專利名稱：一種制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備高純度生物原料藥的方法，特別是一種制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法。
背景技術(shù)：
胰激肽原酶是一種具有擴(kuò)張血管改善微循環(huán)作用的周?chē)軘U(kuò)張藥。它能夠激活纖溶酶，抑制磷脂酶A2，具有降低血粘度，防止血小板聚集，防止血栓形成等作用。其主要用于微循環(huán)障礙性疾病，如糖尿病引起的腎病、周?chē)窠?jīng)病、視網(wǎng)膜病、眼底病及缺血性腦血管病的治療，也可用于高血壓病的輔助治療。
胰激肽原酶是從哺乳動(dòng)物的胰臟中經(jīng)提取純化而得到的，即從胰臟本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品(中間體)中提取，并通過(guò)純化而制得?，F(xiàn)有胰激肽原酶的純化方法包括使用多糖非樹(shù)脂物料進(jìn)行純化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一種弱堿性陰離子交換纖維素上并分離(見(jiàn)日本專利發(fā)行No.11697/62)；或者將一種鋁鹽或者鋅鹽加入含有胰激肽原酶的水溶液中，將產(chǎn)生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱堿性的陰離子交換纖維素上或交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)上，并分離之(見(jiàn)日本公開(kāi)專利發(fā)行No.56886/73)；另一種已知的純化方法是使用離子交換樹(shù)脂，即加入一種蛋白質(zhì)沉淀劑到胰臟提取液中，產(chǎn)生的胰激肽原酶吸附到大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，并分離之(見(jiàn)日本公開(kāi)專利No.103715/73)。然而，利用上述多糖型非樹(shù)脂物料進(jìn)行吸附的方法缺點(diǎn)是離子交換物料的物理強(qiáng)度不夠，不能進(jìn)行大規(guī)模制備。而離子交換樹(shù)脂法不能使產(chǎn)品在洗脫時(shí)除去不需要的雜質(zhì)。因此，上述方法得到產(chǎn)品的純度還有待于進(jìn)一步提高。
《中國(guó)生化藥物雜志》2005Vol.26No.1P.37-38《離子交換色譜法制備高純度胰激肽原酶》作者張建新、姜標(biāo)、劉長(zhǎng)亮。
發(fā)明人原來(lái)采用的方法是通過(guò)離子交換色譜法一步純化胰激肽原酶粗品，采用3-4倍丙酮沉淀，純化得到的胰激肽原酶，比活在300U/mg蛋白質(zhì)以上，活性回收率在65％以上。但是原有PK洗脫液的價(jià)格極高，而且在使用丙酮沉淀過(guò)程中會(huì)造成大量的損失。而且純度也不高。為了解決以上種種問(wèn)題，發(fā)明人采用了新的工藝方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，該方法由胰激肽原酶中間體在優(yōu)化的分離條件下，經(jīng)過(guò)QAE-SepharoseFast Flow離子柱層析純化制得的激肽原酶原料藥。該原料藥的純度高達(dá)75％以上，效價(jià)增加55單位/mg以上，比活達(dá)到350單位/mg蛋白以上，參見(jiàn)表1和表2。
本發(fā)明的方法如下1.配制配制0.15-0.5mol/L的NH4AC緩沖液和0.1-0.5mol/L的NH4AC緩沖液，調(diào)整至pH6.0，并測(cè)電導(dǎo)值；2.層析2.1平衡將裝有QAE-Sepharose Fast Flow離子柱填料的層析柱，用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC緩沖液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值一致、電導(dǎo)值相同后平衡完畢；2.2進(jìn)樣調(diào)胰激肽原酶中間體的pH值與平衡液相近(6.1～6.2)，電導(dǎo)值略低于平衡液電導(dǎo)值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根據(jù)每升填料最大交換量2000萬(wàn)單位計(jì)算上樣量，將上樣液上柱；2.3洗滌用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC緩沖液沖洗柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在280nm處的吸收值，沖洗至洗出液的OD值低于0.5時(shí)停止；2.4洗脫用pH6.0的0.1-0.5mol/L的NH4AC緩沖液洗脫柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)其在253nm處的吸收值，收集峰液；3.超濾脫鹽將收集液加純化水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于0.1×104μs/cm時(shí)，即可停止加純化水，繼續(xù)濃縮；4.濃縮液過(guò)濾；5.加輔料凍干；6.過(guò)篩、分裝。
在上述方法中優(yōu)選使用下列條件進(jìn)行操作在步驟1中，配制0.15mol/L的NH4AC緩沖液和0.5mol/L的NH4AC
緩沖液時(shí)分別用乙酸和氨水調(diào)整pH。
在步驟2中，所用的層析柱為￠40cm，體積為50L；以洗脫液效價(jià)大于50單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于50單位/cm為洗脫收集終點(diǎn)，收集峰液體積約為30～60L。
在步驟3中，超濾脫鹽的截留分子量為10000dt；當(dāng)濃縮至液體體積6～11L時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，純化水沖膜，至回管效價(jià)低于50單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣送檢。
在步驟4中，將濃縮液用0.22μm膜的筒式過(guò)濾器過(guò)濾，得過(guò)濾濃縮液。
在步驟5中，加輔料凍干的具體步驟如下根據(jù)濃縮液的效價(jià)，控制成品比活力350單位/mg蛋白以上和效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算明膠、乳糖的用量，分別用注射用水加熱溶解并通過(guò)0.22μm膜過(guò)濾，待冷卻，加入過(guò)濾濃縮液中，混合后進(jìn)凍干箱凍干。凍干工藝條件為預(yù)凍制品溫度-20℃--40℃，視盤(pán)中液量，保溫2-4小時(shí)。升華導(dǎo)熱油升溫速度10℃/小時(shí)，至油溫升至30℃，過(guò)程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥制品溫度達(dá)23℃時(shí)，保溫4小時(shí)以上直至干燥終點(diǎn)。
在步驟6中，將凍干好的成品粉碎并過(guò)80目篩并混合均勻后用藥用復(fù)合袋分裝，裝于鋁聽(tīng)內(nèi)，加蓋密封。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.配制洗脫液配制0.15mol/L的NH4AC緩沖液和0.5mol/L的NH4AC緩沖液，分別用乙酸和氨水調(diào)整至pH6.0，并測(cè)電導(dǎo)值。
2.層析2.1裝柱平衡將離子柱填料QAE-Sepharose Fast Flow裝于￠40cm，體積為50L的層析柱中，用pH6.0的0.15mol/L的NH4AC緩沖液平衡，直至進(jìn)出溶液pH值一致、電導(dǎo)值相同后平衡完畢。
2.2進(jìn)樣調(diào)胰激肽原酶中間體pH值與平衡液相近(6.1～6.2)，
電導(dǎo)值略低于平衡液電導(dǎo)值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根據(jù)每升填料最大交換量2000萬(wàn)單位，計(jì)算上樣量。將上樣液上柱。
2.3洗滌用pH6.0的0.5mol/L的NH4AC緩沖液沖洗柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在280nm處的吸收值，沖洗至洗出液OD值低于0.5時(shí)停止。
2.4洗脫用pH6.0的0.5mol/L的NH4AC緩沖液洗脫柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)其在253nm處的吸收值，收集峰液。
3.超濾脫鹽3.1將收集液加純化水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于0.1×104μs/cm以下時(shí)，即可停止加純化水，繼續(xù)濃縮。
3.2當(dāng)濃縮至液體體積6～11L時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，純化水沖膜，至回管效價(jià)低于50單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣送檢。
4.濃縮液過(guò)濾將濃縮液用0.22μm膜的筒式過(guò)濾器過(guò)濾，得過(guò)濾濃縮液。
5.加輔料凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)，控制成品比活力350單位/mg蛋白以上和效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算明膠、乳糖的用量。并分別用注射用水加熱溶解并通過(guò)0.22μm膜過(guò)濾，待冷卻至25℃以下，加入過(guò)濾濃縮液中混合均勻后進(jìn)凍干箱凍干。凍干時(shí)每盤(pán)均勻分裝1～3L液體，視液體總量而定，凍干。凍干工藝條件為預(yù)凍制品溫度-20℃--40℃，視盤(pán)中液量，保溫2-4小時(shí)。升華導(dǎo)熱油升溫速度10℃/小時(shí)，至油溫升至30℃，過(guò)程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥制品溫度達(dá)23℃時(shí)，保溫4小時(shí)以上直至干燥終點(diǎn)。
6.過(guò)篩、分裝將凍干好的成品粉碎并過(guò)80目篩并混合均勻后用藥用復(fù)合袋分裝，裝于鋁聽(tīng)內(nèi)，加蓋密封。
實(shí)施例21.配制洗脫液配制0.5mol/L的NH4AC緩沖液和0.1mol/L的NH4AC緩沖液，分別用乙酸和氨水調(diào)整至pH6.0，并測(cè)電導(dǎo)值。
2.層析2.1裝柱平衡將離子柱填料QAE-Sepharose Fast Flow裝于￠40cm，體積為50L的層析柱中，用pH6.0的0.15mol/L的NH4AC緩沖液平衡，直至進(jìn)出溶液pH值一致、電導(dǎo)值相同后平衡完畢。
2.2進(jìn)樣調(diào)胰激肽原酶中間體pH值與平衡液相近(6.1～6.2)，電導(dǎo)值略低于平衡液電導(dǎo)值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根據(jù)每升填料最大交換量2000萬(wàn)單位，計(jì)算上樣量。將上樣液上柱。
2.3洗滌用pH6.0的0.5mol/L的NH4AC緩沖液沖洗柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在280nm處的吸收值，沖洗至洗出液OD值低于0.5時(shí)停止。
2.4洗脫用pH6.0的0.1mol/L的NH4AC緩沖液洗脫柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)其在253nm處的吸收值，收集峰液。
3.超濾脫鹽3.1將收集液加純化水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于0.1×104μs/cm以下時(shí)，即可停止加純化水，繼續(xù)濃縮。
3.2當(dāng)濃縮至液體體積6～11L時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，純化水沖膜，至回管效價(jià)低于50單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣送檢。
4.濃縮液過(guò)濾將濃縮液用0.22μm膜的筒式過(guò)濾器過(guò)濾，得過(guò)濾濃縮液。
5.加輔料凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)，控制成品比活力350單位/mg蛋白以上和效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算明膠、乳糖的用量。并分別用注射用水加熱溶解并通過(guò)0.22μm膜過(guò)濾，待冷卻至25℃以下，加入過(guò)濾濃縮液中混合均勻后進(jìn)凍干箱凍干。凍干時(shí)每盤(pán)均勻分裝1～3L液體，視液體總量而定，凍干。凍干工藝條件為預(yù)凍制品溫度-20---40℃，視盤(pán)中液量，保溫2-4小時(shí)。升華導(dǎo)熱油升溫速度10℃/小時(shí)，至油溫升至30℃，過(guò)程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥制品溫度達(dá)23℃時(shí)，保溫4小時(shí)以上直至干燥終點(diǎn)。
6.過(guò)篩、分裝將凍干好的成品粉碎并過(guò)80目篩并混合均勻后用藥用復(fù)合袋分裝，裝于鋁聽(tīng)內(nèi)，加蓋密封。
實(shí)施例31.配制洗脫液配制0.35mol/L的NH4AC緩沖液和0.3mol/L的NH4AC緩沖液，分別用乙酸和氨水調(diào)整至pH6.0，并測(cè)電導(dǎo)值。
2.層析
2.1裝柱平衡將離子柱填料QAE-Sepharose Fast Flow裝于￠40cm，體積為50L的層析柱中，用pH6.0的0.15mol/L的NH4AC緩沖液平衡，直至進(jìn)出溶液pH值一致、電導(dǎo)值相同后平衡完畢。
2.2進(jìn)樣調(diào)胰激肽原酶中間體pH值與平衡液相近(6.1～6.2)，電導(dǎo)值略低于平衡液電導(dǎo)值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根據(jù)每升填料最大交換量2000萬(wàn)單位，計(jì)算上樣量。將上樣液上柱。
2.3洗滌用pH6.0的0.35mol/L的NH4AC緩沖液沖洗柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在280nm處的吸收值，沖洗至洗出液OD值低于0.5時(shí)停止。
2.4洗脫用pH6.0的0.3mol/L的NH4AC緩沖液洗脫柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)其在253nm處的吸收值，收集峰液。
3.超濾脫鹽3.1將收集液加純化水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于0.1×104μs/cm以下時(shí)，即可停止加純化水，繼續(xù)濃縮。
3.2當(dāng)濃縮至液體體積10L時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，純化水沖膜，至回管效價(jià)低于50單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣送檢。
4.濃縮液過(guò)濾將濃縮液用0.22μm膜的筒式過(guò)濾器過(guò)濾，得過(guò)濾濃縮液。
5.加輔料凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)，控制成品比活力350單位/mg蛋白以上和效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算明膠、乳糖的用量。并分別用注射用水加熱溶解并通過(guò)0.22μm膜過(guò)濾，待冷卻至25℃以下，加入過(guò)濾濃縮液中混合均勻后進(jìn)凍干箱凍干。凍干時(shí)每盤(pán)均勻分裝1～3L液體，視液體總量而定，凍干。凍干工藝條件為預(yù)凍制品溫度-20℃--40℃，視盤(pán)中液量，保溫2-4小時(shí)。升華導(dǎo)熱油升溫速度10℃/小時(shí)，至油溫升至30℃，過(guò)程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥制品溫度達(dá)23℃時(shí)，保溫4小時(shí)以上直至干燥終點(diǎn)。
6.過(guò)篩、分裝將凍干好的成品粉碎并過(guò)80目篩并混合均勻后用藥用復(fù)合袋分裝，裝于鋁聽(tīng)內(nèi)，加蓋密封。
表1原料藥的新工藝與原有技術(shù)純度對(duì)比表選擇五個(gè)批號(hào)

結(jié)論新技術(shù)方案純度較高原有技術(shù)方案發(fā)明人原來(lái)采用的方法是通過(guò)離子交換色譜法一步純化胰激肽原酶粗品，采用3-4倍丙酮沉淀，純化得到的胰激肽原酶。
新工藝標(biāo)準(zhǔn)采用新技術(shù)方案表2原料藥的新工藝與原有技術(shù)主要指標(biāo)對(duì)比表

結(jié)論新工藝技術(shù)生產(chǎn)產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于原有技術(shù)表3不同的凍干溫度對(duì)純度和pH的影響

結(jié)論-20℃----40℃純度較高，pH更穩(wěn)定
權(quán)利要求
1.一種制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其特征在于包括以下步驟1.配制配制0.15-0.5mol/L的NH4AC緩沖液和0.1-0.5mol/L的NH4AC緩沖液，調(diào)整至pH6.0，并測(cè)電導(dǎo)值；2.層析2.1平衡將裝有QAE-Sepharose Fast Flow離子柱填料的層析柱，用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC緩沖液平衡，直至進(jìn)出溶液pH值一致、電導(dǎo)值相同后平衡完畢；2.2進(jìn)樣調(diào)胰激肽原酶中間體的pH值與平衡液相近(6.1～6.2)，電導(dǎo)值略低于平衡液電導(dǎo)值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根據(jù)每升填料最大交換量2000萬(wàn)單位計(jì)算上樣量并將上樣液上柱；2.3洗滌用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC緩沖液沖洗柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在280nm處的吸收值，沖洗至洗出液OD值低于0.5時(shí)停止；2.4洗脫用pH6.0的0.1-0.5mol/L的NH4AC緩沖液以500～600ml/min流速洗脫柱子，同時(shí)用分光光度計(jì)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)其在253nm處的吸收值，收集峰液；3.超濾脫鹽將收集液加純化水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于0.1×104μs/cm以下時(shí)，即可停止加純化水，繼續(xù)濃縮；4.濃縮液過(guò)濾；5.加輔料凍干；6.過(guò)篩、分裝。
2.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中層析時(shí)所用層析柱為￠40cm，體積為50L。
3.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中以洗脫液效價(jià)大于50單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于50單位/cm為洗脫收集終點(diǎn)，收集峰液體積約為30～60L。
4.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中超濾脫鹽時(shí)的截留分子量為10000dt。
5.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中步驟3中當(dāng)濃縮至液體體積6～11L時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，純化水沖膜，至回管效價(jià)低于50單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣送檢。
6.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中步驟4中將濃縮液用0.22μm膜的筒式過(guò)濾器過(guò)濾，得過(guò)濾濃縮液。
7.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中加輔料凍干的步驟如下根據(jù)濃縮液的效價(jià)，控制成品比活力350單位/mg蛋白以上和效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算明膠、乳糖的用量，并分別用注射用水加熱溶解并通過(guò)0.22μm膜過(guò)濾，待冷卻至25℃以下，加入過(guò)濾濃縮液中混合均勻后進(jìn)凍干箱凍干；凍干時(shí)每盤(pán)均勻分裝1～3L液體，視液體總量而定；凍干工藝條件為預(yù)凍制品溫度-20℃--40℃，視盤(pán)中液量，保溫2-4小時(shí)。
8.權(quán)利要求1所述的制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其中將凍干好的成品粉碎并過(guò)80目篩并混合均勻后用藥用復(fù)合袋分裝，裝于鋁聽(tīng)內(nèi)，加蓋密封。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備高純度生物原料藥的方法，特別是一種高純度胰激肽原酶原料藥的方法。該方法由胰激肽原酶中間體在優(yōu)化的分離條件下，經(jīng)過(guò)QAE－Sepharose Fast Flow離子柱層析純化制得的激肽原酶的原料藥。該原料藥的純度高達(dá)75％以上，效價(jià)增加55單位/mg以上，比活達(dá)到350單位/mg蛋白以上。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101073666SQ200710098289
公開(kāi)日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者萬(wàn)龍巖, 陳一平, 楊志建 申請(qǐng)人:上海麗珠制藥有限公司