專利名稱：一種修飾的豬圓環(huán)病毒2型orf2基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物病毒學(xué)與基因工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說涉及一種豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的修飾，還涉及該基因修飾后的免疫原性評價及其在新型DNA疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，簡稱PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post-weaning multisystemic syndrome，PMWS)的主要病原。該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)(Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome.Proc Am Assoc Swine Pract，1997，28499-501)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性消瘦，呼吸道癥狀、發(fā)熱及黃疸等。隨后，該疾病相繼在美國、法國、西班牙、北愛爾蘭等國或地區(qū)出現(xiàn)(Daft B等.Interstitial pneumoniaand lymphadenophathy associated with circoviral infection in a six week-old pig.Proc Am AssocVet Lab Diag，1996，3932；Kennedy S等.Porcine circovirus infection in Northern Ireland.Vet Rec，1998，142495-496；LeCann P等.Piglet wasting disease.Vet Rec，1997，141660；Segales J等.First report of post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain.Vet Rec，1997，141600-660)。在國內(nèi)，郎洪武等(郎洪武等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測.中國獸醫(yī)科技，2000，303-5)和曹勝波等(曹勝波等.豬II型圓環(huán)病毒豫A株的全基因組克隆與序列分析.病毒學(xué)報，2000，18137-141)分別通過血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查表明，我國已有PCV2的流行。目前，PCV2已在世界各地廣泛存在并流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了相當大的經(jīng)濟損失。
由于PCV2的生物學(xué)特性比較特殊，它在細胞上增殖滴度很低，而且不引起細胞病變，雖然使用D-氨基葡萄糖處理細胞后病毒滴度可以升高(Tischer I等.Replication of porcine circovirusinduction by glucosamine and cell cycle dependence.Arch Virol，1987，9639-57)，但D-氨基葡萄糖有細胞毒性而使細胞很快死亡，因此用于發(fā)展預(yù)防PCV2的滅活疫苗和弱毒疫苗的難度很大。基于此，利用基因工程方法用于研制PCV2的疫苗(DNA疫苗、亞單位疫苗等)將成為防制該病的重要方向。但亞單位疫苗由于成本過高，在臨床應(yīng)用上將受到很大限制。而DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有許多優(yōu)越性首先是DNA疫苗制備工藝簡單，只需提取質(zhì)粒即可；其次是DNA疫苗所含的抗原很純，沒有蛋白質(zhì)的污染；此外，DNA疫苗可以突破機體母源抗體的干擾，無論機體內(nèi)母源抗體是否存在，DNA疫苗都可以產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，這對斷奶仔豬免疫保護反應(yīng)的產(chǎn)生與維持相當重要。因此，DNA疫苗在PCV2相關(guān)疾病的防制方面具有很廣泛的應(yīng)用前景。
豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，主要定位于細胞核質(zhì)內(nèi)，可自我裝配成病毒樣粒子(Nawagitgul P等.Open reading frame 2 ofporcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein.J Gen Virol，2000，812282-2287)，并且McNeilly等(McNeilly F等.Production，characterization and applications of monoclonalantibodies to porcine circovirus 2.Arch Virol，2001，146909-922)研究證實ORF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原表位，因此是設(shè)計PCV2新型疫苗的首選目標基因。Blanchard等(Blanchard P等.Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)by porcine circovirus type 2(PCV2)proteins.Vaccine，2003，214565-4575)利用PCV2ORF1和ORF2基因的DNA疫苗和亞單位疫苗研究發(fā)現(xiàn)，無論是DNA疫苗還是亞單位疫苗對PCV2感染都具有一定的免疫保護效果，且ORF1和ORF2聯(lián)合免疫的疫苗可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。Kamst等(Kamstrup S等.Immunisation against PCV2 structural protein by DNAvaccination of mice.Vaccine，2004，221358-1361)也用ORF2基因的核酸疫苗免疫小白鼠，發(fā)現(xiàn)在首免后62d小鼠體內(nèi)可檢測到較高的抗體水平。但上述研究均發(fā)現(xiàn)表達ORF2蛋白的DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體及細胞免疫水平不高。Andrew等(Andrew M等.The immunogenicityof VP7，a rotavirus antigen resident in the endoplasmic reticulum，is enhanced by cell surfaceexpression.J Virol，1990，644776-4783)用重組痘苗病毒作為載體研究輪狀病毒VP7蛋白的免疫原性時發(fā)現(xiàn)，野生型VP7的胞內(nèi)定位限制了它免疫原性的發(fā)揮，而表達可錨定于宿主細胞膜表面的修飾型VP7基因可誘導(dǎo)更高的抗體的水平，免疫原性較野生型大大提高?；谶@一發(fā)現(xiàn)，我們對豬2型圓環(huán)病毒的ORF2基因進行了修飾，即根據(jù)人組織纖維蛋白溶酶原激活劑(human tissue plasminogen activator，tpA)的信號肽序列(Tong T Z等.C3d enhanced DNAvaccination induced humoral immune response to glycoprotein C of pseudorabies virus.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，347845-851)和禽流感病毒HA基因跨膜區(qū)的氨基酸序列(Melikyan G B等.Amino acid sequence requirements of thetransmembrane and cytoplasmic domains of influenza virus hemagglutinin for viable membranefusion.Molecular Biology of the Cell，1999，101821-1836)，對ORF2基因進行添加信號肽和跨膜區(qū)的修飾，以達到修飾后的ORF2基因表達蛋白錨定于細胞膜表面，并以DNA疫苗的方式比較了修飾與未修飾的ORF2基因的免疫原性及其誘發(fā)的免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是對豬圓環(huán)病毒2型的ORF2基因進行修飾，使其表達后可錨定于宿主細胞膜表面，獲得一種免疫原性更好的ORF2基因。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達豬圓環(huán)病毒2型修飾的ORF2基因的DNA疫苗。
本發(fā)明的第三個目的是利用本發(fā)明經(jīng)過改造和修飾ORF2基因及表達質(zhì)粒在制備豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實施一種修飾的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
一種修飾的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因是利用人組織纖維蛋白溶酶原激活劑(humantissue plasminogen activator，tpA)的信號肽序列替換天然ORF2基因N-端的41個氨基酸，并缺失ORF2基因終止子，在其C端融合禽流感病毒HA基因跨膜區(qū)序列而獲得。
所述的表達豬圓環(huán)病毒2型修飾的ORF2基因的DNA疫苗是將修飾的ORF2基因插入真核表達載體pcDNA3.1(+)的BamHI與XhoI位點構(gòu)建而成，包含該真核質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α/pcDNA-spORF2Δ41TM，于2007年5月16日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NOM207069。
本發(fā)明還包括上述修飾的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因及真核表達質(zhì)粒在制備豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥疫苗中的應(yīng)用。
更詳細的方案如下列步驟所述一、PCV2 ORF2基因的修飾和表達修飾的ORF2基因的DNA疫苗的構(gòu)建1、引物的設(shè)計根據(jù)人組織纖維蛋白溶酶原激活劑(human tissue plasminogen activator，簡稱tpA)tpA的信號肽(Tong T Z等.C3d enhanced DNA vaccination induced humoral immune response toglycoprotein C of pseudorabies virus.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，347845-851)和禽流感病毒HA基因跨膜區(qū)的氨基酸序列(Melikyan G B等.Amino acidsequence requirements of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza virushemagglutinin for viable membrane fusion.Molecular Biology of the Cell，1999，101821-1836)，利用PCR擴增結(jié)合DNA拼接、克隆的方法(參見J.薩姆布魯克等，王嘉璽等譯.分子克隆實驗指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002年版)對ORF2基因進行添加信號肽和跨膜區(qū)的修飾。通過PCR的方法缺失ORF2基因N端的41個氨基酸，獲得ORF2Δ41基因。在此基礎(chǔ)之上進一步通過PCR方法去掉ORF2Δ41基因的終止子，在其C端融合禽流感病毒HA跨膜區(qū)的氨基酸序列(Melikyan G B，等.Amino acid sequence requirements of the transmembraneand cytoplasmic domains of influenza virus hemagglutinin for viable membrane fusion.MolecularBiology of the Cell，1999，101821-1836)，從而獲得修飾型的ORF2基因(spORF2Δ41TM)。將spORF2Δ41TM基因插入真核表達載體pCDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM。引物P8和P17用于擴增缺失ORF2基因的全部核定位序列(即缺失ORF2基因N端41個氨基酸)和不含終止子的ORF2基因片段，擴增片段大小為582bp，兩端依次設(shè)計EcoRV位點和Not I位點。引物P18和P11用于擴增禽流感病毒HA跨膜區(qū)的氨基酸序列，片段大小為126bp，兩端依次設(shè)計Not I位點和Xho I位點。引物PtPAF和PtPAR可以直接退火，形成長度為63bp編碼21個氨基酸的雙鏈tPA序列(Tong T Z等.C3d enhancedDNA vaccination induced humoral immune response to glycoprotein C of pseudorabies virus.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，347845-851)，兩端依次設(shè)計BglII位點和BamH I位點。引物P3和P4可用于擴增ORF2基因的完整編碼區(qū)，上下游引物兩端分別設(shè)計了Hind III和Sal I位點。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下
P35’-CAAAAGCTTACCATGACGTATCCAAGGAGG-3’P45’-TATGTCGACTCACTTAGGGTTAAGTGG-3’P85’-CATGATATCATGAATGGCATCTTCAACACC-3’P115’-AGGCTCGAGTTAAATGCAAATTCTGCATTG-3’P175’-TATGCGGCCGCCTTAGGGTTAAGTGGGGG-3’P185’-ATAGCGGCCGCAACTTACCAAATACTG-3’PtPAF5’-GATCTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGG-3’PtPAR5’-GATCCCAGAACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCAGCACACAGCAGAGCCCTCTCTTCATTGCATCCATA-3’2、PCR擴增以含PCV2豫A株(Genebank登錄號AY035820)完整基因組的質(zhì)粒pT-PCV2(郗鑫等，豬II型圓環(huán)病毒全基因組的克隆及感染性鑒定.微生物學(xué)報，2004，44172-176)為模板進行ORF2基因的擴增，ORF2基因序列的擴增條件為95.0℃ 5min變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95.0℃ 1min，55.0℃ 1min，72.0℃ 1min，35個循環(huán)后72.0℃延伸10min。以含禽流感病毒H9亞型的HA基因的質(zhì)粒pMD-HA(張瑞華等，禽流感血凝素基因的原核表達及其在H9亞型診斷中的應(yīng)用.生物工程學(xué)報，2005，21315-319)為模板進行擴增，HA的跨膜區(qū)(TM)的氨基酸序列的PCR擴增條件為94℃ 5min；進入PCR循環(huán)，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，進行35個循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。tPA雙鏈DNA可以通過引物PtPAF和PtPAR混合，94℃ 5min后于42℃直接退火10min獲得。
3、修飾ORF2基因的獲得及其真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建利用引物P8、P17進行PCR擴增ORF2基因，獲得缺失ORF2基因N端41個氨基酸和終止子的ORF2Δ41基因片段，回收該基因片段并用EcoR□和Not I雙酶切后，插入到pcDNA3.1(+)(購自美國Invitrogen公司)的EcoRV和Not I位點之間，獲得重組質(zhì)粒pcORF2Δ41。進一步利用P11、P18引物擴增HA基因的跨膜區(qū)(TM)序列，將獲得跨膜區(qū)PCR產(chǎn)物用Not I和Xho I雙酶切后，與Not I和Xho I酶切的pcORF2Δ41質(zhì)粒連接，獲得ORF2Δ41基因C端添加跨膜區(qū)序列的ORF2Δ41TM基因片段。利用PtPAF、PtPAR引物直接退火獲得的tPA雙鏈DNA的兩端粘性末端直接插入包含ORF2Δ41TM基因片段的真核質(zhì)粒pcDNA-ORF2Δ41TM的BamHI為點，從而完成對ORF2基因添加信號肽和跨膜區(qū)的工作，獲得修飾型的ORF2基因(spORF2Δ41TM)和表達該修飾型基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM，其經(jīng)酶切與PCR鑒定證實構(gòu)建正確。spORF2Δ41TM基因經(jīng)測序表明構(gòu)建正確，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
二、用于對比試驗的表達未修飾ORF2基因的DNA疫苗pcORF2的構(gòu)建以包含PCV2豫A株((Genebank登錄號AY035820))全基因組的重組質(zhì)粒pT-PCV為模板(曹勝波等，豬II型圓環(huán)病毒豫A株的全基因組克隆與序列分析，病毒學(xué)報，2002，18(2)137-141)，以P3、P4為引物進行ORF2基因完整編碼區(qū)的PCR擴增，擴增大小為705bp。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min；進入PCR循環(huán)，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35個循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。純化回收目的片段，純化的擴增產(chǎn)物經(jīng)Hind III、Sal I雙酶切后，直接克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)(購自美國Invitrogen公司)的Hind III、Sal I位點間，獲得表達天然ORF2基因的重組真核質(zhì)粒pcORF2，經(jīng)HindIII、Sal I和HindIII和Sal I酶切與PCR鑒定證實構(gòu)建正確，測序證實無堿基誤配。
三、質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大量制備(1)挑取含有質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM的菌落接種于75mL LB培養(yǎng)液，37℃ 300r/min培養(yǎng)過夜，6000r/min 5min，收集細胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，按照常規(guī)高壓滅菌方法在121℃滅菌20分鐘后后置4℃保存?zhèn)溆?懸浮(吹散或渦旋)。
(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，現(xiàn)配現(xiàn)用)，冰浴7-10min。
(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸鉀，冰醋酸調(diào)pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃10000r/min 10-15min。
(4)取上清，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，-20℃ 30min或室溫5min。室溫，10000r/min6-15min。
(5)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/LTris-HCl，1.0mmol/L EDTA)懸浮(洗壁20min左右)。
(6)加1.5ml即1倍體積冰預(yù)冷的5mol/L NH4Ac，混勻。4℃10000r/min 10min。
(7)將上清轉(zhuǎn)移至7mL的離心管，加1倍體積(3mL)的異丙醇混勻，-20℃作用30min。12000r/m 15min。
(8)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE懸浮(洗壁20min左右)，并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管。
(9)加入適量的RNase，37℃ 1h，去RNA。
(10)加1倍體積的13％的聚乙二醇8000(PEG8000)(含1.6mol/L NaCl)，混勻，-20℃ 30min(可以過夜)。離心，棄上清，用400μL TE重溶。
(11)加等體積酚∶仿∶異戊醇抽提2次，氯仿∶異戊醇抽提1次。
(12)加100μl 10mol/L NH4Ac，充分混勻后，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃ 12000r/min離心5-10min。
(13)棄上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50μL TE或H2O重溶，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 四、豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗的生產(chǎn)工藝豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗生產(chǎn)工藝的主要流包括質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的大量提取、質(zhì)粒濃度的測定與稀釋。
1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2(氨芐抗性)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。具體操作是1)取100μl感受態(tài)細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌的1.5ml EP管中，加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min。2)將離心管放到預(yù)先加溫到42℃的循環(huán)水浴中熱沖擊90秒。3)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。4)每管加400μl LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min，使細菌復(fù)蘇。為達到有效轉(zhuǎn)化，復(fù)蘇時轉(zhuǎn)速不宜超過225轉(zhuǎn)/分。5)取100μl轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含氨芐抗性的LB瓊脂平皿上，用一無菌彎頭玻棒將轉(zhuǎn)化的細胞均勻地涂布到瓊脂平板表面。6)將平皿置37℃培養(yǎng)，直至液體被吸收，然后倒置平皿培養(yǎng)，12～16h可出現(xiàn)菌落。
2、質(zhì)粒的大量提取同上述“二、質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大量制備”的方法(本處省略該詳細制備步驟)。
3、質(zhì)粒濃度的測定、稀釋利用分光光度計測定大提質(zhì)粒的濃度，用磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS，配方如下NaCl 8.0g，KCl 0.2g，NaHPO4(12H2O)2.9g，KH2PO40.2g，pH7.4)將其稀釋到1μg/μl，即可用于Balb/c小鼠注射。
五、豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗的免疫效力檢驗將DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2(分別經(jīng)后腿肌肉注射6周齡的Balb/c小鼠)，每組6只，每只小鼠100μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫2次，間隔2周；同時用空白載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)作為核酸免疫的陰性對照。于首次免疫后2、4、6周經(jīng)尾靜脈負壓采血，分離血清，檢測中和抗體；于首免后6周，通過頸椎處死所有免疫小鼠，無菌取出脾臟，利用淋巴細胞分離液(購自天津TBD公司)分離脾淋巴細胞，進行細胞免疫(包括脾淋巴細胞刺激增殖指數(shù)和IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄、分泌水平檢測(Xiao等Comparison of immuneresponses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine and conventional DNA vaccineencoding glycoprotein C of pseudorabies virus in mice.Vaccine.2004，22，345-351)。結(jié)果顯示本發(fā)明構(gòu)建的表達修飾ORF2基因的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM誘導(dǎo)中和抗體與細胞免疫反應(yīng)均明顯高于表達未修飾的ORF2基因的DNA疫苗pcORF2，展示了本發(fā)明修飾的ORF2基因(spORF2Δ41TM)更好的免疫原性。


序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明中修飾的ORF2基因序列圖1顯示了本發(fā)明中的表達修飾的PCV2豫A株(GenBank登錄號AY035820)ORF2基因DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和未修飾的ORF2基因DNA疫苗pcORF2的結(jié)構(gòu)2顯示了本發(fā)明中的表達修飾的ORF2基因DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM的酶切和PCR鑒定結(jié)果圖3顯示了豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后的中和抗體水平圖4顯示了豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后誘導(dǎo)的脾淋巴細胞刺激增殖指數(shù)圖5顯示了豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后，用ELISPOT方法檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后分泌IFN-γ的水平圖6顯示了豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后，用熒光定量RT-PCR方法檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后IFN-γ的mRNA相對水平。
具體實施例方式
以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1含有本發(fā)明修飾的基因的質(zhì)粒和含有對照基因的質(zhì)粒的制備1、表達未修飾的ORF2基因的真核質(zhì)粒pcORF2的構(gòu)建以pT-PCV為模板，P3和P4為引物擴增ORF2基因，回收并純化擴增產(chǎn)物，用Hind III、Sal I雙酶切后，直接克隆到用相同酶切處理的真核表達載體pcDNA3.1(+)的Hind III、Sal I位點間，獲得重組質(zhì)粒pcORF2。其結(jié)構(gòu)見圖1。
2、表達修飾的ORF2基因的真核質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM的構(gòu)建利用引物P8、P17進行PCR擴增ORF2基因，獲得缺失ORF2基因N端41個氨基酸和終止子的ORF2Δ41基因片段，回收該基因片段并用EcoR□和Not I雙酶切后，插入到pcDNA3.1(+)(購自美國Invitrogen公司)的EcoR V和Not I位點之間，獲得重組質(zhì)粒pcORF2Δ41。進一步利用P11、P18引物擴增HA基因的跨膜區(qū)(TM)序列，將獲得跨膜區(qū)PCR產(chǎn)物用Not I和Xho I雙酶切后，與Not I和Xho I酶切的pcORF2Δ41質(zhì)粒連接，獲得ORF2Δ41基因C端添加跨膜區(qū)序列的ORF2Δ41TM基因片段。利用PtPAF、PtPAR引物直接退火獲得的tPA雙鏈DNA的兩端粘性末端直接插入包含ORF2Δ41TM基因片段的真核質(zhì)粒pcDNA-ORF2Δ41TM的BamHI為點，從而完成對ORF2基因添加信號肽和跨膜區(qū)的工作，獲得修飾型的ORF2基因(spORF2/Δ41TM)和表達該修飾型基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM，其經(jīng)酶切與PCR鑒定證實構(gòu)建正確。該真核表達質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM結(jié)構(gòu)見圖1，鑒定結(jié)果見圖2。
實施例2本發(fā)明的豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗和對照疫苗對小鼠免疫效力的生物學(xué)實驗1)Balb/c小鼠的免疫程序?qū)alb/c小鼠分為3組，分別為本發(fā)明的豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM、pcORF2免疫組和空白載體pcDNA3.1(+)對照組，每組6只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠100μl(含100μg質(zhì)粒)，共免疫2次，間隔2周。在首免后2、4、6周經(jīng)尾靜脈負壓采血，分離血清，檢測中和抗體。于首免后6周，通過頸椎處死所有免疫小鼠，無菌取出脾臟，利用淋巴細胞分離液(購自天津TBD公司)分離脾淋巴細胞，進行細胞免疫(包括脾淋巴細胞刺激增殖指數(shù)和IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄、分泌水平)檢測(Xiao等Comparison of immune responses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine andconventional DNA vaccine encoding glycoprotein C of pseudorabies virus in mice.Vaccine.2004，22，345-351)。
2)中和抗體水平檢測采用Wang等報道(Wang X等.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirusexpressing the capsid protein of porcine circovirus 2(PCV2)in mice.Vaccine，2006，243374-3380)的PCV2的中和抗體檢測方法，檢測血清中特異性抗PCV2的中和抗體水平，結(jié)果表明未經(jīng)修飾的DNA疫苗pcORF2免疫組的中和抗體水平不高，并且上升得較為緩慢，而本發(fā)明修飾改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫組的中和抗體快速上升，達到較高水平，與pcORF2免疫組相比差異顯著(P＜0.05，t-test)，試驗結(jié)果如圖3。
3)脾淋巴細胞刺激增殖指數(shù)檢測采用MTT法測定小鼠脾淋巴細胞的刺激指數(shù)(SI)(沈關(guān)心等主編.現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù).湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998年版)。結(jié)果本發(fā)明經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫組的刺激增殖指數(shù)要顯著高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pcORF2免疫組(P＜0.01，t-test)。試驗結(jié)果如圖4。
4)ELISPOT方法檢測脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平采用ELISPOT方法(龍振洲.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)(第2版).北京人民衛(wèi)生出版社，2000年版)檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后分泌IFN-γ的能力。結(jié)果本發(fā)明經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫組的分泌IFN-γ水平要顯著高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pcORF2免疫組(P＜0.01，t-test)。試驗結(jié)果如圖5。
5)熒光相對定量RT-PCR方法檢測淋巴細胞被特異抗原刺激后IFN-γ的mRNA水平采用熒光相對定量RT-PCR方法(參見章靜波等.細胞生物學(xué)實驗技術(shù).化學(xué)工業(yè)出版社，2006年版)檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后IFN-γ的mRNA水平。小鼠脾淋巴細胞在體外經(jīng)特異抗原(PCV2)刺激后，提取總RNA，利用oligo dT將mRNA體外轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物β-actins5’-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-3’，B-actinr5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’擴增小鼠看家基因β-actin，并將其作為相對定量RT-PCR的內(nèi)參；引物IFN-γs5’-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3’，IFN-γr5’-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3’，擴增小鼠IFN-γ基因。熒光定量PCR反應(yīng)體系(25μl)包括IFN-γ和β-actin上下游引物各0.5μl(10μM)，2×SYBRGreen Realtime PCR MasterMix(包括反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mgcl2、SYBR Green□、Taq酶)(購自ToYoBo公司，上海)12.5μl，雙蒸水11.0μl，cDNA樣品0.5μl。每個樣品做三個重復(fù)。反應(yīng)擴增條件為50℃2min，94℃預(yù)變性10min緊接著40個循環(huán)的94℃變性15s和60℃退火與延伸1min。整個反應(yīng)過程中的熒光信號的變化由ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀(購自美國Applied Biosystems公司)檢測。結(jié)果本發(fā)明經(jīng)修飾改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫組IFN-γ的mRNA水平要明顯高于未經(jīng)修飾的DNA疫苗pcORF2免疫組(P＜0.01，t-test)。試驗結(jié)果如圖6。
附錄術(shù)語定義

序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種修飾的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因及應(yīng)用<130>
<141>2007-04-11<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>822<212>DNA<213>豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus)<220>
<221>gene<222>(1)..(822)<223>
<400>1atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60tcgggatcca ctagtccagt gtggtggaat tctgcagata tcatgaatgg catcttcaac120acccgcctct cccgcacctt cggatatact gtcaagaaaa ccacagtcag aacgccctcc180tgggcggtgg acatgatgag atttaatatt aacgatttcc ttcccccagg agggggctca240aaccccctca ctgtgccctt tgaatactac agaataagaa aggttaaggt tgaattctgg300ccctgctccc caatcaccca gggtgacagg ggagttggat ccactgctgt tattctagat360gataactttg taacaaaggc cacagccctg acttatgatc cctatgtaaa ctactcctcc420cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt actttacccc gaaacctgtt480cttgattcca ctattgatta cttccaacca aataacaaaa ggaatcagct ttggctgagg540ctacaaacct ctgcaaatgt ggaccacgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata600tacgaccagg actacaatat ccgtgtaacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt660aaagaccccc cacttaaccc taaggcggcc gcaacttacc aaatactgtc aatttattca720acagtggcga gttccctagc actggcaatc atggtagctg gtctatcttt atggatgtgc780tccaatggat cgttacaatg cagaatttgc atttaactcg ag 82權(quán)利要求
1.一種修飾的豬圓環(huán)病毒2型的ORF2基因，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.表達權(quán)利要求1中所述基因的真核質(zhì)粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大腸桿菌DH5α/pcDNA-spORF2Δ41TM，其保藏號為CCTCC NOM207069。
3.一種包含權(quán)利要求1所述基因的DNA疫苗。
4.一種包含權(quán)利要求2所述質(zhì)粒的DNA疫苗。
5.權(quán)利要求1所述的基因在制備豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥疫苗中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒在制備豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程與動物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種修飾的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因及其應(yīng)用。其特征在于，將人組織纖維蛋白溶酶原激活劑的信號肽序列替換天然ORF2基因N－端的41個氨基酸，并缺失ORF2基因終止子，在其C端融合禽流感病毒HA基因跨膜區(qū)序列而獲得的一種修飾型ORF2基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。表達所述基因的真核質(zhì)粒pcDNA－spORF2△41TM的大腸桿菌DH5α/pcDNA－spORF2△41TM，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NOM207069。本發(fā)明還公開了該基因與質(zhì)粒在制備豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號A61K48/00GK101092631SQ20071009988
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者肖少波, 樊惠英, 方六榮, 江云波, 謝立蘭, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)