇，溫孵1小時后加入40mM D-GalN，設空白對照組，再溫孵24小時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.5mg/ml)，37℃孵育3.5小時。棄上清液，每孔加入DMSO 150ul，溶解Fomazan顆粒，輕度振蕩后，在檢測波長492nm下測定OD值。結果顯示70％乙醇(草珊瑚D)部位保肝活性顯著。

權利要求
1.草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai在制備保肝藥物中的應用。
2.草珊瑚提取物的提取方法，其特征在于，原藥材草珊瑚用溶劑提取，合并提取液，濃縮，再進行純化。
3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的溶劑選自水、醇類、或水與醇類的混合物。
4.根據權利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述的醇是甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇或其混合物。
5.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的提取為在溫度為從20℃到溶劑回流溫度的范圍進行。
6.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，純化是通過萃取、大孔樹脂柱層析。
7.權利要求2-6中任一提取方法制備的草珊瑚提取物。
8.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥物有效劑量的，作為活性成分的如權利要求7的草珊瑚提取物及藥學上可接受的載體。
9.根據權利要求8的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
10.權利要求7的草珊瑚提取物在制備保肝藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai中獲取能保護肝損傷的提取物，這種提取物的制備方法，含有這種提取物的藥物組合物，以及這種提取物和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是制備保護肝損傷藥物的應用。
文檔編號A61K9/20GK101057877SQ20071009785
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權日2006年4月21日
發(fā)明者張東明, 李燕, 李媛, 李燁, 李建北, 陳暉 , 楊敬芝 申請人:中國醫(yī)學科學院藥物研究所