專(zhuān)利名稱：新型抗腫瘤化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型kahalalide抗腫瘤化合物，特別是kahalalide F的類(lèi)似物，其中脂族5-甲基己酸被4-甲基己酸替代，含有它們的藥物組合物以及作為抗腫瘤、抗病毒、抗真菌劑和在銀屑病的治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Kahalalide化合物是從一種夏威夷海洋中草食性軟體動(dòng)物Elysiarufescens及其食物，羽藻屬(Bryopsis.ap.)綠藻中分離出來(lái)的肽。關(guān)于Kahalalides A-F的描述見(jiàn)于Hamman等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，5825-5826。
關(guān)于Kahalalide A-G的描述見(jiàn)于Hamann，M.等，J.Org.Chem，1996，61，6594-6600″Kahalalidesbioactive peptides from a marine mollusk Elysiarufescens and its algal diet Bryopsis sp.″。
關(guān)于Kahalalide H和J的描述見(jiàn)于Scheuer P.J.等，J.Nat.Prod.1997，60，562-567″Two acyclic kahalalides from the sacoglossan mollusk Elysiarufescens″。
關(guān)于Kahalalide O的描述見(jiàn)于Scheuer P.J.等，J.Nat.Prod.2000，63(1)152-4A new depsipeptide from the sacoglossan mollusk Elysia ornata and thegreen alga Bryopsis species″。
關(guān)于kahalalide K參見(jiàn)Kan，Y.等，J.Nat.Prod.1999 62(8)1169-72″Kahalalide KA new cyclicdepsipeptide from the hawaiian green algabryopsis species″。
相關(guān)報(bào)道還參見(jiàn)Goetz等，Tetrahedron，1999，55；7739-7746″Theabsolute stereochemistry of Kahalalide F″；Albericio，F(xiàn).等TetrahedronLetters，2000，41，9765-9769″Kahalalide B.Synthesis of anaturalcyclodepsipeptide″；Becerro等J.Chem.Ecol.2001，27(11)，2287-99″Chemical defenses of the sarcoglossan mollusk Elysia rufescens and its hostAlga bryopsis sp.″。
在kahalalide化合物中，kahalalide F因其抗腫瘤活性而最具前景。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含六個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀部分和七個(gè)氨基酸組成的末端具有脂肪酸基團(tuán)的環(huán)外鏈。其抗人肺癌A-549和人結(jié)腸癌HT-29的體外細(xì)胞培養(yǎng)物的活性報(bào)道于EP 610 078。Kahalalide F還表現(xiàn)出抗病毒和抗真菌性能。
體內(nèi)臨床前實(shí)驗(yàn)表明Kahalalide F在雌小鼠中的最大耐受劑量(MTD)在單劑量靜脈推注下為280μg/kg。但是微高于MTD的單劑量靜脈注射即有劇烈毒性，動(dòng)物顯示神經(jīng)中毒癥狀并死亡，而如果依照每日一次的5日計(jì)劃，280μg/kg Kahalalide F可重復(fù)施用而無(wú)任何明顯的急性中毒跡象。參見(jiàn)Supko，F(xiàn).等，Proceedings of the 1999 AACR NCI EORTC InternationalConference，abstract 315″Preclinical pharmacology studies with the marinenatural product Kahalalide F″。
WO 02 36145描述了含有kahalalide F的藥物組合物以及該化合物在癌癥治療中的新應(yīng)用，因此其所有內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
WO 03 33012，我們要求其優(yōu)先權(quán)，描述了Kahalalide化合物在腫瘤學(xué)中的臨床應(yīng)用，其完整地結(jié)合于此作為參考。
GB 0304367，我們也要求其優(yōu)先權(quán)，描述了kahalalide化合物在治療銀屑病及相關(guān)疾病中的應(yīng)用，其完整地結(jié)合于此作為參考。
關(guān)于天然及合成kahalalide化合物的合成及細(xì)胞毒活性的描述參見(jiàn)WO 01 58934，其完整地結(jié)合于此作為參考。WO 01 58934描述了Kahalalide F及末端脂肪酸鏈被其它脂肪酸替代的具有相似結(jié)構(gòu)的化合物的合成。
仍需提供更多的抗腫瘤化合物，特別是更多具有改良了的性能的Kahalalide化合物。
發(fā)明概述我們意外地發(fā)現(xiàn)一種kahalalide類(lèi)似化合物表現(xiàn)出頗具前景的活性和體內(nèi)模型中改善的抗腫瘤功效。
本發(fā)明涉及一種式1的化合物及其藥用鹽，前藥，互變異構(gòu)體和溶劑化物等。
式1此化合物相當(dāng)于具有4-甲基己酸末端脂肪酸鏈的Kahalalide F，并將于下文中被稱為4-甲基己酸KF。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有(4S)-甲基己酸、具有式2的化合物及其藥用鹽，前藥，互變異構(gòu)體和溶劑化物。此化全物將于下文中稱為(4S)-甲基己酸KF。
式2本發(fā)明還涉及包含前述化合物及其藥用載體，賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療患癌癥或銀屑病的任何哺乳動(dòng)物，尤其是人的方法，包括對(duì)患者個(gè)體施用治療有效量的上述化合物。
本發(fā)明可特別用于治療對(duì)其它治療無(wú)有利應(yīng)答的難治癌癥。特別是，本發(fā)明的組合物可在其它化療嘗試和無(wú)效后使用。
本發(fā)明特別涉及對(duì)前列腺癌，乳腺癌，肝細(xì)胞癌，黑素瘤，結(jié)直腸癌，腎癌，卵巢癌，NSCL癌，上皮癌，胰腺癌及過(guò)表達(dá)Her2/neu癌基因的腫瘤患者的治療。
另一方面本發(fā)明涉及上述定義的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物用于治療癌癥，銀屑病，病毒感染或真菌感染。
本發(fā)明另外提供包含獨(dú)立容器的試劑盒，容器含有藥物組合物和重構(gòu)試劑，該組合物含有以上定義的化合物。還提供了重構(gòu)方法。
本發(fā)明還涉及上述化合物的制備方法。優(yōu)選地該方法使用4-甲基己酸作為原材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中4-甲基己酸是(4S)-甲基己酸。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中該方法為固相合成。
發(fā)明詳述我們鑒定了Kahalalide F的類(lèi)似物，其表現(xiàn)出相對(duì)于Kahalalide F的顯著活性改進(jìn)。如比較例中所示，4-甲基己酸KF意外地在兩個(gè)體內(nèi)癌癥模型中表現(xiàn)出顯著的改進(jìn)功效?？紤]到4-甲基己酸KF和5-甲基己酸KF之間的結(jié)構(gòu)差異很小，這更令人倍感驚奇。
本發(fā)明中的化合物為具有4-甲基己酸脂肪酸鏈而不是5-甲基己酸的Kahalalide F，并具有按照式1的結(jié)構(gòu)
特別是我們優(yōu)選該化合物具有如式2定義的立體化學(xué)結(jié)構(gòu) 然而本發(fā)明中的化合物具有不對(duì)稱中心并因此存在不同的對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體形式。本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物的所有旋光異構(gòu)體和立體異構(gòu)體及其混合物，和涉及可以使用或含有它們的所有藥物組合物和治療方法。
為了方便，我們將本發(fā)明中的化合物，特別是化合物1和2，稱為4-甲基己基kahalide F化合物，或4-mehexKF化合物。優(yōu)選地本發(fā)明中的4-mehexKF化合物很大程度上不含，基本上不含或完全不含其它kahalalide化合物。例如，本發(fā)明中的4-mehexKF優(yōu)選不含有具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。特別地，本發(fā)明中的4-mehehexKF優(yōu)選含有最多25％，10％，5％，2％，1％或0.5％，或少于0.5％的任何其它kahalalide，尤其是kahalalideF。從相關(guān)角度來(lái)說(shuō)，本發(fā)明中的4mehexKF以基本上純的形式提供。這種在一定程度上不含其它kahalalides的4-mehexKF化合物特別適合用于本發(fā)明中的藥物組合物及治療方法。
本發(fā)明包括本發(fā)明化合物，以及其藥用鹽，其中一個(gè)或多個(gè)氫原子，碳原子或其它原子被其同位素所替代。這樣的化合物可用作藥代動(dòng)力學(xué)研究及結(jié)合測(cè)定中的研究和診斷工具。
如本文所用，本發(fā)明的化合物，包括式1和2的化合物，定義為包括其藥用衍生物或其前藥?！八幱醚苌锘蚯八帯敝溉魏嗡幱名}，酯，酯鹽或本發(fā)明化合物的其它衍生物，其經(jīng)施用于受體后能提供(直接或間接)本發(fā)明的化合物或其代謝物或殘基。尤其適宜的衍生物和前藥是那些當(dāng)將這些化合物施用于患者后有下列效應(yīng)的物質(zhì)能增加本發(fā)明中化合物的生物利用度(如，通過(guò)口服施用化合物以便更容易吸收入血)，增強(qiáng)母體化合物向給定生物隔室的傳遞，增加了溶解度以能夠通過(guò)注射給藥，改變代謝或改變分泌速率。
本發(fā)明中化合物的鹽可以包含式1或2化合物中氮衍生的酸加成鹽。治療活性在于衍生于本文定義的本發(fā)明化合物的部分，其它組分的特性較不重要，盡管出于治療和預(yù)防目的其優(yōu)選對(duì)于患者來(lái)說(shuō)是藥學(xué)可接受的。藥用酸加成鹽的例子包括衍生于無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的那些，所述無(wú)機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，磷酸，偏磷酸，硝酸和硫酸，所述有機(jī)酸如酒石酸，乙酸，三氟乙酸，檸檬酸，蘋(píng)果酸，乳酸，富馬酸，安息香酸，乙醇酸，葡萄糖酸，琥珀酸和甲磺酸及芳基磺酸，如對(duì)甲苯磺酸。優(yōu)選的鹽是三氟乙酸鹽。
本發(fā)明中化合物可依據(jù)WO 01 58934所述的合成方法制備，如在WO01 58934的實(shí)施例3中加入適當(dāng)?shù)?S)或(R)4-甲基己酸代替5-甲基己酸。因此本發(fā)明還包括依照式1或2的化合物的制備方法。優(yōu)選該方法應(yīng)用4-甲基己酸作為初始原料。最優(yōu)選初始原料是(4S)-甲基己酸。合成優(yōu)選為固相合成方法。實(shí)施例中給出了合成的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。
本發(fā)明中的制備方法可由初始原料以一種立體對(duì)映的或立體控制的且快速的方式進(jìn)行，利用固相合成方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，其中構(gòu)建中的分子在整個(gè)結(jié)合操作中都與不溶性載體相結(jié)合。
本發(fā)明化合物的藥物制劑可適合任何適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥，例如通過(guò)口服(包括口腔或舌下)，直腸，鼻腔，局部(包括口腔，舌下或經(jīng)皮)，陰道或非腸道(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)或真皮內(nèi))途徑。這些制劑可通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法制備，如將載體或賦形劑與活性成分相聯(lián)。
本發(fā)明化合物的優(yōu)選藥物組合物包括具有用于靜脈給藥的適當(dāng)組成的液體(溶液，混懸劑或乳劑)，它們可含有純化合物或結(jié)合有任何載體或其它藥物活性的化合物。關(guān)于藥劑組合物的進(jìn)一步指導(dǎo)可見(jiàn)于WO 0236145，其所有內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。因此，非離子型表面活性劑和有機(jī)酸的組合與填充劑一起適用于提供本發(fā)明化合物的凍干形式，其適合重構(gòu)(reconstitution)。重構(gòu)優(yōu)選通過(guò)乳化加溶劑，鏈烷醇和水來(lái)實(shí)現(xiàn)。
凍干組合物優(yōu)選主要含有填充劑，如至少90％或至少95％的填充劑。填充劑的實(shí)例眾所周知且包括蔗糖和甘露醇。也可使用其它填充劑。
凍干組合物中的非離子型表面活性劑優(yōu)選脫水山梨糖醇酯，更優(yōu)選聚乙烯脫水山梨糖醇酯，如聚氧乙烯山梨糖醇酐烷酸酯，特別是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯，例如聚山梨糖醇酐酯80(polysorbate 80)。非離子型表面活性劑典型地構(gòu)成一定百分比的組合物，如0到5％的組合物，例如2到3或4％的組合物。
凍干組合物中的有機(jī)酸典型地是脂族酸，優(yōu)選羥基羧酸，更優(yōu)選羥基多羧酸，特別是檸檬酸。有機(jī)酸典型地構(gòu)成一定百分比的組合物，如0到5％的組合物，例如2到3或4％的組合物。
本發(fā)明化合物在凍干組合物中的量典型地小于混合物的1％，或經(jīng)常小于0.1％。合適的量在50到200μg，比如每100mg組合物中有大約100μg。
重構(gòu)劑的乳化加溶劑適當(dāng)?shù)睾芯垡蚁┮叶减?，特別是脂肪酸酯，更優(yōu)選的是PEG油酸酯如PEG-35油酸酯。乳化加溶劑適當(dāng)?shù)貫橹貥?gòu)劑的0到10％，典型地約3到7％，比如約5％。鏈烷醇通常是乙醇，適當(dāng)?shù)貫橹貥?gòu)劑的0到10％，典型地約3到7％，比如約5％。重構(gòu)劑的其余部分是水，提供適于靜脈注射的重構(gòu)溶液。
用0.9％鹽水進(jìn)一步稀釋重構(gòu)的溶液將更適于kahalalide化合物的輸注。適宜的輸注設(shè)備優(yōu)選包括玻璃容器而不是聚乙烯容器。導(dǎo)管宜用聚硅氧烷導(dǎo)管。
因此優(yōu)選的重構(gòu)劑含有2到7％，比如約5％的乳化加溶劑，2到7％，比如約5％的乙醇，以及剩余的水。
制劑可以單劑量或多劑量容器給出，例如密封的安瓿或小瓶，并存放于(冰凍-干燥)凍干條件下，使用前只需加入消毒過(guò)的液體載體，例如注射用水。
因而本發(fā)明另外提供包含獨(dú)立容器的試劑盒，所述容器含有凍干組合物和重構(gòu)劑。還提供重構(gòu)方法。
本發(fā)明的化合物或組合物的給藥可以通過(guò)靜脈輸注。輸注時(shí)間可達(dá)72小時(shí)，更優(yōu)選的是1到24小時(shí)，最優(yōu)選約1或約3小時(shí)。輸注時(shí)間短到在醫(yī)院不過(guò)夜而能進(jìn)行治療就十分理想。然而，如果需要的話輸注時(shí)間將會(huì)在24小時(shí)左右或甚至更長(zhǎng)。
給藥按周期進(jìn)行，在優(yōu)選應(yīng)用方法中，在每個(gè)周期的第一周將本發(fā)明化合物的靜脈輸注提供給患者，允許患者在周期剩余部分中恢復(fù)。每個(gè)周期優(yōu)選的持續(xù)時(shí)間是1，3或4周；如果需要可以提供多個(gè)周期。在備選的劑量給藥方案中，本發(fā)明的化合物每3周內(nèi)連續(xù)施用5天，每天約1小時(shí)。其它方案可根據(jù)變化設(shè)計(jì)。
根據(jù)患者個(gè)體對(duì)治療的耐受性需要時(shí)可延遲劑量和/或減少劑量并調(diào)整用藥計(jì)劃，特別是對(duì)肝轉(zhuǎn)氨酶或堿性磷酸酶高于正常血清水平的患者建議減少劑量。
從一個(gè)方面說(shuō)，本發(fā)明提供了一種對(duì)患有癌癥的人類(lèi)患者的治療方法，包含對(duì)所述患者施用本發(fā)明的化合物，劑量低于1200mcg/m2/天，優(yōu)選低于930mcg/m2/天且更優(yōu)選低于800mcg/m2/天。適宜的劑量最少為320mcg/m2/天。優(yōu)選的劑量在400-900mcg/m2/天范圍內(nèi)，優(yōu)選在500-800mcg/m2/天，更優(yōu)選在600-750mcg/m2/天。特別優(yōu)選的是約650-700mcg/m2/天的劑量。另一方面本發(fā)明提供了一種對(duì)患有癌癥的人類(lèi)患者的治療方法，包含對(duì)所述患者施用本發(fā)明的化合物，在5天內(nèi)每天施用，劑量低于930mcg/m2/天，隨后休息1到4周，其間不施用kahalalide化合物。劑量?jī)?yōu)選在650-750mcg/m2/天，更優(yōu)選在約700mcg/m2/天。輸注時(shí)間優(yōu)選在1到24小時(shí)之間，更優(yōu)選在1到3小時(shí)之間。特別優(yōu)選的輸注時(shí)間為大約1或約3小時(shí)。休息時(shí)間優(yōu)選為2-3周，更優(yōu)選大約2周。
本發(fā)明還提供了一種對(duì)患有癌癥的人類(lèi)患者的治療方法，包含對(duì)所述患者施用本發(fā)明的化合物，每周一次，劑量低于800mcg/m2/天。該劑量?jī)?yōu)選為600-700mcg/m2/天，更優(yōu)選650mcg/.m2/天。輸注時(shí)間優(yōu)選在1到24小時(shí)之間，更優(yōu)選在1到3小時(shí)之間。特別優(yōu)選的輸注時(shí)間為大約1小時(shí)。
盡管上文給出了關(guān)于劑量的指導(dǎo)，正確的化合物劑量將依具體的制劑，施用方式及具體的部位、宿主和治療的腫瘤而變化。其它因素如年齡，體重，性別，飲食，給藥時(shí)間，分泌速率，宿主狀況，藥物組合，反應(yīng)靈敏性和病情嚴(yán)重性都要考慮。在最大耐受劑量?jī)?nèi)可連續(xù)用藥或周期性用藥。
本發(fā)明特別涉及對(duì)前列腺癌，乳腺癌，肝細(xì)胞癌，黑素瘤，結(jié)直腸癌，腎癌，卵巢癌，NSCL癌，上皮癌，胰腺癌及過(guò)表達(dá)Her2/neu癌基因的腫瘤患者的治療。更優(yōu)選地本發(fā)明涉及對(duì)肝細(xì)胞癌，黑素瘤，乳腺癌和前列腺癌的治療方法。
本發(fā)明還涉及一種治療與哺乳動(dòng)物真皮細(xì)胞過(guò)度增殖有關(guān)的疾病的方法，包含對(duì)該哺乳動(dòng)物施用有效的、無(wú)毒性量的本發(fā)明的化合物。所述皮膚病優(yōu)選銀屑病。本發(fā)明優(yōu)選涉及對(duì)患有銀屑病，特別是嚴(yán)重銀屑病的人類(lèi)患者的治療。
本發(fā)明中化合物和組合物可與其它藥物共用以提供聯(lián)合治療。其它藥物可形成同一組合物的一部分，或作為獨(dú)立的組合物提供在同一時(shí)間或不同時(shí)間施用。對(duì)其它藥物的特性沒(méi)有特別的限制，盡管與其它化療、激素或抗體藥劑的結(jié)合要予以關(guān)注。本發(fā)明化合物和其它藥物活性試劑或藥劑的量以及相對(duì)用藥時(shí)間要進(jìn)行選擇以獲得期望的聯(lián)合治療效果。
實(shí)施例實(shí)施例1(4S)-甲基己酸KF的制備制備的一般方法及起始步驟見(jiàn)于WO 01 58934中所述。
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹(shù)脂去除Fmoc基團(tuán)，用DIPCDI(233μL，對(duì)1.5mmol和3當(dāng)量；310μL，對(duì)2mmol和4當(dāng)量；以及388μL，對(duì)2.5mmol，5當(dāng)量)和HOBt(230mg，對(duì)1.5mmol和3當(dāng)量；307mg，對(duì)2mmol和4當(dāng)量；及395mg，2.5mmol.5當(dāng)量)作用90分鐘將Fmoc-Val-OH(678mg，2mmol，4當(dāng)量)，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH(992mg，2.5mmol，5當(dāng)量)，F(xiàn)moc-D-Val-OH(678mg，2mmol，4當(dāng)量)，和(4S)-MeHex-OH(195mg，1.5mmol，3當(dāng)量)順序加到上述肽酰-樹(shù)脂(實(shí)施例3)中。在所有情況下，經(jīng)過(guò)90分鐘的偶聯(lián)，茚三酮測(cè)試為陰性。Fmoc基團(tuán)的去除及洗滌如一般方法中所述進(jìn)行。
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹(shù)脂在PhSiH3(617μL，5mmol，10當(dāng)量)存在時(shí)在氬氣氣氛中用Pd(PPh3)4(58mg，0.05mmol，0.1當(dāng)量)除去Alloc基團(tuán)，用DMF(1.25mL)溶解Alloc-Phe-Z-Dhb-OH(666mg，2mmol，4當(dāng)量)和HOAt(273mg，2mmol，4當(dāng)量)并加到肽酰-樹(shù)脂中，然后加入DIPCDI(310μL，2mmol，4當(dāng)量)并攪拌混合物5小時(shí)，茚三酮測(cè)試呈陰性。用DMF和CH2Cl2洗滌后將等分部分的肽酰-樹(shù)脂用TFA-H2O(1∶99)處理1分鐘然后產(chǎn)物用MALDI-TOF-MS表征，計(jì)算值C88H146N14O21，1,736.18。實(shí)驗(yàn)值m/z1,758.67[M+Na]+，1,774.62 1,618.2[M+K]+。
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-allo-Ile-D-Val-OHDMF和CH2Cl2洗滌后在PhSiH3(617μL，5mmol，10當(dāng)量)存在時(shí)在氬氣氣氛下用Pd(PPh3)4(58mg，0.05mmol，0.1當(dāng)量)去除Alloc基團(tuán)。用TFA-CH2Cl2(1∶99)(5×30秒)從樹(shù)脂上裂解被保護(hù)的肽。濾出液用水收集(4mL)并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分水分。用ACN溶解除去水分時(shí)出現(xiàn)的固體，然后將溶液凍干，生成639mg(387μmol，產(chǎn)率77％)標(biāo)題化合物，用HPLC(條件A，tR10.5分鐘)測(cè)得純度為＞95％。
(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyclo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)＝(4S)己酸KF被保護(hù)的肽(實(shí)施例6)(639mg，387μmol)溶于CH2Cl2(390mL，1mM)，HOBt(237mg，1.55mmol)溶于最小體積的DMF，加入DIEA(203μL，1.16mmol，3當(dāng)量)，DIPCDI(240μL，1.55mmol，4當(dāng)量)?？蓴嚢杌旌衔?小時(shí)，然后用HPLC檢查結(jié)晶過(guò)程。減壓蒸發(fā)除去溶劑。用TFA-H2O(19∶1，85mL)溶解被保護(hù)的環(huán)肽并攪拌混合物1小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去溶劑，加入二噁烷(30mL)并減壓蒸發(fā)除去溶劑(該過(guò)程重復(fù)了三次)，然后加入H2O(40mL)并凍干。粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(Kromasil C85μm，205×50mm)純化，用含44％乙腈(+0.05％TFA)的水(+0.05％TFA)等度洗脫，55mL/h，在220nm處檢測(cè)，生成標(biāo)題產(chǎn)物(192mg，0.13mmol，產(chǎn)率26％，92.3％)。MALDI-TOF-MS，計(jì)算值C75H124N14O16，1,477.9.實(shí)驗(yàn)值m/z 1,500.12[M+Na]+，1,515.97[M+K]+。該化合物的1H-NMR(2.5mM；500MHz，H2O-D2O(9∶1))譜見(jiàn)表I。

用Varian Unity Plus(500MHz)進(jìn)行1H-NMR波譜法[1H，NOESY，TOCSY在(278K)]?；瘜W(xué)位移(d)表示為T(mén)MS下游每百萬(wàn)部分。相關(guān)常數(shù)表示為赫茲。
實(shí)施例2(4R)-甲基己酸KF的制備實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1所述，從1g樹(shù)脂開(kāi)始，唯一的區(qū)別是，在適當(dāng)?shù)牟襟E中，用(4R)-MexHex代替(4S)-MexHex。產(chǎn)物(220mg，0.15mmol，30％，92.3％純度)用ES-MS表征，C75H124N1416，1,477.9。實(shí)驗(yàn)值m/z 1,499.07[M+Na]+，1,514.94[M+K]+。
實(shí)施例3體外細(xì)胞毒性活性這些測(cè)定的最終目的是通過(guò)使細(xì)胞持續(xù)與待測(cè)樣品接觸以中斷“體外”腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。
細(xì)胞系
一種利用硫代羅丹明B(SRB)反應(yīng)的顯色分析用于定量測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)及活性[根據(jù)Philip Skehan，等(1990)，New colorimetric cytotoxicity assay foranticancer drug screening，J.Natl.Cancer Inst.，821107-1112所述技術(shù)]。
此分析使用直徑9mm的96孔細(xì)胞微型板(Faircloth，1988；Mosmann，1983)。大多數(shù)細(xì)胞系來(lái)自American Type Culture Collection(ATCC)，由人類(lèi)不同的癌細(xì)胞衍生而來(lái)。
細(xì)胞保存于RPMI 1640 10％FBS，其中添加0.1g/l膜霉素和0.1g/l硫酸鏈霉素，在37℃，5％CO2和98％濕度下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用胰蛋白酶消化分匯合的培養(yǎng)物以收獲細(xì)胞并在平板接種前重懸于新鮮培養(yǎng)基中。
細(xì)胞接種于96孔微量滴定板，每孔195μL培養(yǎng)基5×103細(xì)胞，在無(wú)藥物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)18小時(shí)使細(xì)胞貼壁。然后加入濃度范圍在10到10-8μg/ml的等分試樣5μL，其溶于DMSO/EtOH/PBS(0.5∶0.5∶99)。作用48小時(shí)后，用SRB方法檢測(cè)抗腫瘤效果細(xì)胞用50μL冷的50％(wt/vol)三氯乙酸(TCA)固定并在4℃下溫育60分鐘。平板用去離子水清洗并干燥。每個(gè)微量滴定孔中加入100μL SRB溶液(0.4％wt/vol于1％乙酸中)并于室溫溫育10分鐘。用1％乙酸洗滌除去未結(jié)合的SRB。平板在空氣中干燥后，結(jié)合的染料溶于Tris緩沖液。用自動(dòng)分光光度平板讀數(shù)器在單波長(zhǎng)490nm處讀取光密度值。
計(jì)算三個(gè)平行樣品孔數(shù)據(jù)的平均+/-SD?？捎?jì)算細(xì)胞反應(yīng)的一些參數(shù)GI＝生長(zhǎng)抑制，TGI＝總生長(zhǎng)抑制(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng))和LC＝細(xì)胞殺死(細(xì)胞毒性效應(yīng))結(jié)果見(jiàn)表II，各化合物間無(wú)顯著性差異。
表II.活性數(shù)據(jù)(摩爾)
實(shí)施例4體外毒性為了評(píng)估藥物對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性，我們依據(jù)ATCC的說(shuō)明將正常細(xì)胞系以5000細(xì)胞每孔的密度培養(yǎng)于96孔板AML-12，正常小鼠肝細(xì)胞和NRK-52E，正常大鼠腎細(xì)胞。每個(gè)板上的細(xì)胞在加入試驗(yàn)藥物前靜置過(guò)夜。將10μL含不同濃度(1×10-10-0.01mg/ml終濃度)藥物的培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中(100μL培養(yǎng)基)并在37℃及5％CO2下繼續(xù)溫育過(guò)夜。所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次并一式兩份分析。24小時(shí)后依制造商(Promega)的說(shuō)明書(shū)(適合所有細(xì)胞類(lèi)型)進(jìn)行MTS檢測(cè)(細(xì)胞滴定96含水)。通過(guò)formazan底物的酶促轉(zhuǎn)化測(cè)定細(xì)胞生存力(線粒體活性)。
從表III中的結(jié)果可見(jiàn)，化合物5甲基己酸KF和(4S)-甲基己酸KF之間無(wú)顯著性差異。
表III
實(shí)施例5在CD-1小鼠和無(wú)胸腺動(dòng)物中的體外MTD對(duì)CD-1小鼠和無(wú)胸腺小鼠(兩種性別)進(jìn)行單一推注給藥(single bolusadministration)和5個(gè)每日劑量以后確定每種藥物的最大耐受劑量(MTD)。結(jié)果見(jiàn)表IV，化合物5甲基己酸KF和(4S)-甲基己酸KF之間無(wú)顯著性差異。
表IV
實(shí)施例6對(duì)乳房異種移植(5DD)的體內(nèi)藥效采用連續(xù)5日(即QDx5)對(duì)雌小鼠靜脈推注(第0-4日)的用藥方案，用乳房異種移植物分析四分之三最大耐受劑量(MTD)的5-甲基己酸KF和(4S)-甲基己酸KF各自的藥效?；衔镆孕迈r制備的賦形劑[Cremophor-EL/乙醇/水(5∶5∶90)]中的小瓶溶液形式提供。(QDx5方案的)每日劑量依每20g動(dòng)物體重0.2ml的注射體積靜脈用藥。
賦形劑對(duì)照組與對(duì)應(yīng)的治療組之間凈腫瘤生長(zhǎng)的評(píng)估(即％ΔT/ΔC)表明所有組的最小(適)值出現(xiàn)在開(kāi)始用藥后的第3天。另外，成對(duì)統(tǒng)計(jì)分析(采用Mann-Whitney，非參數(shù)方法)顯示，盡管考慮到它們相似的結(jié)構(gòu)及前面的實(shí)施例會(huì)感到意外，這兩個(gè)化合物的功效出現(xiàn)了顯著性差異。
基于此處描述的功效研究及前述毒性實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例4)可賦予(4S)-甲基己酸KF至少1.33的治療指數(shù)(1×MTD/0.75×MTD，有毒劑量/有效劑量)。另外，一個(gè)生物相關(guān)現(xiàn)象是(4S)-甲基己酸KF在乳房?jī)?nèi)的抗腫瘤效果在相同相對(duì)MTD劑量下比在前列腺異種移植(實(shí)施例7)中持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。簡(jiǎn)言之，(4S)-甲基己酸KF在乳房移植物內(nèi)明確表現(xiàn)出是更有效的異構(gòu)體并且其生物作用的持續(xù)時(shí)間表明其在這類(lèi)腫瘤中具有長(zhǎng)時(shí)間的效應(yīng)。
表V
實(shí)施例7前列腺異種移植(5DD)的體內(nèi)功效采用連續(xù)5日(即QDx5)對(duì)雄性小鼠靜脈推注(第0-4日)的用藥方案，用前列腺異種移植物分析單劑量的5-甲基己酸KF和(4S)-甲基己酸KF各自的藥效?；衔镆孕迈r制備的賦形劑[Cremophor-EL/乙醇/水(5∶5∶90)]中的小瓶溶液形式提供。(QDx5方案的)每日劑量依每20g動(dòng)物體重0.2ml的注射體積靜脈用藥。
賦形劑對(duì)照組(即％ΔT/ΔC)與對(duì)應(yīng)的治療組之間凈腫瘤生長(zhǎng)的評(píng)估表明所有組的最小(適)值出現(xiàn)在開(kāi)始用藥后的第3天。另外，成對(duì)統(tǒng)計(jì)分析(采用Mann-Whitney，非參數(shù)方法)顯示，用262μg/kg/天的劑量的(4S)-甲基己酸KF取得了顯著更大的功效?；诖颂幟枋龅墓πа芯考扒笆鰧?shí)驗(yàn)(實(shí)施例4)的毒性實(shí)驗(yàn)可賦予(4S)-甲基己酸KF至少1.33的治療指數(shù)(1×MTD/0.75×MTD，有毒劑量/有效劑量)。結(jié)果列于下面表IV中。
表IV
實(shí)施例8用一組人腫瘤細(xì)胞系評(píng)價(jià)Kahalalide F類(lèi)似物在中空纖維內(nèi)的抗腫瘤活性。
用一組人腫瘤細(xì)胞系，即SK-Hep-1(肝癌)，HepG2(肝細(xì)胞癌)，Panc-1(胰腺)，和Mel-28(黑素瘤)，在中空纖維(HF)內(nèi)檢測(cè)了上述Kahalalide F類(lèi)似物的抗腫瘤活性。人腫瘤細(xì)胞被體外密封在HF中，然后植入到雌性無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)。
根據(jù)前面在無(wú)胸腺小鼠上進(jìn)行的MTD實(shí)驗(yàn)選擇5-甲基己酸KF和(4S)-甲基己酸KF的劑量為325μg/kg/天(見(jiàn)實(shí)施例5)。按每20g動(dòng)物0.2ml注射體積進(jìn)行5個(gè)連續(xù)日劑量的腹膜內(nèi)注射給藥。
總之，KF-4(S)-Met對(duì)肝癌(sc)，肝細(xì)胞癌(ip和sc)，胰腺(ip)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的抗腫瘤活性，并在胰腺和黑素瘤中的sc隔室內(nèi)顯示出有顯著性的趨勢(shì)(即P＝0.059)。相反，KF-5-Met顯示活性的腫瘤種類(lèi)就少一些，即只有胰腺(ip和sc)和黑素瘤(sc)，而對(duì)任何類(lèi)型檢測(cè)用的肝癌細(xì)胞都沒(méi)有活性。下表列出了這些結(jié)果的概述，清楚地顯示了兩種化合物之間的差異。
*統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著，P＜0.05。§有顯著性趨勢(shì)，即P＝0.059。
權(quán)利要求
1.式1的化合物及其藥用鹽、互變異構(gòu)體及溶劑化物
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是(4S)-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-Ile-環(huán)(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-L-Phe-Z-Dhb-L-Val)，及其藥用鹽、互變異構(gòu)體及溶劑化物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是(4S)-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-Ile-環(huán)(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-L-Phe-Z-Dhb-L-Val)，及其藥用鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含至多25％的任何其他kahalalide。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含至多10％的任何其他kahalalide。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含至多5％的任何其他kahalalide。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含至多2％的任何其他kahalalide。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含至多1％的任何其他kahalalide。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含至多0.5％的任何其他kahalalide。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的化合物包含少于0.5％的任何其他kahalalide。
11.一種化合物，如根據(jù)權(quán)利要求3所定義，其中所述的化合物是基本純的。
12.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
14.根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
15.根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
16.根據(jù)權(quán)利要求8的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
17.根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
18.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中所述的其他kahalalide是具有5-甲基己基側(cè)鏈的kahalalide F。
19.含有權(quán)利要求1-18任何一項(xiàng)中定義的化合物的藥物組合物及藥用載體或稀釋劑。
20.權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)中定義的化合物，用作藥物。
21.權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)中定義的化合物在藥物生產(chǎn)中的用途。
22.權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)中定義的化合物在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述的藥物用于治療癌癥，銀屑病，病毒感染或者真菌感染。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述的治療針對(duì)患癌癥或者銀屑病的任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，并且所述的治療包括給被感染的個(gè)體施用治療有效量的權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)中定義的化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述的哺乳動(dòng)物是人并且患有癌癥。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述的患者患有不有利應(yīng)答于其他治療的難治療的癌癥。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述的癌癥選自前列腺癌，乳腺癌，肝細(xì)胞癌，黑素瘤，結(jié)直腸癌，腎癌，卵巢癌，NSCL癌，上皮癌，胰腺癌及過(guò)表達(dá)Her2/neu癌基因的腫瘤。
27.一種試劑盒，其包含獨(dú)立的含有藥物組合物和重構(gòu)試劑的容器，所述的藥物組合物包含權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)中定義的化合物。
28.一種制備權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)中定義的化合物的方法。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，特征在于其使用4甲基己酸作為起始材料。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，特征在于其使用(4S)-甲基己酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型kahalalide抗腫瘤化合物，特別是kahalalide F的類(lèi)似物，其用作抗腫瘤、抗病毒、抗真菌劑和用于治療銀屬病。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101077885SQ20071011225
公開(kāi)日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2003年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者G·T·費(fèi)爾克洛思, M·埃利塞斯, H·薩薩克, P·M·阿維萊斯·馬里亞諾, M·D·C·奎斯瓦斯·馬爾尚特 申請(qǐng)人:馬爾藥品公司