專利名稱：烏司他丁在制備治療和/或預(yù)防心搏驟停后腦損傷藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及烏司他丁的新醫(yī)藥用途， 即烏司他丁在制備治療和/或預(yù)防心搏驟停后腦損傷藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
烏司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制劑(Human Urinary Trypsin Inhibitor)， 是從人體尿液中分離純化的一種糖蛋白，分子量經(jīng)SDS-PAGE測定為40 50KD， 等電點為2.6，是一種對熱穩(wěn)定的酸性蛋白。
烏司他丁主要由三個功能域構(gòu)成，包括O連接糖基化區(qū)域(Alal-Lys21)、 N端Kunitz型結(jié)構(gòu)域I (Lys22-Arg77)和具有胰蛋白酶抑制活性的C端Kunitz 型結(jié)構(gòu)域II (Thr78-Leu143)。兩個Kunitz型結(jié)構(gòu)域具有一定的同源性，每個結(jié) 構(gòu)域中都含有6個保守的半胱氨酸，通過形成3對二硫鍵維持一定的空間構(gòu)型。 烏司他丁這一獨特的分子結(jié)構(gòu)決定了其具有多樣的生物活性，其中酶抑制活性主 要存在于主體蛋白骨架中的Kunitz型結(jié)構(gòu)域。
烏司他丁是一種廣譜水解酶抑制劑，能夠有效抑制胰蛋白酶、a—糜蛋白酶、 彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、纖溶酶等多種水解酶，對細胞膜、溶酶體膜也有明顯 的穩(wěn)定作用。烏司他丁在臨床上主要用于急性胰腺炎、急性循環(huán)障礙的治療，以 及大中型手術(shù)期的器官保護和危重癥中全身性炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙綜合癥 的預(yù)防等。
心搏驟停是指各種原因致心臟突然停止搏動。心臟一旦停搏，血液循環(huán)停 止，生命器官內(nèi)儲存的氧在4一6分鐘內(nèi)即耗竭。人腦重量雖然只占身體重量的 2%，其血流量卻占心輸出量的15%，而耗氧量則占全身耗氧量的20%—25%， 腦組織需氧量如此之大，而其無氧代謝能力及能量貯備能力卻極差，因此，全身 缺血缺氧后最敏感的是腦組織，一般心臟停搏3—4分鐘后就有可能引起嚴重的腦損傷。
心搏驟停后一般先進行常規(guī)心肺復(fù)蘇術(shù)(CardiopulmonaryResuscitation，簡稱 CPR)，如胸外按壓、人工呼吸、氧療、電除顫等，為的是維持重要臟器暫時的
血供，保障基本生命支持。目前心肺復(fù)蘇成功率很低，且復(fù)蘇后存活的病人中， 約有20%—40%留有永久性腦損傷，嚴重者最終成為"植物人"。為了提高心搏 驟停患者的出院率、降低心肺復(fù)蘇后致殘率，近幾年來各地學者特別注重在CPR 過程中腦損傷的防治。
心肺復(fù)蘇最終目的是恢復(fù)正常的腦功能，單純使用常規(guī)的心肺復(fù)蘇術(shù)難以達 成此目的，必須依靠進一步藥物治療。合理的使用復(fù)蘇藥物可以治療和預(yù)防腦損 傷，提高復(fù)蘇的成功率。目前心肺復(fù)蘇中常用到的藥物有腎上腺素、阿托品、 利多卡因、溴芐胺、納絡(luò)酮、碳酸氫鈉等。由于這些藥物在使用過程中出現(xiàn)的副 作用大等問題，長期以來，對于心肺復(fù)蘇的藥物一直存在較大的爭論。
當代醫(yī)學對心搏驟停后的腦損傷還缺少有效的治療和/或預(yù)防藥物。本發(fā)明人 經(jīng)過認真研究和動物試驗發(fā)現(xiàn)，烏司他丁對心搏驟停后的腦損傷有明顯的治療和 /或預(yù)防作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供烏司他丁應(yīng)用于制備治療和/或預(yù)防心搏驟停后腦損 傷藥物的用途。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療和/或預(yù)防心搏驟停后腦損傷的含
有烏司他丁的藥物組合物。
本發(fā)明的烏司他丁對心搏驟停后腦損傷有明顯的治療和/或預(yù)防作用。 本發(fā)明的烏司他丁一般以藥物組合物的形式使用，這種組合物含有治療有效
量的作為活性成分的烏司他丁和一種或多種制藥可接受的載體或添加劑。含有烏
司他丁的藥物組合物通常以靜脈注射途徑給藥，主要劑型包括烏司他丁凍干粉針
劑和注射液劑。
經(jīng)靜脈注射給藥的滅菌組合物， 一般是固體的滅菌組合物形式，即凍干粉針 劑。這些組合物還可以含有一種或多種制藥可接受的載體或添加劑，特別是甘露 醇、乳糖、水解明膠、氯化鈉或葡萄糖中的一種或其任意混合物，在使用時可以 溶解于滅菌水或其他注射用滅菌介質(zhì)中。
經(jīng)靜脈注射給藥滅菌組合物也可以是水溶液，即注射液劑，這些組合物也可 以含有一種或多種制藥可接受的載體或添加劑，特別是注射用水、甘露醇、氯化
鈉或葡萄糖中的一種或其任意混合物。
烏司他丁凍干粉針制備方法是取過濾滅菌的烏司他丁水溶液20000萬單
位，加40克甘露醇溶解，調(diào)pH至中性，加注射用水至4000毫升，加氯化鈉調(diào) 節(jié)等滲，無菌過濾，分裝于2000個西林瓶中，無菌條件下冷凍干燥，即得。
烏司他丁注射液制備方法是取過濾滅菌的烏司他丁水溶液20000萬單位， 加40克甘露醇溶解，調(diào)pH至中性，加注射用水至4000毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等 滲，無菌過濾，分裝于2000個西林瓶中，即得。
在本發(fā)明涉及的烏司他丁 (UTI)在制備治療和/或預(yù)防心肺驟停后腦損傷的 藥物的用途中，其治療劑量根據(jù)病情的嚴重程度、治療時間而定， 一般烏司他丁 靜脈注射給藥，每天給藥l-4次，每次10萬-400萬單位。優(yōu)選，藥物的給藥量 每次30萬-120萬單位。
具體實施例方式
下面用具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例l制備烏司他丁千粉針
取過濾滅菌的烏司他丁水溶液20000萬單位，加40克甘露醇溶解，調(diào)pH 至中性，加注射用水至4000毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，無菌過濾，分裝于2000 個西林瓶中，無菌條件下冷凍干燥，即得。
實施例2制備烏司他丁注射劑
取過濾滅菌的烏司他丁水溶液20000萬單位，加40克甘露醇溶解，調(diào)pH 至中性，加注射用水至4000毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，無菌過濾，分裝于2000 個西林瓶中，即得。
實施例3烏司他丁對犬心搏驟停后腦神經(jīng)功能的保護作用 動物模型和分組健康成年犬24只，體重10—15g，雌雄不限。按照以下方 法制作電擊誘發(fā)室顫致犬心博驟停模型氯胺酮10mg/kg誘導(dǎo)麻醉后，以氯胺 酮10—15mg/kg靜滴維持麻醉。預(yù)處理氣管切開，連接氣管套管，同時行心 電監(jiān)護，經(jīng)股動脈測量動脈壓力。采用體外用交流電，電壓為3.5—4.5V/kg， 通電5秒誘發(fā)室顫，維持室顫3min(分鐘)后開始心肺復(fù)蘇。將動物隨機分為3組 (每組8只犬)
①空白組不誘發(fā)室顫，經(jīng)預(yù)處理6h(小時)后取腦組織；
② 對照組心搏驟停后按2000年《心肺復(fù)蘇和心血管急救國際指南》治療， 即電擊除顫160J，如無效再行l(wèi)次，連接呼吸機(R25—30次/min, Vt20 ml/kg， Fi02 100%)，并予胸外按壓及腎上腺素(2嗎/kg)等常規(guī)CPR治療；
③ 烏司他丁治療組心搏驟停后按常規(guī)CPR術(shù)治療并同時加用烏司他丁 (開始復(fù)蘇時靜脈推注2萬單位/ kg)。
檢測指標和方法觀察各組實驗犬腦組織丙二醛(Malondialdehyde, MDA) 和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)的水平。
結(jié)果各組實驗犬腦組織MDA濃度、S0D活力的比較如下表1:
表l各組實驗犬腦組織勻漿MDA、 SOD濃度的比較
_(x±s)
組別 MDAOmol/g) SOD(NU/mg)
空白組 5.710±1.781 55.929±3.595
對照組 34.513±30.984* 12.386±2,353 *
烏司他丁組 9.699± 1.573 *# 32.410± 12.891 * #
注女表示與空白組比較，PO.01;井表示與對照組比較,PO.Ol
心搏驟停后腦組織處于嚴重的缺血缺氧狀態(tài)，隨著自主循環(huán)的建立出現(xiàn)了再 灌注損傷，其程度影響著患者的預(yù)后。目前認為氧自由基損傷是再灌注損傷導(dǎo)致 神經(jīng)元損傷的一個重要原因，MDA是其中一種，它的上升能引起蛋白質(zhì)交聯(lián)變 性、DNA斷裂，在顱內(nèi)則表現(xiàn)為神經(jīng)元的損傷。SOD在體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)起
關(guān)鍵作用，不斷解除超氧陰離子((V)及H202所引起的連鎖反應(yīng)，保護細胞免受氧
自由基損傷口 。因此，組織SOD和MDA的含量可作為評定腦神經(jīng)功能的指標。 本研究結(jié)果表明，對照組腦組織MDA的濃度比空白組明顯升高(PO.Ol)，而 其SOD濃度明顯低于空白組(PO.Ol)，提示CPR可引起腦組織的氧自由基生成釋 放增多而其清除減少，從而導(dǎo)致缺血再灌注后神經(jīng)病理損傷。烏司他丁組腦組織 MDA的濃度比對照組低(P^.01)，而SOD活力比對照組高(PO.Ol)，證實烏司他 丁作為一種氧自由基清除劑可以減少氧自由基的釋放，從而有效保護腦組織神經(jīng) 細胞免受缺血再灌注引起的死亡，對犬電擊誘發(fā)室顫導(dǎo)致的心博驟停后腦損傷具 有治療和保護作用。
實施例4烏司他丁對大鼠心搏驟停后腦損傷的治療作用 動物模型和分組健康成年雄性SD大鼠24只，體重300 — 350 g。按照以下
方法制作夾閉氣管插管窒息法致大鼠心博驟停模型戊巴比妥35mg / kg腹腔內(nèi) 注射麻醉，氣管切開，氣管內(nèi)插管，建立靜脈通路，在大鼠呼氣末時夾閉氣管， 在窒息7min左右心臟完全停搏。將動物隨機分為3組(每組8只大鼠)
① 空白組僅進行麻醉和氣管插管、血管穿刺，不進行窒息及心肺復(fù)蘇，
于術(shù)后7d(天)處死取樣。
② 對照組心臟停搏后3 min開始CPR (胸外按壓+腎上腺素20 y g/kg+呼吸 機輔助通氣)。
③ 烏司他丁 (UTI)治療組CPR后30min由靜脈導(dǎo)管注入烏司他丁 IO萬單 位/kg 。
檢測指標和方法復(fù)蘇7d后大鼠再次以戊巴比妥麻醉，頸外靜脈置管后 灌注40g/L多聚甲醛，斷頭后剝離出腦組織，放入40g/L多聚甲醛液中常溫固 定。觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)鈣結(jié)合蛋白D28k表達水平，應(yīng)用Axioplan2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)在海馬區(qū)隨機采集10個視野(x200倍)，以百分率 (%)表示陽性細胞百分數(shù)；連續(xù)7d對大鼠神經(jīng)功能進行評分，參照Geodadra 的神經(jīng)功能評分(Neural Deficit Scores, NDS)，從意識、基本反射、運動 和感覺等方面進行神經(jīng)功能評定，評分范圍為0—80分，O分表示腦死亡，80 分為完全正常。
結(jié)果各組大鼠鈣結(jié)合蛋白D28k陽性細胞百分數(shù)及神經(jīng)功能評分的檢測
結(jié)果如下表2和圖1:
表2各組大鼠鈣結(jié)合蛋白Dwk陽性細胞百分數(shù)的比較
組別 鈣結(jié)合蛋白D28k陽性細胞百分數(shù)(。/。)
空白組 45.69±5.80 對照組 21.68±4.18
UTI纟且 40.98 ±6.62*
注大表示與對照組比較，P《.01
心肺復(fù)蘇后全腦神經(jīng)元功能損傷的原因有很多，但主要仍為缺血、缺氧 后神經(jīng)元內(nèi)持續(xù)的鈣超載、氧自由基、興奮氨基酸的大量產(chǎn)生等原因，而鈣 超載被認為是損傷的共同途徑。鈣結(jié)合蛋白D28k是鈣結(jié)合蛋白家族成員之 一，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，它具有鰲合鈣離子能力，因此能避免細胞內(nèi)鈣離
子濃度過高。許多實驗表明，鈣結(jié)合蛋白D28k通過它的鈣緩沖作用能明顯減 輕缺血缺氧對神經(jīng)細胞的損傷，而缺血再灌注損傷會導(dǎo)致鈣結(jié)合蛋白D28k表
達明顯減少，使細胞鈣緩沖能力下降。
參見圖l:各組大鼠復(fù)蘇后神經(jīng)功能評分，本研究結(jié)果表明，UTI組的鈣結(jié) 合蛋白02814陽性細胞百分數(shù)明顯高于對照組(PO.Ol)，神經(jīng)功能評分的結(jié)果顯示 3d后UTI組神經(jīng)功能基本恢復(fù)正常，7d后神經(jīng)功能評分明顯高于對照組(P0.01)。 說明UTI可以通過促進神經(jīng)元內(nèi)鈣結(jié)合蛋白D28k表達來抑制鈣超載，從而減輕缺 血再灌注損傷對腦神經(jīng)元的損傷，對大鼠心搏驟停后腦損傷有明顯的治療和保護 作用。


圖1為各組大鼠復(fù)蘇后神經(jīng)功能評分示意圖。
權(quán)利要求
1.烏司他丁在制備治療和/或預(yù)防心博驟停后腦損傷藥物的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物的給藥量是每天給藥1一4次， 每次10萬-400萬單位；優(yōu)選，每次30萬-120萬單位。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述藥物是凍干粉針劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述藥物是注射液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的藥物還含有選自甘露醇、 乳糖、水解明膠、氯化鈉或葡萄糖的一種或其任意混合物的添加劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的藥物還含有選自注射用水、甘 露醇、氯化鈉或葡萄糖的一種或其任意混合物的添加劑。
7. —種治療和/或預(yù)防心搏驟停后腦損傷的藥物，其包含烏司他丁和一種或 多種制藥可接受的載體或添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及烏司他丁(Urinary Trypsin Inhibitor，UTI)應(yīng)用于制備治療和/或預(yù)防心搏驟停后腦損傷藥物的用途。本發(fā)明的烏司他丁對心搏驟停后的腦損傷有明顯的治療和/或預(yù)防作用。本發(fā)明的藥物通常以凍干粉針劑或注射液劑的形式使用。
文檔編號A61K9/08GK101095948SQ20071011122
公開日2008年1月2日 申請日期2007年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日
發(fā)明者侯永敏, 傅和亮, 吳蓉蓉, 王曉巖, 瑤 雷 申請人:廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司